Summary
Her beskriver vi metoden for å etablere en trippelcellekulturmodell av blod-hjernebarrieren basert på primære humane hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og pericytter. Denne flercellede modellen er egnet for studier av dysfunksjon i nevrovaskulære enheter under iskemisk hjerneslag in vitro eller for screening av legemiddelkandidater.
Abstract
Iskemisk hjerneslag er en viktig årsak til død og uførhet over hele verden med begrensede terapeutiske muligheter. Nevropatologien til iskemisk slag er preget av et avbrudd i blodtilførselen til hjernen som fører til celledød og kognitiv dysfunksjon. Under og etter iskemisk hjerneslag letter blod-hjernebarriere (BBB) dysfunksjon skadeprogresjon og bidrar til dårlig pasientgjenoppretting. Nåværende BBB-modeller inkluderer primært endotelmonokulturer og doble samkulturer med enten astrocytter eller pericytter.
Slike modeller mangler evnen til å etterligne et dynamisk hjernemikromiljø, noe som er avgjørende for celle-til-celle-kommunikasjon. I tillegg inneholder ofte brukte BBB-modeller ofte udødelige humane endotelceller eller dyreavledede (gnagere, svin eller storfe) cellekulturer som utgjør translasjonelle begrensninger. Dette papiret beskriver en ny brønninnsatsbasert BBB-modell som bare inneholder primære humane celler (hjernemikrovaskulære endotelceller, astrocytter og hjernevaskulære pericytter) som muliggjør undersøkelse av iskemisk hjerneskade in vitro.
Effektene av oksygen-glukosemangel (OGD) på barriereintegritet ble vurdert ved passiv permeabilitet, transendotelial elektrisk motstand (TEER) målinger og direkte visualisering av hypoksiske celler. Den presenterte protokollen gir en klar fordel ved å etterligne det intercellulære miljøet til BBB in vivo, og fungerer som en mer realistisk in vitro BBB-modell for å utvikle nye terapeutiske strategier i innstillingen av iskemisk hjerneskade.
Introduction
Hjerneslag er en av de viktigste årsakene til død og langsiktig uførhet over hele verden1. Forekomsten av hjerneslag øker raskt med alderen, og dobles hvert 10. år etter fylte 55år. Iskemisk hjerneslag oppstår som følge av cerebral blodstrømforstyrrelse på grunn av trombotiske og emboliske hendelser, som omfatter mer enn 80% av alle slagtilfeller3. Selv nå er det relativt få behandlingsalternativer tilgjengelig for å minimere vevsdød etter iskemisk slag. Behandlingene som finnes er tidssensitive og fører følgelig ikke alltid til gode kliniske resultater. Derfor er det behov for forskning på komplekse cellulære mekanismer for iskemisk slag som påvirker poststroke-utvinning.
BBB er et dynamisk grensesnitt for utveksling av molekyler mellom blodet og hjernen parenchyma. Strukturelt består BBB av hjernemikrovaskulære endotelceller sammenkoblet av krysskomplekser omgitt av en kjellermembran, pericytter og astrocytiske endfeet4. Pericytter og astrocytter spiller en viktig rolle i opprettholdelsen av BBB-integritet gjennom sekresjon av ulike faktorer som er nødvendige for dannelsen av sterke, tette kryss 5,6. Fordelingen av BBB er et av kjennetegnene ved iskemisk slag. Akutt inflammatorisk respons og oksidativt stress assosiert med cerebral iskemi resulterer i forstyrrelse av tette kryssproteinkomplekser og dysregulert krysstale mellom astrocytter, pericytter og endotelceller, noe som fører til økt paracellulær løsemiddelpermeabilitet over BBB7. BBB-dysfunksjon fremmer videre dannelsen av hjerneødem og øker risikoen for hemorragisk transformasjon8. Tatt i betraktning alt ovenfor, er det stor interesse for å forstå de molekylære og cellulære endringene som oppstår på BBB-nivå under og etter iskemisk slag.
Selv om mange in vitro BBB-modeller har blitt utviklet de siste tiårene og brukt i en rekke studier, kan ingen av dem fullt ut replikere in vivo-forhold 9. Mens noen modeller er basert på endotelcellemonolag dyrket på godt innsatte permeable støtter alene eller i kombinasjon med pericytter eller astrocytter, har bare nyere studier introdusert trippelcellekulturmodelldesign. Nesten alle eksisterende trippelkultur BBB-modeller inkorporerer primære hjerneendotelceller sammen med astrocytter og pericytter isolert fra dyrearter eller celler avledet fra humane pluripotente stamceller10,11,12,13.
Ved å erkjenne behovet for å bedre rekapitulere den humane BBB in vitro, etablerte vi en trippelcellekultur in vitro BBB-modell sammensatt av humane hjernemikrovaskulære endotelceller (HBMEC), primære humane astrocytter (HA) og primære vaskulære pericytter i humanhjernen (HBVP). Denne trippelkulturen BBB-modellen er satt opp på 6-brønns plate, polyestermembraninnsatser med 0,4 μm porestørrelse. Disse brønninnsatsene gir et optimalt miljø for cellefeste og gir enkel tilgang til både apikale (blod) og basolaterale (hjerne) rom for middels prøvetaking eller sammensatt applikasjon. Funksjonene i denne foreslåtte trippelcellekultur BBB-modellen vurderes ved å måle TEER og paracellulær fluks etter OGD som etterligner iskemisk slag in vitro, med mangel på oksygen (<1% O2) og næringsstoffer (ved bruk av glukosefritt medium) oppnådd ved bruk av et fuktet, forseglet kammer. I tillegg er induserte iskemisklignende forhold i denne modellen nøyaktig verifisert ved direkte visualisering av hypoksiske celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se materialtabellen for detaljer relatert til alle celler, materialer, utstyr og løsninger som brukes i denne protokollen.
1. Trippel cellekultur BBB-modellinnstilling
- Såing pericytter
- Dyrk HBVP i T75 kulturflasker med en aktivert overflate for celleadhesjon innenfor en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C til den er sammenflytende. Når sammenløp er nådd, aspirer det gamle pericyttmediet og vask cellene med 5 ml varm Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS). Aspirer DPBS og løsne cellene fra kolben ved hjelp av en kombinasjon av 4 ml varm trypsin-EDTA-løsning og 1 ml DPBS.
MERK: Unngå å bruke passasjer senere enn P7. - Inkuber kolben i 5 minutter ved 37 °C i en CO 2-inkubator. Se under et mikroskop for å bekrefte om cellene er løsrevet fra kolben. Tilsett 5 ml varmt pericyttmedium (inneholdende 2% føtalt bovint serum [FBS]) til kolben og overfør de frittliggende cellene til et 50 ml sentrifugerør.
- Sentrifuge cellesuspensjonen i 3 minutter ved 200 × g, slik at cellene kan danne en pellet i bunnen av røret. Aspirer mediet fra røret, slik at cellepelleten forblir intakt.
- Resuspend cellepelleten i pericyttmedium; Beregn mengden medium avhengig av sammenløpet av cellene og antall brønninnsatser som trengs. Ta 10 μL av de resuspenderte cellene, plasser dem i et celletellingslysbilde og tell antall celler.
- Bestem celletetthet og frø 300 000 celler / sett inn i 1 ml pericyttmedium på abluminalsiden av brønninnsatsene (6-brønnformat).
MERK: Når du sår HBVP på undersiden av innsatsene, er det veldig viktig å først snu brønninnsatsplatene opp ned. Mens platen legges flatt på en overflate, fjern den nederste delen for å eksponere den abluminale siden av brønninnsatsene. Etter tilsetning av pericyttcellesuspensjon på abluminalsiden, dekk brønninnsatsene med den vendte platen for å forhindre fordampning. Hold alle platene snudd på hodet i en 5 % CO2 inkubator ved 37 °C over natten.
- Dyrk HBVP i T75 kulturflasker med en aktivert overflate for celleadhesjon innenfor en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C til den er sammenflytende. Når sammenløp er nådd, aspirer det gamle pericyttmediet og vask cellene med 5 ml varm Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS). Aspirer DPBS og løsne cellene fra kolben ved hjelp av en kombinasjon av 4 ml varm trypsin-EDTA-løsning og 1 ml DPBS.
- Såing astrocytter
- Dyrk HA i T75-flasker innenfor en 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C til samløpet er nådd. Følg trinnene ovenfor 1.1.1-1.1.4 ved å bruke astrocyttmedium (inneholder også 2% FBS) i stedet for pericyttmedium.
MERK: Unngå å bruke passasjer senere enn P9. - Bestem celletetthet og frø 300.000 celler / brønn på bunnen av vevskulturen 6-brønnsplater. Dekk platen for å forhindre fordampning og hold alle platene i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C over natten.
- Dyrk HA i T75-flasker innenfor en 5 % CO 2-inkubator ved 37 °C til samløpet er nådd. Følg trinnene ovenfor 1.1.1-1.1.4 ved å bruke astrocyttmedium (inneholder også 2% FBS) i stedet for pericyttmedium.
- Såing av endotelceller
- Dyrk HBMEC i vevskulturretter innenfor en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C til de er sammenflytende. Følg trinnene ovenfor 1.1.1-1.1.4 ved å bruke komplett klassisk medium (som inneholder 10% FBS) i stedet for pericyttmedium.
MERK: Unngå å bruke passasjer senere enn P12. - Ta ut vevskulturen 6-brønnsplater som inneholder astrocytter og brønninnsatsene (6-brønnformat) som inneholder pericytter fra 5% CO 2-inkubatoren ved 37 °C. Aspirer astrocyttmediet fra vevskulturen 6-brønnsplater. Tilsett 1 ml pericyttmedium og 1 ml astrocyttmedium til hver brønn.
- Aspirer pericyttmediet fra brønninnsatsene og plasser dem i vevskulturen 6-brønnsplater som inneholder de seedede astrocytter. Frø HBMEC med en tetthet på 300 000 celler/brønn i 2 ml komplett klassisk medium på den apikale siden av de samme brønninnsatsene.
MERK: Endotelcellene skal sås på den apikale siden av brønninnsatsene neste dag etter sådd av pericytter på abluminalsiden av brønninnsatsene og astrocytter på vevskultur 6-brønnsplater. Celler bør opprettholdes i trippelkultur i 6 dager for å indusere BBB-lignende egenskaper. Cellekulturmediet bør endres i begge brønninnsatsrommene 24 timer før eksperimenter.
- Dyrk HBMEC i vevskulturretter innenfor en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C til de er sammenflytende. Følg trinnene ovenfor 1.1.1-1.1.4 ved å bruke komplett klassisk medium (som inneholder 10% FBS) i stedet for pericyttmedium.
2. Induksjon av oksygen-glukose deprivasjon
- Vask cellene 3x med DPBS. For trippelcellekulturer utsatt for OGD, tilsett glukosefritt medium (uten L-glutamin og fenolrødt) til både apikale og basolaterale rom. Erstatt kulturmediet med ferskt medium i normoksiske kontrollcellekulturer. Plasser kontroll trippelkulturer i 5% CO2 inkubatoren ved 37 ° C.
MERK: Middels endringer før induksjon av OGD eller umiddelbart etter OGD kan skape mekanisk stress som ytterligere vil påvirke endotelcellemonolagene. Dermed er trinnene med middels erstatning inkludert for normoksiske kontrollcellekulturer. - Plasser en petriskål som inneholder 20 ml sterilt vann i hypoksi-inkubatorkammeret for å gi tilstrekkelig fuktighet av kulturene. Åpne kammeret ved å slippe ringklemmen. Ordne cellekulturene på hyllene. Forsegl kammeret ved å feste ringklemmen.
- Åpne både innløps- og utløpsportene i kammeret. Fest slangen som kommer fra toppen av strømningsmåleren til kammeret. Fest slangen som kommer fra bunnen av strømningsmåleren til bensintanken som inneholder gassblandingen på 95 % N 2/5 % CO2via et luftfilter.
- Åpne tankens strømningskontrollventil ved å vri den mot klokken for å tillate minimal gasstrøm. Åpne trykkregulatorventilen sakte ved å vri med klokken.
- Skyll kammeret med gassblandingen med en strømningshastighet på 20 l/min i 5 minutter. Koble kammeret fra gasskilden og lukk begge hvite plastklemmene godt.
- Slå av tankens strømningskontrollventil ved å vri med klokken. Lukk trykkregulatorventilen ved å vri mot klokken.
- Plasser hypoksikammeret i en konvensjonell inkubator ved 37 °C i 4 timer.
MERK: For å tilsette påfølgende reoksygeneringsperiode, vask cellene 3x med DPBS, tilsett ferskt medium i alle trippelkulturer, og hold i ytterligere 24 timer i 5% CO 2-inkubatoren ved 37 ° C. I henhold til produsentens instruksjoner er oksygenkonsentrasjonen som gjenstår i kammeret 0% etter ikke mindre enn 4 minutter med rensing med anaerob gassblanding ved 20 l / min.
3. TEER-målinger
- Plasser det steriliserte TEER-instrumentet i biosikkerhetsskapet og koble elektrodene til epitelvoltohmmeteret. Steriliser elektrodene i 30 ml 70% isopropylalkoholoppløsning i minst 30 minutter.
- Slå på TEER-instrumentet og sett funksjonen til ohm.
- Fjern elektrodene fra 70% isopropylalkoholoppløsningen og legg dem i 20 ml DPBS i minst 30 minutter til den digitale avlesningen på TEER-enheten leser 0 ohm.
- Sett den lange spissen av elektroden gjennom en av de tre åpningene i brønninnsatshengeren på den tomme brønninnsatskontrollen, senk den til den berører bunnen av brønnen. Forsikre deg om at den korte spissen hviler over den apikale kulturen på bunnen av brønninnsatsen.
MERK: Den blanke brønninnsatskontrollen består av 2 ml komplett klassisk medium i det apikale rommet og en kombinasjon av 1 ml pericyttmedium og 1 ml astrocyttmedium i det basolaterale rommet. Konstaterer at elektrodene holdes 90° til brønninnsatsen mens du tar TEER-målingen. Å bruke gjennomsnittet av to eller tre avlesninger oppnådd i samme brønn (per åpning) kan bidra til å redusere variabiliteten. - Vent til de digitale avlesningsverdiene på TEER-instrumentet flater ut før du registrerer verdien. Plasser elektrodene tilbake i DPBS for å vaske dem mellom målingene. Fortsett å samle alle TEER-målingene for ytterligere to blanke brønninnsatskontroller.
- Samle inn TEER-målingene av prøveplatene ved hjelp av trinn 3.4-3.5 tatt for kontrollmålingene. Når alle målinger er gjort, plasser elektroden tilbake i 70% isopropylalkoholoppløsningen i 30 minutter. Koble elektrodene fra TEER-instrumentet og la dem lufttørke.
- Beregn TEER-verdiene. Bruk ligning (1) til å trekke den gjennomsnittlige ohm-verdien til den tomme brønninnsatskontrollen fra ohm-verdien i prøven, og multipliser deretter denne motstandsverdien med arealet av membraninnsatsen (cm 2) for å gi den rapporterte TEER-verdien i Ω∙cm2.
(1)
(1)4. Vurdering av BBB paracellulær permeabilitet
MERK: Utfør alle trinn som involverer FITC-dextran i et biosikkerhetsskap for cellekultur med lysene slått av. Dekk FITC-dextran-løsningene med aluminiumsfolie for å minimere fotobleking.
- Klargjør oppløsninger som inneholder FITC-dextrans på 20 og 70 kDa (0,1 mg/ml) ved bruk av fenol rødfritt endotelcellevekstmedium og la det røre på en risteplattform i 1 time. Filtrer oppløsningene med et 0,22 μm sprøytefilter.
- Aspirer mediet fra det basolaterale rommet og erstatt det med 2 ml fenol rødfritt endotelcellevekstmedium i trippelcellekulturen BBB-modellen. Vask cellene i det apikale rommet to ganger med Hanks balanserte saltløsning (HBSS).
- Tilsett 1 ml av FITC-dextran-løsningen i det apikale rommet og dekk platen med aluminiumsfolie. Plasser platen i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 1 time.
- Ta 100 μL medium fra de basolaterale rommene og overfør det til en svart 96-brønnsplate. Mål fluorescensen ved hjelp av en mikroplateleser med eksitasjons- og utslippsbølgelengdene satt til henholdsvis 480 nm og 530 nm.
5. Påvisning av hypoksi i levende celler
- Frø 200 μL HBMEC, HA og HBVP i midten av poly-d-lysinbelagte, 35 mm glassbunnretter med en tetthet på 150 000 celler / tallerken. Før såing HBMEC, belegg bunnen av oppvasken med vedleggsfaktoren. La cellene feste seg til glassoverflaten ved å la dem stå over natten ved 37 °C i en CO2 inkubator.
MERK: Det er viktig å plassere retter med humane primære celler samtidig med en trippel godt sett inn BBB-modell i et hypoksikammer for OGD. - Når sammenløp er nådd, kast kulturmediet og tilsett 2 ml forvarmet glukosefritt medium (for OGD) eller normalt medium (for kontroller) som inneholder 2 μL 1 mM Hoechst 33342 (endelig konsentrasjon 0,2 μM) og 0,5 μL 5 mM lageroppløsning av det refererte Image-iT grønne hypoksireagenset (endelig konsentrasjon 1 μM). Etter OGD-behandling, erstatt mediet med bildeoptimalisert medium i alle retter.
- Utfør fluorescens live-cell imaging med GFP-filteret og topptrinns konfokal mikroskopinkubator som beskrevet tidligere14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å undersøke effekten av astrocytter og pericytter på barrierefunksjonen til HBMEC, konstruerte vi trippelcellekultur BBB-modellen på cellekulturinnsatser (figur 1A) sammen med HBMEC-monokultur og to doble kokulturmodeller som kontroller (figur 1B). Doble kokulturkontroller inkluderte en ikke-kontakt-samkultur av HBMEC med HA og kontakt-samkultur av HBMEC med HBVP. Etter 6 dager i kokultur ble alle eksperimentelle oppsett utsatt for OGD i 4 timer. Barriereintegriteten til endotelmonolaget i de angitte BBB-konfigurasjonene ble vurdert ved å bestemme TEER før og etter OGD, samt etter 24 timers reoksygenering (figur 1C). I 4 timer forårsaket OGD en signifikant reduksjon i TEER-verdier bare i HBMEC-monokultur og samkulturmodellen med HBMEC og HBVP. Disse reduserte nivåene nådde utgangsnivåene etter 24 timers reoksygenering. Ingen effekt av OGD på samkulturmodellen med HBMEC og HA pekte på astrocytters beskyttende rolle mot iskemiske tilstander in vitro.
Selv om det ikke var noen forskjell i baseline TEER mellom trippel og HBMEC / HBVP dobbel kokulturmodell, var TEER-verdiene i trippel-kokulturmodellen signifikant høyere enn i de doble kokulturkontrollene eller monokulturkontrollen umiddelbart etter OGD, noe som tyder på at integrering av HA og HBVP i trippel BBB-modellen spiller en kritisk rolle for å opprettholde BBB funksjonell integritet under patologiske forhold (figur 1C ). Vi undersøkte også permeabiliteten av FITC-dextrans med liten (20 kDa) og stor (70 kDa) molekylmasse over endotelmonolaget i den utviklede trippelkulturmodellen. Den paracellulære permeabiliteten av endotelmonolag til 20 kDa molekylmasse FITC-dextran ble drastisk økt i HBMEC monokultur og i mindre grad i samkulturmodellen med HBMEC og HBVP sammenlignet med normoksiske kontroller (figur 1D). Videre var 20 kDa FITC-dextran permeabilitetsnivåer de laveste i trippel BBB-modellen blant alle modeller under normoksiske og OGD-forhold. Ingen endringer ble observert i 70 kDa FITC-dekstranfluks over endotelmonolag i noen av modellene (figur 1E). Disse dataene antyder at iskemisk-hypoksisk skade ikke var så alvorlig for å forårsake endringer i paracellulær permeabilitet til store molekyler som plasmaproteiner.
Figur 1: Effekter av oksygen-glukosemangel på transendotelial elektrisk motstand og endotelpermeabilitet i humane primære mono-, co- og trippelkultur BBB-modeller. (A) Skjematisk tidslinje for innstillingen av den tredobbelte primære cellekulturen BBB-modellen. (B) Skjematiske representasjoner av konfigurasjonene for in vitro statiske humane primære cellebaserte BBB-modeller. En monokulturmodell inneholder HBMEC sådd på den apikale siden av brønninnsatsen porøs membran. En kontaktfri samkultur inneholder HBMEC sådd på den øvre overflaten av brønninnsatsstøtten og HA sådd i bunnen av kulturbrønnen. En kontakt-kokulturmodell inkluderer HBVP-sådd på den nedre overflaten av brønninnsatsstøtten med HBMEC på den øvre overflaten. For trippelkulturmodellen sås HBMEC på den øvre overflaten av støtten med HBVP sådd på den nedre overflaten og HA sådd på bunnen av kulturbrønnene. (C) Endringer i TEER overvåket umiddelbart før OGD, etter 4 timer med OGD og etter 24 timers reoksygenering. Data representert som gjennomsnittlig ± SEM (n = 5-6). P < 0,0001 sammenlignet med mono- og samkulturmodeller (toveis ANOVA). (D) Paracellulær permeabilitet til 20 kDa FITC-dekstran på tvers av endotelmonolag ble målt etter 4 timer med OGD. (E) Paracellulær permeabilitet til 70 kDa FITC-dekstran over endotelmonolag ble målt etter 4 timer OGD. Data representert som gjennomsnitt ± SD (n = 5-6). *P < 0,05. P < 0,0001 (toveis ANOVA). Forkortelser: OGD = oksygen-glukose deprivasjon; TEER = transendotelial elektrisk motstand; HBMEC = mikrovaskulære endotelceller i hjernen hos mennesker; HA = menneskelige astrocytter; HBVP = vaskulære pericytter i hjernen hos mennesker; FITC-dextran = dextran konjugert til fluoresceinisotiocyanat; Arb. enheter = vilkårlige enheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å verifisere OGD-indusert hypoksisk skade ble HBMEC, HA og HBVP dyrket i brønnene på 35 mm glassbunnskåler og lastet med hypoksireagenset, hvis fluorescerende signal økte med reduserte oksygennivåer. Alle primære mennesketyper utsatt for OGD viste sterk grønn fluorescens, noe som viste at de avbildede levende cellene var hypoksiske (figur 2). Etter å ha estimert effekten av å ha forskjellige perivaskulære celletyper (astrocytter og pericytter), eller deres kombinasjon i BBB-modellen på barriereegenskapene etter en OGD-protokoll, konkluderte vi med at trippelmodellen var bedre enn de andre BBB-modellene som ble testet.
Figur 2: Levende farging av hypoksiske primære humane hjernemikrovaskulære endotelceller, humane astrocytter og humane hjernevaskulære pericytter etter 4 timer oksygen-glukosemangel. OGD-eksponering ble utført på alle primære celler (HBMEC, HA og HBVP) ved bruk av et hypoksireagens og glukosefritt medium i 4 timer. Resultater fra fire uavhengige eksperimenter er vist. Kulturer ble avbildet med 20x forstørrelse. Skala barer = 100 μm. Forkortelser: OGD = oksygen-glukose deprivasjon; HBMEC = mikrovaskulære endotelceller i hjernen hos mennesker; HA = menneskelige astrocytter; HBVP = vaskulære pericytter i hjernen hos mennesker; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen beskriver vi en metode for å sette opp en pålitelig trippel endotelcelle-pericytt-astrocyttkultur BBB-modell for å studere BBB-dysfunksjon i innstillingen av iskemisk hjerneslag in vitro. Med tanke på at pericytter er de nærmeste naboene til endotelceller in vivo, er HBVP belagt på undersiden av brønninnsatsene i denne modellen16. Selv om denne konfigurasjonen mangler direkte celle-til-celle-kommunikasjon mellom astrocytter og endotelceller, tillater dette arrangementet indirekte celle-til-celle-kommunikasjon mellom celletyper via utskilte løselige faktorer. Tilstedeværelsen av astrocytter og pericytter i dette systemet forbedrer HBMECs integritet, og begrenser paracellulær permeabilitet av monolaget til små sporstoffer. I tillegg har astrocytter og pericytter en beskyttende effekt på HBMEC ved OGD-tilstander.
I den utviklede protokollen optimaliserte vi celleforholdet (1: 1: 1) og kulturmediumblandingen for det basolaterale rommet. Trippel BBB-modellen viste nesten 2,5 ganger høyere TEER-verdier (239 ± 9 Ω·cm 2) enn kontroll-HBMEC-monokulturen (112 ± 11 Ω·cm2) etter 6 dagers kokulturasjon, tiden som er nødvendig for riktig HBMEC-monolagsdannelse17,18. TEER-verdiene oppnådd i denne trippelmodellen er sammenlignbare med verdiene i den andre tidligere beskrevne trippelmodellen, der HA var i kontakt med HBMEC og HBVP ble sådd på bunnen av platebrønnene19. I den andre humane primære celle trippelkulturmodellen med samme cellekonfigurasjon og OGD-eksponeringstid var baseline TEER-verdiene vesentlig lavere enn i dette arbeidet og nådde ikke standardnivåene (100 Ω · cm2) 20. Bruken av 6-brønns brønninnsatsplater med større rom tillot oss å redusere mediumendringsfrekvensen for å unngå forstyrrelse av stoffutveksling mellom cellepopulasjonene.
OGD-eksperimenter ble utført ved bruk av et forseglet hypoksi-inkubatorkammer som inneholdt en anaerob gassblanding (95% nitrogen og 5% karbondioksid). En av hovedfordelene med denne protokollen er at alvorlighetsgraden av den iskemiske skaden enkelt kan justeres til spesifikke behov ved å variere lengden på OGD-perioden. Etter å ha evaluert TEER- og dextran-permeabiliteten, kompromitterte ikke 4 timer OGD BBB-integriteten i den konstruerte trippelmodellen. Derfor, for å studere iskemisk slag in vitro, må lengre eksponering for OGD påføres for å indusere BBB-sammenbrudd. Live-celleavbildning, gitt i protokollen, tillater sanntidsovervåking av forskjellige celletyper og verifisering av OGD-skade, noe som representerer en fordel i mange studier.
I denne protokollen ble 0,4 μm polyester brønninnsatser valgt som grunnlag for denne trippel BBB-modellen. En polyestermembran regnes som den beste innsatstypen for cellevisualisering i fluorescensavbildningsapplikasjoner, noe som gir en utmerket mulighet til å visualisere modifikasjoner av tette kryssproteiner og transportører om nødvendig. Mens den valgte lille porediameteren skaper en lav permeabilitet for små hydrofile molekyler over endotelmonolag, begrenser den også den potensielle anvendelsen av den nåværende trippel BBB-modellen for transendotelmigrasjonsanalyser, der 3 μm eller 8 μm porestørrelser er påkrevd.
Endelig kan en annen begrensning av denne modellen være relatert til mangel på skjærspenning, som har vist seg å fremme dannelsen av tette kryss i dynamiske trippel BBB in vitro-systemer 21. Avslutningsvis representerer den etablerte robuste og fysiologisk relevante trippelkulturelle BBB-modellen, sammensatt av primære humane celler, et verdifullt verktøy for narkotikascreening og studier av BBB-dysfunksjon assosiert med iskemisk hjerneslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfatterne avslørte at det ikke er noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) tilskudd MH128022, MH122235, MH072567, MH122235, HL126559, DA044579, DA039576, DA040537, DA050528 og DA047157.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3450 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Life Sciences (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| Astrocyte Medium | Science Cell | 1801 | |
| Attachment Factor | Cell Systems (Fisher Scientific) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL Syringe | BD | 309653 | |
| BrainPhys Imaging Optimized Medium | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| Complete Classic Medium With Serum and CultureBoost | 4Z0-500 | Cell Systems | |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes (Conical Bottom with CentriStar Cap | VWR | 430829 | |
| Corning 75cm² U-Shaped Canted Neck Not Treated Cell Culture Flask | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96-well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | Fisher Scientific | 04-355-71 | |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| DMEM Medium (No glucose, No glutamine, No phenol red) | ThermoFisher | A14430-01 | Glucose-free medium |
| DPBS (No Calcium, No Magnesium) | ThermoFisher | 14190250 | |
| EBM Endothelial Cell Growth Basal Medium, Phenol Red Free, 500 mL | Lonza | CC-3129 | |
| EVOM2 Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter with STX2 electrodes | World Precison Instruments | NC9792051 | Epithelial voltohmmeter |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 20,000) | Millipore Sigma | FD20-250MG | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (wt 70,000) | Millipore Sigma | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 Confocal Microscope | Olympus | FV3000 | |
| Gas Tank (95% N2, 5% CO2) | Airgas | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (No calcium, No magnesium, no phenol red) | Thermofisher | 14025092 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher | H3570 | |
| Human Astrocytes | Science Cell | 1800 | |
| Human Brain Vascular Pericytes | Science Cell | 1200 | |
| Hypoxia Incubator Chamber | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| Pericyte Medium | Science Cell | 1201 | |
| Primary Human Brain Microvascular Endothelial Cells | ACBRI 376 | Cell Systems | |
| Rocking Platform Shaker, Double | VWR | 10860-658 | |
| Single Flow Meter | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 Microplate Reader | Molecular Devices | 75886-128 | |
| Syringe Filter, 25 mm, 0.22 μm, PVDF, Sterile | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP Mutli-well Plates (6 wells) | MidSci | TP92406 | |
| TPP Tissue Culture Flasks T-75 Flasks | MidSci | TP90075 | Flasks with activated surface for cell adhesion |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| Uno Stage Top Incubator- | Oko Lab | UNO-T-H-CO2-TTL |
References
- Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics-2016 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 133 (94), 38 (2016).
- Yousufuddin, M., Young, N. Aging and ischemic stroke. Aging. 11 (9), 2542-2544 (2019).
- Donkor, E. S. Stroke in the 21st century: a snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. , 3238165 (2018).
- Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids and Barriers of the CNS. 17 (1), 69 (2020).
- Brown, L. S., et al. Pericytes and neurovascular function in the healthy and diseased brain. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 282 (2019).
- Cabezas, R., et al. Astrocytic modulation of blood brain barrier: perspectives on Parkinson's disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 211 (2014).
- Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 315 (3), 343-356 (2018).
- Candelario-Jalil, E., Dijkhuizen, R. M., Magnus, T. Neuroinflammation, stroke, blood-brain barrier dysfunction, and imaging modalities. Stroke. 53 (5), 1473-1486 (2022).
- He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
- Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A triple culture model of the blood-brain barrier using porcine brain endothelial cells, astrocytes and pericytes. PLoS One. 10 (8), 0134765 (2015).
- Song, Y., Cai, X., Du, D., Dutta, P., Lin, Y. Comparison of blood-brain barrier models for in vitro biological analysis: one cell type vs three cell types. ACS Applied Bio Materials. 2 (3), 1050-1055 (2019).
- Xu, L., et al. Silver nanoparticles induce tight junction disruption and astrocyte neurotoxicity in a rat blood-brain barrier primary triple coculture model. International Journal of Nanomedicine. 10, 6105-6118 (2015).
- Appelt-Menzel, A. Establishment of a human blood-brain barrier co-culture model mimicking the neurovascular unit using induced pluri- and multipotent stem cells. Stem Cell Reports. 8 (4), 894-906 (2017).
- Zhang, Y., et al. Rational construction of a reversible arylazo-based NIR probe for cycling hypoxia imaging in vivo. Nature Communications. 12 (1), 2772 (2021).
- Palacio-Castañeda, V., Kooijman, L., Venzac, B., Verdurmen, W. P. R., Le Gac, S. Metabolic switching of tumor cells under hypoxic conditions in a tumor-on-a-chip model. Micromachines. 11 (4), 382 (2020).
- Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
- Lyck, R., et al. ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).
- Rizzi, E., et al. A triple culture cell system modeling the human blood-brain barrier. Journal of Visualized Experiments. (177), (2021).
- Kumar, S., Shaw, L., Lawrence, C., Lea, R., Alder, J. P50: Developing a physiologically relevant blood brain barrier model for the study of drug disposition in glioma. Neuro-Oncology. 16 (6), (2014).
- Stone, N. L., England, T. J., O'Sullivan, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
- Al Ahmad, A., Taboada, C. B., Gassmann, M., Ogunshola, O. O. Astrocytes and pericytes differentially modulate blood-brain barrier characteristics during development and hypoxic insult. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (2), 693-705 (2011).
