Summary
Hier beschrijven we de methode voor het vaststellen van een drievoudig celkweekmodel van de bloed-hersenbarrière op basis van primaire microvasculaire endotheelcellen, astrocyten en pericyten van de menselijke hersenen. Dit meercellige model is geschikt voor studies van neurovasculaire eenheidsdisfunctie tijdens ischemische beroerte in vitro of voor de screening van kandidaat-geneesmiddelen.
Abstract
Ischemische beroerte is wereldwijd een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit met beperkte therapeutische opties. De neuropathologie van ischemische beroerte wordt gekenmerkt door een onderbreking van de bloedtoevoer naar de hersenen, wat leidt tot celdood en cognitieve disfunctie. Tijdens en na ischemische beroerte vergemakkelijkt bloed-hersenbarrière (BBB) disfunctie de progressie van letsel en draagt bij aan slecht herstel van de patiënt. Huidige BBB-modellen omvatten voornamelijk endotheelmonoculturen en dubbele coculturen met astrocyten of pericyten.
Dergelijke modellen missen het vermogen om een dynamische micro-omgeving van de hersenen volledig te imiteren, wat essentieel is voor cel-tot-cel communicatie. Bovendien bevatten veelgebruikte BBB-modellen vaak vereeuwigde menselijke endotheelcellen of van dieren afgeleide (knaagdier-, varkens- of runderen) celculturen die translationele beperkingen vormen. Dit artikel beschrijft een nieuw goed ingebracht BBB-model dat alleen primaire menselijke cellen bevat (hersenmicrovasculaire endotheelcellen, astrocyten en vasculaire pericyten in de hersenen) die het onderzoek van ischemisch hersenletsel in vitro mogelijk maakt.
De effecten van zuurstof-glucosedeprivatie (OGD) op de integriteit van de barrière werden beoordeeld door passieve permeabiliteit, transendotheliale elektrische weerstand (TEER) metingen en directe visualisatie van hypoxische cellen. Het gepresenteerde protocol biedt een duidelijk voordeel bij het nabootsen van de intercellulaire omgeving van de BBB in vivo, en dient als een realistischer in vitro BBB-model voor het ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën in de setting van ischemisch hersenletsel.
Introduction
Beroerte is wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken en langdurige invaliditeit1. De incidentie van beroerte neemt snel toe met de leeftijd en verdubbelt elke 10 jaar na de leeftijd van 552. Ischemische beroerte treedt op als gevolg van verstoring van de cerebrale bloedstroom als gevolg van trombotische en embolische gebeurtenissen, die meer dan 80% van alle gevallen van beroerte omvat3. Zelfs nu zijn er relatief weinig behandelingsopties beschikbaar om weefseldood na ischemische beroerte te minimaliseren. De behandelingen die er wel zijn, zijn tijdgevoelig en leiden bijgevolg niet altijd tot goede klinische resultaten. Daarom is onderzoek naar complexe cellulaire mechanismen van ischemische beroerte die het herstel na een beroerte beïnvloeden dringend nodig.
De BBB is een dynamische interface voor de uitwisseling van moleculen tussen het bloed en het hersenparenchym. Structureel bestaat de BBB uit microvasculaire endotheelcellen van de hersenen die onderling verbonden zijn door junctionele complexen omgeven door een keldermembraan, pericyten en astrocytische endfeet4. Pericyten en astrocyten spelen een essentiële rol bij het behoud van de integriteit van BBB door de afscheiding van verschillende factoren die nodig zijn voor de vorming van sterke, tight junctions 5,6. De afbraak van de BBB is een van de kenmerken van ischemische beroerte. Acute ontstekingsreactie en oxidatieve stress geassocieerd met cerebrale ischemie resulteert in de verstoring van tight junction eiwitcomplexen en ontregelde overspraak tussen astrocyten, pericyten en endotheelcellen, wat leidt tot verhoogde paracellulaire opgeloste permeabiliteit over de BBB7. BBB-disfunctie bevordert verder de vorming van hersenoedeem en verhoogt het risico op hemorragische transformatie8. Gezien al het bovenstaande is er grote interesse in het begrijpen van de moleculaire en cellulaire veranderingen die optreden op BBB-niveau tijdens en na ischemische beroerte.
Hoewel veel in vitro BBB-modellen de afgelopen decennia zijn ontwikkeld en in verschillende onderzoeken zijn gebruikt, kan geen van hen in vivo omstandigheden volledig repliceren9. Hoewel sommige modellen gebaseerd zijn op endotheelcelmonolagen gekweekt op goed ingebrachte permeabele steunen alleen of in combinatie met pericyten of astrocyten, hebben alleen recentere studies drievoudige celkweekmodelontwerpen geïntroduceerd. Bijna alle bestaande BBB-modellen met drievoudige cultuur bevatten primaire hersen endotheelcellen samen met astrocyten en pericyten geïsoleerd uit diersoorten of cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen 10,11,12,13.
Erkennend de noodzaak om de menselijke BBB in vitro beter samen te vatten, hebben we een drievoudig celkweek in vitro BBB-model opgezet dat bestaat uit microvasculaire endotheelcellen (HBMEC), primaire menselijke astrocyten (HA) en primaire vasculaire pericyten van de menselijke hersenen (HBVP). Dit BBB-model met drie kweken is opgesteld op 6-wells plaat, polyester membraaninzetstukken met een poriegrootte van 0,4 μm. Deze putinzetstukken bieden een optimale omgeving voor celaanhechting en bieden gemakkelijke toegang tot zowel apicale (bloed) als basolaterale (hersenen) compartimenten voor mediumbemonstering of samengestelde toepassing. De kenmerken van dit voorgestelde BBB-model met drievoudige celcultuur worden beoordeeld door teer en paracellulaire flux na OGD te meten die ischemische beroerte in vitro nabootst, met een tekort aan zuurstof (<1% O2) en voedingsstoffen (met behulp van glucosevrij medium) bereikt door een bevochtigde, afgesloten kamer te gebruiken. Bovendien worden geïnduceerde ischemische-achtige aandoeningen in dit model nauwkeurig geverifieerd door directe visualisatie van hypoxische cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle cellen, materialen, apparatuur en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Drievoudige celcultuur BBB-modelinstelling
- Zaaien van pericyten
- Kweek HBVP in T75 kweekkolven met een geactiveerd oppervlak voor celhechting in een 5% CO2-incubator bij 37 °C tot confluent. Zodra de samenvloeiing is bereikt, ademt u het oude pericytenmedium aan en wast u de cellen met 5 ml warme Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Adem de DPBS op en maak de cellen los van de kolf met een combinatie van 4 ml warme trypsine-EDTA-oplossing en 1 ml DPBS.
OPMERKING: Vermijd het gebruik van passages later dan P7. - Incubeer de kolf gedurende 5 minuten bij 37 °C in een CO2-incubator . Bekijk onder een microscoop of de cellen los zijn van de kolf. Voeg 5 ml warm pericytenmedium (met 2% foetaal runderserum [FBS]) toe aan de kolf en breng de losgemaakte cellen over naar een centrifugebuis van 50 ml.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 200 × g, zodat de cellen een pellet kunnen vormen in de bodem van de buis. Aspirateer het medium uit de buis en zorg ervoor dat de celpellet intact blijft.
- Resuspendeer de celkorrel in pericytenmedium; bereken de hoeveelheid medium afhankelijk van de samenvloeiing van de cellen en het aantal benodigde putinzetstukken. Neem 10 μL van de geresuspendeerde cellen, plaats ze in een celteldia en tel het aantal cellen.
- Bepaal de celdichtheid en zaai 300.000 cellen / insert in 1 ml pericytenmedium op de abluminale kant van de putinzetstukken (6-well formaat).
OPMERKING: Bij het zaaien van HBVP aan de onderkant van inserts, is het erg belangrijk om eerst de put-insert platen ondersteboven te draaien. Terwijl de plaat plat op een oppervlak wordt gelegd, verwijdert u het onderste gedeelte om de abluminale kant van de putinzetstukken bloot te leggen. Nadat u pericytencelsuspensie aan de abluminale kant hebt toegevoegd, bedekt u de putinzetstukken met de omgedraaide plaat om verdamping te voorkomen. Houd alle platen ondersteboven in een 5% CO2-incubator bij 37 °C 's nachts.
- Kweek HBVP in T75 kweekkolven met een geactiveerd oppervlak voor celhechting in een 5% CO2-incubator bij 37 °C tot confluent. Zodra de samenvloeiing is bereikt, ademt u het oude pericytenmedium aan en wast u de cellen met 5 ml warme Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS). Adem de DPBS op en maak de cellen los van de kolf met een combinatie van 4 ml warme trypsine-EDTA-oplossing en 1 ml DPBS.
- Astrocyten zaaien
- Kweek HA in T75-kolven in een CO2-incubator van 5% bij 37 °C totdat de samenvloeiing is bereikt. Volg de bovenstaande stappen 1.1.1-1.1.4 met behulp van astrocytenmedium (dat ook 2% FBS bevat) in plaats van pericytenmedium.
OPMERKING: Vermijd het gebruik van passages later dan P9. - Bepaal de celdichtheid en zaai 300.000 cellen/put op de bodem van de weefselkweek 6-well platen. Bedek de plaat om verdamping te voorkomen en bewaar alle platen in een 5% CO2-incubator bij 37 °C 's nachts.
- Kweek HA in T75-kolven in een CO2-incubator van 5% bij 37 °C totdat de samenvloeiing is bereikt. Volg de bovenstaande stappen 1.1.1-1.1.4 met behulp van astrocytenmedium (dat ook 2% FBS bevat) in plaats van pericytenmedium.
- Zaaien van endotheelcellen
- Kweek HBMEC in weefselkweekschalen in een 5% CO2-incubator bij 37 °C tot confluent. Volg de bovenstaande stappen 1.1.1-1.1.4 met behulp van een volledig klassiek medium (met 10% FBS) in plaats van pericytenmedium.
OPMERKING: Vermijd het gebruik van passages later dan P12. - Verwijder de weefselkweek 6-well platen met astrocyten en de putinzetstukken (6-well formaat) met pericyten uit de 5% CO2 incubator bij 37 °C. Aspirateer het astrocytenmedium uit de weefselkweek 6-well platen. Voeg 1 ml pericytenmedium en 1 ml astrocytenmedium toe aan elk putje.
- Aspirate het pericytenmedium uit de putinzetstukken en plaats ze in de weefselkweek 6-well platen met de gezaaide astrocyten. Zaai HBMEC met een dichtheid van 300.000 cellen/put in 2 ml compleet klassiek medium aan de apicale kant van dezelfde putinzetstukken.
OPMERKING: De endotheelcellen moeten de volgende dag aan de apicale kant van de putinzetstukken worden gezaaid na het zaaien van pericyten aan de abluminale kant van de putinzetstukken en astrocyten op weefselkweek 6-well platen. Cellen moeten gedurende 6 dagen in drievoudige cultuur worden gehouden om BBB-achtige eigenschappen te induceren. Het celkweekmedium moet 24 uur voorafgaand aan experimenten in beide goed ingebrachte compartimenten worden vervangen.
- Kweek HBMEC in weefselkweekschalen in een 5% CO2-incubator bij 37 °C tot confluent. Volg de bovenstaande stappen 1.1.1-1.1.4 met behulp van een volledig klassiek medium (met 10% FBS) in plaats van pericytenmedium.
2. Inductie van het zuurstof-glucosedeprivatie
- Was de cellen 3x met DPBS. Voeg voor drievoudige celculturen die worden blootgesteld aan OGD het glucosevrije medium (zonder L-glutamine en fenolrood) toe aan zowel de apicale als de basolaterale compartimenten. Vervang het kweekmedium door vers medium in normoxische controlecelculturen. Plaats controle drievoudige culturen in de 5% CO2 incubator bij 37 °C.
OPMERKING: Gemiddelde veranderingen voorafgaand aan de inductie van OGD of onmiddellijk na OGD kunnen mechanische stress veroorzaken die de monolagen van de endotheelcellen verder zou beïnvloeden. Zo zijn de stappen met mediumvervanging opgenomen voor normoxische controlecelculturen. - Plaats een petrischaal met 20 ml steriel water in de hypoxie-incubatorkamer om voldoende bevochtiging van de culturen te bieden. Open de kamer door de ringklem los te maken. Rangschik de celculturen op de planken. Sluit de kamer af door de ringklem vast te zetten.
- Open zowel de inlaat- als de uitlaatpoorten van de kamer. Bevestig de buis die van de bovenkant van de stroommeter komt aan de kamer. Bevestig de buizen die van de onderkant van de stroommeter komen aan de gastank met het gasmengsel van 95% N2/5% CO2 via een luchtfilter.
- Open de tankdebietregelklep door deze tegen de klok in te draaien om een minimale gasstroom mogelijk te maken. Open langzaam het drukregelventiel door met de klok mee te draaien.
- Spoel de kamer met het gasmengsel met een debiet van 20 L/min gedurende 5 min. Koppel de kamer los van de gasbron en sluit beide witte plastic klemmen stevig af.
- Schakel de tankdebietregelklep uit door met de klok mee te draaien. Sluit het drukregelventiel door tegen de klok in te draaien.
- Plaats de hypoxiekamer gedurende 4 uur in een conventionele incubator bij 37 °C.
OPMERKING: Voor het toevoegen van de volgende reoxygenatieperiode, was de cellen 3x met DPBS, voeg vers medium toe in alle drievoudige culturen en bewaar nog eens 24 uur in de 5% CO2-incubator bij 37 °C. Volgens de instructies van de fabrikant is de zuurstofconcentratie die in de kamer achterblijft 0% na niet minder dan 4 minuten purgeren met anaeroob gasmengsel bij 20 l/min.
3. TEER-metingen
- Plaats het gesteriliseerde TEER-instrument in de bioveiligheidskast en sluit de elektroden aan op de epitheliale voltohmmeter. Steriliseer de elektroden in 30 ml 70% isopropylalcoholoplossing gedurende minimaal 30 minuten.
- Schakel het TEER-instrument in en stel de functie in op ohm.
- Verwijder de elektroden uit de 70% isopropylalcoholoplossing en plaats ze in 20 ml DPBS gedurende minimaal 30 minuten totdat de digitale uitlezing op het TEER-apparaat 0 ohm leest.
- Steek de lange pen van de elektrode door een van de drie openingen in de putinzethanger van de lege putinzetbediening en laat deze zakken totdat deze de bodem van de put raakt. Zorg ervoor dat de korte pen boven de apicale cultuur op de bodem van de putinzet rust.
OPMERKING: De blanco putinzetregeling bestaat uit 2 ml volledig klassiek medium in het apicale compartiment en een combinatie van 1 ml pericytenmedium en 1 ml astrocytenmedium in het basolaterale compartiment. Controleer of de elektroden op 90° ten opzichte van het putelement worden gehouden tijdens het uitvoeren van de TEER-meting. Het gebruik van het gemiddelde van twee of drie metingen verkregen in dezelfde put (per opening) kan helpen om de variabiliteit te verminderen. - Wacht tot de digitale uitleeswaarden op het TEER-instrument afvlakken voordat u de waarde registreert. Plaats de elektroden terug in DPBS om ze tussen de metingen door te wassen. Blijf alle TEER-metingen verzamelen voor nog twee lege putinzetregelaars.
- Verzamel de TEER-metingen van de monsterplaten met behulp van stap 3.4-3.5 voor de controlemetingen. Zodra alle metingen zijn uitgevoerd, plaatst u de elektrode gedurende 30 minuten terug in de 70% isopropylalcoholoplossing. Koppel de elektroden los van het TEER-instrument en laat ze aan de lucht drogen.
- Bereken de TEER-waarden. Gebruik vergelijking (1) om de gemiddelde ohmwaarde van de blanco putinzetregelaar af te trekken van de ohmwaarde van het monster en vermenigvuldig deze weerstandswaarde vervolgens met het oppervlak van het membraaninzetstuk (cm2) om de gerapporteerde TEER-waarde in Ω∙cm2 te geven.
(1)
(1)4. Beoordeling van de paracellulaire permeabiliteit van BBB
OPMERKING: Voer alle stappen met FITC-dextran uit in een bioveiligheidskast voor celkweek met de lichten uitgeschakeld. Bedek de FITC-dextran oplossingen met aluminiumfolie om fotobleaching te minimaliseren.
- Bereid oplossingen die FITC-dextrans van 20 en 70 kDa (0,1 mg/ml) bevatten met behulp van fenol roodvrij endotheelcelgroeimedium en laat gedurende 1 uur roeren op een schommelende platformschudder. Filtreer de oplossingen met een spuitfilter van 0,22 μm.
- Zuig het medium op uit het basolaterale compartiment en vervang het door 2 ml fenol roodvrij endotheelcelgroeimedium in het BBB-model met drievoudige celcultuur. Was de cellen in het apicale compartiment tweemaal met hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS).
- Voeg 1 ml van de FITC-dextran-oplossing toe in het apicale compartiment en bedek de plaat met aluminiumfolie. Plaats de plaat in een 5% CO2-incubator bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Neem 100 μL medium uit de basolaterale compartimenten en breng het over in een zwarte 96-well plaat. Meet de fluorescentie met behulp van een microplaatlezer met de excitatie- en emissiegolflengten ingesteld op respectievelijk 480 nm en 530 nm.
5. Detectie van hypoxie in levende cellen
- Zaad 200 μL HBMEC, HA en HBVP in het midden van poly-d-lysine-gecoate, 35 mm glazen bodemschotels met een dichtheid van 150.000 cellen / schotel. Voordat u HBMEC zaait, bedekt u de bodem van de gerechten met de aanhechtingsfactor. Laat de cellen zich hechten aan het glasoppervlak door ze een nacht bij 37 °C in een CO2-incubator te laten zitten.
OPMERKING: Het is belangrijk om gerechten met menselijke primaire cellen tegelijkertijd met een drievoudig goed ingebracht BBB-model in een hypoxiekamer voor OGD te plaatsen. - Zodra de confluentie is bereikt, gooit u het kweekmedium weg en voegt u 2 ml voorgewarmd glucosevrij medium (voor OGD) of normaal medium (voor controles) toe dat 2 μL 1 mM Hoechst 33342 (eindconcentratie 0,2 μM) en 0,5 μL 5 mM stamoplossing van het referentiemiddel Image-iT groene hypoxiereagens bevat (eindconcentratie 1 μM). Vervang na de OGD-behandeling het medium door een voor beeldvorming geoptimaliseerd medium in alle gerechten.
- Voer fluorescentie live-cell imaging uit met het GFP-filter en de top-stage confocale microscoop incubator zoals eerder beschreven14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de effecten van astrocyten en pericyten op de barrièrefunctie van HBMEC te onderzoeken, construeerden we het triple cell culture BBB-model op celkweekinzetstukken (figuur 1A) samen met HBMEC-monocultuur en twee dubbele co-kweekmodellen als controles (figuur 1B). Dubbele co-kweekcontroles omvatten een contactloze cocultuur van HBMEC met HA en contactcocultuur van HBMEC met HBVP. Na 6 dagen in co-kweek werden alle experimentele opstellingen gedurende 4 uur onderworpen aan OGD. De barrière-integriteit van de endotheelmonolaag in de aangegeven BBB-configuraties werd beoordeeld door TEER te bepalen vóór en na OGD, evenals na 24 uur reoxygenatie (figuur 1C). Gedurende 4 uur veroorzaakte de OGD alleen een significante afname van teer-waarden in HBMEC-monocultuur en het cocultuurmodel met HBMEC en HBVP. Deze verlaagde niveaus bereikten de uitgangswaarden na 24 uur reoxygenatie. Geen enkel effect van OGD op het co-kweekmodel met HBMEC en HA wees op de beschermende rol van astrocyten tegen ischemische aandoeningen in vitro.
Hoewel er geen verschil was in baseline TEER tussen triple en HBMEC/HBVP double co-culture modellen, waren de TEER waarden in het triple co-culture model significant hoger dan die in de dubbele co-culture controls of monocultuur control direct na OGD, wat suggereert dat integratie van HA en HBVP in het triple BBB model een cruciale rol speelt bij het handhaven van de BBB functionele integriteit onder pathologische omstandigheden (Figuur 1C ). We onderzochten ook de permeabiliteit van kleine (20 kDa) en grote (70 kDa) moleculaire massa FITC-dextrans over de endotheelmonolaag in het ontwikkelde triple kweekmodel. De paracellulaire permeabiliteit van endotheelmonolagen tot 20 kDa moleculaire massa FITC-dextran was drastisch verhoogd in HBMEC monocultuur en in mindere mate in het co-kweekmodel met HBMEC en HBVP in vergelijking met normoxische controles (figuur 1D). Bovendien waren de permeabiliteitsniveaus van 20 kDa FITC-dextran de laagste in het triple BBB-model van alle modellen onder normoxische en OGD-omstandigheden. Er werden geen veranderingen waargenomen in 70 kDa FITC-dextran flux over endotheel monolagen in een van de modellen (figuur 1E). Deze gegevens suggereren dat ischemisch-hypoxische schade niet zo ernstig was om veranderingen in paracellulaire permeabiliteit voor grote moleculen zoals plasma-eiwitten te veroorzaken.
Figuur 1: Effecten van zuurstof-glucosedeprivatie op transendotheliale elektrische weerstand en endotheelpermeabiliteit in menselijke primaire mono-, co- en triple-cultuur BBB-modellen. (A) Schematische tijdlijn voor de instelling van het drievoudige primaire celkweek BBB-model. (B) Schematische representaties van de configuraties voor in vitro statische humane primaire cel-gebaseerde BBB-modellen. Een monocultuurmodel bevat HBMEC gezaaid aan de apicale kant van het poreuze membraan. Een contactloze co-kweek bevat HBMEC gezaaid op het bovenoppervlak van de put-insert ondersteuning en HA gezaaid aan de onderkant van de kweekput. Een contact co-kweekmodel omvat HBVP gezaaid op het onderste oppervlak van de put-insert ondersteuning met HBMEC op het bovenoppervlak. Voor het drievoudige kweekmodel wordt HBMEC gezaaid op het bovenste oppervlak van de steun met HBVP gezaaid op het onderste oppervlak en HA gezaaid op de bodem van de kweekputten. (C) Veranderingen in TEER gemonitord onmiddellijk vóór OGD, na 4 uur OGD en na 24 uur reoxygenatie. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 5-6). P < 0,0001 in vergelijking met mono- en co-kweekmodellen (tweeweg ANOVA). (D) Paracellulaire permeabiliteit tot 20 kDa FITC-dextran over endotheel monolagen werd gemeten na 4 uur OGD. (E) Paracellulaire permeabiliteit tot 70 kDa FITC-dextran over endotheel monolagen werd gemeten na 4 uur OGD. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 5-6). *P < 0,05. P < 0,0001 (tweeweg ANOVA). Afkortingen: OGD = zuurstof-glucosedeprivatie; TEER = transendotheliale elektrische weerstand; HBMEC = menselijke hersenen microvasculaire endotheelcellen; HA = menselijke astrocyten; HBVP = vasculaire pericyten in de menselijke hersenen; FITC-dextran = dextran geconjugeerd tot fluoresceïne-isothiocyanaat; Arb. eenheden = willekeurige eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om OGD-geïnduceerde hypoxische schade te verifiëren, werden HBMEC, HA en HBVP gekweekt in de putten van 35 mm glazen bodemschotels en geladen met het hypoxie-reagens, waarvan het fluorescerende signaal toenam met verlaagd zuurstofgehalte. Alle primaire menselijke typen die aan OGD werden blootgesteld, vertoonden sterke groene fluorescentie, wat bewijst dat de afgebeelde levende cellen hypoxisch waren (figuur 2). Na het schatten van de effecten van het hebben van verschillende perivasculaire celtypen (astrocyten en pericyten), of hun combinatie in het BBB-model op de barrière-eigenschappen volgens een OGD-protocol, concludeerden we dat het drievoudige model superieur was aan de andere geteste BBB-modellen.
Figuur 2: Levende kleuring van hypoxische primaire menselijke hersenen microvasculaire endotheelcellen, menselijke astrocyten en vasculaire pericyten van de menselijke hersenen na 4 uur zuurstof-glucosedeprivatie. OGD-blootstellingen werden uitgevoerd op alle primaire cellen (HBMEC, HA en HBVP) met behulp van een hypoxie-reagens en glucosevrij medium gedurende 4 uur. Resultaten van vier onafhankelijke experimenten worden getoond. Culturen werden afgebeeld met een vergroting van 20x. Schaalstaven = 100 μm. Afkortingen: OGD = zuurstof-glucosedeprivatie; HBMEC = menselijke hersenen microvasculaire endotheelcellen; HA = menselijke astrocyten; HBVP = vasculaire pericyten in de menselijke hersenen; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol beschrijven we een methode om een betrouwbaar drievoudig endotheelcel-pericyten-astrocytenkweek BBB-model op te zetten voor het bestuderen van BBB-disfunctie in de setting van ischemische beroerte in vitro. Gezien het feit dat pericyten in vivo de dichtstbijzijnde buren van endotheelcellen zijn, zijn HBVP in dit model16 aan de onderkant van de putinzetstukken geplaatst. Hoewel deze configuratie de directe cel-naar-cel communicatie tussen astrocyten en endotheelcellen mist, maakt deze opstelling indirecte cel-naar-cel communicatie tussen celtypen mogelijk via uitgescheiden oplosbare factoren. De aanwezigheid van astrocyten en pericyten in dit systeem verbetert de HBMEC-integriteit aanzienlijk, waardoor de paracellulaire permeabiliteit van de monolaag wordt beperkt tot tracers van kleine afmetingen. Bovendien hebben astrocyten en pericyten een beschermend effect op HBMEC in OGD-omstandigheden.
In het ontwikkelde protocol hebben we de celverhouding (1:1:1) en het kweekmediummengsel voor het basolaterale compartiment geoptimaliseerd. Het triple BBB-model vertoonde bijna 2,5x hogere TEER-waarden (239 ± 9 Ω·cm2) dan de controle HBMEC monocultuur (112 ± 11 Ω·cm2) na 6 dagen co-culturing, de tijd die nodig is voor de juiste HBMEC monolaagvorming17,18. De TEER-waarden die in dit drievoudige model worden bereikt, zijn vergelijkbaar met die in het andere eerder beschreven drievoudige model, waarbij HA in contact kwam met HBMEC en HBVP op de bodem van de plaatputten werd gezaaid19. In het andere menselijke primaire cel triple kweekmodel met dezelfde celconfiguratie en OGD-blootstellingstijd waren de baseline TEER-waarden aanzienlijk lager dan die in dit werk en bereikten ze niet de standaardniveaus (100 Ω·cm2)20. Het gebruik van 6-well-insert platen met grotere compartimenten stelde ons in staat om de gemiddelde veranderingsfrequentie te verlagen om de verstoring van de uitwisseling van stoffen tussen de celpopulaties te voorkomen.
OGD-experimenten werden uitgevoerd met behulp van een verzegelde hypoxie-incubatorkamer met een anaeroob gasmengsel (95% stikstof en 5% koolstofdioxide). Een van de belangrijkste voordelen van dit protocol is dat de ernst van de ischemische verwonding eenvoudig kan worden aangepast aan specifieke behoeften door de lengte van de OGD-periode te variëren. Na evaluatie van de TEER- en dextran-permeabiliteit bracht 4 uur OGD de BBB-integriteit in het geconstrueerde drievoudige model niet in gevaar. Daarom moet, om ischemische beroerte in vitro te bestuderen, een langere blootstelling aan OGD worden toegepast om BBB-afbraak te induceren. Live-cell imaging, voorzien in het protocol, maakt real-time monitoring van verschillende celtypen en verificatie van OGD-letsel mogelijk, wat in veel studies een voordeel is.
In dit protocol is gekozen voor 0,4 μm polyester putinzetstukken als basis voor dit triple BBB model. Een polyestermembraan wordt beschouwd als het beste inserttype voor celvisualisatie in fluorescentiebeeldvormingstoepassingen, wat een uitstekende gelegenheid biedt om indien nodig modificaties van tight junction-eiwitten en transporters te visualiseren. Hoewel de geselecteerde kleine poriediameter een lage permeabiliteit creëert voor kleine hydrofiele moleculen in endotheelmonolagen, beperkt het ook de potentiële toepassing van het huidige drievoudige BBB-model voor transendotheliale migratietests, waarbij poriegroottes van 3 μm of 8 μm vereist zijn.
Ten slotte kan een andere beperking van dit model verband houden met het gebrek aan schuifspanning, waarvan is aangetoond dat het de vorming van tight junctions in dynamische triple BBB in vitro systemenbevordert 21. Kortom, het gevestigde robuuste en fysiologisch relevante triple culture BBB-model, samengesteld uit primaire menselijke cellen, vormt een waardevol hulpmiddel voor medicijnscreening en het bestuderen van BBB-disfunctie geassocieerd met ischemische beroerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs onthulden dat er geen belangenconflicten zijn.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 en DA047157.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
