Summary
Fonksiyon kaybı ve kazancı hem Angelman sendromu hem de otizm spektrum bozukluğu ile bağlantılı olan bir gen olan Ube3a'daki yanlış anlam varyantlarının fonksiyonel önemini değerlendirmek için basit ve ölçeklenebilir bir yöntem geliştirilmiştir.
Abstract
Tıpta dizilemenin artan kullanımı, insan genomunda milyonlarca kodlama varyantı tanımlamıştır. Bu varyantların birçoğu nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili genlerde görülür, ancak varyantların büyük çoğunluğunun fonksiyonel önemi bilinmemektedir. Mevcut protokol, hem otizm hem de Angelman sendromuna bağlı bir E3 ubikitin ligazını kodlayan bir gen olan Ube3a için varyantların incelenmesini açıklamaktadır. Ube3a'nın çoğaltılması veya çoğaltılması otizmle güçlü bir şekilde bağlantılıdır, oysa silinmesi Angelman sendromuna neden olur. Bu nedenle, UBE3A protein aktivitesindeki değişikliklerin değerini anlamak, klinik sonuçlar için önemlidir. Burada, Ube3a varyantlarını bir Wnt yol muhabiri ile eşleştiren hızlı, hücre tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu basit tahlil ölçeklenebilir ve herhangi bir Ube3a varyantındaki aktivite değişikliklerinin değerini ve büyüklüğünü belirlemek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntemin tesisi, UBE3A'nın enzimatik mekanizmaları hakkında derin bilgiler edinmek için kullanılabilecek çok sayıda yapı-işlev bilgisinin üretilmesine izin verir.
Introduction
Son teknolojik gelişmeler, ekzomların ve genomların dizilimini klinik ortamlarda rutin hale getirmiştir 1,2. Bu, tipik olarak bir proteindeki bir amino asidi değiştiren milyonlarca yanlış anlam varyantı da dahil olmak üzere çok sayıda genetik varyantın keşfedilmesine yol açmıştır. Bu varyantların fonksiyonel önemini anlamak bir zorluk olmaya devam etmektedir ve bilinen yanlış anlam varyantlarının sadece küçük bir kısmı (~% 2) klinik bir yoruma sahiptir 1,3.
Bu sorunun belirgin bir örneği, yıkım için substrat proteinlerini hedef alan bir E3 ubikitin ligazını kodlayan bir gen olan Ube3a'dır 4. Ube3a, kromozom 15q11-13 içinde bulunur ve sadece maternal kalıtsal alel 5,6,7'den eksprese edilir. Hastalık genetiğinden yapılan gözlemler, UBE3A enziminin yetersiz veya aşırı aktivitesinin farklı nörogelişimsel bozukluklara neden olduğunu kuvvetle göstermektedir. Maternal kromozom 15q11-13'ün silinmesi, ciddi zihinsel engellilik, motor bozukluklar, nöbetler, sık sık gülümseyen mutlu bir tavır ve dismorfik yüz özellikleri 8,9,10 ile karakterize bir bozukluk olan Angelman sendromuna (AS) 8'e neden olur. Buna karşılık, maternal kromozom 15q11-13'ün çoğaltılması veya çoğaltılması, otizmin en yaygın sendromik formlarından biri olarak kabul edilen heterojen bir durum olan Dup15q sendromuna neden olur11,12,13. Ek olarak, Ube3a'da tanımlanan yüzlerce yanlış anlam varyantı vardır, bunların çoğu, fonksiyonel ve klinik önemi bilinmediğinden, belirsiz öneme sahip varyantlar (VUS) olarak kabul edilir. Bu nedenle, nörogelişimsel hastalığa katkıda bulunup bulunmadıklarını belirlemek için Ube3a varyantlarını ampirik olarak değerlendirebilecek yöntemler geliştirmeye büyük ilgi vardır.
UBE3A enzimi, E2 enzimlerinden aktive ubikitini kabul etmek ve substrat proteinlerine aktarmak için gerekli biyokimyasal makineleri içeren isimsiz HECT alanına sahip olan E3 ubikitin ligazlarının HECT (E6-AP C-terminus'a homolog) alan ailesine aittir14. Tarihsel olarak, E3 enzimlerinin karakterizasyonu,saflaştırılmış proteinlerin bir topluluğunu gerektiren yeniden yapılandırılmış in vitro sistemlere dayanmaktadır 4,15,16. Bu tür yöntemler yavaş ve emek yoğundur ve çok sayıda varyantın aktivitesini değerlendirmeye uygun değildir. Önceki çalışmalarda, UBE3A'nın, β-katenin17'nin bozulmasını yavaşlatmak için proteazomun işlevini modüle ederek HEK293T hücrelerinde Wnt yolunu aktive ettiği tespit edildi. Bu içgörü, Wnt yol muhabirlerinin Ube3a18'in hem işlev kaybı hem de kazanç değişkenlerini tanımlamak için verimli ve hızlı bir yöntem olarak kullanılmasına izin verir. Aşağıdaki protokol, Ube3a varyantlarının aktivitesindeki değişiklikleri değerlendirmek için Lusiferaz tabanlı bir muhabirin yanı sıra Ube3a varyantlarını üretmek için bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ube3a varyantları üretmek için mutagenez klonlaması
- Tüm Ube3a varyantlarını, EGFP ekspresyonu19 için bir tavuk-β-aktin promotörü ve bir iç ribozom giriş bölgesi (IRES) içeren bir bisistronik vektör olan pCIG2 plazmidine (Şekil 1A) klonlayın. Tam uzunluktaki Ube3a yapıları bir N-terminal Myc-tag dizisi içerir ve 5' SacI sitesi ve 3' XmaI sitesi kullanılarak pCIG2'ye klonlanır. Ek olarak, Ube3a kodlama dizisindeki doğal olarak oluşan EcoRI, EcoRV ve PstI siteleri de parçaları alt klonlamak için kullanılır.
NOT: Ube3a için tanımlanmamış varyantlar, literatür aracılığıyla ve ClinVar veritabanı1 gibi kamuya açık depolarda elde edilebilir. Bildirilmemiş ek varyantlar, tıp merkezleriyle kişisel iletişim yoluyla elde edilebilir. - Ube3a okuma çerçevesine mutasyonlar eklemek için uyarlanmış iki aşamalı megaprimer mutagenez yöntemi20 kullanın. İlk adımda, istenen mutasyonu içeren mutajenik oligonükleotidi tasarlayın (bu protokolde gösterilen örnek, mutasyona en az 30 baz çifti (bp) homoloji 5′ ve 3′ ile çevrili bir UBE3A Q588E varyantı oluşturmaktır (Şekil 1B ve Tablo 1).
- Mutasyonu içeren 200-400 bp'lik bir megaprimer oluşturmak için ilk tur PCR için tamamlayıcı bir oligonükleotid ile birlikte mutajenik oligonükleotidi kullanın (Şekil 1C; Tablo 2 ve Tablo 3). % 1'lik bir jel ve müteakip jel saflaştırması (Malzeme Tablosu) kullanarak agaroz jel elektroforezi için PCR reaksiyon hacminin 50 μL'sinin tamamını kullanın. PCR ürününü aşağıdaki ikinci tur PCR adımında kullanılmak üzere 30 μL deiyonize H2O (diH2O) içinde süzün.
- İkinci tur PCR'yi belirtildiği gibi ayarlayın (Şekil 1C; Tablo 2 ve Tablo 3). Bu adım, alt klonlama için uygun mutasyon ve terminal kısıtlama bölgelerini içeren daha büyük DNA fragmanları (tipik olarak ~ 1-1.5 kb uzunluğunda) üretecektir (Şekil 1C).
- PCR reaksiyonunun tamamlanmasından sonra, elde edilen ürünü bir PCR saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak saflaştırın. 30 μL'de salınım yapın ve saflaştırılmış tüm ürünü ve pCIG2 Ube3a WT yapısını uygun kısıtlama enzimleri ile sindirin (örnek EcoRI ve XmaI ile sindirimi gösterir).
- 37 °C'de 2 saatlik sindirimden sonra, sindirim ürünlerini agaroz jel elektroforezi (% 1 jel) ile çözün ve uygun ürünleri jel saflaştırın. Üreticinin protokolüne (Malzeme Tablosu) göre ligasyonlar kurun, ligasyon ürünlerini DH10B bakteri suşuna (Malzeme Tablosu) dönüştürün ve ardından ampisilin (100 μg / mL) seçimi ile plaka.
- Ertesi gün, Luria Broth (LB) ve 100 μg / mL ampisilin içeren 3 mL kültürleri aşılamak için iki ila dört koloni seçin. Kültürlerin bir gecede 37 ° C'de bir yörüngesel inkübatörde sallanarak (225 rpm) büyümesine izin verin.
- Ertesi gün, plazmid DNA'sını en aza indirmek için 1-1.5 mL bakteri kültürü kullanın (Malzeme Tablosu). Kalan kültürü 4 °C'ye yerleştirerek kaydedin. Miniprepped plazmidleri, istenen mutasyondan ~ 200 bp'ye bağlanan bir oligonükleotid kullanarak Sanger dizilimi ile tarayın.
- Doğru plazmidin midiprep edilmesi için 50 mL kültürleri yeniden aşılamak için 4 ° C'de kaydedilen bakteri kültürlerini kullanın (Malzeme Tablosu). DNA'nın doğru dizisini doğrulamak için Ube3a kodlama dizisini tam olarak sıralayın.
- Sonraki transfeksiyon adımları için steril H 2 O kullanarak Ube3a varyantı plazmidlerinin yanı sıra β-katenin aktive edilmiş muhabir (BAR)21, TK-Renilla lusiferaz, ligaz-ölü Ube3a (UBE3A C820A mutasyonu) vepCIG2boş vektörünün çalışma stoklarını oluşturun.
2. İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücrelerinin hazırlanması ve transfeksiyonu
- Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) yetiştirilen HEK293T hücrelerinde glutamin,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve daha önce tarif edildiği gibi antibiyotik-antimikotik ajan ile önceden desteklenmiş HEK293T hücrelerinde tahlilleri gerçekleştirin17. Steril, nemlendirilmiş bir inkübatördeki hücreleri% 5 CO2 ile 37 ° C'de büyütün.
- Bir biyogüvenlik kabini kullanarak, ilk önce askıya alınmış HEK293T hücrelerini, 100 μL kültür ortamında kuyu başına 2.2 × 104 hücre yoğunluğunda doku kültürü ile muamele edilmiş 96 kuyucuklu düz tabanlı plakalara yerleştirin ve bir gecede büyümelerini sağlayın.
- İkinci gün, bir biyogüvenlik kabinindeki hücreleri Firefly ve Renilla lusiferaz muhabir plazmidleri (Tablo 4) ve Ube3a plazmidleri üçlü olarak transfekte edin. Transfeksiyonları, daha önce tarif edildiği gibi 10: 1: 8 plazmid oranı (sırasıyla 50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla ve kuyu başına 40 ng Ube3a plazmid) kullanarak kuyu başına toplam hacmin 10 μL'sinde gerçekleştirin18 ve 0.4 μL transfeksiyon reaktifi (Tablo 4).
NOT: Her deney için, boş bir vektör (yalnızca GFP) ve bir plazmid kodlama ligaz ölü Ube3a da negatif kontroller olarak hizmet etmek üzere transfekte edilir. - 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde (Tablo 4) her varyant için transfeksiyonlar için bir ana karışım oluşturun ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. Kuluçkadan sonra, tüpe dokunarak transfeksiyon karışımını hafifçe çalkalayın ve ardından transfeksiyon karışımının 10 μL'sini doğrudan kuyucuklardaki mevcut büyüme ortamına ekleyin.
- Daha sonra, hücreleri inkübatöre geri döndürün ve plazmidlerin 48 saat boyunca eksprese olmasına izin verin. Büyüme ortamının değiştirilmesi gerekli değildir.
- Bir floresan mikroskobu kullanarak GFP floresan ile transfeksiyon verimliliğini izleyin. HEK293T hücreleri bu yöntemle verimli bir şekilde transfekte edilir ve hücrelerin% >80'i 48 saat sonra GFP eksprese etmelidir.
3. Lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi
NOT: Luciferaz aktivitesi, üreticinin protokolüne göre hem Firefly hem de Renilla luciferase'i (Malzeme Tablosu) test eden ticari olarak temin edilebilen bir sistem kullanılarak değerlendirilir.
- Kültür ortamını transfekte HEK293T hücrelerinden dikkatlice aspire edin ve ardından hücreleri soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 25 μL denatüre olmayan lizis tamponu ekleyerek hücreleri lize edin ve buz üzerinde hafifçe sallanarak 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Daha sonra, elde edilen lizatın 20 μL'sini (santrifüjleme gerekmez) 100 μL Firefly lusiferaz substrat reaktifi içeren yeni bir 96 kuyulu tahlil plakasına ekleyin. Plakayı hafifçe dokunarak karıştırın.
- Plakayı bir plaka okuyucuya yükleyin ve 1 mm okuma yüksekliğine ve 1 s entegrasyon süresine sahip bir üst dedektör kullanarak parlaklığı ölçün.
NOT: Dedektörün kazancının, sinyalin gücüne göre ayarlanması gerekebilir. - Firefly lusiferaz lüminesansını okuduktan hemen sonra, kuyucuklara 100 μL Renilla lusiferaz substratı ekleyin. Bu adım, Renilla lusiferaz aktivitesini değerlendirirken aynı zamanda Firefly lusiferaz aktivitesini söndürür. Numuneleri plakanın nazikçe çalkalanması ile karıştırın ve Renilla lusiferaz aktivitesini değerlendirmek için lüminesansı tekrar ölçün.
NOT: Bu test için başka plakalar da kullanılabilirken, siyah çerçeveli ve beyaz kuyucuklu plakaların kullanılması, gürültüyü en aza indirirken lusiferaz sinyalini yükselttiği için en hassas sonuçları sağlayacaktır. - Muhabirin yanıtlarını Firefly luciferase - Renilla luciferase oranı (Firefly / Renilla) olarak ölçün ve üçlü ölçümlerin değerlerinin ortalamasını alın. Daha sonra, varyant proteinlerin göreceli aktivitesini karşılaştırmak için her varyant için Firefly / Renilla değerini, vahşi tip (WT) Ube3a eksprese eden hücrelerin değerlerine karşı normalleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ube3a yanlış anlam varyantlarının büyük ölçekli fonksiyonel taraması, fonksiyon kaybı ve kazancı mutasyonlarının geniş bir manzarasını tanımlar.
Ube3a mutantları ile yapılan önceki çalışmalar, Wnt yanıtının hücresel UBE3A protein aktivitesinin bir muhabiri olarak hizmet edebileceğini öne sürdü. Bu gözlemler genişletildi ve BAR testinin hücredeki bir dizi UBE3A aktivitesini rapor etmek için uygun olup olmadığını araştırmak için ek doğrulama deneyleri yapıldı. İlk olarak, HEK293T hücreleri, insan WT Ube3a'yı kodlayan çeşitli miktarlarda plazmid DNA'sı ile transfekte edildi. Bu deney, BAR yanıtının hücrelere aktarılan Ube3a miktarı ile doğrusal olarak değiştiğini göstermiştir (Şekil 2A). İkincisi, BAR testi, daha önce literatürde karakterize edilen plazmid DNA kodlama hastalığına bağlı varyantlar kullanılarak test edilmiştir22. Bunlar arasında iyi huylu varyantlar (R39H ve A178T), bir otizme bağlı fonksiyon kazancı varyantı (T458A) ve çeşitli mekanizmalarla UBE3A fonksiyonunun kaybına neden olan doğrulanmış Angelman sendromuna bağlı varyantların bir koleksiyonuvardı 15,22. BAR testi, tüm fonksiyon kaybı varyantları da dahil olmak üzere her bir varyantı doğru bir şekilde tanımlamıştır (Şekil 2B), bu yöntemin doğruluğunu ve genelliğini göstermektedir18.
BAR testi, çoğu ClinVar veritabanından tanımlanan 152 yanlış anlam değişkenini taramak için kullanıldı. Ube3a'ya bağımlı bozukluklarda kopya sayısı varyasyonlarına ilişkin genetik kanıtlara benzer şekilde, yanlış anlamlı varyantların fonksiyonel etkisi genişti ve iyi huylu varyantların yanı sıra hem fonksiyon kaybı hem de fonksiyon kazancı varyantlarını içeriyordu (Şekil 3)18. Özellikle ilgi çekici olan, bu yöntem kullanılarak tanımlanan fonksiyon kazancı varyantlarının hepsi yeniydi ve daha sonraki doğrulama, klasik Angelman sendromu18'den farklı fenotiplere sahip Ube3a'ya bağımlı bozuklukların bir alt sınıfını tanımladıklarını güçlü bir şekilde önerdi.
Yanlış anlam değişkenlerinin etkisi genellikle öngörülemezdir ve fonksiyonel değerlendirmeye duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.
Ube3a varyantlarının fonksiyonel taramasından elde edilen ilginç bir gözlem, bazı amino asit pozisyonlarındaki değişikliklerin büyük ölçüde farklı etkiler yarattığı ve böylece ampirik varyant değerlendirmesinin önemini vurgulamasıdır18. Örneğin, UBE3A'daki glutamin 588 (Q588) pozisyonunda, fonksiyon kazancı glutamat ikamesi (Q588E), fonksiyon kaybı arginin ikamesi (Q588R) ve başka bir fonksiyon kaybı prolin ikamesi (Q588P; Şekil 4A). Q588 pozisyonunu mümkün olan her amino aside dönüştürmek için kapsamlı bir mutasyon yaklaşımı kullanıldı. Bu varyantların aktivitesi BAR testi kullanılarak ölçüldüğünde, 588 pozisyonundaki herhangi bir negatif yüklü amino asidin hiperaktif bir enzim ürettiğini göstermiştir (Şekil 4B). Bu içgörü, ubikitin zinciri uzamasını kolaylaştıran UBE3A'nın HECT alanı içinde yeni bir sitenin keşfedilmesine izin veren önemli fonksiyonel ipuçları sağlamıştır18.
Şekil 1: Ube3a'nın PCR'ye bağımlı mutagenezisi. (A) İlgili kısıtlama bölgelerini gösteren Ube3a ekspresyon vektörünün gösterimi. (B) UBE3A'yı kodlayan DNA dizisi en üstte gösterilir. Q588 kodonu kalın harflerle gösterilir. Q588E mutagenez astarı (Mut. primer) UBE3A dizisine hizalanmış olarak gösterilmiştir. Kırmızı harf, mutajenize edilmiş bölgeyi gösterir. (C) Megaprimer üretmek için PCR'nin bir şeması ve Q588E fragmanını alt klonlamak için kullanılan DNA fragmanı gösterilmiştir. Q588E mutasyonunun konumu kırmızı yıldız işareti ile gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: BAR testinin UBE3A ubikitin ligaz aktivitesinin bir muhabiri olarak doğrulanması. (A) WT UBE3A'yı kodlayan artan miktarlarda plazmid ile transfekte edilen HEK293T hücreleri, BAR yanıtında doğrusal bir artış göstermektedir. Firefly/Renilla lusiferaz oranları ± standart hata (SE) için ortalama değerler gösterilmiştir. N= 3 bağımsız deney. (B) Daha önce karakterize edilmiş Ube3a varyantları BAR testinde test edilmiştir. WT UBE3A'ya verilen yanıtlar normalleştirildi ve değerler SE'± ortalaması olarak gösterildi. Benjamini-Hochberg çoklu karşılaştırma düzeltmesi (FDR = 0.05) ile tek örneklemli bir t-testi (iki kuyruklu) kullanılarak hesaplanan deney sayısı (n) ve p-değerleri aşağıdaki gibidir: GFP, n = 19, ***p = 1.733 × 10−31; WT UBE3A, n = 19; UBE3A LD, n = 19, ***p = 1.519 × 10−31; R39H, n = 3, p = 0.567; A178T, n = 4, p = 0.828; T485A, n = 5, *p = 0,019; C21Y, n = 3, ***p = 8.725 × 10−6; C117R, n = 3, ***p = 3.419 × 10−4; N243K, n = 3, **p = 0,0072; E269G, n = 3, **p = 7.787 × 10−4; L273F, n = 3, **p = 0,0052; S349P, n = 3, **p = 0,0016; L502P, n = 3, **p = 0,0033; R506C, n = 3, **p = 0,0033; T106K, n = 6, **p = 0.0.0078; T106P, n = 3, **p = 0,0013; I130T, n = 6, *p = 0,016; R477P, n = 3, ***p = 4,24 × 10−4; M478I, n = 3, ***p = 3,39 × 10−4; R482P, n = 3, **p = 5,82 × 10−4; I329T, n = 5, ***p = 1,22 × 10−5; E550L, n = 3, *p = 0,0013. Veriler Weston ve ark.18'in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Çok çeşitli fonksiyonel etkileri kapsayan UBE3A varyantları. WT UBE3A'ya göre iyi huylu (gri), fonksiyon kaybı (mavi) ve fonksiyon kazancı (kırmızı) mutasyonları gösteren 152 Ube3a varyantının BAR tahlil ekranı. Anlamlılık, Benjamini-Hochberg çoklu karşılaştırma düzeltmesi (FDR = 0.05) ile tek örneklemli bir t-testi (iki kuyruklu) kullanılarak belirlendi. Kırmızı, işlev kazancı; Gri, WT UBE3A'dan değişiklik yok; Mavi, işlev kaybı. Veriler Weston ve ark.18'in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Çok çeşitli fonksiyonel etkileri kapsayan UBE3A varyantları. (A) UBE3A'nın 588 pozisyonundaki varyantların hem fonksiyon kaybını hem de kazancı ikamelerini gösteren BAR tahlil sonuçları. Q588E, n = 6; Q588P, n = 3; Q588R, n = 4; p < 0.0005, Benjamini-Hochberg çoklu karşılaştırma düzeltmesi ile tek örneklemli t-testi (iki kuyruklu) (FDR = 0.05). (B) UBE3A'da 588 pozisyonunda kapsamlı mutasyon analizi için normalleştirilmiş BAR sonuçlarını gösteren ısı grafiği. Beyaz gölgelendirme WT UBE3A etkinlik düzeylerini, mavi gölgelendirme işlev kaybını ve kırmızı gölgelendirme işlev kazancını gösterir. Ölçek çubuğu, WT UBE3A'ya göre yüzde değişimini gösterir. N = Q588T, Q588N, Q588K, Q588P, Q588M, Q588G, Q588A, Q588F, Q588Y, Q588W, Q588L, Q588V, Q588I, Q588C için 3 bağımsız deney; Q588E için n = 8, Q588D için n = 6, Q588R için n = 5, Q588H için n = 4, *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Benjamini-Hochberg çoklu karşılaştırma düzeltmesi ile tek örneklemli t-testi (iki kuyruklu) (FDR = 0.05). Veriler Weston ve ark.18'in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Ad | Sıra | Şunun için kullanılır: | |
| Astar 1 | GATTATATTATGACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a EcoRI duyusu | |
| Mut. Astar | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAAAGAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E mutagenez antisens | |
| Astar 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a XmaI antisens | |
Tablo 1: UBE3A Q588E mutagenezi için kullanılan astarlar.
| 1. Tur PCR | |
| Reaktif | Reaksiyon Miktarı |
| 5x yüksek kaliteli tampon | 10 μL |
| dNTP (10 mM stok) | 1 μL |
| Astar 1 (10 mM stok) | 1 μL |
| Astar 2 (10 mM stok) | 1 μL |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL stok) | 1 μL |
| H2O | 35 μL |
| Yüksek doğrulukta DNA polimeraz | 1 μL |
| Toplam Hacim | 50 μL |
| 2. Tur PCR | |
| Reaktif | Reaksiyon Miktarı |
| 5x yüksek kaliteli tampon | 10 μL |
| dNTP (10 mM stok) | 1 μL |
| Astar 3 (10 mM stok) | 1 μL |
| Saflaştırılmış PCR ürünü (Megaprimer) | 30 μL |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL stok) | 1 μL |
| H2O | 6 μL |
| Yüksek doğrulukta DNA polimeraz | 1 μL |
| Toplam Hacim | 50 μL |
Tablo 2: Mutagenez için PCR parametreleri.
| 1. Tur PCR | ||
| Adım | Sıcaklık | Saat |
| İlk denatürasyon | 95 °C | 2 dk |
| (1 döngü) | ||
| Denatürasyon | 95 °C | 30 Saniye |
| Tavlama | 50 °C | 20 Saniye |
| Uzantı | 72 °C | 15 Saniye |
| (30 döngü) | ||
| Son uzatma | 72 °C | 1 dk |
| Tutmak | 4 °C | Sonsuz |
| 2. Tur PCR | ||
| Adım | Sıcaklık | Saat |
| İlk denatürasyon | 95 °C | 2 dk |
| (1 döngü) | ||
| Denatürasyon | 95 °C | 30 Saniye |
| Tavlama | 50 °C | 20 Saniye |
| Uzantı | 72 °C | 35 Saniye |
| (30 döngü) | ||
| Son uzatma | 72 °C | 1 dk |
| Tutmak | 4 °C | Sonsuz |
Tablo 3: Mutagenez için PCR Program Parametreleri.
| Reaktif | Çalışma konsantrasyonu | 1x transfeksiyon | 3,5x ana karışım |
| pGL3 BAR plazmid | 100 ng/μL | 0,5 μL | 1,75 μL |
| pTK Renilla plazmidi | 100 ng/μL | 0,05 μL | 0,175 μL |
| Ube3a plazmid | 100 ng/μL | 0,4 μL | 1,4 μL |
| Glutamin takviyeli DMEM | 8,65 μL | 30,275 μL | |
| Transfeksiyon reaktifi | 0,4 μL | 1,4 μL |
Tablo 4: Transfeksiyon karışımları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, Ube3a varyantlarının enzimatik aktivitesini değerlendirmek için verimli ve ölçeklenebilir bir yöntem sağlar. Bu tahlili kullanırken dikkatli bir şekilde düşünülmesini gerektiren birkaç teknik ayrıntı vardır. Bir husus, bu tahlilde kullanılan Wnt muhabir plazmidlerinin seçimidir. Burada açıklanan protokol, özellikle TCF bağlanma bölgelerinin rekombinasyonunu ve kaybını en aza indirmek için özel olarak tasarlanmış bağlayıcı dizileriyle ayrılmış 12 T-hücresi faktörü (TCF) yanıt elemanından oluşan bir birleştirici içeren bir raporlayıcı olan β-katenin aktive edilmiş muhabiri (BAR)21'i kullanır. Literatür 23'te tanımlanan ek lusiferaz bazlı Wnt muhabir plazmidleri vardır ve önceki çalışmalar bazılarınınUBE3A aktivitesini değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermesine rağmen, BAR plazmidi bu amaç için en kapsamlı şekilde karakterize edilmiştir17,18. İkincisi, Renilla lusiferaz plazmidinin seçimi kritiktir. Transfeksiyon verimliliğini normalleştirmek için transfeksiyon adımı sırasında Renilla lusiferaz kodlayan bir plazmid dahil edilmiştir. Bu protokolde kullanılan plazmid, bir timidin kinaz (TK) promotörü (TK-Renilla) kontrolü altında Renilla lusiferazı yapısal olarak eksprese eder. Yaygın olarak kullanılan sitomegalovirüs (CMV) promotörü gibi diğer promotörleri içeren plazmidlerin kullanımı, Renilla lusiferaz ekspresyonunda değişken sonuçlara yol açabilir.
İkinci bir husus, hücre kültürü için kullanılan FBS'nin türüne ve lotuna bağlı olarak hücrelerin davranışıdır. Örneğin, FBS, HEK293T hücrelerinin büyüme hızını değişken olarak etkileyebilir. Mevcut protokol, 18-24 saatlik tipik bir iki katına çıkma süresi sergileyen hücrelerle optimize edildi ve transfeksiyon sırasındaki hücre yoğunluğunu kuyu başına yaklaşık ~ 4 × 104 hücre haline getirdi. Hücre yoğunluğu transfeksiyon verimliliğini etkileyebileceğinden, hücre büyüme oranları kullanıcı tarafından dikkatlice değerlendirilmeli ve hücre sayıları kaplama sırasında buna göre ayarlanmalıdır. Ek olarak, UBE3A'ya bağımlı BAR yanıtı, deney sırasında bir miktar Wnt ligandının bulunmasını gerektirir. Çoğu standart koşulda, FBS'de bu yanıtı yönlendirmek için yeterli Wnt vardır; ancak, bu yanıt da değişebilir. Transfeksiyon için kullanılan plazmid oranlarının titrasyonlanması, BAR yanıtının uygun doğrusal aralıkta ölçülmesini sağlamak için önerilir. Alternatif bir yaklaşım, rekombinant bir Wnt ligand veya Wnt takviyeli büyüme ortamı 17 kullanarak Wnt sinyallemesiniuyarmaktır.
BAR testinin bir avantajı, tüm Ube3a izoformlarının ubikitin ligaz aktivitesini bildirebilmesidir. İnsanlar, alternatif transkripsiyonel başlangıç bölgelerinin kullanımı nedeniyle aşırı N-terminlerinde farklılık gösteren üç Ube3a izoformunu ifade eder24. BAR testi, izoformlara agnostik olarak aynı okumayı sağlar ve bu nedenle, bu tahlil tüm Ube3a varyantlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Ek olarak, Ube3a varyantlarının büyük ölçekli karakterizasyonu, enzim fonksiyonu için kritik olan yeni alanları ve mekanizmaları ortaya çıkarabilen derin yapı-fonksiyon verileri sağlar. Önceki bir çalışmada, ubikitin zinciri uzamasını kolaylaştıran UBE3A içinde ubikitin bağlayıcı bir alan keşfetmek için varyant verileri kullanılmıştır18. Ek yapı-fonksiyon çalışmaları muhtemelen terapötik gelişim için kullanılabilecek UBE3A'nın biyokimyasal mekanizmaları hakkında yeni bilgiler sağlayacaktır.
BAR tahlilinde, bir varyantın patojenitesini belirlerken dikkatli bir şekilde dikkate alınmasını gerektiren bazı sınırlamalar vardır. Ube3a'nın nöronlardaki epigenetik baskısı nedeniyle, bu test maternal ve paternal alelleri ayırt edemez ve bir varyantın patojenitesini belirlemek için fonksiyonel verilerle birlikte ek genetik kanıtlar tartılmalıdır. Ayrıca, UBE3A'nın ubikitin ligaz aktivitesinin ötesindeki ek değişkenler hastalık bağlamında düşünülmelidir. Örneğin, önceki çalışmalar, nükleer lokalize UBE3A'nın Angelman sendromu patolojisi25'e katkıda bulunduğunu ve bazı varyantlarınenzim 26'nın bu lokalizasyon modelini bozduğunu göstermiştir. Bu nedenle, Ube3a varyantlarının nörogelişimsel patolojiye katkısının tam olarak anlaşılması için ek aşağı akış karakterizasyonları yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Simons Vakfı Bağımsızlık Köprüsü Ödülü (SFARI Ödülü #387972; J.J.Y.), Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı'ndan (J.J.Y.) NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü, Alfred P. Sloan Vakfı'ndan (J.J.Y.) Araştırma Bursu ve Angelman Sendromu Vakfı (J.J.Y.), Whitehall Vakfı (J.J.Y.) ve NIMH'den (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
