Summary
본 프로토콜은 양막(AM)으로부터 루미칸을 추출하고 그의 단백질 및 루미칸 농도를 정량화하기 위해 -20°C, 4°C 및 실온(RT)에서 6, 12, 20 및 32일 동안 AM 추출물(AME)로서 그의 저장 조건을 설명한다.
Abstract
Lumican은 각막 상피화와 콜라겐 섬유 조직을 촉진하여 각막 투명성을 유지하는 인간 양막(AM)에 있는 작은 류신이 풍부한 프로테오글리칸입니다. 본 연구에서, AM으로부터 단백질을 추출하여 루미칸을 얻는 방법이 제안된다. 또한, 상이한 온도 및 시간대에 저장된 AM 추출물 (AME)에서 lumican의 안정성이 평가된다. 100mg의 AM을 해동하고 기계적 탈상피화하였다. 탈상피화된 AM을 동결시키고 미세 분말이 수득될 때까지 분쇄하고, 단백질 분해효소 억제제와 함께 2.5mL의 식염수 완충액으로 가용화하고, 단백질 추출을 위해 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, -20°C, 4°C, 및 실온(RT)에서 6, 12, 20, 및 32일 동안 저장하였다. 그 후, 루미칸을 각 AME에서 정량화하였다. 이 기술은 AM에서 lumican 추출을위한 접근 가능하고 획득 가능한 프로토콜을 허용합니다. 루미칸 농도는 보관 시간 및 온도 조건에 의해 영향을 받았다. -20°C 및 4°C에서 12일간 저장된 AME에서 루미칸은 다른 AME보다 유의하게 높았다. 이 lumican 추출은 치료 및 제약 솔루션 개발에 유용 할 수 있습니다. 재상피화 및 상처 치유 과정에서 AME lumican의 사용을 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
Introduction
각막 애정에 가장 많이 사용되는 치료법 중 하나는 양막 이식입니다. 그러나 최근 몇 년 동안 양수의 다양한 구성 요소를 대체 및 보조 치료법으로 사용하기위한 새로운 제안이 등장했습니다. AM의 가장 많이 연구 된 성분 중에는 AM 추출물 (AME) 1,2,3,4,5,6,7에서 얻은 성분이 있습니다. AM은 항 혈관 신생 단백질, 인터루킨 (IL), 금속 단백 분해 효소 (TIMPs)의 조직 억제제, 호중구 세포 외 트랩을 억제하는 TSG-6에 의해 매개되는 항 염증 단백질, 성장 인자 : 표피 성장 인자 (EGF), 형질 전환 성장 인자 (TGF) (알파 및 베타), 각질 세포 성장 인자 (KGF), 간세포 성장 인자 (HGF) 및 콜라겐 원 섬유 생성을 조절하여 각막 투명성을 유지하는 루미 칸과 같은 여러 가용성 인자를 포함합니다1, 2,3,4,5,6,7,8,9.
Lumican은 콜라겐 섬유를 조직하고 각막 투명성을 유지하는 역할을하는 각막 기질 기질의 간질 콜라게나제의 주요 세포 외 구성 요소 중 하나 인 작은 류신이 풍부한 프로테오글리칸 (SLRP)입니다 4,10,11. 프로테오글리칸은 세포 외 기질 (ECM)의 분자로, 세포 신호 전달을 수행하고 세포 내 항상성을 유지하는 주요 분자입니다12. ECM 단백질은상처 치유 동안 증식, 분화 및 이동의 세포 과정을 주도하는 것으로 보고되었습니다11.
증거는 각막 재 상피화 과정에서 lumican의 참여 가능성을 나타냅니다. Saika et al.은 한 연구에서 각막 손상 후 손상 후 처음 8 시간에서 최대 3 일 사이에 각막 각질 세포에서 lumican이 검출 될 수 있음을 보여주었습니다. 둘째 날과 셋째 날에 가장 높은 농도의 루미칸을 나타내는 이 프로테오글리칸은 이후 7일째에 검출되지 않습니다13. 이 데이터는 각막 재 상피화 과정의 활성화에 lumican의 참여를 시사합니다. 다른 한편으로, 다른 연구에서, lumican의 부재는 재 상피화를 지연시키는 것으로보고되었다; 흥미롭게도 Lumican을 추가하면 재상피화 과정 4,11,13이 가속화될 수 있습니다. 마찬가지로, 최근 연구에 따르면 lumican은 각막 윤부 섬유 아세포14의 염증 기능을 조절할 수 있으며, 이는 염증성, 항 섬유화 및 재 상피 화 반응의 조절제로서 lumican의 역할을 시사합니다. 유사하게, lumican은 Fas-FasL과 같은 신호 분자와 상호 작용하여 각막 반응을 조절할 수 있습니다. 또한, 녹아웃 Lum-/- 마우스 모델에서 루미칸의 부재는 루미칸 신호전달의 부족이 적절한 각막 복구를 방해한다는 것을 입증했다15.
주로이 방법은 AM에서 lumican을 추출하는 실현 가능하고 접근 가능한 방법을 입증하는 것을 목표로합니다. 이 유리한 lumican 추출 방법을 사용하면 유사한 농도의 단백질을 얻을 수있어 처리 시간이 단축되고 이전 연구에 비해 조사자에게 더 편리합니다16. 또한, 이 AME 루미칸은 각막 복구 및 재상피화 과정을 위한 보조제로 사용될 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 기관 검토위원회 (프로젝트 번호 CEI-2020/06/04)의 승인을 받았습니다. AM은 Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amnion bank (식별되지 않은 인간 피험자로부터)에서 얻었으며, 이는 Chávez-García et al.17에 설명 된대로 준비되었습니다.
1. 양막 추출물의 제조
- 양막 은행에서 AM 100mg을 얻으십시오.
참고: 이전 보고서에 따르면 AM 50mg은 총 10ng/mL의 루미칸14를 분비합니다. 더 높은 농도의 루미칸을 얻으려면 총 면적 32cm2에 해당하는 AM 100mg을 사용하십시오. - AM이 얼면 실온에서 해동하십시오.
알림: 층류 후드 클래스 II B에서 다음 절차를 수행하십시오. - 페트리 접시에 AM을 멸균 균형 소금 용액 10mL(BSS, 재료 표 참조)로 2분 동안 세척합니다.
- BSS를 비커에 붓습니다.
- 단계 3을 반복하고 글리세롤 배지가 페트리 디쉬 BSS에 존재하지 않는지 육안으로 확인한다.
참고: 3단계를 반복합니다. 글리세롤 배지가 페트리 디쉬 BSS에 존재하지 않을 때까지 필요에 따라.
- AM을 37°C, 5%CO2에서 30분 동안 10mL의 디스파아제 II(1.7IU/mL, 재료 표 참조)와 함께 배양합니다.
참고: Dispase II는 상피 세포에 대해 부드러운 활성을 갖는 중성 프로테아제입니다. 이 효소는 온전한 표피를 진피로부터 효과적으로 분리하고 온전한 상피 시트를 단리한다(18). - dispase 배양 후, 고무 경찰관과 함께 기계적 탈 상피화14 를 수행하십시오 ( 재료 표 참조). 현미경 시각화로 상피화 제거를 확인합니다.
참고: 상피화 제거 과정은 4x 및 20x 대물렌즈를 사용하여 도립 현미경에서 확증됩니다. 세포층의 존재를 배제하기 위해 조직을 시각화하십시오. - 페트리 접시에 AM을 BSS 10mL로 2분간 세척합니다. BSS를 비커에 붓습니다.
- 탈상피화된 AM(dAM)을 2mL 미세 원심분리 튜브에 넣습니다. dAM을 액체 질소에 40분 동안 담그십시오.
- 미세 분말이 얻어질 때까지 -85°C의 사전 냉각된 모르타르에서 2-3분 동안 동결된 dAM을 수동으로 분쇄합니다.
- 모르타르에서 dAM 분말을 2.5mL의 프로테아제 억제제 용액(프로테아제 억제제가 포함된 BSS)으로 가용화합니다.
참고: 프로테아제 억제제의 모든 정제는 췌장 추출물(0.02mg/mL), 서몰리신(메탈로프로테아제)(0.0005mg/mL), 키모트립신(0.002mg/mL), 트립신(0.02mg/mL) 및 파파인(0.33mg/mL)과 같은 효소 혼합물로 구성됩니다( 재료 표 참조). - 마이크로 피펫으로 혼합물을 모으고 메스 나이프를 사용하여 모르타르 벽을 청소하십시오. 혼합물을 5mL 튜브에 넣습니다.
- 30 초 동안 와류와 잘 섞는다.
- 조직 혼합물을 4°C에서 20분 동안 34 x g에서 원심 분리하고 즉시 4°C에서 20분 동안 3360 x g 에서 원심분리하여 균질화합니다.
- 수집된 상청액은 AME입니다(그림 1). 각 AME 0.7mL를 서로 다른 2mL 미세 원심분리 튜브에 -20°C, 4°C 및 실온(RT)의 서로 다른 온도 조건에서 6일, 12일, 20일 및 33일 동안 보관합니다.
그림 1: AME 준비 과정 및 루미칸 농도 측정 . 100mg의 AM을 37°C에서 30분 동안 디스파제 II와 함께 인큐베이션하고 기계적으로 탈상피화하였다. 탈상피화된 AM을 세척하고 40분 동안 액체 질소에 침지한 다음, 미세 분말이 얻어질 때까지 분쇄하고, 프로테아제 억제제를 사용한 식염수 완충액 2.5mL로 가용화하고 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 총 단백질 및 루미칸 정량이 이루어질 때까지 6, 12, 20, 및 32일 동안 -20°C, 4°C 및 RT에서 보관하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. AME 단백질 정량화
참고: AME에서 총 단백질의 정량화는 관찰 직후에 수행해야 합니다. Lowry 단백질 분석을 사용하여 단백질을 정량화하고 제조업체의 지침을 따르십시오( 재료 표 참조). 모든 표준물질과 샘플을 삼중으로 분석하는 것이 좋습니다.
- AME의 각 샘플 40 μL를 96-웰 마이크로플레이트에 피펫팅한다.
- 최종 BSA 농도 0-1,500 μg/mL(0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1,000 및 1,500 μg/mL)에 대해 소 혈청 알부민(BSA) 표준물질을 사용하여 동일한 마이크로플레이트에 표준 곡선을 준비합니다.
- 200 μL의 변형된 Lowry 시약을 각 웰에 피펫팅한다. 즉시 플레이트 믹서에서 30 초 동안 혼합하십시오.
- 마이크로 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 RT에서 10 분 동안 배양합니다.
- 각 웰에 1x 폴린-시오칼트 시약 20 μL를 피펫팅합니다. 즉시 플레이트 믹서에서 30 초 동안 혼합하십시오.
참고: 1x 폴린-시오칼테우 시약을 준비하려면 초순수로 2x (2N) 시약을 1:1로 희석하십시오. 희석된 시약이 불안정하므로 사용 당일에 1x Folin-Ciocalteu 시약을 준비하십시오. - 마이크로 플레이트를 알루미늄 호일로 빛으로부터 덮고 RT에서 30 분 동안 배양합니다.
- ELISA 플레이트 분광기에서 660nm에서 샘플의 흡광도를 측정합니다( 재료 표 참조).
참고: 색상은 650nm에서 750nm 사이의 파장에서 측정할 수 있습니다. - 표준 블랭크 샘플의 660nm 흡광도 값을 평균하고 표준 및 알려지지 않은 샘플의 다른 660nm 값에서 뺍니다.
- ELISA 플레이트 분광기로 10초 동안 낮은 흔들림으로 엔드포인트 모드로 흡광도를 측정합니다.
- 표준 곡선을 사용하여 알려지지 않은 각 샘플의 단백질 농도를 결정합니다.
- 단백질 계산을 위해 각 표준 BSA 곡선의 X축에 있는 mg/mL 농도에 대해 Y축의 흡광도 값을 사용하여 선형 회귀 그래프에서 농도를 결정합니다.
- 선형 회귀 방정식과 r 값을 구하여 단백질 농도를 계산합니다.
참고: 결과는 AM mg(μg/mL 단백질/mg AM 조직)에 대한 총 단백질의 정규화된 상대 농도 값으로 표시됩니다.
- 선형 회귀 방정식과 r 값을 구하여 단백질 농도를 계산합니다.
3. AME에서 루미칸의 정량화
알림: lumican의 농도는 다른 보관 조건과 기간에 저장된 AME에서 측정해야 합니다. 샌드위치 ELISA를 사용하여 루미칸을 정량화하고 제조업체의 지침을 따르십시오. 모든 표준물질과 샘플을 이중으로 분석하는 것이 좋습니다.
- 인간 lumican 포획 항체 ( 재료 표 참조)를 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 사용 된 농도로 희석하십시오.
참고: 포획 항체 바이알에는 120μg의 항체가 들어 있습니다. 0.5mL의 PBS로 재구성한 후 2μg/mL의 작업 용액에서 포획 항체를 희석합니다.- 희석된 포획 항체를 웰당 100 μL를 즉시 피펫팅하여 96-웰 마이크로플레이트에 배치합니다. 플레이트를 동봉하고 RT에서 밤새 배양합니다.
- 각 웰을 흡인하고 다중 채널 피펫터를 사용하여 PBS, pH 7.2-7.4 ( 재료 표 참조) 중 0.05% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트 20: 300 μL의 세척 완충액으로 피펫팅하여 세척합니다. 세 번 반복하십시오.
알림: 마지막 세척 후 접시를 에버팅하여 남아 있는 세척액을 제거하고 종이 타월에 부드럽게 두드립니다. - 300 μL의 시약 희석제를 첨가하여 플레이트 차단: PBS 중 1% BSA, pH 7.2-7.4, 0.2 μm 여과( 재료 표 참조)를 각 웰에 여과하였다. RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 2단계를 반복합니다.
- 최종 농도 125, 250, 500, 1,000, 2,000, 4,000 및 8,000pg/mL에 대해 0-8,000pg/mL의 2배 연속 희석액을 사용하여 96웰 마이크로플레이트에 표준 곡선을 준비합니다. ELISA 루미칸 키트에는 75ng의 재조합 루미칸 표준이 포함되어 있습니다( 재료 표 참조).
- 100 μL의 샘플과 표준 곡선을 포획 항체 코팅된 96웰 마이크로플레이트에 추가합니다.
- 마이크로플레이트를 덮고 2-3rpm 사이의 속도를 유지하는 소형 로커에서 낮은 교반으로 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
- 2단계를 반복합니다.
- 100μL의 비오티닐화 검출 항체( 재료 표 참조)를 각 웰에 추가합니다. 빛으로부터 덮고 2-3rpm 사이의 속도를 유지하는 소형 로커에서 낮은 교반으로 RT에서 2 시간 배양하십시오.
참고: 비오티닐화 검출 항체 바이알에는 24μg의 항체가 들어 있습니다. 1.0mL의 시약 희석제로 재구성한 후 400ng/mL의 작업 용액에서 비오티닐화 검출 항체를 희석합니다. - 2단계를 반복합니다.
- 스트렙타비딘-양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP, 재료 표 참조)의 작업 희석액 100 μL를 각 웰에 첨가하십시오. 마이크로플레이트를 빛으로부터 덮고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
참고: 반응성 스트렙타비딘-HRP는 40배 농축되었습니다. 스트렙타비딘-HRP의 작업 용액 1x는 시약 희석제로 만들어졌습니다.
알림: 플레이트를 직사광선에 두지 마십시오. - 2단계를 반복합니다.
- 마지막으로 100μL의 기질 테트라메틸벤지딘(TMB, 재료 표 참조) 용액을 각 웰에 추가합니다.
알림: 키트에 제공된 동일한 부피의 안정화 과산화수소 30% 용액으로 TMB 용액을 준비하십시오.
알림: 사용 직전에 용액을 준비하고 실온에서 유지하십시오. - 어두운 곳에서 RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
알림: 플레이트를 직사광선에 두지 마십시오. 더 이상 세척할 필요가 없으므로 TMB 용액을 흡입하지 마십시오. - 50 μL의 1NH2SO4정지 용액을 첨가하여 비색 반응을 중지시켰다. 플레이트를 부드럽게 두드려 완전히 혼합되도록 합니다.
- ELISA 플레이트 분광기에서 450nm로 설정된 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 흡광도를 즉시 측정합니다.
- ELISA 플레이트 분광기로 10초 동안 낮은 흔들림으로 엔드포인트 모드로 흡광도를 측정합니다.
- 표준 블랭크 샘플의 450nm 흡광도 값을 평균하고 표준 및 알려지지 않은 샘플의 다른 450nm 값에서 뺍니다.
- 표준 곡선을 사용하여 알려지지 않은 각 샘플의 lumican 농도를 결정합니다.
- 루미칸 농도를 계산하려면 각 표준 루미칸 곡선의 X축에 있는 pg/mL 농도에 대해 Y축의 흡광도 값을 사용하여 선형 회귀 그래프를 만듭니다.
- 선형 회귀 방정식과 r 값을 구하여 lumican 농도를 계산합니다.
참고: lumican의 농도는 추출된 조직의 mg에 대해 표준화되었습니다. 결과는 mg AM (ng / mL lumican / mg AM 조직)에 대한 루미 칸의 정규화 된 상대 농도 값으로 표현됩니다.
- 선형 회귀 방정식과 r 값을 구하여 lumican 농도를 계산합니다.
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Representative Results
결과는 표준 편차(SD)± 평균값으로 보고됩니다. 스튜던트 t-검정과 분산 분석(ANOVA)을 수행했습니다. 0.05< p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다. 통계 분석은 통계 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다( 재료 표 참조).
AME의 총 단백질 양은 시간 및 저장 조건에 의해 영향을 받았다. 기초 단백질 농도는 모든 AME에서 유사했습니다. 총 단백질의 범위는 평가 된 샘플간에 유의 한 차이없이 2.7 ± 0.3 μg / mL였습니다. 그러나, 샘플을 12, 20 및 32 일 동안 보관했을 때, 기저 농도에 대한 단백질 농도의 변동성이 관찰되었다. 흥미롭게도, 단백질 농도는 저장의 항상 RT에 대하여 4°C 및 -20°C에서 AME에서 증가하였다.
유사하게, 단백질 농도를 저장 시간 사이에 비교했을 때, 12, 20 및 32 일 후에 변화했다. RT 조건과 비교하여 4°C 및 -20°C에서 32일 및 20일의 AME에서 상당한 차이(p < 0.05)가 발견되었으며(그림 2), 이는 온도가 얻어진 다른 AME에서 단백질 보존에 중요하다는 것을 시사합니다.
그림 2: 시간 및 보관 온도의 영향을 받는 AME의 총 단백질 농도. AME 상의 단백질 추출 농도는 온도 및 시간 보관 조건 전후에 정량화하였다. 평가된 저장 시간은 3가지 상이한 온도 조건(RT°C, 4°C 및 -20°C)과 비교하여 6일(검은색 삼각형), 12일(분홍색 삼각형), 20일(보라색 사각형) 및 32일(갈색 원)이었다. 기초 단백질 농도는 모든 AME에서 유사했습니다. 상이한 온도 조건에서의 기저 단백질 농도와 관련하여 20일 및 32일의 AME에서 단백질 농도에 상당한 차이가 있었다. 각 조건에서 n = 3. 데이터는 단백질 ± SE *p < 0.05(S1 32일 대 S1 4°C에서 20, 12, 6일)의 μg/mL의 중앙값으로 표시됩니다. (S1 32일 대 S1 -20°C에서 20, 12 및 6일). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
루미칸 농도는 보관 시간 및 온도 조건에 의해 영향을 받았다. 6일, 20일 및 32일 동안 보관된 AME에서 12일의 보관에 비해 더 적은 농도의 루미칸이 발견되었습니다. 유의하게도, 12일의 AME는 20일 및 32일의 저장보다 더 높은 루미칸 농도를 가졌다(p < 0.05).
AME의 루미칸 농도를 보관 온도 간에 비교했을 때 -20°C 및 4°C에서 12일 동안 보관하면 더 높은 농도의 루미칸이 발견되었습니다(그림 3). 흥미롭게도, 심지어 더 높은 (p < 0.05) 농도의 루미칸은 4°C와 비교하여 -20°C에서 보관한 경우 12일 AME에서 발견되었다.
이것은 lumican의 농도가 온도 조건 및 저장 시간에 의해 영향을 받는다는 것을 시사하며, lumican의 최고 농도를 달성하기 위한 적절한 저장 시간 및 온도는 -20°C에서 12일임을 시사합니다.
그림 3: 시간 및 보관 온도의 영향을 받는 AME의 총 루미칸 농도. 루미칸 농도는 보관 시간 및 온도 조건에 의해 영향을 받았다. AME에서 루미칸의 농도는 온도 및 시간 보관 조건 전후에 정량화되었습니다. 평가된 저장 시간은 3가지 상이한 온도 조건(RT°C, 4°C 및 -20°C)과 비교하여 6일(검은색 삼각형), 12일(분홍색 삼각형), 20일(보라색 사각형) 및 32일(갈색 원)이었다. 12일의 AME에서의 루미칸은 -20°C 및 4°C의 온도 조건에서 32, 20, 및 6일의 AME와 비교하여 유의하게 더 높았다. *p < 0.05 (S1 4°C에서의 12일, 20일, 및 6일 대 S1); p < 0.001 (-20 ° C에서 S1 12 일 대 S1 32, 20 및 6 일). AME에서 루미칸의 최고 농도는 -20°C에서 12일째에 저장하였다. ++p < 0.01 (S1 12일 4°C 대 S1 12일 -20°C). 32 일과 20 일의 AME에서 루미 칸은 보관 온도 조건 (n.s)과 비교하여 유의 한 차이가 없었다. 각 조건(n = 3)에서 데이터는 단백질 ng/mL의 중앙값으로 표시됩니다. 데이터는 통계적 유의성이 아닌 조직 ± SE.(n.s.)의 mg에 대하여 정규화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서는 AME에서 lumican의 존재와 다양한 저장 조건에서의 안정성과의 직접적인 상관 관계를 분석했습니다. 흥미롭게도 AME의 총 단백질 농도를 정량화하면 보관 후 단백질 농도가 증가했습니다. 증거는 냉동 보관에서 단백질 농도를 변화시킬 수 있는 세 가지 메커니즘, 즉 저온 변성, 용질의 동결 농도 및 얼음으로 인한 단백질 구조의 부분 풀림을 시사합니다19. 냉동 과정은 샘플에서 액상의 결정화로 인해 보관 샘플의 단백질 농도에 영향을 미칠 수 있습니다. 결과는 이것이 냉동실의 보관 시간에 영향을 받아 농도를 동결하는 과정으로 발생했을 수 있음을 시사합니다. 더 높은 농도의 단백질은 더 긴 보관 시간 (32 일 및 20 일)과 가장 추운 온도 (4 ° C 및 -20 ° C)에서 관찰되었습니다. 그러나 단백질 농도가 가장 높은 기간에는 lumican 농도가 가장 높지 않았습니다. 이는 Lumican이 동결 온도 및 시간 조건의 영향을 받을 수 있음을 시사합니다.
결과에 따르면, lumican 농도는 4 °C 및 -20 °C에서 12 일간 보관했을 때 더 높고 안정했다. 그럼에도 불구하고, lumican의 농도는 12 일에 비해 6 일에 더 적게 발견되었습니다. 일부 보고서는 냉동 보관 조건20 후에 단백질 농도가 변할 수 있음을 시사합니다. 결과는 샘플 동결 중에 발생하는 단백질 구조의 얼음 유도 부분 풀림이라는 열역학적 메커니즘으로 인해 발생할 수 있습니다. 수용액에서 단백질과 물의 상호 작용은 다른 분자와의 상호 작용을 감소시킵니다. 동결 조건 하에서 물의 결정화 과정은 단백질 및 일부 작용 영역이 다른 분자(19)와 상호작용할 수 있게 한다. 전술한 바와 같이, 루미칸을 수용액에서 12일간 동결시킨 후, ELISA 정량 키트에 존재하는 항체와 상호작용하여 더 높은 농도를 얻을 수 있었다. 다른 한편으로, 아마도 여섯째 날에, lumican은 수용액에서 외딴 곳에있을 수있었습니다.
혁신을 발전시키는 데 있어 AM의 사용은 병인에 관계없이 각막 재상피화를 위한 최첨단 치료법입니다. 앞서 언급했듯이 AM의 이점은 21,22,23,24,25,26입니다. 많은 저자들이 AME에서 lumican의 이점을 입증하여 개발 도상국 1,2,3,4,5,6,7,8,9를위한 저렴한 대안이되었습니다. 현재 AME에는 루미칸의 많은 이점이 있습니다. 치료로서의 사용은 각막 재 상피화를 촉진하고 각막 궤양 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15의 예후를 향상시킵니다. AM 이식 (AMT)은 다양한 각막 장애24,25를 개선하는 데 큰 이점을 가진 치료법이되었습니다. 그러나 지속적인 상피 결함 (PED) 및 윤부 줄기 세포 결핍 (LESCD)과 같은 각막 조직의 만성적 인 애정이 있으며, 이는 각막 복구를 돕는 생물학적 요인의 존재를 지속적으로 치료하고 유지해야합니다21,24. 현재 각막 표면에서 AMT에 의해 방출되는 요인을 장기간 유지할 수있는 보조 치료법은 없습니다. 그러나, AMT의 지속적인 교체는 환자 안전을 위해 권장될 수 없었다26. 이러한 이유로, AMT의 기능이 각막27의 지속적인 문제의 치료를 선호하기 위해 lumican과 같은 각막 조직에서 AM에 의해 방출되는 인자의 존재를 더 오랫동안 유지하고 유지하는 데 도움이되는 대안을 개발할 필요가있다.
Lumican은 각막 복구 과정에서 기능하는 것으로보고 된 항 염증 및 항 섬유 성 기능이있는 AM에 존재하는 요인 중 하나입니다 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . 그렇기 때문에 lumican은 각막 애정 치료에 도움이 되는 좋은 후보자가 될 것을 제안합니다. 그러나 각막 재상피화를 달성하기 위해 AME에서 루미칸의 효능을 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
루미칸은 콜라겐으로서 세포외 기질 화합물의 분비를 조절하는 것으로 밝혀진 프로테오글리칸이다; 또한, 섬유아세포의 활성화 및 염증세포의 조절 및 혈관신생 과정에 관여하며, 상처치유에 중요한 역할을 한다. 결과에 따르면, lumican은 AM 조직에서 추출 될 수 있습니다. lumican의 치료 적 응용은 다양합니다. AME에서 lumican을 사용하면 안구 장애 4,13에 대한 달성 가능한 치료 옵션이 가능합니다. AME 사용의 주요 이점은 수성 조성을 고려할 때 안구 표면에 대한 국소 치료로 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다. 마찬가지로, AM 조직에서 추출한 성분 내에서 항 염증 및 면역 조절 특성을 가진 다른 단백질을 찾을 수 있으며, 이는 눈의 탈 상피화 문제를 치료하는 데 더 큰 이점을 제공 할 수 있습니다. 예를 들어, AM 및 세포 성분에 존재하는 TSG-6과 같은 다른 항염증 인자는 이전에 면역조절 특성을 갖는 것으로 보고되었다8. 이로써, AME에 존재하는 루미칸 및 다른 세포외 기질 화합물 및 면역조절 분자의 병용 요법은 재상피화 및 상처 치유 과정에 유용할 수 있다.
이 방법은 풍부한 단백질과 인자의 섭취에 유용한 단백질 추출을위한 간단한 기술을 입증하는 것을 목표로합니다. 이 방법에 대한 중요한 고려 사항 중 하나는 AM이 단백질 분해를 방지하기 위해 효소 화합물이 많은 조직이기 때문에 성공적인 단백질 추출의 기본이기 때문에 프로테아제 억제제의 사용입니다27. 증거는 수용액과 함께 단백질 억제제를 사용하면 AM 조직26에서 HGF와 같은 다른 인자의 추출을 증가시킨다고보고했습니다. AM을 동결 및 접지 한 후 미세 분말을 제거하는 것은 AME의 최적 유지를 위해 필요하며,이 과정은 세포질 및 기타 핵 화합물28,29의 추출에 필요한 구조의 조직 및 세포 파괴에 적합하기 때문입니다.
이 추출 방법의 몇 가지 한계는 사용 된 AM 수량이 대규모 추출을 허용 할 수 없다는 것입니다. 이 프로토콜은 제한된 양의 조직에서 단백질 추출을 허용합니다. 이 방법이 더 큰 조직 영역에서 더 많은 양의 단백질을 얻을 수 있다는 증거가 없기 때문입니다. 다른 추출 방법과 비교하여 고려해야 할 문제 해결은 과량의 효소가 단백질30 에 영향을 미치고 기술의 효능을 감소시킬 수 있으므로 적절한 농도의 프로테아제 억제제 및 배양 시간을 사용하는 것입니다.
이 기술의 일부는 Mahbod et al.16에 의해보고 된 것에서 수정되었으며, 이는 원심 분리 및 추출 과정을 반복하면 단백질 추출이 증가한다고 설명합니다. Mahbod와는 달리, 결과는 원심 분리의 3주기 후에 단백질 농도를보고하지 않았다. 총 단백질 농도가 결정되었을 때, 두 번째 추출에서 80 %, 세 번째 추출에서 최대 97 %까지 감소했습니다. 추출을 한 번만 수행하면 처리 시간이 단축되고 총 단백질의 양이 감소하지 않습니다. 앞의 경우, 여기에 보고된 추출 방법은 유리한 결과를 가진 단 하나의 원심분리 단계만 필요합니다.
이 기술은 AM에 존재하는 다른 인자와 단백질을 추출하고 동물이나 채소와 같은 다른 공급원에서 인자를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 또한 기본 연구 또는 제형 및 치료법 개발을 수행하기 위해 단백질을 얻는 응용 프로그램을 가질 수도 있습니다.
이러한 결과는 루미칸이 AM에서 추출되어 -20°C 및 4°C 온도 조건 모두에서 AME로서 12일 동안 저장될 수 있음을 시사합니다. AME로서 lumican의 치료 효과를 얻기 위해서는 반감기를 고려하는 것이 중요합니다. 각막 상피 세포에서 AME lumican의 역할을 결정하고 각막 재 상피화를위한 lumican의 이상적인 용량을 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
결론적으로, 결과는 AME에서 루미칸과 같은 인자를 얻는 것이 가능하다는 것을 시사합니다. 마찬가지로 온도 및 보관 시간 조건은 AME에 존재하는 루미칸의 농도에 영향을 미칩니다.
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Disclosures
이 연구는 멕시코 국립 자치 대학의 연구 및 기술 혁신 프로젝트 지원 프로그램 (보조금 번호. PAPIIT IN203821) 및 교육 과학 기술 혁신부 (보조금 번호. SECTEI 250/2019).
Acknowledgments
저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계가 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N H2SO4 stop solution | R&D Systems | DY994 | |
| 100 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 1000 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 15 mm Petri dish | Symlaboratorios | ||
| 18 G Needle (1.2 mm x 40 mm) | BD Becton Dickinson | 305211 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | Z606340 | |
| 20 mL plastic syringe | BD Becton Dickinson | 302562 | |
| 20 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 20-200 μL micropipette | Eppendorf | ||
| 5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30119401 | |
| 96-well microplate | SARSTEDT | 821581 | |
| Aluminum foil | N/A | N/A | |
| Amniotic membrane | Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank | 100 mg | |
| Balanced salt solution | Bausch + Lomb | BSS-403802 | |
| Beaker | N/A | N/A | |
| BioRender | BioRender | figures design | |
| Compact Rocker | BioRad | 970822DD | Mod. 5202SD-BIO |
| complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail tablets |
Roche | 11 873 580 001 | Protease Inhibitor |
| Daiggner vortex Genie 2 | A.Daigger & Co. , INC | 22220A | |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | |
| ELISA plate spectrometer | Thermo Labsystems | 35401106 | Multiscan |
| Freezer | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | version 9 | statistical analysis and graphic program |
| Human lumican DuoSet ELISA kit | R&D Systems | DY2846-05 | includes human Lumican capture antibody |
| Incubator | Forma Scientific | 3326 S/N 36481-7002 | |
| Inverted light Microscope | Olympus | 6A13921 | to confirm de-epithelialization Mod.CK2 |
| Laminar flow hood | Forma Scientific | 14753-567 | Mod.1184 |
| Liquid nitrogen | N/A | N/A | |
| Mortar | N/A | N/A | |
| Multi-channel pipettor | Eppendorf | ||
| Nitrogen Tank | Thermo Scientific | Mod. Biocan 20 | |
| Paper towels | N/A | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | R&D Systems | DY006 | |
| Pierce Modified Lowry Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23240 | |
| Plate sealers | R&D Systems | DY992 | |
| Reagent diluent | R&D Systems | DY995 | 1% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered |
| Refrigerated centrifuge | centurion scientific Ltd | 15877 | Mod. K2015R |
| Rubber policeman cell scraper | NEST | 710001 | for mechanical de-epithelialization |
| Scalpel knife | Braun | BB521 | No. 10 or 21 |
| Streptavidin-HRP 40-fold concentrated | R&D Systems | part 893975 | |
| Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solution | R&D Systems | DY999 | |
| Toothed tweezers | Invent Germany | 6b | inox |
| Ultrapure water | PISA | ||
| Wash buffer | R&D Systems | WA126 | 0.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4 |
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