Summary
ローリングサークル増強酵素活性検出アッセイを用いたトポイソメラーゼ1活性の高感度かつ定量的検出のためのプロトコルが記載されている。この方法では、精製成分または細胞/組織抽出物からトポイソメラーゼ1活性を検出できます。このプロトコルは、酵素活性の検出を含むあらゆる分野で幅広い用途があります。
Abstract
ローリングサークル増幅などの等温増幅ベースの技術は、核酸、タンパク質量、またはその他の関連分子の検出に成功裏に採用されています。これらの方法は、臨床および研究アプリケーションにおいてPCRまたはELISAの実質的な代替手段であることが示されています。さらに、タンパク質量の検出(ウェスタンブロットまたは免疫組織化学による)は、癌診断のための情報を提供するには不十分な場合が多いが、酵素活性の測定は貴重なバイオマーカーである。酵素活性の測定はまた、病原体媒介性疾患の診断および潜在的な治療を可能にする。すべての真核生物において、トポイソメラーゼは、重要な細胞プロセス中のDNAトポロジカル状態の制御に関与する重要なDNA結合酵素であり、癌の予後と治療のための重要なバイオマーカーの1つです。
長年にわたり、トポイソメラーゼは、毎年調査されている天然および合成の低分子化合物のライブラリを使用して、抗寄生虫薬および抗癌剤の潜在的な標的として実質的に調査されてきました。ここでは、トポイソメラーゼ1(TOP1)活性を簡便、高速、ゲルフリーで定量測定できるローリングサークル増強酵素活性検出(REEAD)アッセイと呼ばれるローリングサークル増幅法を紹介します。TOP1は、特別に設計されたDNA基質を切断およびライゲーションすることにより、DNAオリゴヌクレオチドを閉じた円に変換し、これがローリングサークル増幅のテンプレートとなり、~103 タンデムリピートローリングサークル製品を生成します。増幅中のヌクレオチドの取り込みに応じて、蛍光から化学発光、比色まで、さまざまな読み出し方法の可能性があります。TOP1を介した切断ライゲーションごとに1つの閉じたDNAサークルが生成されるため、アッセイは非常に感度が高く、直接定量的です。
Introduction
トポイソメラーゼはDNA修飾酵素のクラスに属し、これらの多くはヒト疾患のバイオマーカーとして有用であることが証明されています1,2,3,4,5,6。TOP1は、DNA複製、遺伝子転写、組換え、染色体分配などの細胞プロセスに関連するトポロジカルストレスの解決に関与しています7。TOP1は、DNAに一過性の一本鎖切断の形成を含むメカニズムによって、負と正の両方のスーパーコイルを分解することができます8,9。DNAに結合した後、TOP1は活性部位のチロシン(Tyr723)を配置して、ホスホジエステル骨格に対して求核攻撃を行います。次に、TOP1-DNA切断複合体が生成され、酵素が壊れたDNA鎖の3'末端に共有結合します。これにより、切断されたストランドの5'端が無傷のストランドの周りを回転できるようにすることで、ねじり応力を解放します。最後に、5'末端のヒドロキシル基は、3'-ホスホチロシル結合に対して求核攻撃を行う。その結果、TOP1が放出され、DNA骨格が復元される8。
TOP1触媒サイクルのステップを調査するために、リラクゼーションアッセイ10、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)11,12、DNA自殺切断ライゲーションアッセイ13,14、およびin vivo酵素複合体(ICE)アッセイ15など、いくつかのアッセイが開発されています。.ただし、これらのアッセイは、DNAインターカレート剤を必要とするゲル電気泳動に依存しているか、高度に専門化されたトレーニングと機器を必要とするため、いくつかの制限があります。さらに、アッセイは、最適な性能を発揮するために、大量の精製TOP1酵素(リラクゼーションアッセイでは1〜5 ng、EMSAおよび切断ライゲーションアッセイでは50〜200 ngの範囲)または少なくとも106細胞からの抽出物を必要とします。そのため、粗生物学的サンプル中のTOP1活性を単一の触媒イベントレベルで特異的に検出できる、REEADアッセイと呼ばれる高感度の方法が開発されました16。
ここでは、REEADアッセイ16 を用いたTOP1活性の検出のためのプロトコルが提示される。アッセイの概略図を 図1に示します。カスタム設計のシリコングリッドを機能化されたスライドに取り付けて、以下のWellmakerと呼ばれるガラススライドマルチウェルセットアップを作成します(図1A)。これに続いて、5'-アミノ修飾プライマーをスライドのウェル内の機能性NHS基にカップリングします(図1B)。TOP1を介した切断およびライゲーション反応は、特定のDNA基質を閉じた円に変換します。TOP1特異的基質(図1C)は、二本鎖ステムと2本一本鎖ループを含むダンベル型に自発的に折り畳まれます。ループの1つは、表面アンカープライマーと相補的です。ステム領域には、3'末端から3塩基上流に好まれるTOP1切断部位と5'-ヒドロキシルオーバーハングが含まれています。基質の環状化は、細胞/組織抽出物(図1C)または組換え精製TOP1(図1D)のいずれかを使用して達成できます。
基質がTOP1によって切断されると、酵素は一過性に3'末端に結合し、3塩基フラグメントが拡散し、5'オーバーハングが基質にアニールし、TOP1を介したライゲーションを促進します。ライゲーションは基質の環状化をもたらし、続いてTOP1の解離をもたらす。閉じた円は表面アンカープライマーにハイブリダイズし(図1E)、鎖置換を伴うRCAを実行できるphi29ポリメラーゼによって媒介される等温ローリングサークル増幅(RCA)のテンプレートとして使用され、103 タンデムリピート生成物を生成します。RCAステップの間、蛍光標識(図1F)またはビオチン共役(図1G)ヌクレオチドを組み込むことができる17。蛍光標識ヌクレオチドを組み込むことで、蛍光顕微鏡または蛍光スキャナーを使用してRCPを検出することができます。あるいは、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗ビオチン抗体(図1H)はビオチン化ヌクレオチドに結合できるため、増強化学発光(ECL)または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)の検出可能な色への変換のいずれかを使用して、ロールサークル製品(RCP)を検出できます。RCAは線形反応速度論に従い、1つのRCPが単一のTOP1媒介切断ライゲーション反応を表すため、REEADアッセイを直接定量的にします。ここでは、このアッセイが、精製された組換え酵素として、または粗サンプルから抽出されたTOP1活性を検出するために、および抗TOP1薬物スクリーニングツールとして使用できることが示されています。
Protocol
注意: 必要なバッファー組成、機器、およびその他の材料のリストは、 材料表に記載されています。
1. 細胞培養
- 適当な培地で好ましい細胞を培養し、指示に従って増殖させる。一例として、20%ウシ胎児血清(FBS)、1%非必須アミノ酸(NEAA)、100単位/ mLペニシリン、および100 mg / mLストレプトマイシンを添加した最小必須培地(MEM)で、結腸直腸腺癌由来の細胞であるCaco2を増殖させます。細胞培養物を加湿インキュベーター(37°Cで5%CO2/95%空気雰囲気)に維持します。細胞を組織培養フラスコにプレートし、3日ごとに分割して細胞を70%のコンフルエントに維持します。
- トリプシン処理(0.25%トリプシン、0.02%EDTA溶液)によって70%コンフルエントフラスコから細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
- 細胞ペレットをPBSに再懸濁して、細胞濃度を0.5 ×10 6 細胞/チューブに調整します。200 × g で5分間回転させ、上清を注意深く吸引します。
注意: REEADに使用されるセルは、新鮮に使用し、氷上で保管する必要があります。Caco2細胞で得られた結果は最近発表されました17。このアッセイは、結腸がん、乳がん、肺がん、子宮頸がん由来の細胞18、19、20、21、22、23など、さまざまな細胞株でテストされていますが、組織、血液、唾液など、TOP1を含むすべての粗生物学的サンプルで使用できます。
2.機能化スライドの準備
- カスタム設計のシリコーンアイソレータグリッドを機能化されたスライドに取り付け、それによってウェルメーカーを作ります。気泡が形成されないようにシリコンを押します( 図1Aを参照)。
- 5 μM 5'-アミノプライマーの混合物を1xプリントバッファーで調製します。4 μLの混合物を各ウェルに加え、ウェランカーを15°Cから25°Cの間の温度で飽和NaClとハイブリダイゼーションチャンバーに入れ、光から保護します。
注:ハイブリダイゼーションチャンバーは、飽和NaClで満たされたピペットチップボックスを使用して簡単に作成できます。ハイブリダイゼーションには、最小16時間、最大72時間かかります。 図1Bの5'-アミノプライマーの配列を参照されたい。スライドはNHS基で官能化され、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの結合を可能にします。
3. 閉じた円形基板の生成
- 組換えTOP1または細胞抽出物を用いた閉鎖環状基質の調製。
- 0.5 × 106 細胞の細胞ペレットを500 μLの溶解バッファーで溶解し、1,000細胞/μLの細胞密度に到達します。 氷上で10分間インキュベートします。
- 5 μM TOP1特異的基質(基質の配列は以下の通りである:5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3')と16 μL中の組換えTOP1酵素2 μLまたは細胞抽出物2 μL(ステップ3.1.1を参照)の円混合物を調製します(ステップ3.1.1を参照)。1x TOP1反応バッファーの。
注:使用する組換えTOP1の濃度は、選択した読み出し方法によって異なります(図2、図3、図4、および図5を参照)。図1CのTOP1特異的基質の配列を参照されたい。 - 37°Cで30分間インキュベートします( 図1C、Dを参照)。
- 2 μLの1%SDSを加えて反応を停止します。
- 薬物の存在下での閉じた円形基質の調製
- 14 μLの1x TOP1反応バッファー中で、2 μLの5 μLのTOP1特異的基質と1 μLの100%DMSOまたは1 μLの1.6 mMカンプトテシン(CPT)の円混合物を調製します。2 μLの5 ng/μL組換えTOP1酵素を追加します。
注:他の低分子化合物または薬物を使用することができる。その場合、化合物の滴定を行う必要があります。化合物がDMSO以外の溶媒に溶解している場合は、DMSOの代わりにこれをコントロールとして使用する必要があります。 - 37°Cで1分間インキュベートします。
- 2 μLの1%SDSを加えて反応を停止します。
- 14 μLの1x TOP1反応バッファー中で、2 μLの5 μLのTOP1特異的基質と1 μLの100%DMSOまたは1 μLの1.6 mMカンプトテシン(CPT)の円混合物を調製します。2 μLの5 ng/μL組換えTOP1酵素を追加します。
注意: ステップ3はステップ2と並行して開始でき、円は4°Cで一晩保存できます。あるいは、ステップ4と同時にDNAサークルを調製し、直ちに使用することができる。 図1CのTOP1特異的基質の配列を参照されたい。基板は、好ましいTOP1切断部位および2つの一本鎖ループを含むダブルステム領域を有するダンベル形状に折り畳まれる。開いたダンベル基板は、TOP1を介した切断およびライゲーションによって閉じた円形基板に変換され、以下、円と呼ばれる。5'-アミノプライマーが過剰に存在するため、オープンTOP1特異的基質とクローズトTOP1特異的基質の間に競合はありません。
4.坑井メーカーのブロック
- 50°Cに予熱したバッファー1で満たされた5 cm x 5 cmのトレイにウェルメーカーを浸します。 ピペットを使用して、液体をウェル内に押し込み、気泡がないことを確認します。50°Cで30分間インキュベートします。
- バッファー1を取り外し、dH 2 Oで2x 1分洗浄します。 手で激しく振ってください。
- 50°Cに予熱したバッファー2を追加します。 ウェルに気泡がないことを確認してください。50°Cで30分間インキュベートします。
- dH 2 Oで2x 1分洗い、手で激しく振ってください。
- 70%EtOHで1分間洗浄します。手で激しく振ってください。
- ウェルメーカーのセットアップを風乾させます。
注意: 圧縮空気を使用してウェルを乾燥させます。あるいは、パスツールピペットを使用して空気を吹き込むことも可能です。先に進む前に、ウェルが乾いていることを確認してください。
5.サークルの坑井メーカーへのハイブリダイゼーション
- 対応する各ウェルに4 μLの円(ステップ3で作成)を追加します。
- ウェルメーカーを湿度チャンバーに37°CのdH2Oで1時間入れます。
注:湿度チャンバーは、dH2Oで満たされたピペットチップ用のボックスを使用して作成でき、あるいは、ハイブリダイゼーションは、湿度チャンバー内で25°Cで一晩行うことができる。
6.洗濯
- ウェルメーカーをバッファー3で洗浄します。
- バッファ 3 を削除し、バッファ 4 に置き換えます。
- バッファー4を除去し、70%EtOHで洗浄します。
- EtOHを取り外し、ウェルメーカーを乾燥させます。
注意: すべての洗浄手順は、スライドを完全に沈めることにより、5 cm x 5 cmのトレイで1分間実行されます。ウェル内に気泡がないことを常に確認してください。
7.ローリングサークル増幅
- 0.2 μg/μL BSA、1ユニットのPhi29ポリメラーゼを添加した1x Phi29反応バッファー、および蛍光読み出し用の0.25 mM dNTPおよび0.0125 mM ATTO-488-dUTP、または比色/化学発光読み出し用の0.1 mM dATP、0.1 mM DTTP、0.1 mM dGTP、0.09 mM dCTP、および0.01 mM ビオチン-dCTPのRCA混合物を調製します。各ウェルに4 μLを加えます。 図1Eを参照してください。
注意: RCA混合物の調製は氷上で行う必要があります。RCAに蛍光ヌクレオチドを組み込む場合は、蛍光色素を保護するために、このステップからの直接光を避けてください。 - 湿度チャンバー内で37°Cで2時間インキュベートします。蛍光ヌクレオチドを使用する場合は、湿度チャンバーを暗所に設置してください。図 1F,G を参照してください。
8.洗濯
- 化学発光または比色読み出しプロトコルの場合は、ステップ6のようにウェルメーカーを洗浄してから、ステップ11に進みます。
- 蛍光読み出しプロトコルの場合は、次の手順で洗浄する前にピンセットを使用してシリコングリッドを取り外します。
- スライドをバッファー3で10分間洗浄します。
- バッファ 3 を削除し、バッファ 4 に置き換えます。5分間洗います。
- バッファー4を除去し、70%EtOH中で1分間洗浄します。
- EtOHを取り外し、ウェルメーカーを乾燥させます。
9. 蛍光スキャナーを用いた蛍光ローリングサークル製品の可視化
- 使用する蛍光色素に対応するフィルターを使用して、蛍光スキャナーでスライドをスキャンします。飽和を与えない可能な限り最大の光電子増倍管を使用してください。
注:このプロトコルで画像取得に使用される蛍光スキャナーには、473 nmレーザーとFAMフィルター励起490 nm、発光520 nmが装備されています。 - 画像を ImageJ にインポートし、画像の種類を 8 ビット (画像 |タイプ |8 ビット)。バンドを個別に計測するには、ツールバーの長方形描画ツールを使用して計測領域を制限します。目的の領域を描画し、強度を測定します(分析|測定)。次に、最初に描画した領域を次のバンドに移動して測定します。
- 目的のソフトウェアでデータをプロットします。ImageJから抽出した定量化を含む代表的な画像を 図2に示します。
10. 蛍光顕微鏡による蛍光転がり円製品の可視化
- EtOH耐性ペンを使用して、シリコングリッドを取り外す前にウェルの位置を描き、手順8.2のようにスライドを洗浄します。洗浄手順の後、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含まない1 μLの封入剤でスライドをマウントし、カバーガラスを追加します。カメラで視覚化できるようにするには、スライドを76 mm x 26 mmの顕微鏡スライドに接着します。
- 60倍の油浸対物レンズとカメラを備えた蛍光顕微鏡を使用して分析します。各サンプル/ウェルの画像を12〜15枚撮影します。
- 画像をImageJにインポートし、画像を積み重ねます(画像|スタック |スタックする画像)。イメージの種類を 8 ビットに変更します (Image |タイプ |8 ビット)。
- しきい値を設定します(画像|調整 |しきい値)。
- しきい値を次のように設定します:下のバーを設定し、上のバーを調整して、正しい信号のみが赤で背景が黒になるようにします。実際の信号が消え始める前に、しきい値ができるだけ低いことを確認してください。
- しきい値を設定する前に、個々の画像をスイープし、それらが画像に対応していることを確認してください。しきい値は実験ごとに変わる可能性があることに注意してください。
- 信号をカウントする(分析|パーティクルを解析します)。ImageJ 設定の集計フィールドがオンになっていることを確認します。
- 結果をスプレッドシートまたはその他のソフトウェアにエクスポートして、さらにデータ処理を行います。ImageJから抽出した定量を含む代表的な画像を 図3に示します。
11. HRP結合抗ビオチン抗体とビオチン標識ローリングサークル製品のカップリング
- バッファー5で1:300に希釈したHRP結合抗ビオチン抗体4 μLを、5%の脱脂乳と5%のBSAを添加して各ウェルに加えます。
- 湿度チャンバー内で15〜25°Cで50分間インキュベートします( 図1Hを参照)。
- バッファー5で3 x 3分洗浄します。
- ウェルメーカーを乾かします。
12. ビオチン標識ローリングサークル製品の可視化
- ECL によるビジュアライゼーション
- 使用直前に40μLのECLルミノールと40μLのH 2 O2を混合する。各ウェルに2 μLを加えます。
- CCDカメラまたはX線フィルムを使用してスライドを視覚化します。
- TMBによるビジュアライゼーション
- 手順11.4の後、シリコングリッドを取り外します。次に、スライド全体の上に400 μLのTMBを追加し、スライドを湿度チャンバーに入れます。発色まで~5-10分待ちます。発色後、スライドを70%EtOHで洗浄します。
- 肉眼で発色を可視化します。写真カメラまたは携帯電話でスライドの写真を撮ります。
- 画像を ImageJ にインポートし、画像の種類を 8 ビット (画像 |タイプ |8 ビット)。バンドを個別に計測するには、ツールバーの長方形描画ツールを使用して計測領域を制限します。目的の領域を描画し、強度を測定します(分析|測定)。次に、最初に描画した領域を次のバンドに移動して測定します。
- 目的のソフトウェアでデータをプロットします。ImageJから抽出した定量を含む代表的な画像を図4、図5、および図6に示します。
Representative Results
ここでは、REEADアッセイを用いたTOP1活性の検出のためのプロトコールが提示されている16。このプロトコルは、蛍光スキャナー、蛍光顕微鏡、化学発光、比色法の4つの異なる読み出し方法を使用して、組換えTOP1活性を検出するために使用されました。このプロトコルは、粗抽出物の例として、Caco2細胞から抽出されたTOP1の活性を化学発光またはTMB読み出しで検出するためにも使用されました。また、このプロトコルを薬物スクリーニングツールとして用い、CPTによる組換えTOP1活性の阻害を検出するために、TOP1特異的阻害剤の一例として、化学発光読み出し法を用いた。
蛍光読み出しを用いてTOP1活性を分析したときに得られた結果を図2および図3に表す。蛍光スライドの代表的なスキャンとその結果の定量を図2に示します。定量から明らかなように、この読み出しには12.5 ngのTOP1の検出限界があります。蛍光顕微鏡を使用した場合に得られた代表的な画像および得られた定量値を図3に示す。この読み出し法を使用すると、検出限界はTOP1のわずか0.1ngです。化学発光読み出しを用いてTOP1活性を分析したときに得られた結果を図4に示し、比色読み出しの結果を示す結果を図5に示す。これらの読み出し法の検出限界は、6 ngのTOP1または312個のCaco2細胞から抽出されたTOP1です。図6は、薬物スクリーニング適用の一例としての80μM CPTまたはDMSOの存在下でのTOP1活性の測定値を示す。代表的な画像および得られた3つの独立した実験の定量化は、CPTが予想通り基質のTOP1媒介環状化を阻害することを示している24,25。
図1:REEADプロトコルの概略図。 (A,B)機能化されたスライドの準備。シリコングリッドは、機能化されたスライドに取り付けられています。次いで、5'-アミノプライマーをスライドに結合させ、TOP1特異的基質の増幅を可能にする。(C,D)閉じた円形基板の生成。TOP1特異的基質は、二本鎖ステムに好ましいTOP1切断部位を有し、2本鎖ループのうちの1つにプライマー結合配列を有するダンベル形状に折り畳まれる。(c)細胞の溶解時にTOP1が放出される。TOP1を介した切断およびライゲーションにより、基質は閉じた円に変換されます。(d)精製された、組換えTOP1が用いられる。(E)ローリングサークル増幅。閉じた環状基質は、表面アンカープライマーにハイブリダイズされ、Phi29ポリメラーゼを使用してRCAによって増幅されます。RCAは、Fのように蛍光ヌクレオチドを組み込むことによって、またはGのようにビオチン化ヌクレオチドを組み込むことによって達成することができる。蛍光ローリングサークル製品は、蛍光顕微鏡または蛍光スキャナーのいずれかを使用して視覚化されます。(h)HRP結合抗ビオチン抗体の結合。ビオチン化ローリングサークル産物は、HRP結合抗ビオチン抗体とともにインキュベートされます。シグナルの発生はHRP酵素によって媒介され、シグナルはECLによって視覚化され、CCDカメラを使用して検出されるか、TMBを使用して比色可視化を生成します。略語:REEAD =ローリングサークル増強酵素活性検出;RCA =ローリングサークル増幅;TOP1 = トポイソメラーゼ1;HRP = 西洋ワサビペルオキシダーゼ;ECL =増強された化学発光;TMB = 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:蛍光スキャナーを用いたTOP1活性の測定。 左パネルは、蛍光スキャナー読み出しプロトコルを用いてTOP1の3〜50ngの活性を分析するときのスライドの代表的な画像を示す。右パネルは、結果の定量を示しています。ウェルチ補正による t検定、 p = 0.0064、n = 4。略称:TOP1 = トポイソメラーゼ1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:蛍光顕微鏡を用いたTOP1活性の測定。 左パネルは、蛍光顕微鏡読み出しプロトコルを用いてTOP1の0.1-12.5ngの活性を分析したときのスライドの代表的な画像を示す。画像はドットを正しく表示するためにトリミングされたバージョンであることに注意してください。このため、右パネルに示す定量化のシグナル数とは似ていません。ウェルチ補正による t検定、 p = 0.0136、n = 3。略称:TOP1 = トポイソメラーゼ1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:化学発光読み出しを用いたTOP1活性の測定 。 (A)左パネルは、化学発光読み出しプロトコルを用いてTOP1の3〜50ngの活性を解析したときのスライドの代表像を示す。右パネルは、結果の定量を示しています。ウェルチの補正による t検定、 p < 0.0001、n = 4。(B)左パネルは、化学発光読み出しプロトコルを用いて156-40,000個のCaco2細胞から抽出したTOP1の活性を解析したときのスライドの代表的な画像を示す。右パネルは、結果の定量を示しています。ウェルチ補正による t検定、 p = 0.0224、n = 3。略語:TOP1=トポイソメラーゼ1。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:比色読み出しを用いたTOP1活性の測定 。 (A)左パネルは、比色読み出しプロトコルを用いてTOP1の3〜50ngを分析したときのスライドの代表画像を示す。右パネルは、結果の定量を示しています。ウェルチ補正による t検定、 p = 0.0012、n = 4。(B)左パネルは、比色読み出しプロトコルを用いて156-40,000個のCaco2細胞から抽出したTOP1の活性を解析したときのスライドの代表的な画像を示す。右パネルは、結果の定量を示しています。ウェルチ補正による t検定、 p = 0.0117、n = 3。略語:TOP1 =トポイソメラーゼ1;TMB = 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:化学発光読み出しプロトコルを使用した薬物治療後のTOP1活性の測定。 左パネルは、5%DMSOまたは80μM CPTの存在下で10 ngのTOP1を1分間分析したときのスライドの代表的な画像を示しています。右パネルは、結果の定量を示しています。ウェルチ補正による t検定、 p = 0.0017、n = 3。略語:TOP1 =トポイソメラーゼ1;CPT =カンプトテシン;DMSO = ジメチルスルホキシド;Neg = ネガティブコントロール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
トポイソメラーゼは、高い研究と臨床的関心を引き付けるDNA修飾酵素のクラスを表しており、抗癌治療または感染症との闘いにおいて潜在的な効果を有する低分子化合物の標的である。さらに、ヒトTOP1の活性は、癌の予後および治療の有効なバイオマーカーであることが証明されている18、19、23。化学療法阻害剤26の有効性に影響を与えるのはTOP1活性であるが、臨床現場で評価されるのはDNA-RNAの量またはTOP1の量であることが多い。これは、あらゆる実験室環境でトポイソメラーゼ活性を正確かつ正確に定量できる、迅速で簡単なゲルベースの無料ツールがないためです。
ここでは、ゲルフリー方式でTOP1活性の測定を可能にするREEADアッセイのプロトコルについて説明する。このプロトコルでは、精製されたTOP1または細胞からの粗抽出物を特別に設計されたDNAダンベル型基質とともにインキュベートし、切断/ライゲーション時にTOP1によって媒介され、閉じた環状分子に変換されます。次に、円をガラス表面にハイブリダイズし、RCAによって増幅します。スライド上で起こる反応の実行における使いやすさを可能にするために、シリコーングリッドがガラスに取り付けられ、反応が起こる個々のウェルを作る。このようにして、プロトコルはマルチウェルシステム(ウェルメーカーと呼ばれるシリコングリッド)を利用します。
このプロトコルは、例として使用した結腸直腸腺癌細胞Caco2から抽出された組換えTOP1およびTOP1の活性を検出するために使用された。また、薬物スクリーニングツールとして使用されるREEADの一例として、周知のTOP1阻害剤CPT24,25によるTOP1活性阻害を検出するためにプロトコルを用いた。このアッセイは、高感度の蛍光顕微鏡法と、特殊な機器やトレーニングを必要としない蛍光スキャナー、化学発光、または比色法など、さまざまな読み出し方法と組み合わせていました。高感度の蛍光顕微鏡の読み出しには、高品質の蛍光顕微鏡設定、熟練した人員、および時間のかかる画像の取得と分析が必要であるという制限があります。
これらの理由から、感度を犠牲にしてもより高速な取得および分析を可能にする蛍光スキャナ読み出しが提示される。蛍光スキャナーがない場合は、化学発光と比色読み出し法の2つの優れた代替手段を検討することができます。どちらの方法も高速で簡単で、高価な機器や専門的なトレーニングは必要ありません。すべての読み出しフォーマットにおいて、REEADは、より時間がかかり、ゲルベース(インターカレーティングエージェントの要件を伴う)、直接定量性が低い最先端のアッセイと比較して多くの利点があります。ただし、提示されたプロトコルにはいくつかの重要な手順があります。薬物スクリーニングを取り扱う場合、時点、薬物濃度、およびTOP1量/DNA基質の比率は、CPT用に最適化された記載された設定と比較して最適化されるべきである。 薬物は、DNA基質とのプレインキュベーションまたはTOP1酵素とのプレインキュベーションを行うことで調査することができる。これにより、TOP1を阻害する分子の能力に関する貴重な情報が得られ、薬物の作用機序についての洞察が得られます。
さらに、シグナルが低いか存在しない場合、これは粗サンプルの非効率的な溶解またはプロテアーゼ阻害剤の不適切な使用による抽出物中のTOP1の分解が原因である可能性が最も高いです。さらに、これは、組換えTOP1、phi29ポリメラーゼ、ヌクレオチド、基質、プライマーなどの重要なアッセイ成分の不十分な保管が原因である可能性もあります。最後に、オリゴヌクレオチドの凍結融解サイクルの繰り返しは、アッセイ性能に劇的な影響を与えるため、避ける必要があります。粗抽出物を使用する場合、特定の生物学的サンプルの抽出効率を最適化する必要があり、TOP1の量と活性はここで報告されている例とは異なる可能性があります。このため、試験するすべての粗抽出物は、その特定のサンプルを使用する場合、アッセイの検出限界と感度の範囲を特定するための滴定を必要とします。このプロトコルは、ヒトTOP1の検出用に最適化されています。他の真核生物のTOP1の活性を測定することはできますが、NaCl濃度とインキュベーション時間は、酵素精製法と最適な酵素活性に応じて最適化する必要がある場合があります。より多くの環状基質は長時間のインキュベーションから生じますが、より少ない環状基質はインキュベーションの短縮から生じます。
提示されたアプリケーションに加えて、REEADは、癌患者からの小さな生検からの粗抽出物中のTOP1活性の測定18、癌細胞株におけるCPTの細胞傷害性抗癌効果の予測20,21,22、さらには単一細胞における酵素活性の検出20,21を可能にする。.さらに、ウェルメーカーを使用して提示されたREEAD設定は、合成または天然化合物のライブラリのマルチウェルベースの薬物スクリーニングを可能にします。これに加えて、REEAD C / Lと呼ばれるREEADアッセイの修正バージョンが開発されました。このセットアップにより、TOP1反応27の切断ステップとライゲーションステップの個別の調査が可能になります。REEAD C/Lを使用すると、低分子阻害剤の作用機序を決定し、潜在的な抗寄生虫効果28を有するTOP1触媒阻害剤として、または抗癌治療に使用されるTOP1毒として特徴付けることができます24,25。最後に、他のTOP1酵素のさまざまな要件(DNA結合または切断ライゲーション)に一致するようにDNA基質を特異的に再設計することで、REEADは感染症(熱帯熱マラリア原虫の場合など、マラリア29)、またはリーシュマニアドノバニおよびサル痘ウイルス(データ示さず)の検出にも使用されています。または、抗病原性効果を有する低分子化合物を同定するために使用することができる。提示されたプロトコルは、TOP1分野の科学者に、最適化をほとんどまたはまったく行わずに酵素活性を検出する簡単な方法を提供し、将来的にさらに幅広いアプリケーションに適応する可能性があります。
Disclosures
著者のC.T.とK.M.はVPCIR バイオサイエンス ApSの従業員です。C.T.、B.R.K.、およびM.S.は株主および/またはストックオプション保有者です。C.T.、B.R.K.、およびMSは、VPCIR バイオサイエンス ApSの名前で出願された特許EP2022/057172の発明者に指名されたことを宣言します。他の著者は、競合する利益がないことを宣言します。
Acknowledgments
著者らは、オーフス大学分子生物学および遺伝学部の検査技師であるNoriko Y. Hansen氏に、Phi29およびTOP1酵素精製に関する技術支援を提供してくれたことに感謝の意を表したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Camera for fluorescence image analysis | |||
| CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
| Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
| Humidity chamber with dH2O | |||
| Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
| ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Materials | |||
| Cell culture | |||
| Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
| Trypsin | Sigma | #T4174 | |
| Pen strep | Sigma | #P4300 | |
| Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Functionalized slides | |||
| 5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
| Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
| Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
| Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
| DNA circles and rolling circle amplification | |||
| TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Detection of rolling circle products | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Cover glass | |||
| ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
| HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
| Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
| Buffer list | |||
| 1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
| 6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
| Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
| 10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
| 10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
| Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
| Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Chemicals for buffers | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
| Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
| K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
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