Summary

İnsan Serebellar Gelişiminin In Vitro in 2D Yapının Modellenmesi

Published: September 16, 2022
doi:

Summary

Mevcut protokol, serebellar gelişimin erken aşamalarını araştırmak için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden 2D tek katmanlı bir serebellar hücre üretimini açıklamaktadır.

Abstract

Beyinciğin hassas ve zamanında gelişimi sadece doğru motor koordinasyon ve denge için değil, aynı zamanda biliş için de çok önemlidir. Ek olarak, serebellar gelişimdeki bozulma, otizm, dikkat eksikliği-hiperaktivite bozukluğu (DEHB) ve şizofreni dahil olmak üzere birçok nörogelişimsel bozuklukta rol oynamıştır. İnsanlarda serebellar gelişimin araştırılması daha önce sadece ölüm sonrası çalışmalar veya nörogörüntüleme yoluyla mümkün olmuştur, ancak bu yöntemler, birçok nörogelişimsel bozukluğun ortaya çıktığı erken gelişim sırasında in vivo olarak meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri anlamak için yeterli değildir. Somatik hücrelerden insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC’ler) üretme tekniklerinin ortaya çıkması ve iPSC’leri nöronlara daha fazla yeniden ayırt etme yeteneği, erken beyin gelişiminin in vitro modellemesinin yolunu açmıştır. Bu çalışma, 2 boyutlu (2B) tek katmanlı bir yapı gerektiren uygulamalar için serebellar hücreler üretmeye yönelik basitleştirilmiş adımlar sunmaktadır. Erken gelişim aşamalarını temsil eden serebellar hücreler, aşağıdaki adımlarla insan iPSC’lerinden türetilir: ilk olarak, embriyoid cisimler 3 boyutlu (3D) kültürde yapılır, daha sonra serebellar kader spesifikasyonunu teşvik etmek için FGF2 ve insülin ile muamele edilir ve son olarak, poli-l-ornitin (PLO) / laminin kaplı substratlar üzerinde tek katmanlı olarak terminal olarak farklılaştırılırlar. 35 günlük farklılaşmada, iPSC kaynaklı serebellar hücre kültürleri, ATOH1, PTF1α, PAX6 ve KIRREL2 dahil olmak üzere serebellar belirteçleri eksprese eder, bu da bu protokolün glutamaterjik ve GABAerjik serebellar nöronal öncüllerin yanı sıra Purkinje hücre progenitörleri ürettiğini düşündürür. Ayrıca, farklılaşmış hücreler farklı nöronal morfoloji gösterir ve TUBB3 gibi nöronal kimliğin immünofloresan belirteçleri için pozitiftir. Bu hücreler, semaforin-4C, pleksin-B2 ve nöropilin-1 dahil olmak üzere aksonal rehberlik moleküllerini eksprese eder ve nörit büyümesinin ve sinaptik bağlantının moleküler mekanizmalarını araştırmak için bir model olarak hizmet edebilir. Bu yöntem, 2D tek katmanlı formatlar gerektiren gen ekspresyonu, fizyolojik ve morfolojik çalışmalar dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için yararlı insan serebellar nöronları üretir.

Introduction

İnsan serebellar gelişimini ve bu sürecin kritik zaman pencerelerini anlamak, sadece nörogelişimsel bozuklukların olası nedenlerini çözmek için değil, aynı zamanda terapötik müdahale için yeni hedeflerin belirlenmesi için de önemlidir. İnsan serebellar gelişiminin in vitro olarak modellenmesi zor olmuştur, ancak zamanla, insan embriyonik kök hücrelerini (hESC’ler) veya iPSC’leri serebellar soy kaderleriyle farklılaştıran birçok protokol ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8 . Ayrıca, tekrarlanabilir sonuçlar üreten, nispeten basit (hatayı azaltmak için) ve parasal maliyetler üzerinde ağır olmayan protokoller geliştirmek önemlidir.

Serebellar farklılaşma için ilk protokoller, kaplanmış embriyoid cisimlerden (EB’ler) 2D kültürlerden üretildi ve WNT, BMP’ler ve FGF’ler 1,9 dahil olmak üzere in vivo gelişime benzer çeşitli büyüme faktörleriyle serebellar kaderi indükledi. Daha yeni yayınlanan protokoller, öncelikle FGF2 ve insülin ile 3D organoid kültüründe farklılaşmaya neden oldu, ardından eşkenar dörtgen dudak benzeri yapılar3,4 için FGF19 ve SDF1 izledi veya FGF2, FGF4 ve FGF85’in bir kombinasyonunu kullandı. Her iki serebellar organoid indüksiyon yöntemi de benzer 3D serebellar organoidlerle sonuçlandı, çünkü her iki protokol de aynı zaman noktalarında benzer serebellar belirteç ekspresyonu bildirdi. Holmes ve Heine, 2D serebellar hücrelerin 3D agregalar olarak başlayan hESC’lerden ve iPSC’lerden üretilebileceğini göstermek için 3D protokol5’lerini genişletti. Ek olarak, Silva ve ark.7, 2D’deki olgun serebellar nöronları temsil eden hücrelerin, 3B’den 2B’ye geçmek ve büyüme ve olgunlaşma süresini uzatmak için farklı bir zaman noktası kullanarak, Holmes ve Heine’e benzer bir yaklaşımla üretilebileceğini göstermiştir.

Mevcut protokol, insülin ve FGF2 kullanarak serbest yüzen embriyoid cisimler (EB’ler) üreterek ve daha sonra EB’leri 2D büyüme ve farklılaşma için 14. günde FK / laminin kaplı tabaklara kaplayarak besleyicisiz iPSC’lerde serebellar kaderi indüklemektedir. 35. günde, serebellar kimliğe sahip hücreler elde edilir. Serebellar gelişimin erken aşamalarını, özellikle 2D bir ortamda, özetleme yeteneği, araştırmacıların tek katmanlı bir yapı ile deneyler gerektiren belirli soruları cevaplamalarını sağlar. Bu protokol aynı zamanda istenen hücre popülasyonlarını zenginleştirmek için mikro desenli yüzeyler, aksonal büyüme testleri ve hücre sıralama gibi daha ileri modifikasyonlara da uygundur.

Protocol

İnsan denekleri araştırması, 201805995 Iowa Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu onay numarası ve Iowa Üniversitesi İnsan Pluripotent Kök Hücre Komitesi onay numarası 2017-02 altında onaylanmıştır. Deneklerden deri biyopsileri yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra alındı. Fibroblastlar DMEM’de fetal sığır serumu (FBS) ve %1 MEM-esansiyel olmayan amino asit solüsyonu ile 37 °C’de ve %5 CO2’de kültürlendi. Fibroblastlar, elektroporasyon için bir nükleofektör kullanı…

Representative Results

3B’den 2B’ye serebellar farklılaşmaya genel bakışSerebellar hücreler iPSC’lerden başlayarak üretilir. Şekil 1A , genel iş akışını ve farklılaştırma için ana bileşenlerin eklenmesini göstermektedir. 0. günde, EB’ler, SB431542 ve Y-27632 içeren CDM’de çekilmiş bir cam pipet kullanılarak iPSC kolonilerinin yavaşça kaldırılmasıyla yapılır (Şekil 1B) ve ultra düşük ataşmanlı plakalara yerleştirilir. FGF2, 2. …

Discussion

İnsan serebellar gelişimini in vitro olarak modelleme yeteneği, hastalık modellemesi için ve normal beyin gelişiminin anlaşılmasını ilerletmek için önemlidir. Daha az karmaşık ve uygun maliyetli protokoller, çoğaltılabilir veri üretimi ve birden fazla bilimsel laboratuvarda geniş uygulama için daha fazla fırsat yaratır. Burada, Muguruma ve ark. tarafından bildirilen büyüme faktörleri kullanılarak, enzimler veya ayrışma ajanları gerektirmeyen EB’ler üretmek için modifiye edilmiş b…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Jenny Gringer Richards’a, kontrol iPSC’lerini oluşturduğumuz kontrol konularımızı doğrulamadaki kapsamlı çalışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH T32 MH019113 (D.A.M. ve K.A.K.’ya), Nellie Ball Trust (T.H.W. ve A.J.W.’ye), nih R01 MH111578 (V.A.M. ve J.A.W.’ye), nih KL2 TR002536 (A.J.W.’ye) ve Roy J. Carver Charitable Trust (V.A.M., J.A.W. ve A.J.W.) tarafından desteklenmiştir. Figürler BioRender.com ile yaratıldı.

Materials

10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum – Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90×250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

References

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -. M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).

Play Video

Cite This Article
Madencioglu, D. A., Kruth, K. A., Wassink, T. H., Magnotta, V. A., Wemmie, J. A., Williams, A. J. Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure. J. Vis. Exp. (187), e64462, doi:10.3791/64462 (2022).

View Video