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Cancer Research

कच्चे जैविक नमूनों में टोपोइसोमेरेस 1 गतिविधि का सरल और तेज रोलिंग सर्कल प्रवर्धन-आधारित पता लगाना

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64484
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 2,3,4, 1,3, 3
1Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 2Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 3VPCIR Biosciences ApS, 4Department of Pathology, Aarhus University Hospital

Summary

रोलिंग सर्कल एन्हांस्ड एंजाइम गतिविधि पहचान परख का उपयोग करके टोपोइसोमेरेस 1 गतिविधि के संवेदनशील और मात्रात्मक पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। विधि शुद्ध घटकों या सेल / ऊतक अर्क से टोपोइसोमेरेस 1 गतिविधि का पता लगाने की अनुमति देती है। इस प्रोटोकॉल में एंजाइमैटिक गतिविधि का पता लगाने से जुड़े किसी भी क्षेत्र में व्यापक अनुप्रयोग हैं।

Abstract

न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन की मात्रा या अन्य प्रासंगिक अणुओं का पता लगाने के लिए रोलिंग सर्कल प्रवर्धन जैसी इज़ोटेर्मल प्रवर्धन-आधारित तकनीकों को सफलतापूर्वक नियोजित किया गया है। इन विधियों ने नैदानिक और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए पीसीआर या एलिसा के पर्याप्त विकल्प दिखाए हैं। इसके अलावा, प्रोटीन की मात्रा का पता लगाना (पश्चिमी धब्बा या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा) अक्सर कैंसर निदान के लिए जानकारी प्रदान करने के लिए अपर्याप्त होता है, जबकि एंजाइम गतिविधि का माप एक मूल्यवान बायोमार्कर का प्रतिनिधित्व करता है। एंजाइम गतिविधि का माप रोगज़नक़ जनित रोगों के निदान और संभावित उपचार के लिए भी अनुमति देता है। सभी यूकेरियोट्स में, टोपोइसोमेरेस महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं के दौरान डीएनए टोपोलॉजिकल स्थिति के नियंत्रण में शामिल प्रमुख डीएनए-बाध्यकारी एंजाइम हैं और कैंसर के पूर्वानुमान और उपचार के लिए महत्वपूर्ण बायोमाकर्स में से हैं।

वर्षों से, टोपोइसोमेरेस को प्राकृतिक और सिंथेटिक छोटे-अणु यौगिकों के पुस्तकालयों के साथ एंटीपैरासिटिक और एंटीकैंसर दवाओं के संभावित लक्ष्य के रूप में काफी हद तक जांच की गई है जिनकी हर साल जांच की जाती है। यहां, रोलिंग सर्कल प्रवर्धन विधि, जिसे रोलिंग सर्कल एन्हांस्ड एंजाइम एक्टिविटी डिटेक्शन (आरईईएडी) परख कहा जाता है जो एक सरल, तेज और जेल-मुक्त तरीके से टोपोइसोमेरेस 1 (टीओपी 1) गतिविधि के मात्रात्मक माप की अनुमति देता है। एक विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए डीएनए सब्सट्रेट को छोड़कर और लिगेट करके, टीओपी 1 एक डीएनए ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को एक बंद सर्कल में परिवर्तित करता है, जो रोलिंग सर्कल प्रवर्धन के लिए टेम्पलेट बन जाता है, जिससे ~ 103 टेंडम रिपीट रोलिंग सर्कल उत्पाद उत्पन्न होते हैं। प्रवर्धन के दौरान न्यूक्लियोटाइड निगमन के आधार पर, प्रतिदीप्ति से केमिल्यूमिनेसेंस से कलरमेट्रिक तक विभिन्न रीडआउट विधियों की संभावना है। चूंकि प्रत्येक टीओपी 1-मध्यस्थता दरार-बंधाव एक बंद डीएनए सर्कल उत्पन्न करता है, परख अत्यधिक संवेदनशील और सीधे मात्रात्मक है।

Introduction

टोपोइसोमेरेस डीएनए-संशोधित एंजाइमों के वर्ग से संबंधित हैं और इनमें से कई मानव रोगों 1,2,3,4,5,6 के लिए बायोमार्कर के रूप में उपयोगी साबित हुए हैं। टीओपी 1 सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे डीएनए प्रतिकृति, जीन प्रतिलेखन, पुनर्संयोजन और क्रोमोसोमल अलगाव 7 से जुड़े टोपोलॉजिकल तनाव को हल करने में शामिलहै। टीओपी 1 एक तंत्र द्वारा नकारात्मक और सकारात्मक सुपरकॉइल दोनों को हल कर सकता है जिसमें डीएनए 8,9 में क्षणिक एकल-फंसे हुए ब्रेक का गठन शामिल है। डीएनए से जुड़ने के बाद, टीओपी 1 सक्रिय साइट टायरोसिन (टायर 723) को फॉस्फोडिएस्टर रीढ़ की हड्डी पर न्यूक्लियोफिलिक हमला करने के लिए रखता है। एक टीओपी 1-डीएनए क्लीवेज कॉम्प्लेक्स तब एंजाइम सहसंयोजक रूप से टूटे हुए डीएनए स्ट्रैंड के 3'-अंत से जुड़ा होता है। यह क्लीवर स्ट्रैंड के 5'-एंड को बरकरार स्ट्रैंड के चारों ओर घूमने की अनुमति देकर टोरसनल तनाव को जारी करता है। अंत में, 5'-एंड का हाइड्रॉक्सिल समूह 3'-फॉस्फोटायरोसिल बॉन्ड पर न्यूक्लियोफिलिक हमला करता है। नतीजतन, टीओपी 1 जारी किया जाता है, और डीएनए बैकबोनको बहाल किया जाता है।

टॉप 1 उत्प्रेरक चक्र के चरणों की जांच करने के लिए कई परख विकसित किए गए हैं, जिनमें विश्राम परख10, इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख (ईएमएसए) 11,12, डीएनए आत्महत्या दरार-बंधाव परख13,14, और एंजाइमों के विवो कॉम्प्लेक्स (आईसीई) परख15 शामिल हैं। . हालांकि, इन परखों की कई सीमाएं हैं क्योंकि वे जेल वैद्युतकणसंचलन पर निर्भर हैं, जिसके लिए डीएनए इंटरकैलेटिंग एजेंटों की आवश्यकता होती है, या उन्हें अत्यधिक विशिष्ट प्रशिक्षण और उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, परख को बेहतर प्रदर्शन करने के लिए बड़ी मात्रा में शुद्ध टीओपी 1 एंजाइम (विश्राम परख के लिए 1 से 5 एनजी और ईएमएसए और क्लीवेज-लिगेशन परख के लिए 50 से 200 एनजी तक) या कम से कम 106 कोशिकाओं से अर्क की आवश्यकता होती है। इसलिए, एक अत्यधिक संवेदनशील विधि जो कच्चे जैविक नमूनों में और एकल उत्प्रेरक घटना स्तर पर टीओपी 1 गतिविधि का विशिष्ट पता लगाने में सक्षम बनाती है, जिसे आरईईएडी परख कहा जाता है, विकसितकिया गया है।

यहां, आरईईएडी परख16 का उपयोग करके टीओपी 1 गतिविधि का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। परख का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1 में दर्शाया गया है। एक कस्टम-डिज़ाइन किया गया सिलिकॉन ग्रिड ग्लास-स्लाइड मल्टीवेल सेटअप बनाने के लिए एक कार्यात्मक स्लाइड से जुड़ा हुआ है, जिसे निम्नलिखित में वेलमेकर कहा जाता है (चित्रा 1 ए)। इसके बाद स्लाइड के कुओं में कार्यात्मक एनएचएस समूहों के लिए 5'-एमिनो संशोधित प्राइमर का युग्मन होता है (चित्रा 1 बी)। टीओपी 1-मध्यस्थता दरार और बंधाव प्रतिक्रिया एक विशिष्ट डीएनए सब्सट्रेट को एक बंद सर्कल में परिवर्तित करती है। टॉप 1-विशिष्ट सब्सट्रेट (चित्रा 1 सी) अनायास एक डंबल-आकार में फोल्ड हो जाता है जिसमें एक डबल-फंसे हुए स्टेम और दो एकल-फंसे हुए लूप होते हैं। लूप में से एक सतह-लंगर प्राइमर का पूरक है। स्टेम क्षेत्र में एक पसंदीदा टीओपी 1 दरार साइट होती है जो 3'-एंड और 5'-हाइड्रॉक्सिल ओवरहैंग से ऊपर की ओर तीन आधार होती है। सब्सट्रेट का परिपत्रीकरण या तो सेल / ऊतक अर्क (चित्रा 1 सी) या पुनः संयोजक, शुद्ध टीओपी 1 (चित्रा 1 डी) का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।

जब सब्सट्रेट को टीओपी 1 द्वारा छोड़ दिया जाता है, तो एंजाइम क्षणिक रूप से 3'-अंत से बंध जाता है और तीन-बेस टुकड़ा फैल जाता है, जिससे 5'-ओवरहैंग सब्सट्रेट को नष्ट करने और टीओपी 1-मध्यस्थता बंधाव की सुविधा प्रदान करता है। बंधाव के परिणामस्वरूप सब्सट्रेट का परिपत्रीकरण होता है और बाद में टीओपी 1 का पृथक्करण होता है। बंद सर्कल को सतह-लंगर वाले प्राइमर (चित्रा 1 ई) में संकरित किया जाता है और इसका उपयोग फी 29 पोलीमरेज़ द्वारा मध्यस्थता में इज़ोटेर्मल रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया जाता है, जो स्ट्रैंड विस्थापन के साथ आरसीए कर सकता है, जिससे 103 अग्रानुक्रम दोहराव उत्पाद उत्पन्न होते हैं। आरसीए चरण के दौरान, फ्लोरोसेंटली लेबल (चित्रा 1 एफ) या बायोटिन-युग्मित (चित्रा 1 जी) न्यूक्लियोटाइड को 17 शामिल किया जा सकताहै। फ्लोरोसेंटली लेबल न्यूक्लियोटाइड्स का समावेश या तो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप या फ्लोरेसेंस स्कैनर का उपयोग करके आरसीपी का पता लगाने की अनुमति देता है। वैकल्पिक रूप से, एक हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी)-युग्मित एंटी-बायोटिन एंटीबॉडी (चित्रा 1 एच) बायोटिनाइलेटेड न्यूक्लियोटाइड्स को बांध सकता है, इस प्रकार या तो एन्हांस्ड केमिलुमिनेसेंस (ईसीएल) का उपयोग करके या 3,3', 5,5'-टेट्रामिथाइलबेंजिडीन (टीएमबी) के एक पता लगाने योग्य रंग में रूपांतरण करके रोल्ड सर्कल उत्पादों (आरसीपी) का पता लगाने की अनुमति देता है। आरसीए एक रैखिक प्रतिक्रिया गतिज का अनुसरण करता है, जिससे आरईईएडी परख सीधे मात्रात्मक हो जाती है, क्योंकि एक आरसीपी एकल टीओपी 1-मध्यस्थता दरार-बंधाव प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है। यहां यह दिखाया गया है कि इस परख का उपयोग टीओपी 1 गतिविधि को शुद्ध पुनः संयोजक एंजाइम के रूप में या कच्चे नमूनों से निकाला जा सकता है और एंटी-टॉप 1 ड्रग्स स्क्रीनिंग टूल के रूप में किया जा सकता है।

Protocol

नोट: सामग्री की तालिका में आवश्यक बफर रचनाओं, उपकरणों और अन्य सामग्रियों की एक सूची खोजें।

1. सेल संस्कृति

  1. उपयुक्त माध्यम में पसंदीदा कोशिकाओं को कल्चर करें और उन्हें निर्देशों के अनुसार उगाएं। एक उदाहरण के रूप में, कैको 2, कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा-व्युत्पन्न कोशिकाओं को न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) में 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन और 100 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक करें। एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2/95% वायु वातावरण) में सेल संस्कृतियों को बनाए रखें। कोशिकाओं को टिशू कल्चर फ्लास्क में प्लेट करें और कोशिकाओं को 70% स्थिरता पर बनाए रखने के लिए हर 3 दिनों में विभाजित करें।
  2. ट्रिप्सिन उपचार (0.25% ट्रिप्सिन, 0.02% ईडीटीए समाधान) द्वारा 70% कंफ्लुएंट फ्लास्क से कोशिकाओं को काटें और फॉस्फेट बफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ धोएं।
  3. सेल एकाग्रता को 0.5 × 106 कोशिकाओं / ट्यूब में समायोजित करने के लिए पीबीएस में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर घुमाएं और सुपरनैटेंट को सावधानी से एस्पिरेट करें।
    नोट: आरईईएडी के लिए उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं को ताजा इस्तेमाल किया जाना चाहिए और बर्फ पर रखा जाना चाहिए। Caco2 कोशिकाओं के साथ प्राप्त परिणाम हाल ही मेंप्रकाशित किए गए हैं। परख को विभिन्न प्रकार की सेल लाइनों के साथ परीक्षण किया गया है, जिसमें बृहदान्त्र, स्तन, फेफड़े और गर्भाशय ग्रीवा के कैंसर व्युत्पन्न कोशिकाएं 18,19,20,21,22,23 शामिल हैं, लेकिन इसका उपयोग टीओपी 1 युक्त सभी कच्चे जैविक नमूनों के साथ किया जा सकता है, जैसे ऊतक, रक्त और लार।

2. कार्यात्मक स्लाइड्स की तैयारी

  1. कस्टम-डिज़ाइन किए गए सिलिकॉन आइसोलेटर ग्रिड को कार्यात्मक स्लाइड में संलग्न करें, जिससे वेलमेकर बन सके। हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए सिलिकॉन दबाएं ( चित्रा 1 ए देखें)।
  2. 1x प्रिंट बफर में 5 μM 5'-एमिनो प्राइमर का मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक कुएं में मिश्रण का 4 μL जोड़ें और वेलेमर को 15 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान पर संतृप्त NaCl के साथ संकरण कक्ष में रखें, प्रकाश से सुरक्षित।
    नोट: संतृप्त NaCl से भरे पिपेट टिप बॉक्स का उपयोग करके एक संकरण कक्ष आसानी से बनाया जा सकता है। संकरण में न्यूनतम 16 घंटे और अधिकतम 72 घंटे लगते हैं। चित्रा 1 बी में 5'-एमिनो प्राइमर का अनुक्रम देखें। अमीनो-संशोधित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के बंधन की अनुमति देने के लिए स्लाइड्स को एनएचएस समूहों के साथ कार्यात्मक किया जाता है।

3. बंद परिपत्र सब्सट्रेट्स का उत्पादन

  1. पुनः संयोजक टीओपी 1 या सेल अर्क के साथ बंद परिपत्र सब्सट्रेट की तैयारी।
    1. लाइसिस बफर के 500 μL में 0.5 × 106 कोशिकाओं की एक कोशिका गोली को 1,000 कोशिकाओं / μL के सेल घनत्व तक पहुंचने के लिए।
    2. 5 μM TOP1-विशिष्ट सब्सट्रेट के 2 μL का एक वृत्त मिश्रण तैयार करें (सब्सट्रेट का अनुक्रम निम्नानुसार है: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA AAT TCT TTT AGA TCC TCC TTC AAT GCA TTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA AGA CGA AGA AGA AGA-3') और 2 μL रिकॉम्बिनेंट TOP1 एंजाइम का 2 μL या 2 μL रिकॉम्बिनेंट TOP1 एंजाइम का एक वृत्त मिश्रण तैयार करें (16 चरण 1 में 2 μL सेल एक्सट्रैक्ट (चरण 3.1) 1x TOP1 प्रतिक्रिया बफर।
      नोट: उपयोग किए गए पुनः संयोजक TOP1 की एकाग्रता चुनी गई रीडआउट विधि पर निर्भर करती है ( चित्र 2, चित्रा 3, चित्रा 4 और चित्रा 5 देखें)। चित्रा 1 सी में टॉप 1-विशिष्ट सब्सट्रेट का अनुक्रम देखें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ( चित्रा 1 सी, डी देखें)।
    4. 1% एसडीएस के 2 μL जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें।
  2. दवाओं की उपस्थिति में बंद परिपत्र सब्सट्रेट्स की तैयारी
    1. 1x TOP1 रिएक्शन बफर के 14 μL में 5 μM TOP1-विशिष्ट सब्सट्रेट के 2 μL और 100% DMSO के 1 μL या 1.6 mM कैंप्टोथेसिन (CPT) के 1 μL का एक वृत्त मिश्रण तैयार करें। 5 ng/μL पुनः संयोजक TOP1 एंजाइम का 2 μL जोड़ें।
      नोट: अन्य छोटे अणु यौगिकों या दवाओं का उपयोग किया जा सकता है। उस स्थिति में, यौगिक का एक अनुमापन किया जाना चाहिए। यदि यौगिक डीएमएसओ के अलावा एक विलायक में घुल जाता है, तो इसका उपयोग डीएमएसओ के बजाय नियंत्रण के रूप में किया जाना चाहिए।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. 1% एसडीएस के 2 μL जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें।

नोट: चरण 3 को चरण 2 के समानांतर शुरू किया जा सकता है, और मंडलियों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, डीएनए सर्कल को चरण 4 के रूप में एक ही समय में तैयार किया जा सकता है और तुरंत उपयोग किया जा सकता है। चित्रा 1 सी में टॉप 1-विशिष्ट सब्सट्रेट का अनुक्रम देखें। सब्सट्रेट एक डबल स्टेम क्षेत्र के साथ एक डंबल आकार में फोल्ड होता है जिसमें एक पसंदीदा टॉप 1 क्लीवेज साइट और दो एकल-फंसे हुए लूप होते हैं। ओपन डंबल सब्सट्रेट को टीओपी 1-मध्यस्थता दरार और बंधाव द्वारा एक बंद परिपत्र सब्सट्रेट में परिवर्तित किया जाता है और इसके बाद इसे सर्कल के रूप में जाना जाता है। चूंकि 5'-एमिनो प्राइमर की अधिकता है, इसलिए खुले और बंद टीओपी 1-विशिष्ट सब्सट्रेट्स के बीच कोई प्रतिस्पर्धा नहीं होगी।

4. वेलमेकर को ब्लॉक करना

  1. वेलमेकर को बफर 1 से भरे 5 सेमी x 5 सेमी ट्रे में डुबोएं जिसे 50 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट किया गया था। पिपेट का उपयोग करके, यह सुनिश्चित करने के लिए कुओं के अंदर तरल को धक्का दें कि हवा के बुलबुले नहीं हैं। 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. बफर 1 निकालें और 2 x 1 मिनट को डीएच2ओ के साथ धो लें।
  3. बफर 2 जोड़ें जिसे 50 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया है। सुनिश्चित करें कि कुओं में हवा के बुलबुले न हों। 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. 2 x 1 मिनट को डीएच2ओ के साथ धो लें।
  5. 1 मिनट के लिए 70% ईटीओएच के साथ धो लें। हाथ से जोर से हिलाएं।
  6. वेलमेकर सेटअप को एयर-ड्राई होने दें।
    नोट: कुओं को सुखाने के लिए संपीड़ित हवा का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, पाश्चर पिपेट का उपयोग करके हवा उड़ाना संभव है। सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले कुएं सूख गए हैं।

5. वेलमेकर के लिए मंडलियों का संकरण

  1. प्रत्येक संबंधित कुएं में 4 μL वृत्त (चरण 3 में बनाया गया) जोड़ें।
  2. वेलमेकर को 37 डिग्री सेल्सियस पर डीएच2ओ के साथ 1 घंटे के लिए आर्द्रता कक्ष में रखें।
    नोट: डीएच2ओ से भरे पिपेट युक्तियों के लिए एक बॉक्स का उपयोग करके एक आर्द्रता कक्ष बनाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, संकरण आर्द्रता कक्ष में 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर किया जा सकता है।

6. धोना

  1. बफर 3 के साथ वेलमेकर को धो लें।
  2. बफर 3 को हटा दें और बफर 4 से बदलें।
  3. बफर 4 निकालें और 70% ईटीओएच से धो लें।
  4. ईटीओएच को हटा दें और वेलमेकर को सूखने दें।
    नोट: स्लाइड को पूरी तरह से डुबोकर 5 सेमी x 5 सेमी ट्रे में 1 मिनट के लिए सभी धोने के चरण किए जाते हैं। हमेशा सुनिश्चित करें कि कुओं के अंदर हवा के बुलबुले न हों।

7. रोलिंग सर्कल प्रवर्धन

  1. 1x Phi29 रिएक्शन बफर का एक RCA मिश्रण तैयार करें, जिसमें 0.2 μg/μL BSA, Phi29 पोलीमरेज़ की 1 इकाई, और फ्लोरेसेंस रीडआउट के लिए या तो 0.25 mM dNTP और 0.0125 mM ATTO-488-dUTP, या 0.1 mM DATP, 0.1 mM DTTP, 0.1 mM dGTP, 0.09 mM dCTP, और 0.09 mM dCTP के साथ पूरक किया जाता है। प्रत्येक कुएं में 4 μL जोड़ें। चित्र 1E देखें।
    नोट: आरसीए मिश्रण की तैयारी बर्फ पर की जानी चाहिए। आरसीए में फ्लोरोसेंट न्यूक्लियोटाइड को शामिल करते समय, फ्लोरोफोरेस की रक्षा के लिए इस चरण से प्रत्यक्ष प्रकाश से बचें।
  2. आर्द्रता कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। उपयोग किए गए फ्लोरोसेंट न्यूक्लियोटाइड के मामले में, अंधेरे में आर्द्रता कक्ष सेट करें। चित्र 1एफ, जी देखें।

8. धोना

  1. केमिलुमिनेसेंस या कलरमेट्रिक रीडआउट प्रोटोकॉल के लिए, वेलमेकर को चरण 6 में धोएं, और फिर चरण 11 पर आगे बढ़ें।
  2. फ्लोरेसेंस रीडआउट प्रोटोकॉल के लिए, निम्नलिखित चरणों में धोने से पहले चिमटी का उपयोग करके सिलिकॉन ग्रिड को हटा दें।
    1. बफर 3 में 10 मिनट के लिए स्लाइड धो लें।
    2. बफर 3 को हटा दें और बफर 4 से बदलें। 5 मिनट के लिए धो लें।
    3. बफर 4 निकालें और 70% ईटीओएच में 1 मिनट के लिए धो लें।
    4. ईटीओएच को हटा दें और वेलमेकर को सूखने दें।

9. फ्लोरेसेंस स्कैनर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट रोलिंग सर्कल उत्पादों का विज़ुअलाइज़ेशन

  1. फ्लोरोफोरे के अनुरूप फिल्टर का उपयोग करके फ्लोरेसेंस स्कैनर में स्लाइड को स्कैन करें। अधिकतम फोटोमल्टीप्लायर का उपयोग करें जो संतृप्ति नहीं देता है।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में छवि अधिग्रहण के लिए उपयोग किया जाने वाला फ्लोरोसेंट स्कैनर 473 एनएम लेजर और एफएएम फिल्टर-उत्तेजना 490 एनएम, उत्सर्जन 520 एनएम से लैस है।
  2. चित्र को ImageJ में आयात करें और छवि प्रकार को 8-बिट में बदलें (छवि | प्रकार | 8-बिट)। बैंड को अलग से मापने के लिए, टूलबार से आयत ड्राइंग टूल का उपयोग करके मापा क्षेत्र को सीमित करें। वांछित क्षेत्र खींचें और तीव्रता को मापें (विश्लेषण | माप)। फिर, मूल रूप से खींचे गए क्षेत्र को अगले बैंड में ले जाएं और मापें।
  3. वांछित सॉफ़्टवेयर में डेटा प्लॉट करें। इमेजजे से निकाले गए परिमाणीकरण सहित प्रतिनिधि छवियों को चित्र 2 में दर्शाया गया है।

10. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरोसेंट रोलिंग सर्कल उत्पादों का विज़ुअलाइज़ेशन

  1. एक ईटीओएच प्रतिरोधी पेन के साथ, सिलिकॉन ग्रिड को हटाने से पहले कुओं की स्थिति खींचें और चरण 8.2 में स्लाइड को धो लें। धोने के चरणों के बाद, स्लाइड को 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (DAPI) के बिना 1 μL माउंटिंग माध्यम के साथ माउंट करें और एक कवर ग्लास जोड़ें। कैमरे में विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए, स्लाइड को 76 मिमी x 26 मिमी माइक्रोस्कोप स्लाइड पर गोंद करें।
  2. 60x तेल विसर्जन उद्देश्य और एक कैमरे से लैस प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विश्लेषण करें। प्रत्येक नमूने / कुएं की 12-15 छवियां लें।
  3. चित्रों को ImageJ पर आयात करें और छवियों को ढेर करें (छवि | ढेर | स्टैक करने के लिए छवि)। छवि प्रकार को 8-बिट में बदलें (छवि | प्रकार | 8-बिट)।
  4. दहलीज सेट करें (छवि | समायोजित करें | दहलीज)।
    1. दहलीज को निम्नानुसार सेट करें: निचली पट्टी सेट करें और ऊपरी पट्टी को समायोजित करें ताकि केवल सही संकेत लाल हों और पृष्ठभूमि काली हो। सुनिश्चित करें कि वास्तविक संकेतों के गायब होने से पहले सीमा जितना संभव हो उतना कम है।
    2. व्यक्तिगत छवियों के माध्यम से स्वीप करें और सुनिश्चित करें कि वे दहलीज सेट करने से पहले छवियों के अनुरूप हैं। ध्यान दें कि सीमा प्रयोग से प्रयोग में बदल सकती है।
  5. संकेतों की गणना करें (विश्लेषण | कणों का विश्लेषण करें)। सुनिश्चित करें कि ImageJ सेटिंग्स में सारांशित फ़ील्ड चेक किया गया है।
    1. परिणामों को आगे डेटा प्रोसेसिंग के लिए स्प्रेडशीट या अन्य सॉफ़्टवेयर पर निर्यात करें। इमेजजे से निकाले गए परिमाणीकरण सहित प्रतिनिधि छवियों को चित्रा 3 में दर्शाया गया है।

11. एचआरपी-संयुग्मित एंटी-बायोटिन एंटीबॉडी का बायोटिन-लेबल रोलिंग सर्कल उत्पादों से युग्मन

  1. प्रत्येक कुएं में 5% गैर-वसा स्किम्ड दूध और 5% बीएसए के साथ पूरक बफर 5 में 1:300 एचआरपी-संयुग्मित एंटी-बायोटिन एंटीबॉडी के 4 μL जोड़ें।
  2. आर्द्रता कक्ष में 15-25 डिग्री सेल्सियस पर 50 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ( चित्र 1 एच देखें)।
  3. बफर 5 के साथ 3 x 3 मिनट धो लें।
  4. वेलमेकर को सुखाएं।

12. बायोटिन-लेबल रोलिंग सर्कल उत्पादों का विज़ुअलाइज़ेशन

  1. ईसीएल के साथ विज़ुअलाइज़ेशन
    1. उपयोगसे ठीक पहले ईसीएल ल्यूमिनोल के 40 μL और H2 O 2के 40 μL मिलाएं। प्रत्येक कुएं में 2 μL जोड़ें।
    2. सीसीडी कैमरे या एक्स-रे फिल्मों का उपयोग करके स्लाइड की कल्पना करें।
  2. TMB के साथ विज़ुअलाइज़ेशन
    1. चरण 11.4 के बाद, सिलिकॉन ग्रिड को हटा दें। फिर, पूरी स्लाइड के शीर्ष पर 400 μL TMB जोड़ें और स्लाइड को आर्द्रता कक्ष में रखें। रंग विकास के लिए ~ 5-10 मिनट तक प्रतीक्षा करें। रंग विकास के बाद, स्लाइड को 70% ईटीओएच के साथ धो लें।
    2. नग्न आंखों के साथ रंग विकास की कल्पना करें। फोटो कैमरा या मोबाइल फोन के साथ स्लाइड की एक तस्वीर लें।
  3. चित्र को ImageJ में आयात करें और छवि प्रकार को 8-बिट में बदलें (छवि | प्रकार | 8-बिट)। बैंड को अलग से मापने के लिए, टूलबार से आयत ड्राइंग टूल का उपयोग करके मापा क्षेत्र को सीमित करें। वांछित क्षेत्र खींचें और तीव्रता को मापें (विश्लेषण | माप)। फिर, मूल रूप से खींचे गए क्षेत्र को अगले बैंड में ले जाएं और मापें।
  4. वांछित सॉफ़्टवेयर में डेटा प्लॉट करें। इमेजजे से निकाले गए परिमाणीकरण सहित प्रतिनिधि छवियों को चित्रा 4, चित्रा 5 और चित्रा 6 में दर्शाया गया है।

Representative Results

यहां, आरईईएडी परख का उपयोग करके टीओपी 1 गतिविधि का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत कियागया है। प्रोटोकॉल का उपयोग चार अलग-अलग रीडआउट विधियों का उपयोग करके पुनः संयोजक टीओपी 1 गतिविधि का पता लगाने के लिए किया गया था: फ्लोरेसेंस स्कैनर, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप, केमिल्यूमिनेसेंस और कलरमेट्रिक। प्रोटोकॉल का उपयोग केमो2 कोशिकाओं से निकाले गए टॉप 1 की गतिविधि का पता लगाने के लिए भी किया गया था, कच्चे अर्क के उदाहरण के रूप में, केमिलुमिनेसेंस या टीएमबी रीडआउट के साथ। इसके अलावा, प्रोटोकॉल का उपयोग दवा स्क्रीनिंग टूल के रूप में किया गया था, ताकि सीपीटी द्वारा पुनः संयोजक टीओपी 1 गतिविधि के निषेध का पता लगाया जा सके, एक टीओपी 1-विशिष्ट अवरोधक के उदाहरण के रूप में, केमिल्यूमिनेसेंस रीडआउट विधि का उपयोग करके।

फ्लोरेसेंस रीडआउट का उपयोग करके टॉप 1 गतिविधि का विश्लेषण करते समय प्राप्त परिणाम चित्रा 2 और चित्रा 3 में दर्शाए गए हैं। फ्लोरोसेंट स्लाइड का एक प्रतिनिधि स्कैन और परिणामस्वरूप परिमाणीकरण चित्रा 2 में दिखाया गया है। जैसा कि परिमाणीकरण से स्पष्ट है, इस रीडआउट में टॉप 1 की 12.5 एनजी की पहचान सीमा है। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप रीडआउट का उपयोग करते समय प्राप्त प्रतिनिधि छवियों और परिणामी परिमाणीकरण को चित्रा 3 में दिखाया गया है। इस रीडआउट विधि का उपयोग करके, पहचान सीमा TOP1 के 0.1 ng जितनी कम है। केमिल्यूमिनेसेंस रीडआउट का उपयोग करके टॉप 1 गतिविधि का विश्लेषण करते समय प्राप्त परिणामों को चित्रा 4 में दर्शाया गया है, और कलरिमेट्रिक रीडआउट के परिणामों को चित्रा 5 में दर्शाया गया है। इन रीडआउट विधियों की पहचान सीमा TOP1 के 6 ng पर या 312 Caco2 कोशिकाओं से निकाले गए TOP1 के रूप में है। चित्रा 6 दवा स्क्रीनिंग अनुप्रयोग के एक उदाहरण के रूप में 80 μM CPT या DMSO की उपस्थिति में TOP1 गतिविधि के माप को दर्शाता है। प्रतिनिधि छवि और तीन स्वतंत्र प्रयोगों के परिणामस्वरूप परिमाणीकरण से पता चलता है कि सीपीटी अपेक्षित24,25 के अनुसार सब्सट्रेट के टीओपी 1-मध्यस्थता परिपत्रीकरण को रोकता है।

Figure 1
चित्र 1: REEAD प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (A, B) कार्यात्मक स्लाइड्स की तैयारी। सिलिकॉन ग्रिड कार्यात्मक स्लाइड से जुड़ा हुआ है। फिर, 5'-एमिनो प्राइमर को स्लाइड के साथ जोड़ा जाता है, जिससे टीओपी 1-विशिष्ट सब्सट्रेट का प्रवर्धन सक्षम होता है। (C, D) बंद परिपत्र सब्सट्रेट्स का उत्पादन। टॉप 1-विशिष्ट सब्सट्रेट डबल-फंसे हुए स्टेम में एक पसंदीदा टॉप 1 क्लीवेज साइट और दो एकल-फंसे लूपों में से एक में प्राइमर-बाइंडिंग अनुक्रम के साथ एक डंबल आकार में फोल्ड हो जाता है। (सी) टीओपी 1 कोशिकाओं के लाइसिस पर जारी किया जाता है। टीओपी 1-मध्यस्थता दरार और बंधाव पर, सब्सट्रेट को एक बंद सर्कल में परिवर्तित किया जाता है; (डी) शुद्ध, पुनः संयोजक टीओपी 1 का उपयोग किया जाता है। (ई) रोलिंग सर्कल प्रवर्धन। बंद गोलाकार सब्सट्रेट्स को सतह-लंगर वाले प्राइमर में संकरित किया जाता है और फी 29 पोलीमरेज़ का उपयोग करके आरसीए द्वारा प्रवर्धित किया जाता है। आरसीए को या तो फ्लोरोसेंट न्यूक्लियोटाइड्स को शामिल करके प्राप्त किया जा सकता है जैसा कि एफ में या बायोटिनाइलेटेड न्यूक्लियोटाइड्स में जी में होता है। फ्लोरोसेंट रोलिंग सर्कल उत्पादों को या तो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप या फ्लोरेसेंस स्कैनर का उपयोग करके देखा जाता है। (एच) एचआरपी-संयुग्मित एंटी-बायोटिन एंटीबॉडी का युग्मन। बायोटिनिलेटेड रोलिंग सर्कल उत्पादों को एचआरपी-संयुग्मित एंटी-बायोटिन एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। सिग्नल विकास एचआरपी एंजाइम द्वारा मध्यस्थ होता है, और संकेतों को या तो ईसीएल द्वारा देखा जाता है और सीसीडी कैमरे का उपयोग करके या टीएमबी का उपयोग करके एक रंगीन विज़ुअलाइज़ेशन उत्पन्न किया जाता है। संक्षिप्तीकरण: आरईईएडी = रोलिंग सर्कल एन्हांस्ड एंजाइम गतिविधि का पता लगाना; आरसीए = रोलिंग सर्कल प्रवर्धन; TOP1 = टोपोइसोमेरेस 1; एचआरपी = हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज; ईसीएल = बढ़ी हुई केमिल्यूमिनेसेंस; टीएमबी = 3,3', 5,5'-टेट्रामिथाइलबेंजिडाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरेसेंस स्कैनर का उपयोग करके टॉप 1 गतिविधि का माप। फ्लोरेसेंस स्कैनर रीडआउट प्रोटोकॉल का उपयोग करके टीओपी 1 के 3-50 एनजी की गतिविधि का विश्लेषण करते समय बाएं पैनल स्लाइड की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। दायां पैनल परिणामी परिमाणीकरण दिखाता है। वेल्च के सुधार के साथ टी-टेस्ट, पी = 0.0064, एन = 4। संक्षिप्त नाम: TOP1 = टोपोइसोमेरेस 1. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके टीओपी 1 गतिविधि का माप। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप रीडआउट प्रोटोकॉल का उपयोग करके टीओपी 1 के 0.1-12.5 एनजी की गतिविधि का विश्लेषण करते समय बाएं पैनल स्लाइड की प्रतिनिधि छवियां दिखाता है। ध्यान दें कि छवियां बिंदुओं को ठीक से दिखाने के लिए क्रॉप्ड संस्करण हैं। इस कारण से, वे दाएं पैनल में दिखाए गए परिमाणीकरण में संकेतों की संख्या से मिलते जुलते नहीं हैं। वेल्च के सुधार के साथ टी-टेस्ट, पी = 0.0136, एन = 3। संक्षिप्त नाम: TOP1 = टोपोइसोमेरेस 1. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: केमिल्यूमिनेसेंस रीडआउट का उपयोग करके TOP1 गतिविधि का माप। (A) बाएं पैनल केमिलुमिनेसेंस रीडआउट प्रोटोकॉल का उपयोग करके TOP1 के 3-50 ng की गतिविधि का विश्लेषण करते समय स्लाइड की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। दायां पैनल परिणामी परिमाणीकरण दिखाता है। वेल्च के सुधार के साथ टी-परीक्षण, पी < 0.0001, एन = 4। (बी) बाएं पैनल केमिलुमिनेसेंस रीडआउट प्रोटोकॉल का उपयोग करके 156-40,000 कैको 2 कोशिकाओं से निकाले गए टीओपी 1 की गतिविधि का विश्लेषण करते समय स्लाइड की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। दायां पैनल परिणामी परिमाणीकरण दिखाता है। वेल्च के सुधार के साथ टी-टेस्ट, पी = 0.0224, एन = 3। संक्षेप: टॉप 1 = टोपोइसोमेरेस 1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: कलरिमेट्रिक रीडआउट का उपयोग करके TOP1 गतिविधि का माप। (A) बाएं पैनल कलरिमेट्रिक रीडआउट प्रोटोकॉल का उपयोग करके TOP1 के 3-50 ng का विश्लेषण करते समय स्लाइड की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। दायां पैनल परिणामी परिमाणीकरण दिखाता है। वेल्च के सुधार के साथ टी-टेस्ट, पी = 0.0012, एन = 4। (बी) बाएं पैनल कलरिमेट्रिक रीडआउट प्रोटोकॉल का उपयोग करके 156-40,000 कैको 2 कोशिकाओं से निकाले गए टीओपी 1 की गतिविधि का विश्लेषण करते समय स्लाइड की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। दायां पैनल परिणामी परिमाणीकरण दिखाता है। वेल्च के सुधार के साथ टी-टेस्ट, पी = 0.0117, एन = 3। संक्षेप: TOP1 = टोपोइसोमेरेस 1; टीएमबी = 3,3', 5,5'-टेट्रामिथाइलबेंजिडाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: केमिलुमिनेसेंस रीडआउट प्रोटोकॉल का उपयोग करके दवा उपचार के बाद टीओपी 1 गतिविधि का माप। बाएं पैनल 1 मिनट के लिए 5% डीएमएसओ या 80 एसएम सीपीटी की उपस्थिति में टीओपी 1 के 10 एनजी का विश्लेषण करते समय स्लाइड की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है। दायां पैनल परिणामी परिमाणीकरण दिखाता है। वेल्च के सुधार के साथ टी-टेस्ट, पी = 0.0017, एन = 3। संक्षेप: TOP1 = टोपोइसोमेरेस 1; सीपीटी = कैंपटोथेसिन; डीएमएसओ = डाइमिथाइलसल्फोक्साइड; नकारात्मक = नकारात्मक नियंत्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

टोपोइसोमेरेस डीएनए-संशोधित एंजाइमों के एक वर्ग का प्रतिनिधित्व करते हैं जो उच्च अनुसंधान और नैदानिक रुचि को आकर्षित करते हैं, एंटीकैंसर उपचार में या संक्रामक रोगों की लड़ाई में संभावित प्रभाव के साथ छोटे-अणु यौगिकों का लक्ष्य होता है। इसके अलावा, मानव टीओपी 1 की गतिविधि कैंसर के पूर्वानुमान और उपचार 18,19,23 का एक प्रभावी बायोमार्कर साबित हुई है। यद्यपि यह टीओपी 1 गतिविधि है जो कीमोथेरेपी अवरोधक26 की प्रभावकारिता को प्रभावित करती है, यह अक्सर डीएनए-आरएनए की मात्रा या टीओपी 1 की मात्रा है जिसका नैदानिक सेटिंग्स में मूल्यांकन किया जाता है। यह तेज़, आसान और जेल-आधारित मुक्त उपकरणों की कमी के कारण है जो हर प्रयोगशाला सेटिंग्स में टोपोइसोमेरेस गतिविधि का सटीक और सटीक परिमाणीकरण प्रदान कर सकते हैं।

यहां, आरईईएडी परख के लिए एक प्रोटोकॉल जो जेल-मुक्त तरीके से टीओपी 1 गतिविधि के माप की अनुमति देता है, का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं से शुद्ध टीओपी 1 या कच्चे अर्क को एक विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए डीएनए डंबल के आकार के सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, जो टीओपी 1 द्वारा मध्यस्थता में दरार / बंधाव पर एक बंद, गोलाकार अणु में परिवर्तित हो जाता है। फिर मंडलों को कांच की सतह पर संकरित किया जाता है और आरसीए द्वारा प्रवर्धित किया जाता है। स्लाइड पर होने वाली प्रतिक्रियाओं के प्रदर्शन में उपयोग में आसानी की अनुमति देने के लिए, ग्लास से एक सिलिकॉन ग्रिड जुड़ा हुआ है, जिससे अलग-अलग कुएं बनते हैं जहां प्रतिक्रियाएं होती हैं। इस तरह, प्रोटोकॉल एक मल्टीवेल सिस्टम का लाभ उठाता है- एक सिलिकॉन ग्रिड-जिसे वेलमेकर कहा जाता है।

प्रोटोकॉल का उपयोग कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा कोशिकाओं कैको 2 से निकाले गए पुनः संयोजक टीओपी 1 और टीओपी 1 की गतिविधि का पता लगाने के लिए किया गया था, जिसका उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया गया था। इसके अलावा, दवा स्क्रीनिंग टूल के रूप में उपयोग किए जाने वाले आरईईएडी के एक उदाहरण के रूप में, प्रोटोकॉल का उपयोग प्रसिद्ध टीओपी 1 अवरोधक सीपीटी24,25 द्वारा टीओपी 1 गतिविधि अवरोध का पता लगाने के लिए किया गया था। परख को विभिन्न रीडआउट विधियों-फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ा गया था, जो एक उच्च संवेदनशीलता देता है, और एक फ्लोरेसेंस स्कैनर, केमिल्यूमिनेसेंस, या कलरमेट्रिक, जिसके लिए कम विशेष उपकरण और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। अत्यधिक संवेदनशील फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप रीडआउट में अच्छी गुणवत्ता वाले फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप सेटिंग, कुशल कर्मियों और समय लेने वाली छवि अधिग्रहण और विश्लेषण की आवश्यकता की सीमाएं हैं।

इन कारणों से, प्रतिदीप्ति स्कैनर रीडआउट जो संवेदनशीलता की कीमत पर भी तेजी से अधिग्रहण और विश्लेषण की अनुमति देता है। फ्लोरेसेंस स्कैनर की कमी के मामले में, दो उत्कृष्ट विकल्प, केमिलुमिनेसेंस और कलरमेट्रिक रीडआउट विधियों पर विचार किया जा सकता है। दोनों विधियां तेज और सरल हैं, जिन्हें किसी महंगे उपकरण या विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है। सभी रीडआउट प्रारूपों में, आरईईएडी के पास अत्याधुनिक परखों की तुलना में कई फायदे हैं, जो अधिक समय लेने वाले, जेल-आधारित (इंटरकैलेटिंग एजेंटों की आवश्यकताओं के साथ), और कम सीधे मात्रात्मक हैं। हालांकि, प्रस्तुत प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। दवा स्क्रीनिंग को संभालते समय, समय बिंदुओं, दवा एकाग्रता, और TOP1 राशि / DNA सब्सट्रेट के अनुपात को CPT के लिए अनुकूलित वर्णित सेटिंग्स की तुलना में अनुकूलित किया जाना चाहिए। दवा की जांच डीएनए सब्सट्रेट के साथ प्रीइन्क्यूबेशन या TOP1 एंजाइम के साथ प्रीइन्क्यूबेशन करते हुए की जा सकती है। यह टीओपी 1 को रोकने के लिए अणु की क्षमता के बारे में मूल्यवान जानकारी दे सकता है और कार्रवाई के दवा तंत्र की अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

इसके अलावा, यदि कम या अनुपस्थित संकेतों का अनुभव हो रहा है, तो यह कच्चे नमूने के अक्षम लाइसिस या प्रोटीज अवरोधकों के अनुचित उपयोग के कारण अर्क में टीओपी 1 के क्षरण के कारण सबसे अधिक संभावना है। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण परख घटकों के अपर्याप्त भंडारण के कारण भी हो सकता है, जैसे कि पुनः संयोजक टीओपी 1, फी 29 पोलीमरेज़, न्यूक्लियोटाइड, सब्सट्रेट और प्राइमर। अंत में, ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचा जाना चाहिए, क्योंकि यह नाटकीय रूप से परख प्रदर्शन को प्रभावित करता है। जब कच्चे अर्क का उपयोग किया जाता है, तो विशिष्ट जैविक नमूने की निष्कर्षण दक्षता को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है और टीओपी 1 की मात्रा और गतिविधि यहां बताए गए उदाहरण से भिन्न हो सकती है। इस कारण से, परीक्षण किए जाने वाले प्रत्येक कच्चे अर्क को उस विशेष नमूने का उपयोग करते समय परख का पता लगाने की सीमा और संवेदनशीलता की सीमा की पहचान के लिए अनुमापन की आवश्यकता होगी। प्रोटोकॉल को मानव TOP1 का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया है। अन्य यूकेरियोटिक टीओपी 1 की गतिविधि को मापा जा सकता है, लेकिन एनएसीएल एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय को एंजाइम शुद्धिकरण विधि और इष्टतम एंजाइम गतिविधि के अनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है। अधिक गोलाकार सब्सट्रेट लंबे समय तक इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप होंगे, जबकि कम गोलाकार सब्सट्रेट्स छोटे इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप होंगे।

प्रस्तुत अनुप्रयोगों के अलावा, आरईईएडी कैंसर रोगियों18 से छोटी बायोप्सी से कच्चे अर्क में टीओपी 1 गतिविधि के माप के लिए अनुमति देता है, कैंसर सेल लाइनों20,21,22 में सीपीटी के साइटोटोक्सिक एंटीकैंसर प्रभाव की भविष्यवाणी, और यहां तक कि एकल कोशिकाओं में एंजाइम गतिविधि का पता लगानेके लिए 20,21 . इसके अलावा, वेलमेकर का उपयोग करके प्रस्तुत आरईईएडी सेटिंग सिंथेटिक या प्राकृतिक यौगिकों के पुस्तकालयों की बहु-आधारित दवा स्क्रीनिंग को सक्षम बनाती है। इसके अलावा, आरईईएडी परख का एक संशोधित संस्करण, जिसे आरईईएडी सी / एल कहा जाता है, विकसित किया गया है। यह सेटअप टॉप 1 प्रतिक्रिया27 के दरार और बंधाव चरणों की अलग-अलग जांच को सक्षम बनाता है। आरईईएडी सी / एल के साथ, छोटे अणु अवरोधकों की कार्रवाई के तंत्र को निर्धारित करना संभव है और उन्हें संभावित एंटीपैरासिटिक प्रभाव 28 या एंटीकैंसर उपचार24,25 के लिए उपयोग किए जाने वाले टीओपी 1 जहर के रूप में टीओपी 1 उत्प्रेरकअवरोधकों के रूप में चिह्नित करना संभव है। अंत में, अन्य टीओपी 1 एंजाइमों की विभिन्न आवश्यकताओं (डीएनए बाइंडिंग या क्लीवेज-लिगेशन के लिए) से मेल खाने के लिए डीएनए सब्सट्रेट्स के विशिष्ट रीडिज़ाइन के साथ, आरईईएडी का उपयोग संक्रामक रोगों (जैसे कि प्लास्मोडियम फाल्सीपेरम के मामले में, मलेरिया29 का कारण बनता है), या लीशमैनिया डोनोवानी और मंकीपॉक्स वायरस (डेटा नहीं दिखाया गया है) का पता लगाने के लिए भी किया गया है। या, इसका उपयोग एंटीपैथोजेनिक प्रभाव वाले छोटे अणु यौगिकों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल टीओपी 1 क्षेत्र में वैज्ञानिकों को एंजाइम गतिविधि का पता लगाने के लिए एक आसान तरीका प्रदान करता है, जिसमें कोई अनुकूलन नहीं होता है और भविष्य में और भी व्यापक अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित होने की संभावना होती है।

Disclosures

लेखक सीटी और केएम वीपीसीआईआर बायोसाइंसेज एपीएस के कर्मचारी हैं। सीटी, बी.आर.के., और एम.एस. शेयरधारक और / या शेयर विकल्प धारक हैं। सीटी, बी.आर.के., और एमएस ने घोषणा की कि वे वीपीसीआईआर बायोसाइंसेज एपीएस के नाम पर दायर पेटेंट ईपी 2022/057172 के आविष्कारक हैं। अन्य लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

लेखक फी 29 और टीओपी 1 एंजाइम शुद्धिकरण के संबंध में तकनीकी सहायता के लिए प्रयोगशाला तकनीशियन नोरिको वाई हैनसेन, आणविक जीवविज्ञान और आनुवंशिकी विभाग, आरहस विश्वविद्यालय को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Camera for fluorescence image analysis
CCD camera For chemiluninescence image analysis
Fluorescence microscope Olympus Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/)
Fluorescence scanner Typhoon FLA 9500 Equipped with 473 laser and FAM filter
Humidity chamber with dH2O
Hybridization chamber with saturated NaCl
ImageJ software Fiji Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads
Materials
Cell culture
Cell growth medium appropiate for the chosen cell line
Trypsin Sigma #T4174
Pen strep Sigma #P4300
Tissue culture flasks ThermoFisher #178983
FBS Gibco #10270106
NEEA Sigma #M7145
PBS ThermoFisher #10010023
Functionalized slides
5'-amine anti-TOP1 primer Sigma 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’
Activated Codelink HD slides SurModics #DHD1-0023
Silicon grid Grace-biolabs Custom made
Pertex glue Histolabs #00801
Microscope slide 76 x 26 mm Hounisen #2510 1201BL Other microscope slide of same dimension can be used
DNA circles and rolling circle amplification
TOP1 specific substrate Sigma 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’
ATTO-488-dUTP Jena Biosciences #95387
Biotin-dCTP Jena Biosciences #NU-809-BIO16L
dNTP ThermoFisher #R0181
Phi29 polymerase VPCIR Biosciences #10010041
Recombinant TOP1 VPCIR Biosciences #10010001
Detection of rolling circle products
BioFX TMB SurModics #ESPM-0100-01
Cover glass
ECL mixture Cytiva #RPN2236
HRP conjugated anti-biotin antibody Merck #A4541
Mounting medium (vectachield) Vector laboratories #H-1000
Buffer list
1x PE Buffer 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O
6x Print Buffer 300 mM Na3PO4, pH 8.5
Blocking solution Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9
Lysis Buffer 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors
10x TOP1 Reaction Buffer 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5
10x Phi29 Reaction Buffer 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT
Buffer 1 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C.
Buffer 2 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C.
Buffer 3 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS
Buffer 4 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20
Buffer 5 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20
Chemicals for buffers
Tris Sigma #T1506
HCl Sigma #1.00317.2011
EDTA Sigma #1.08418.1000
PMSF Sigma #05056489001
SDS Applichem #436143
Na2HPO4 Sigma #1.06580.1000
NaH2PO4 Sigma #1.06346.1000
Ethanolamine Sigma #411000
SSC Invitrogen #15557-036
Tris-acetate Sigma #T1258
Mg-acetate Sigma #M0631
K-acetate Sigma #1.04820.1000
Tween20 Sigma #8.22184.0500
DTT Sigma #D0632
CaCl2 Sigma #1.02382.1000
MgCl2 Sigma #M2670
NaCl Sigma #1.06404.5000
Skimmed milk powder Sigma #70166
BSA Sigma #A4503

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References

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Keller, J. G., Mizielinski, K.,… More

Keller, J. G., Mizielinski, K., Petersen, K. V., Stougaard, M., Knudsen, B. R., Tesauro, C. Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples. J. Vis. Exp. (190), e64484, doi:10.3791/64484 (2022).

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