Summary
描述了使用滚动圆增强酶活性检测测定法灵敏和定量检测拓扑异构酶1活性的方案。该方法允许从纯化的组分或细胞/组织提取物中检测拓扑异构酶1活性。该协议在涉及酶活性检测的任何领域具有广泛的应用。
Abstract
基于等温扩增的技术（如滚环扩增）已成功用于检测核酸、蛋白质量或其他相关分子。这些方法已被证明是临床和研究应用中PCR或ELISA的重要替代品。此外，蛋白质量的检测（通过蛋白质印迹或免疫组织化学）通常不足以为癌症诊断提供信息，而酶活性的测量是一种有价值的生物标志物。酶活性的测量还可以诊断和潜在治疗病原体传播的疾病。在所有真核生物中，拓扑异构酶是参与重要细胞过程中DNA拓扑状态控制的关键DNA结合酶，并且是癌症预后和治疗的重要生物标志物之一。
多年来，拓扑异构酶作为抗寄生虫和抗癌药物的潜在靶标已被大量研究，每年都会研究天然和合成小分子化合物库。这里介绍了滚动环扩增方法，称为滚动圆增强酶活性检测（REEAD）测定，该方法允许以简单，快速和无凝胶的方式定量测量拓扑异构酶1（TOP1）活性。通过切割和连接特殊设计的DNA底物，TOP1将DNA寡核苷酸转化为闭合环，成为滚动环扩增的模板，产生~103 串联重复滚动循环产物。根据扩增过程中的核苷酸掺入情况，有可能有不同的读出方法，从荧光到化学发光再到比色。由于每个 TOP1 介导的切割连接都会产生一个闭合的 DNA 环，因此该测定具有高度灵敏度且直接定量。
Introduction
拓扑异构酶属于DNA修饰酶类，其中许多已被证明可作为人类疾病的生物标志物1，2，3，4，5，6。TOP1 参与解决与细胞过程相关的拓扑应力，例如 DNA 复制、基因转录、重组和染色体分离7。TOP1 可以通过涉及在 DNA8，9 中形成瞬时单链断裂的机制来解析负极和正极超线圈。与DNA结合后，TOP1定位活性位点酪氨酸（Tyr723）以对磷酸二酯骨架进行亲核攻击。然后生成TOP1-DNA切割复合物，将酶共价连接到断裂DNA链的3'末端。这通过允许裂解的链的 5' 端围绕完整链旋转来释放扭转应力。最后，5'-末端的羟基对3'-磷酸酪基键进行亲核攻击。结果，TOP1被释放，DNA骨架恢复8。
已经开发了几种测定方法来研究TOP1催化循环的步骤，包括弛豫测定10，电泳迁移率转移测定（EMSA）11，12，DNA自杀切割连接测定13，14和体内酶复合物（ICE）测定15.然而，这些测定有几个局限性，因为它们依赖于凝胶电泳，这需要DNA插层剂，或者它们需要高度专业化的培训和设备。此外，测定需要大量纯化的TOP1酶（松弛测定范围为1至5ng，EMSA和切割连接测定范围为50至200ng）或至少106细胞的提取物才能发挥最佳性能。因此，已经开发了一种高灵敏度的方法，该方法能够在粗生物样品和单一催化事件水平上特异性检测TOP1活性，称为REEAD测定16。
这里介绍了使用REEAD测定16 检测TOP1活性的方案。该测定的示意图如图 1所示。将定制设计的硅胶网格连接到功能化载玻片上，以创建玻璃载玻片多孔设置，在下文中称为造井器（图1A）。随后将5'-氨基修饰引物偶联到载玻片孔中的功能性NHS基团（图1B）。TOP1介导的切割和连接反应将特定的DNA底物转化为闭合的环。TOP1 特异性基板（图 1C）自发折叠成哑铃形，其中包含一个双链茎和两个单链环。其中一个环与表面锚定底漆互补。茎区域包含有利的TOP1裂解位点，位于3'端上游的三个碱基和一个5'-羟基突出。底物的循环化可以使用细胞/组织提取物（图1C）或重组纯化的TOP1（图1D）来实现。
当底物被TOP1裂解时，酶瞬时结合到3'末端，三碱基片段扩散，允许5'-突出部退火到底物上并促进TOP1介导的连接。连接导致底物的环状化，随后导致TOP1的解离。闭合环与表面锚定引物杂交（图1E），并用作由phi29聚合酶介导的等温滚动环扩增（RCA）的模板，该酶可以进行链置换的RCA，产生103 串联重复产物。在RCA步骤中，可以掺入荧光标记的（图1F）或生物素偶联的（图1G）核苷酸17。掺入荧光标记的核苷酸允许使用荧光显微镜或荧光扫描仪检测RCP。或者，辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗生物素抗体（图1H）可以结合生物素化的核苷酸，从而允许使用增强化学发光（ECL）或通过将3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）转化为可检测的颜色来检测轧圆产物（RCP）。RCA 遵循线性反应动力学，使 REEAD 测定直接定量，因为一个 RCP 代表单个 TOP1 介导的切割连接反应。这里表明，该测定可用于检测TOP1活性作为纯化的重组酶或从粗样品中提取的以及作为抗TOP1药物筛选工具。
Protocol
注意：在材料表中查找所需缓冲液成分、设备和其他 材料的列表。
1. 细胞培养
- 在合适的培养基中培养优选细胞并根据说明培养它们。例如，在补充有 20% 胎牛血清 （FBS）、1% 非必需氨基酸 （NEAA）、100 单位/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的最小必需培养基 （MEM） 中培养结直肠腺癌衍生细胞 Caco2。将细胞培养物保持在加湿的培养箱（37°C下5%CO2 / 95%空气气氛）中。将细胞接种到组织培养瓶中，每3天分裂一次，以保持细胞在70%汇合。
- 通过胰蛋白酶处理（0.25%胰蛋白酶，0.02%EDTA溶液）从70%汇合烧瓶中收获细胞，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤。
- 将细胞沉淀重悬于PBS中，将细胞浓度调节至0.5×106 个细胞/管。以200 ×g 旋转5分钟，小心吸出上清液。
注意：用于REEAD的细胞必须新鲜使用并保持在冰上。用Caco2细胞获得的结果最近发表了17。该测定已用多种细胞系进行了测试，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌和宫颈癌衍生细胞18、19、20、21、22、23，但它可用于所有含有 TOP1 的粗生物样品，例如组织、血液和唾液。
2. 功能化玻片的制备
- 将定制设计的硅胶隔离器网格连接到功能化的载玻片上，从而使制井机。按压硅胶以避免形成气泡（见 图1A）。
- 在1x打印缓冲液中制备5μM 5'-氨基引物的混合物。向每个孔中加入 4 μL 混合物，并将孔中放入温度在 15 °C 至 25 °C 之间的饱和 NaCl 杂交室中，避光。
注意：使用装满饱和NaCl的移液器吸头盒可以轻松制作杂交室。杂交最少需要16小时，最多需要72小时。参见 图1B中5'-氨基引物的序列。载玻片用NHS基团功能化，以允许结合氨基修饰的寡核苷酸。
3. 产生封闭的圆形基板
- 用重组TOP1或细胞提取物制备封闭的圆形底物。
- 在 500 μL 裂解缓冲液中裂解 0.5 × 106 个细胞的细胞沉淀，以达到 1，000 个细胞/μL 的细胞密度。 在冰上孵育 10 分钟。
- 制备 2 μL 5 μM TOP1 特异性底物的圆形混合物（底物的序列如下：5'-AGA aaa att ttt aaa aaa act gtg aag atc gct tat ttt ttt aaa aat aaa tct aag tct ttt aga tcc ctc aat gca gca cat gtt tgg ctc cga tct aaa aga ctt aga-3'）和 2 μL 重组 TOP1 酶或 2 μL 细胞提取物（参见步骤 3.1.1）在 16 μL 中1x TOP1 反应缓冲液。
注意：使用的重组TOP1浓度取决于所选的读出方法（参见图2，图3，图4和图5）。 参见图1C中TOP1特异性底物的顺序。 - 在37°C孵育30分钟（见 图1C，D）。
- 通过加入 2 μL 1% SDS 停止反应。
- 在药物存在下制备封闭的圆形底物
- 在 14 μL 1x TOP1 反应缓冲液中制备 2 μL 5 μM TOP1 特异性底物和 1 μL 100% DMSO 或 1 μL 1.6 mM 喜树碱 （CPT） 的圆形混合物。加入 2 μL 的 5 ng/μL 重组 TOP1 酶。
注意：可以使用其他小分子化合物或药物。在这种情况下，应滴定化合物。如果化合物溶解在DMSO以外的溶剂中，则应将其用作对照而不是DMSO。 - 在37°C孵育1分钟。
- 通过加入 2 μL 1% SDS 停止反应。
- 在 14 μL 1x TOP1 反应缓冲液中制备 2 μL 5 μM TOP1 特异性底物和 1 μL 100% DMSO 或 1 μL 1.6 mM 喜树碱 （CPT） 的圆形混合物。加入 2 μL 的 5 ng/μL 重组 TOP1 酶。
注意：步骤3可以与步骤2并行启动，圆圈可以在4°C下储存过夜。或者，DNA环可以与步骤4同时制备并立即使用。参见 图1C中TOP1特异性底物的顺序。基质折叠成哑铃形状，具有包含优选TOP1裂解位点和两个单链环的双茎区域。开放式哑铃基质通过TOP1介导的裂解和连接转化为封闭的圆形底物，以下称为圆形。由于5'-氨基引物过量，开放和封闭的TOP1特异性底物之间不会有竞争。
4. 堵塞制井机
- 将制井机浸入装有缓冲液1的5cm x 5cm托盘中，该托盘预热至50°C。 使用移液器将液体推入孔内，以确保没有气泡。在50°C孵育30分钟。
- 取出缓冲液1并用dH 2 O洗涤2x 1分钟。 用手剧烈摇晃。
- 加入已预热至50°C的缓冲液2。 确保井中没有气泡。在50°C孵育30分钟。
- 用dH 2 O洗涤2x 1分钟，用手剧烈摇晃。
- 用70%乙基醇洗涤1分钟。用手用力摇晃。
- 让打井机风干设置。
注意：使用压缩空气干燥井。或者，也可以使用巴斯德移液器吹气。在继续之前，请确保井干燥。
5. 圆圈与制井机的杂交
- 向每个相应的孔中加入 4 μL 圆圈（在步骤 3 中制作）。
- 将孔机置于湿度室中1小时，dH2O在37°C下。
注意：可以使用装有dH2O的移液器吸头盒来制作湿度室，或者，可以在湿度室中在25°C下进行过夜的杂交。
6. 洗涤
- 用缓冲液3清洗造井机。
- 删除缓冲区 3 并替换为缓冲区 4。
- 除去缓冲液4并用70%EtOH洗涤。
- 取出乙基醇，让打井机干燥。
注意：所有洗涤步骤均在5厘米x 5厘米的托盘中完全浸没载玻片，进行1分钟。始终确保井内没有气泡。
7. 滚圈放大
- 制备 1x Phi29 反应缓冲液的 RCA 混合物，补充有 0.2 μg/μL BSA、1 单位 Phi29 聚合酶和 0.25 mM dNTP 和 0.0125 mM ATTO-488-dUTP 用于荧光读数，或 0.1 mM dATP、0.1 mM DTTP、0.1 mM dGTP、0.09 mM dCTP 和 0.01 mM 生物素-dCTP 用于比色/化学发光读数。向每个孔中加入 4 μL。参见 图 1E。
注意：RCA混合物的制备必须在冰上进行。在RCA中掺入荧光核苷酸时，请避免此步骤的直射光以保护荧光团。 - 在湿度室中于37°C孵育2小时。如果使用荧光核苷酸，请将湿度室置于黑暗中。参见 图1F，G。
8. 洗涤
- 对于化学发光或比色读数方案，如步骤6所示洗涤孔机，然后继续步骤11。
- 对于荧光读数方案，请在洗涤前使用镊子取出硅胶网格，按照以下步骤操作。
- 在缓冲液3中清洗载玻片10分钟。
- 删除缓冲区 3 并替换为缓冲区 4。洗5分钟。
- 除去缓冲液4，在70%EtOH中洗涤1分钟。
- 取出乙基醇，让打井机干燥。
9. 使用荧光扫描仪可视化荧光滚动圈产品
- 使用与所用荧光团相对应的滤光片在荧光扫描仪中扫描载玻片。使用不饱和的最大光电倍增管。
注意：本协议中用于图像采集的荧光扫描仪配备473 nm激光器和FAM滤光片激发490 nm，发射520 nm。 - 将图片导入 ImageJ 并将图片 类型 更改为 8 位 （图片 |类型 |8 位）。要单独测量波段，请使用工具栏中的 矩形 绘制工具限制测量区域。绘制所需区域并测量强度（分析 |测量）。然后，将最初绘制的区域移动到下一个波段并测量。
- 在所需的软件中绘制数据。 图2显示了代表性图像，包括从ImageJ中提取的定量。
10. 使用荧光显微镜可视化荧光滚动圈产品
- 用抗EtOH笔在移除硅胶网格之前绘制孔的位置，并按照步骤8.2清洗载玻片。洗涤步骤后，用不含 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的 1 μL 封片介质安装载玻片，并添加盖玻片。为了在相机中进行可视化，请将载玻片粘在76 mm x 26 mm显微镜载玻片上。
- 使用配备60倍油浸物镜和相机的荧光显微镜进行分析。为每个样品/孔拍摄 12-15 张图像。
- 将图片导入 ImageJ 并堆叠图像（图片 |堆栈 |要堆叠的图像）。将图像 类型 更改为 8 位 （图像 |类型 |8 位）。
- 设置 阈值 （图片 |调整 |阈值）。
- 设置阈值如下：设置下栏并调整上栏，以便只有正确的信号为红色，背景为黑色。确保在实际信号开始消失之前阈值尽可能低。
- 在设置阈值之前，扫描单个图像并确保它们与图像相对应。请注意，阈值可能会因实验而异。
- 对信号进行计数（分析 |分析粒子）。确保选中 ImageJ 设置中的汇总字段。
- 将结果导出到电子表格或其他软件以进行进一步的数据处理。包括从ImageJ中提取的定量的代表性图像如图 3所示。
11. HRP偶联的抗生物素抗体与生物素标记的滚动循环产物的偶联
- 向每个孔中加入 4 μL HRP 偶联的抗生物素抗体，在缓冲液 5 中以 1：300 稀释，并补充有 5% 脱脂牛奶和 5% BSA。
- 在湿度室中于15-25°C孵育50分钟（见 图1H）。
- 用缓冲液5洗涤3 x 3分钟。
- 将打井机晾干。
12. 生物素标记的滚圈产品的可视化
- 使用预期信用损失实现可视化
- 使用前立即混合 40 μL ECL 鲁米诺和 40 μL H 2 O2。向每个孔中加入 2 μL。
- 使用 CCD 相机或在 X 射线胶片上可视化载玻片。
- 使用 TMB 实现可视化
- 步骤11.4后，取下硅胶网格。然后，在整个载玻片顶部加入 400 μL TMB，并将载玻片放入湿度室中。等待~5-10分钟进行显色。显色后，用70%EtOH清洗载玻片。
- 用肉眼可视化颜色发展。用照相机或手机拍摄幻灯片的照片。
- 将图片导入 ImageJ 并将图片 类型 更改为 8 位 （图片 |类型 |8 位）。要单独测量波段，请使用工具栏中的 矩形 绘制工具限制测量区域。绘制所需区域并测量强度（分析 |测量）。然后，将最初绘制的区域移动到下一个波段并测量。
- 在所需的软件中绘制数据。代表性图像（包括从ImageJ中提取的定量）如图4、图5和图6所示。
Representative Results
这里介绍了使用REEAD测定法检测TOP1活性的方案16。该方案用于使用四种不同的读出方法检测重组TOP1活性：荧光扫描仪，荧光显微镜，化学发光和比色法。该协议还用于检测从Caco2细胞中提取的TOP1的活性，作为粗提取物的一个例子，具有化学发光或TMB读数。此外，该方案被用作药物筛选工具，以检测CPT对重组TOP1活性的抑制，作为TOP1特异性抑制剂的一个例子，使用化学发光读出方法。
使用荧光读数分析TOP1活性时获得的结果如图 2 和 图3所示。荧光载玻片的代表性扫描和所得定量结果如图 2所示。从定量中可以明显看出，该读数的检测限为 TOP1 的 12.5 ng。使用荧光显微镜读数时获得的代表性图像和所得定量如图 3所示。使用这种读出方法，检测限低至TOP1的0.1 ng。使用化学发光读数分析TOP1活性时获得的结果如图 4所示，比色读数的结果如图 5所示。这些读出方法的检测限为 TOP1 的 6 ng 或从 312 个 Caco2 细胞中提取的 TOP1。 图6 显示了在存在80μM CPT或DMSO的情况下TOP1活性的测量值，作为药物筛选应用的示例。代表性图像和三个独立实验的结果定量表明，CPT抑制了TOP1介导的底物的循环化，如预期的那样24，25。
图 1：REEAD 协议的示意图 。 （A，B） 功能化载玻片的制备。硅胶网格连接到功能化滑块上。然后，将5'-氨基引物偶联到载玻片上，从而能够扩增TOP1特异性底物。（中，四）产生封闭的圆形基板。TOP1特异性底物折叠成哑铃形状，在双链茎中具有首选的TOP1裂解位点，在两个单链环之一中具有引物结合序列。（C）TOP1在细胞裂解时释放。在TOP1介导的裂解和连接下，底物转化为闭合的圆;（D）纯化后，使用重组TOP1。（五）滚圆放大。闭合的圆形底物与表面锚定的引物杂交，并使用Phi29聚合酶通过RCA扩增。RCA可以通过掺入 F 中的荧光核苷酸或 G中的生物素化核苷酸来实现。荧光滚动圈产品使用荧光显微镜或荧光扫描仪进行可视化。（H）HRP偶联的抗生物素抗体的偶联。生物素化的滚动圈产物与HRP偶联的抗生物素抗体一起孵育。信号发展由HRP酶介导，信号通过ECL可视化并使用CCD相机或使用TMB生成比色可视化进行检测。缩写：REEAD = 滚动圆增强酶活性检测;RCA = 滚动圆放大;TOP1 = 拓扑异构酶 1;HRP = 辣根过氧化物酶;ECL = 增强化学发光;TMB = 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：使用荧光扫描仪测量 TOP1 活性。 左图显示了使用荧光扫描仪读出协议分析3-50 ng TOP1活性时的载玻片代表性图像。右图显示了所得定量结果。带有韦尔奇校正的 t 检验， p = 0.0064，n = 4。缩写：TOP1 = 拓扑异构酶 1。 请点击此处查看此图的大图。
图3：使用荧光显微镜测量TOP1活性。 左图显示了使用荧光显微镜读出方案分析0.1-12.5 ng TOP1活性时载玻片的代表性图像。请注意，图像是裁剪版本，以正确显示点。因此，它们与右侧面板中显示的量化中的信号数量不同。韦尔奇校正的 t检验， p = 0.0136，n = 3。缩写：TOP1 = 拓扑异构酶 1。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：使用化学发光读数测量 TOP1 活性。 （A） 左面板显示了使用化学发光读数协议分析 3-50 ng TOP1 活性时的载玻片代表性图像。右图显示了所得定量结果。韦尔奇校正的 t 检验，p < 0.0001，n = 4。（B）左侧面板显示了使用化学发光读出方案分析从156-40，000个Caco2细胞中提取的TOP1活性时的载玻片的代表性图像。右图显示了所得定量结果。韦尔奇校正的 t 检验，p = 0.0224，n = 3。缩写：TOP1 = 拓扑异构酶 1。请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用比色读数测量 TOP1 活性。 （A） 左侧面板显示了使用比色读数协议分析 3-50 ng TOP1 时载玻片的代表性图像。右图显示了所得定量结果。韦尔奇校正的t检验，p = 0.0012，n = 4。（B）左图显示了使用比色读数方案分析从156-40，000个Caco2细胞中提取的TOP1活性时的载玻片的代表性图像。右图显示了所得定量结果。韦尔奇校正的t检验，p = 0.0117，n = 3。缩写：TOP1 = 拓扑异构酶 1;TMB = 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺。请点击此处查看此图的大图。
图6：使用化学发光读出方案测量药物治疗后的TOP1活性。 左图显示了在5%DMSO或80μM CPT存在下分析10ng的TOP111分钟时载玻片的代表性图像。右图显示了所得定量结果。带有韦尔奇校正的 t检验， p = 0.0017，n = 3。缩写：TOP1 = 拓扑异构酶 1;CPT = 喜树碱;DMSO = 二甲基亚砜;负 = 阴性对照。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
拓扑异构酶代表一类DNA修饰酶，吸引了高度研究和临床兴趣，是小分子化合物的靶标，在抗癌治疗或对抗传染病方面具有潜在效果。此外，人类TOP1的活性已被证明是癌症预后和治疗的有效生物标志物18，19，23。虽然影响化疗抑制剂26疗效的是TOP1活性，但在临床环境中评估的通常是DNA-RNA的数量或TOP1的量。这是由于缺乏快速、简单和基于凝胶的免费工具，这些工具可以在每个实验室环境中提供拓扑异构酶活性的准确和精确定量。
这里描述了一种REEAD测定方案，允许以无凝胶的方式测量TOP1活性。在该协议中，从细胞中纯化的TOP1或粗提取物与专门设计的DNA哑铃形底物一起孵育，在TOP1介导的切割/连接时将其转化为封闭的环状分子。然后将圆圈杂交到玻璃表面上并通过RCA放大。为了便于在载玻片上进行反应，在玻璃上安装了一个有机硅网格，在发生反应的地方形成单独的孔。通过这种方式，该协议利用了一个多孔系统 - 一种称为制井机的有机硅网格。
该方案用于检测从结直肠腺癌细胞Caco2中提取的重组TOP1和TOP1的活性，以为例。此外，作为用作药物筛选工具的REEAD的一个例子，该协议用于检测众所周知的TOP1抑制剂CPT24，25的TOP1活性抑制。该测定与不同的读出方法相结合 - 荧光显微镜，其灵敏度高，荧光扫描仪，化学发光或比色法，需要较少的专业设备和培训。高灵敏度荧光显微镜读数的局限性在于需要高质量的荧光显微镜设置、熟练的人员以及耗时的图像采集和分析。
由于这些原因，即使以牺牲灵敏度为代价，也可以更快地采集和分析荧光扫描仪读数。在缺少荧光扫描仪的情况下，可以考虑两种出色的选择，即化学发光和比色读数方法。这两种方法都快速简单，不需要昂贵的设备或专业培训。在所有读数形式中，与最先进的检测方法相比，REEAD具有许多优点，这些检测方法更耗时，基于凝胶（需要插层剂），并且更不直接定量。但是，所提出的协议中有几个关键步骤。在进行药物筛选时，与针对CPT优化的所述设置相比，应优化时间点、药物浓度和TOP1量/DNA底物的比例。 可以研究该药物与DNA底物进行预孵育或与TOP1酶进行预孵育。这可以提供有关分子抑制TOP1的能力的宝贵信息，并提供药物作用机制的见解。
此外，如果信号低或缺失，这很可能是由于粗样品裂解效率低下或由于蛋白酶抑制剂使用不当导致提取物中的TOP1降解。此外，这也可能是由于重要检测组分（如重组TOP1、phi29聚合酶、核苷酸、底物和引物）储存不足。最后，应避免寡核苷酸的重复冻融循环，因为这会极大地影响测定性能。当使用粗提物时，需要优化特定生物样品的提取效率，TOP1的量和活性可能与此处报告的示例不同。因此，使用特定样品时，每种待测试的粗提取物都需要滴定，以确定测定检测限和灵敏度范围。该协议已针对检测人类 TOP1 进行了优化。可以测量其他真核TOP1的活性，但可能需要根据酶纯化方法和最佳酶活性优化NaCl浓度和孵育时间。长时间孵育将产生更多的圆形底物，而缩短孵育时间将导致更少的圆形底物。
除了所介绍的应用外，REEAD还允许测量癌症患者小活检粗提取物中的TOP1活性18，预测CPT在癌细胞系中的细胞毒性抗癌作用20，21，22，甚至检测单细胞中的酶活性20，21.此外，所呈现的使用制井机的REEAD设置能够对合成或天然化合物的文库进行基于多孔的药物筛选。除此之外，还开发了REEAD测定的修改版本，称为REEAD C / L。该设置可以单独研究TOP1反应27的裂解和连接步骤。使用REEAD C / L，可以确定小分子抑制剂的作用机制，并将其表征为具有潜在抗寄生虫作用的TOP1催化抑制剂28或用于抗癌治疗的TOP1毒物24，25。最后，通过对DNA底物进行特定的重新设计，以满足其他TOP1酶的不同要求（用于DNA结合或切割连接），REEAD也被用于检测传染病（例如恶性疟原虫，导致疟疾29），或利什曼原虫和猴痘病毒（数据未显示）。或者，它可用于鉴定具有抗致病作用的小分子化合物。所提出的协议为TOP1领域的科学家提供了一种简单的方法来检测酶活性，几乎没有优化，并且有可能在未来适应更广泛的应用。
Disclosures
作者C.T.和K.M.是VPCIR biosciences ApS的员工。C.T.、B.R.K. 和 M.S. 是股东和/或股票期权持有人。C.T.、B.R.K. 和 M.S. 声明他们是以 VPCIR 生物科学 ApAps 名义提交的专利 EP2022/057172 的指定发明人。其他作者宣称他们没有竞争利益。
Acknowledgments
作者要感谢奥胡斯大学分子生物学和遗传学系的实验室技术人员Noriko Y. Hansen在Phi29和TOP1酶纯化方面的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Camera for fluorescence image analysis | |||
| CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
| Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
| Humidity chamber with dH2O | |||
| Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
| ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Materials | |||
| Cell culture | |||
| Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
| Trypsin | Sigma | #T4174 | |
| Pen strep | Sigma | #P4300 | |
| Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Functionalized slides | |||
| 5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
| Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
| Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
| Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
| DNA circles and rolling circle amplification | |||
| TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Detection of rolling circle products | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Cover glass | |||
| ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
| HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
| Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
| Buffer list | |||
| 1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
| 6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
| Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
| 10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
| 10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
| Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
| Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Chemicals for buffers | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
| Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
| K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
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