Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bestemmelse af S-fase varighed ved anvendelse af 5-ethynyl-2'-deoxyuridin inkorporering i Saccharomyces cerevisiae

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64490
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Summary

Vi beskriver to komplementære protokoller for nøjagtigt at bestemme S-fasevarighed i S. cerevisiae ved hjælp af EdU, en thymidinanalog, som inkorporeres in vivo og detekteres ved hjælp af klikkemi ved mikroskopi og flowcytometri. Det giver mulighed for let karakterisering af varigheden af DNA-replikation og oversete replikationsfejl hos mutanter.

Abstract

Eukaryot DNA-replikation er en stærkt reguleret proces, der sikrer, at den genetiske plan for en celle duplikeres korrekt inden kromosomadskillelse. Da DNA-syntesefejl ligger til grund for kromosomomlægninger, er overvågning af DNA-replikation blevet afgørende for at forstå grundlaget for genomstabilitet. Saccharomyces cerevisiae er en klassisk model til at studere cellecyklusregulering, men vigtige DNA-replikationsparametre, såsom fraktionen af celler i S-fasen eller S-fasevarigheden, er stadig vanskelige at bestemme. Denne protokol bruger korte og ikke-toksiske impulser af 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU), en thymidinanalog, i konstruerede TK-hENT1-gærceller efterfulgt af dens påvisning ved klikreaktion for at muliggøre visualisering og kvantificering af DNA-replikation med høj rumlig og tidsmæssig opløsning på både enkeltcelle- og populationsniveauer ved mikroskopi og flowcytometri. Denne metode kan identificere tidligere oversete defekter i S-fasen og cellecyklusprogressionen af gærmutanter og derved muliggøre karakterisering af nye spillere, der er afgørende for at sikre genomstabilitet.

Introduction

Genomstabilitet gennem mitotisk opdeling sikres ved transmission af et komplet og lige sæt kromosomer til de to producerede celleafkom. Dette afhænger af den nøjagtige gennemførelse af en række begivenheder, der forekommer på et givet tidspunkt i hver fase af cellecyklussen. I G 1 er replikationsoprindelsen licenseret ved rekruttering af flere licensfaktorer, herunder Cdc61. I S-fasen initieres helgenomduplikering fra flere aktive replikationsoprindelser og udføres af replikationsmaskiner, der samles i mikroskopisk synlige foci navngivne replikationsfabrikker2. I M-fasen er duplikerede søsterkromatider fastgjort og toorienteret på den mitotiske spindel for at tillade deres adskillelse til de modsatte poler i den mitotiske celle3. Reguleringen, korrekt færdiggørelse og varighed af hver fase er nøglen til at sikre genomstabilitet. Faktisk fører for tidlig udgang fra nogen af disse faser til ustabilitet i genomet. For eksempel vil en kortere G 1 induceret ved sletning af den spirende gær CDK-hæmmer Sic1 eller ved overekspression af G 1-cycliner ændre den efterfølgende S-fase 4,5,6. Derfor resulterer disse dereguleringer, der er forbundet eller ej med replikationsspænding, i kromosombrud, omlejringer og fejladskillelse 4,5,6. Derfor kan overvågning af varigheden af S-fasen og mere generelt varigheden af de andre faser af cellecyklussen være afgørende for at identificere de defekter, der forekommer i forskellige mutanter og under forskellige stressende forhold.

En traditionel metode til måling af cellecyklusfasevarighed inkluderer simpel DNA-indholdsflowcytometri (figur 1A) og er afhængig af en passende algoritme (tilgængelig i de fleste cytometrisoftware), der bruges til at adskille befolkningen i G1, S og G2 + M fasefraktioner fra 1C- og 2C-toppe. Brøkerne ganges derefter med befolkningsfordoblingstiden7. Denne metode giver imidlertid kun estimerede værdier, kræver en homogen cellestørrelsesfordeling inden for en given fraktion og kan ikke anvendes på synkroniserede kulturer. For at studere S-fasevarigheden i pattedyrceller er flere thymidinanaloger blevet udviklet og udbredt, herunder EdU. Deres optagelse fra det ekstracellulære medium og phosphorylering af thymidinkinase (i det følgende benævnt TK) gør dem tilgængelige for DNA-polymeraser til at inkorporere dem på steder med DNA-syntese (replikation, rekombination, reparation). For at omgå fraværet af TK-genet i Saccharomyces cerevisiae-celler er gærstammer blevet konstrueret til at muliggøre stabil og konstitutiv ekspression af herpes simplex-viruset TK8 og den humane ligevægtige nukleosidtransportør (hENT1)9. Når det er inkorporeret i DNA, detekteres EdU via den selektive klikreaktion, som kemisk kobler sin alkyndel til azidmodificerede fluorokromer10.

Dette papir giver to optimerede omfattende protokoller til pulsmærkning af asynkrone og synkrone TK-hENT1-konstruerede celler med EdU for præcist at visualisere og måle DNA-replikationsvarighed og dynamik samt varigheden af de andre faser af cellecyklussen med høj rumlig og tidsmæssig opløsning på både enkeltcelle- og populationsniveauer ved mikroskopi og flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. S. cerevisiae cellekultur

BEMÆRK: De anvendte gærstammer er anført i tabel 1

BEMÆRK: S-fasevarigheden kan overvåges på forskellige måder. Afhængigt af det spørgsmål, der skal behandles, kan cellerne dyrkes asynkront eller synkront efter G1-anholdelse .

  1. Fra asynkront voksende S. cerevisiae celler
    BEMÆRK: Denne metode gør det muligt at bestemme procentdelen af celler i S-fasen i en asynkront voksende cellepopulation. Ved at bestemme fordoblingstiden kan varigheden af S-fasen (og de andre faser) ekstrapoleres.
    1. S. cerevisiae-celler podes i 10 ml syntetisk komplet (SC) medium ved en lav cellekoncentration (5 × 104 celler/ml) til en døgnkultur ved 30 °C med orbital omrøring ved 130 omdr./min.
      BEMÆRK: Koncentrationen måles med en celletæller. For effektivt at beregne fordoblingstiderne anbefales det at inokulere kulturen fra en overnatningskultur, der stadig er i eksponentiel fase (dvs. ideelt under 2 × 107 celler / ml). Dyrkning af celler i rich medium (YPD) anbefales ikke, da EdU-detektion ikke er effektiv.
    2. Den følgende dag fortyndes cellerne i 20 ml frisk SC-medium ved den endelige koncentration på 5 × 105 celler / ml.
    3. Kultur cellerne ved 30 °C i et rystende vandbad med vandret omrystning ved 120 o / min.
    4. Mål cellekoncentrationen hver time, indtil den når 1 × 107 celler / ml.
      BEMÆRK: Dette trin giver mulighed for at lave en grafisk repræsentation af cellekoncentrationsforøgelsen over tid. Formlen, der bruges til at beregne fordoblingstiderne, er forklaret i forklaringen til tabel 2.
    5. Fortsæt parallelt med trin 2 for EdU-mærkning, når cellekoncentrationen er ca. 2 × 10 6-5 × 106 celler / ml.
  2. Fra G1-synkroniserede S. cerevisiae celler
    BEMÆRK: Denne metode gør det muligt at bestemme, hvornår S-fasen starter og slutter ved hjælp af flowcytometri og / eller mikroskopianalyser.
    1. S. cerevisiae-celler podes i 10 ml SC-medium ved en lav cellekoncentration (5 × 104 celler/ml) til en døgnkultur ved 30 °C med orbital omrøring ved 130 o/min.
      BEMÆRK: Se noterne efter trin 1.1.1.
    2. Den følgende dag fortyndes cellerne i 20 ml frisk SC-medium i en slutkoncentration på 2 × 10 6-3 × 106 celler/ml.
    3. Der tilsættes 40 μL 1 mg/ml α-faktor fortyndet i vand.
    4. Kultur cellerne ved 30 °C med orbital omrøring ved 130 o / min i 1 time.
    5. Der tilsættes igen 40 μL 1 mg/ml α-faktor fortyndet i vand.
    6. Kultur cellerne ved 30 °C med orbital omrøring ved 130 o / min i 1 time.
    7. Visualiser cellerne under et lysmikroskop for at overvåge G1-anholdelse . Fortsæt, hvis mere end 90% af cellerne viser en shmoo, og de andre er afrundede, ubudne celler.
      BEMÆRK: Afhængigt af den anvendte baggrund anbefales det at sonikere cellerne før shmoo-visualisering. For W303-baggrunden sonikeres 2x, i 2 s hver gang, ved en amplitude på 40-50.
    8. Centrifuge i 3 min ved 1.500 × g. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    9. Resuspender cellerne i 20 ml SC-medium.
    10. Gentag trin 1.2.8-1.2.9 én gang.
      BEMÆRK: α-faktoren vaskes væk med disse trin, og cellerne frigives i cellecyklussen. Alternativt kan α-faktoren vaskes væk ved at filtrere gærcellerne med et 1,2 μm nitrocellulosefilter ved hjælp af en tragt, der er sat på en sidearmskolbe, der er forbundet til en vakuumpumpe.
    11. Saml 1 ml celler 2x hvert 5. minut, og fortsæt til trin 2 for EdU-mærkning.
      BEMÆRK: Pulsmærk cellerne fra kun et af de to rør med EdU. De ikke-pulsmærkede celler bruges til at skelne EdU-positive fra EdU-negative celler på en bivariat propidiumiodid (PI) -EdU-graf.
    12. Der tilsættes 400 μL 1 mg/ml α-faktor fortyndet i vand 30 min efter frigivelsen.
      BEMÆRK: Denne høje dosis α-faktor er nødvendig for at standse cellerne i G1-fasen af den næste cellecyklus og for at forhindre cellerne i at komme ind i den efterfølgende S-fase igen.

2. EdU-mærkning

  1. Overfør 1 ml cellekultur til et 2,0 ml mikrofugerør indeholdende 1 μL 10 mM EdU. Bland godt ved inversion.
    BEMÆRK: For at skelne de EdU-positive celler fra de EdU-negative celler på en PI-EdU bivariat FACS, overfør yderligere 1 ml cellekultur til et 2,0 ml mikrofugerør indeholdende 1 μL DMSO.
  2. Inkuberes i 3-5 minutter ved 30 °C under omrøring i et rystende vandbad.
    BEMÆRK: Tre minutter er tilstrækkelige til EdU-detektion med et mikroskop; Der kræves 5 minutter til optimal EdU-detektion på et flowcytometer.
  3. Stop reaktionen med tilsætning af 100 μL 100% ethanol.
    1. Stop reaktionen med tilsætning af 100 μL 20% paraformaldehyd, hvis der kræves måling af cellestørrelse.
      BEMÆRK: Hvis de mitotiske cellers nukleare arkitektur skal holdes intakt til yderligere analyser efter Click-reaktionen, anbefaler vi at fiksere celler med 2% paraformaldehyd ved stuetemperatur (RT) i stedet for at lægge cellerne på is, da sidstnævnte forårsager mikrotubulær depolymerisering.
    2. Lad cellerne stå i 20 minutter ved RT under mild omrøring på en vipper med variabel hastighed ved 20 hældninger / min for at fastgøre cellerne inden tilsætning af 100 μL 100% ethanol.

3. Cellefiksering og permeabilisering

  1. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrofuge. Fjern supernatanten ved hjælp af en vakuumpipette.
  2. Resuspender cellepelleten i 500 μL 70% ethanol. Bland godt ved hvirvelstrøm.
  3. Lad stå i ≥1 time ved RT ved 20 hældninger / min på en vipper med variabel hastighed for at gennemtrænge cellerne.
    BEMÆRK: Celler dyrket i SC-medium pelleterer ikke godt, da de har tendens til at klæbe til mikrofugevæggene. Tilsætningen af ethanol forbedrer pelletering og reducerer celletab. Cellerne kan opbevares ved 4 °C natten over eller i længere perioder ved -20 °C.
  4. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrocentrifuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
  5. Cellerne vaskes 2x med 500 μL 10% ethanol i PBS.
    BEMÆRK: Vaskene er afgørende for at fjerne ikke-inkorporeret EdU fra cellerne.

4. Click-it reaktion

  1. Til cytometrianalyse
    1. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrofuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    2. Pelleten gensuspenderes i 200 μL PBS indeholdende 0,1 mg/ml RNase A og 0,2 mg/ml proteinase K.
    3. Inkuberes i 1-2 timer ved 50 °C med lejlighedsvis omrystning (eller natten over ved 37 °C).
    4. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrocentrifuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    5. Cellerne vaskes med 500 μL PBS.
    6. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrofuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    7. Cellepelleten gensuspenderes i 200 μL PBS + 1% bovin serumalbumin (BSA). Inkuberes i 30 minutter ved RT.
      BEMÆRK: Længere tider er ikke nødvendige og er endda skadelige for effektiviteten af klikreaktioner.
    8. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrocentrifuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    9. Pelleten gensuspenderes i 300 μL PBS + 1% BSA.
    10. Fordel cellerne mellem to rør: 200 μL i et 1,5 ml mikrocentrifugerør til Click-reaktionen og 100 μL i et andet 1,5 ml mikrocentrifugerør til Sytox Green-farvning.
    11. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrocentrifuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    12. Til Sytox Green farvning
      BEMÆRK: Vi anbefaler stærkt at tage en aliquot til Sytox Green farvning (uden klik) for at opnå DNA-indholdsreferenceprofiler af høj kvalitet. Faktisk slukker Click-reaktionen kraftigt interkalant fluorescens, herunder Sytox Green og PI-fluorescens. Derfor kan Click-reaktionen forvrænge læsningen af DNA-indhold.
      1. Resuspender cellepelleten i 100 μL PBS.
      2. Overfør 10-30 μL (afhængigt af cellekoncentrationen) til et flowcytometerrør indeholdende 300 μL 50 mM Tris-HCI, pH 7,5 og 0,5 μM Sytox Green.
      3. Sonicate 2x, for 2 s hver gang, ved en amplitude på 40-50.
      4. Lad det stå i mørke, indtil prøverne behandles på et flowcytometer.
        BEMÆRK: Cellerne kan opbevares på dette stadium ved 4 °C i et par dage.
    13. Til Click-reaktionen
      1. Der fremstilles frisk azidfarvebuffer ved at blande reagenserne i følgende rækkefølge (mængde for et rør): 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Cy5 Azid og 2 μL 1 M ascorbinsyre.
        BEMÆRK: Det er muligt at forberede en masterblanding af Azide Dye-bufferen. Reagenserne skal blandes i samme rækkefølge som ovennævnte.
      2. Resuspender cellepelleten med 40 μL frisklavet Azide Dye-blanding. Inkuber ved RT i mørke i 60 min.
      3. Pellet cellerne i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrocentrifuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
      4. Cellerne vaskes 3x med 300 μL 10% ethanol i PBS.
        BEMÆRK: Vaskene er afgørende for at fjerne alt det opløselige EdU-Cy5-azid.
      5. Resuspender cellerne i 100 μL af 50 μg/ml PI i PBS. Lad stå i 10 minutter i mørket.
      6. Overfør 10-30 μL af cellesuspensionen (afhængigt af cellekoncentrationen) til et flowcytometerrør indeholdende 300 μL af 50 mM Tris-HCI, pH 7,5.
      7. Sonicate 2x, for 2 s hver gang, ved en amplitude på 40-50.
      8. Lad det stå i mørke, indtil prøverne behandles på et cytometer.
        BEMÆRK: Cellerne kan opbevares på dette stadium ved 4 °C i et par dage.
    14. Læs Sytox Green-prøverne ved hjælp af en excitationsblå laser ved 488 nm og et 530/30 BP-filter. Se figur 1A for typiske resultater. Læs de bivariate PI-EdU-prøver på et prikplot ved hjælp af en excitationsblå laser ved 488 nm og et 615/20 BP-filter til PI (x-aksen) og en excitationsrød laser ved 640 nm og et 660/20 BP-filter (y-akse). Se figur 1B for typiske resultater.
      BEMÆRK: Figur 1C repræsenterer det typiske PI-EdU bivariate FACS-resultat for EdU-negative celler. Det giver mulighed for forskelsbehandling af de EdU-negative celler fra de EdU-positive celler.
  2. Til mikroskopianalyse
    1. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrocentrifuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    2. Resuspender pelleten i 200 μL PBS + 1% BSA. Inkuberes i 30 minutter ved RT.
    3. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrofuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    4. Der fremstilles frisk azidfarvebuffer ved at blande reagenserne i følgende rækkefølge (mængde for et rør): 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Dy-530 azid, 2 μL 1 M ascorbinsyre.
      BEMÆRK: En masterblanding af Azide Dye-bufferen kan fremstilles frisk ved at blande reagenserne i ovennævnte rækkefølge.
    5. Resuspender pelleten med 40 μL frisklavet azidfarvebuffer. Inkuber ved RT i mørke i 60 min.
    6. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrofuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    7. Cellerne vaskes 2x med 300 μL 10% ethanol i PBS.
      BEMÆRK: Vaskene er afgørende for at eliminere alt opløseligt Dy-530 azid.
    8. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrocentrifuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    9. Resuspender cellerne i 100 μL 0,5 μg/ml 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i PBS. Lad stå i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur.
    10. Pellet cellerne i 2 minutter ved 10.000 × g i en mikrocentrifuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    11. Der vaskes med 300 μL PBS for at fjerne overskydende DAPI.
    12. Pellet cellerne i 2 min ved 10.000 × g i en mikrofuge. Kassér supernatanten med en vakuumpipette.
    13. Lægemidlet resuspenderes med 10-50 μL PBS afhængigt af cellekoncentrationen.
    14. Sonicate 2x, for 2 s hver gang, ved en amplitude på 40-50.
      BEMÆRK: Cellerne kan opbevares på dette stadium ved 4 °C i et par dage.
    15. Pipetter 1,7 μL af cellerne på et glasmikroskopglas og dæk med en ren dækslip.
    16. Observer straks under et fluorescensmikroskop med DAPI- og TexasRed- eller Cy3-filtre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at bestemme S-fasevarigheden og mere bredt varigheden af G 1 og G2 + M (protokoltrin 1.1) blev S. cerevisiae W303 vildtypeceller (WT, tabel 1) dyrket asynkront i SC-medium i 7 timer. Hver time blev cellekoncentrationen overvåget for at bestemme fordoblingstiden (figur 2B). Under disse vækstbetingelser var den beregnede fordoblingstid 120 min ± 13 min ved 25 °C (tabel 2). Når cellerne var i den eksponentielle fase (2 × 10 6-5 × 106 celler / ml), blev en aliquot af celler pulsmærket med EdU (10 μM) i 5 minutter for at udpege cellerne i S-fasen og bestemme procentdelen af celler, der var i G1, S og G2 + M faser. Tre populationer af celler blev observeret i en bivariat EdU-PI cytometeranalyse (figur 1B). Forskelsbehandlingen mellem de EdU-negative og EdU-positive populationer blev foretaget ved hjælp af et kontroleksperiment, hvor cellerne ikke blev pulsmærket med EdU, men Click-reaktionen blev udført (figur 1C). De to EdU-negative populationer i nederste venstre og nederste højre områder, der adskiller sig i PI-intensitet, svarede to gange til henholdsvis G1 og G2 + M (figur 1B, C). Derfor svarede den øvre population (med en intensitet >1× 10 4-2 × 104) til de EdU-positive celler, der var i S-fasen på tidspunktet for pulsen (figur 1B). Derfor var 27% ± 5% af cellepopulationen i G1-fasen, 29% ± 3% var i S-fasen, og 44% ± 2% var i G2 + M. Da fordoblingstiden var 120 min ± 13 min under disse forhold, ekstrapolerede vi, at faserne G1, S og G 2 + M varede henholdsvis 32 minutter ± 4 minutter, 35 minutter ± 6 minutter og 53 minutter ± 7 minutter ved 25 °C (tabel2 og tabel 3).

Dernæst havde vi til formål at validere denne metode og vise, at den er følsom nok til at identificere mutanter med DNA-replikationsfejl, der hidtil er blevet overset. Vi ræsonnerede, at justerbare funktionstab-alleler af de faktorer, der er involveret i DNA-replikation, ville være ideelle valideringskontroller. Derfor brugte vi en gærstamme indeholdende en temperaturfølsom cdc6-1 mutant (tabel 1)11. Cdc6 er en væsentlig licensfaktor, der udtrykkes i sen M og G1 for at samle præreplikationskomplekser (preRC) på ORC-bundne kromosomsteder, der senere kan bruges som replikationsoprindelse. Ved en tilladelig temperatur bør dens S-fasevarighed derfor være den samme som WT's, mens der ved en restriktiv temperatur ikke bør forekomme DNA-replikation, da ingen oprindelse er licenseret12. Dog ved en semi-tilladelig temperatur, hvor færre oprindelser er licenseret, men der er nok til at give cellelevedygtighed (vores upublicerede data; Barba Tena et al., under forberedelse), forventede vi forskellige varigheder for hver fase. Som forventet, baseret på faldtest, voksede cdc6-1-cellerne det samme som WT-celler ved en tilladelig temperatur (dvs. 25 ° C, figur 2A), der viste den samme fordoblingstid (figur 2B og tabel 2), men var døde ved eller over 34 ° C (figur 2A). Af interesse var cdc6-1 ved en semi-tilladelig temperatur (dvs. 28 °C) levedygtig (28 °C, figur 2A). Fordoblingstiden var imidlertid længere end for WT (figur 2B og tabel 2), og varigheden af hver fase var forskellig. Faktisk var G 1 i cdc6-1 lidt kortere (12 min ±1 min vs. 16 min ± 2 min), mens S-fasen var lidt forlænget (34 min ± 4 min vs. 29 min ± 5 min), og G2 + M fasen var betydeligt længere (77 min ± 4 min vs. 45 min ± 3 min) sammenlignet med WT (figur 2C, D og tabel 3). S-fasen blev overraskende nok ikke forlænget særlig meget, men den gennemsnitlige intensitet af EdU-signalet blev reduceret med 25% (figur 2C, D), hvilket er i overensstemmelse med en S-fase initieret fra færre oprindelser. Mens de EdU-positive WT-celler var homogent fordelt mellem de tidlige (S1) og sene S (S2) faser (figur 2C, supplerende figur S1A, tidlige [S1] og sene S [S2] faser afgrænset med en lodret stiplet linje i den øverste port), akkumulerede 65% af de EdU-positive cdc6-1-celler i den sene S-fase (figur 2D, supplerende figur S1B). Der var endda ingen klar skelnen mellem S- ogG2 + M-populationerne (figur 2D), hvilket tyder på, at cellerne kæmpede for at fuldføre S-fasen, før de kom ind i G2-fasen. Derfor er denne metode egnet og følsom til at identificere mutanter med defekter i S-fasen (varighed og / eller distribution) og i cellecyklusfasevarighed.

En komplementær metode blev udtænkt til at bestemme, hvornår celler starter og afslutter deres DNA-replikation og estimerer S-fasevarigheden ved hjælp af synkroniserede celler (protokoltrin 1.2). Til dette formål blev celler ved hjælp af α-faktor med synkroniserede celler i G1 frigivet i SC-medium og opsamlet hvert 5. minut. Varigheden af S-fasen kan være ca. 25 minutter baseret på det tidspunkt, hvor DNA-indholdet ændrede sig fra 1C til 2C på Sytox Green flowcytometerprofilen (figur 3A). Dette skøn afhænger imidlertid af, hvornår en betydelig cellefraktion af befolkningen har inkorporeret nok Sytox Green til at blive set i FACS-profilen. De tidlige og sene replikationshændelser kan ikke registreres med denne metode. For at definere nøjagtigt, hvornår S-fasen starter og slutter, og hvor længe den varer, blev S-faseceller udpeget fra en aliquot af celler ved pulsmærkning med EdU (10 μM) i 5 minutter hvert 5. minut efter G1-frigivelsen. Som forventet var alle cellerne inden for de første 10 minutter efter frigivelsen i nederste venstre område (dvs. i G1, figur 3B, supplerende figur S2). Femten minutter efter frigivelsen blev der allerede påvist en brøkdel af EdU-positive celler (sammenlign de to første rækker i henholdsvis supplerende figur S2 og supplerende figur S3, EdU-behandlede og EdU-frie celler), hvilket indikerer, at S-fasen var startet (figur 3C). Progressionen gennem S-fasen blev set ved, at celleskyen først bevægede sig opad og derefter til højre i den bivariate PI-EdU-graf (figur 3D-F). Endelig, 35 minutter fra frigivelsen, var en brøkdel af cellerne EdU-negative, men med dobbelt så meget DNA, hvilket indikerer, at disse celler havde afsluttet S-fasen og var i G2 + M-fasen (figur 3G). Således varer S-fasen 20 minutter under disse forhold. Bemærk, på trods af den høje synkronitet, der blev observeret med overlejringen af DNA-indhold detekteret med Sytox Green, hvilket tyder på, at S-fasen var forbi i hele befolkningen 40 minutter efter frigivelsen, viste de bivariate analyser, at nogle celler afsluttede S-fasen 60 minutter efter frigivelsen, og at S-fasen var komplet for hele befolkningen 65 minutter efter frigivelsen (figur 3H, I og supplerende figur S2).

Derudover kan S-fasen og DNA-syntesen overvåges ved mikroskopi. Fra hver aktiveret replikationsoprindelse udføres DNA-syntese af to tøjrede replisomer, der danner et nukleart replikationsfokus, der kan efterfølges af mikroskopi ved at billeddanne en mærket version af en replikationsfaktor og / eller operatørarray og deres tilsvarende repressor smeltet sammen med et fluorescerende protein 2,13. Alternativt kan DNA-syntese detekteres ved mikroskopi ved anvendelse af thymidinanaloger14,15. Vi brugte EdU til at overvåge de subnukleære DNA-regioner, der gennemgår DNA-syntese. Til dette formål pulsmærkede vi asynkrone WT- og cdc6-1-celler med EdU (10 μM) i 3 minutter ved 28 ° C og afbildede dem efter klikreaktionen. Vi forventede at detektere variationer i EdU-signalintensiteterne afhængigt af DNA-syntesehastigheden og af celleprogressionen i cellecyklussen under 3 minutters EdU-puls (dvs. celler, der bruger hele 3 minutter i S-fasen, viser et stærkere signal end dem, der går ind eller ud af S-fasen under pulsen). Følgelig viste WT S-faseceller et EdU-signal i deres kerne, der varierede i intensitet (figur 4A). S-fasevarigheden kan let ekstrapoleres fra denne analyse. Faktisk blev det bestemt ud fra to biologiske replikater (mindst 150 celler blev talt), at 34% ± 3% og 38% ± 3% af WT- og cdc6-1-cellerne var henholdsvis EdU-positive. Da fordoblingstiden under disse vækstbetingelser var 90 min og 123 min for henholdsvis WT- og cdc6-1-cellerne (tabel 2), ekstrapolerede vi, at S-fasen varede henholdsvis 31 min og 47 min. Det førstnævnte resultat er i overensstemmelse med det, der er opnået fra vores FACS-analyser (tabel 3), hvilket indikerer, at påvisning af EdU-positive celler ved mikroskopi muliggør bestemmelse af S-fasevarigheden. Det skal bemærkes, at sidstnævnte er højere end den S-fasevarighed, der er ekstrapoleret fra vores FACS-analyser, fordi der ikke var nogen klar skelnen mellem S-og G2 + M-populationerne (figur 2D). EdU-foci blev let observeret i WT-cellerne (figur 4B), men var svagere og færre i cdc6-1-cellerne (figur 4C). For at udelukke muligheden for, at EdU-signalintensitetsforskellen mellem WT- og cdc6-1-cellerne var afhængig af trinnet i S-fasen, blev intensiteten kvantificeret fra synkroniserede celler. Som forventet var den gennemsnitlige EdU-signalintensitet tre gange lavere i cdc6-1-cellerne (figur 4D), i overensstemmelse med DNA-replikation initieret fra færre replikationsoprindelser. EdU-signalet var begrænset til kernen, colocaliserende med et stærkt DAPI-signal og organiseret i kugleformede mønstre, i overensstemmelse med organiseringen af DNA-replikation i nukleare regioner eller replikationsfabrikker. Det er vigtigt, at EdU kun blev påvist i ikke-budded eller små-budded celler og aldrig til stede i celler med store knopper, hvilket indikerer, at WT-gærcellerne var færdige med replikation, da de kom ind i mitose. Denne metode er derfor følsom til visualisering af DNA-replikation ved en høj rumlig opløsning samt til påvisning og kvantificering af milde DNA-replikationsdefekter.

Figure 1
Figur 1: Repræsentative FACS-analyser. (A) Repræsentative Sytox Green FACS-analyser for WT-celler dyrket ved 25 °C. (B,C) Repræsentative EdU-PI-bivariate FACS-analyser for WT-celler dyrket ved 25 °C og pulsmærket i 5 minutter med EdU (10 μM) eller 1 μL DMSO. Polygonerne var de samme i begge analyser. C blev brugt til at afgrænse EdU-negativ fra de EdU-positive celler (generelt er grænsen sat til en intensitet >1× 10 4-2 × 104). Den øverste polygonport afgrænsede de EdU-positive celler (S-fasefraktion). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Fraktion af celler i cellecyklusfaserne G 1, S ogG2 + M i asynkrone cellepopulationer. (A) WT- og cdc6-1-stammer blev spottet ved serielle fem gange fortyndinger på rigt medium og dyrket enten ved 25 °C, 28 °C eller 34 °C. (B) Fordobling af population. Asynkrone WT- og cdc6-1-celler blev dyrket ved 25 °C eller 28 °C, og cellekoncentrationen blev målt hver time i 7 timer. (C,D) EdU-PI bivariat FACS-analyse af WT- og cdc6-1-celler dyrket ved 28 °C og pulsmærket i 5 minutter med EdU (10 μM). Multiplikation af populationsfordoblingstiden med S-fasefraktionen giver S-fasevarigheden. De gennemsnitlige intensiteter af de EdU-positive og EdU-negative celler blev beregnet som gennemsnittet af intensiteten af hver værdi i den tilsvarende polygon. De gennemsnitlige intensiteter af WT- og cdc6-1 EdU-negative celler (henholdsvis 5.077 og 4.454) blev normaliseret til 1. De gennemsnitlige intensiteter af WT- og cdc6-1 EdU-positive celler (henholdsvis 52.604 og 36.141) blev divideret med normaliseringsfaktoren, der blev anvendt for hver stamme. De opnåede værdier var henholdsvis 10,4 og 8,1 (dvs. et fald på 25% som nævnt i teksten). Forkortelser: WT = vildtype; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; PI = propidiumiodid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Bestemmelse af S-fasevarigheden på synkroniserede celler. (A) Tidsforløbsanalyse af DNA-indholdet i WT-celler efter frigivelse af α faktor ved 28 °C. Den angivne tid tager højde for varigheden af EdU-pulsen (5 min). (B-I) EdU-PI bivariate FACS-analyser for synkroniserede WT-celler pulsmærket i 5 minutter med EdU (10 μM) og indsamlet på de angivne tidspunkter efter frigivelsen fra G1-anholdelse. Forkortelser: WT = vildtype; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; PI = propidiumiodid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: EdU-detektion og kvantificering ved mikroskopi. Asynkrone WT- og cdc6-1-stammer blev dyrket i 2 timer ved 28 °C og derefter pulsmærket i 3 minutter med EdU (10 μM) og afbildet ved vidvinkelmikroskopi ved hjælp af passende excitations-/emissionsfiltre. (A) Repræsentative billeder fra vidvinkelmikroskopi for WT- og (B,C) individuelle celler til WT og cdc6-1 visualiseret af DIC og farvet med DAPI eller til EdU, som angivet. Skalabjælkerne i (A) og (B,C) er henholdsvis 10 μm og 2 μm. (D) EdU-intensitetsmålinger på synkrone WT- og cdc6-1-celler dyrket ved 28 °C 30 minutter efter frigivelsen fra G 1-anholdelse. Grafen repræsenterer samlingen af tre biologiske replikater (mindst 50 celler blev talt i hver biologisk replikat). Middel± SD vises på grafen. En uparret to-tailed t-test mellem WT- og cdc6-1-celler er angivet med **** (p < 0,0001). Forkortelser: WT = vildtype; EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; DIC = differentiel interferenskontrast; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; A.U. = vilkårlige enheder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Navn Genotype Figurer og tabeller
WT (E3087): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.1, fig.2A,B,C, fig3, fig.4A,B,D, SUPP fig.1,2,3 tabeller2,3
Cdc6-1 (E5956): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.2A,B,D, fig.4 C,D, Supp fig.1, tabeller2,3
TK+ (E1000): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) Supp Fig.4
TK+ hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 Supp Fig.4
Cdc6-1 TK+ hENT+ (E3968): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
W303-1A (E001): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 Supp Fig.4

Tabel 1: Liste over de stammer, der er anvendt i denne undersøgelse.

WT Cdc6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Fordoblingstid (min.) 120 90 118 123
SD ± 13 min ± 3 minutter ± 10 minutter ± 6 minutter

Tabel 2: Gennemsnitlige fordoblingstider for WT- og cdc6-1-stammer , der dyrkes ved 25 °C og 28 °C. Fordoblingstiderne blev beregnet ud fra tre biologiske replikater (fire tekniske replikater for hver biologisk replikat) ved hjælp af følgende formel: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), hvor Cf og Ci svarer til henholdsvis slut- og initialcellekoncentrationerne, og Δt svarer til forskellen i minutter mellem tf og ti, når Cf og Ci blev målt, henholdsvis.

WT Cdc6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Procent Varighed
(min)		 Procent Varighed
(min)		 Procent Varighed
(min)		 Procent Varighed
(min)
G1 27 32 18 16 13 16 10 12
S 29 35 32 29 28 34 28 34
G2+M 44 53 50 45 59 71 62 77
SD G1 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±1 ±1 ±1
SD S ±3 ±6 ±5 ±5 ±5 ±7 ±4 ±4
SD G2+M ±2 ±7 ±4 ±3 ±4 ±4 ±6 ±4

Tabel 3: Gennemsnitlige fraktioner af celler og varighed af faserne G 1, S ogG2 + M i WT- og cdc6-1-celler dyrket ved 25 °C og 28 °C. Fraktionerne af celler blev bestemt ud fra tre biologiske replikater (to tekniske replikater for hver biologisk replikat). Forskellene i G 1, S og G2 + M varighed mellem WT- og cdc6-1-cellerne dyrket ved 28 ° C var statistisk signifikante (uparret to-tailed t-test, p <0,1).

Supplerende figur S1: Fraktion af celler i de tidlige og sene S-faser i WT- og cdc6-1-celler dyrket ved 28 °C. To identiske polygoner ved navn S1 og S2 for henholdsvis de tidlige og sene S-faser blev tegnet i fraktionen af EdU-positive celler for at opdele den i to halvdele på EdU-PI-bivariate FACS-analyser for (A) WT-celler dyrket ved 28 ° C og (B) cdc6-1 celler dyrket ved 28 ° C. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Cellecyklusprogression af EdU-pulsmærkede celler efter frigivelse fra G1-anholdelse visualiseret af EdU-PI bivariate FACS. En aliquot af celler blev pulsmærket i 5 minutter med 10 μM EdU hvert 5. minut efter frigivelse fra α-faktor anholdelse ved 28 ° C og indtil 80 min, som angivet. Forkortelser: EdU = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; PI = propidiumiodid. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S3: Cellecyklusprogression af DMSO-behandlede celler efter frigivelse fra G1-anholdelse visualiseret af EdU-PI bivariat FACS. Dette er det samme som supplerende figur 2, men cellerne blev inkuberet i 5 minutter med 1 μL DMSO (dimethylsulfoxid). Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S4: BrdU- og EdU-toksicitet i TK hENT1-gærceller. Celler af den angivne genotype blev spottet i fem gange serielle fortyndinger på YPD-plader indeholdende stigende koncentrationer af BrdU eller EdU og dyrket i 40 timer ved 30 °C. Forkortelser: DMSO = dimethylsulfoxid; BrdU = bromodeoxyuridin; Edu = 5-ethynyl-2'-deoxyuridin; TK = thymidinkinase; hENT1 = human ækvilibreringsnukleosidtransportør. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gær er en primær modelorganisme til cellecyklusundersøgelser, men karakteriseringen af dens S-fase har længe været hæmmet af dens manglende evne til at inkorporere eksogene nukleosider, såsom BrdU, der bruges som sporstoffer af DNA-replikation. At udstyre gær med et højt udtryk af herpes simplex thymidinkinase (TK) og tilsætning af en human nukleosidtransportør (hENT) har stort set løst dette problem15,16. EdU er mere alsidig end BrdU, da dens påvisning med lille fluorescerende azid og klikkemi er modtagelig for permeabiliserede gærceller og FACS-analyse, i modsætning til anti-BrdU-antistoffer17. Her optimerede vi betingelserne for EdU-mærkning og detektion i denne TK-hENT1-stamme og viste, at tidligere uopdagede replikationsfejl kan kvantificeres ved hjælp af denne protokol ved FACS eller mikroskopi.

At studere en biologisk mekanisme ved hjælp af værktøjer, der kan forstyrre den samme mekanisme, er et almindeligt problem i biologi. Da EdU har en kendt cytotoksisk virkning, søgte vi efter EdU-koncentrationer, der ikke er toksiske ved kronisk eksponering for den konstruerede TK-hENT1-stamme og fandt, at 10 μM var en passende dosis. TK-hENT1-celler spredes ikke ved 25 μM EdU, mens TK-alene eller hENT1-alene celler let modstår 100 μM EdU (supplerende figur S4). Selvom gærceller er betydeligt mere følsomme over for EdU end BrdU, fandt vi, at proliferation først faldt efter den anden cellecyklus efter EdU-eksponering, hvilket tyder på, at den skal inkorporeres på begge tråde for at påvirke celleproliferation (data ikke vist). For at forblive på den sikre side brugte vi 10 μM EdU i hele denne protokol med kun korte impulser (3 min til mikroskopi; 5 min til FACS) og fandt, at dette var egnet til god detektion ved hjælp af denne optimerede protokol.

Subtile defekter i DNA-replikation kan have en stærk indvirkning på kromosomomlejringer4. Derfor er udviklingen af teknikker og protokoller, der er i stand til at detektere disse subtile defekter, nøglen til at afdække ætiologien af kromosomafvigelser. Her viser vi, at denne optimerede protokol for EdU-inkorporering og detektion kan måle op til en tredobbelt reduktion i signalintensitet (figur 2 og figur 4), hvilket indikerer, at hastigheden af DNA-syntese reduceres i temperaturfølsomme cdc6-1-celler dyrket ved 28 ° C, som endnu ikke viser nogen defekter på pladelevedygtighedsassays (figur 2A ). Denne protokol for EdU-inkorporering og kvantificering kan således bruges til at screene andre mutanter, for hvilke replikationsfejl ikke oprindeligt er mistænkt. Derudover kan det være nyttigt at detektere mitotisk DNA-syntese (MiDAS), meiotisk rekombinationsafhængig DNA-syntese eller anden langkanals DNA-syntese.

En ulempe er, at EdU-detektion kun kan udføres på faste celler, hvilket udelukker levende analyse som med PCNA-GFP eller andre fluorescerende aflæsninger af DNA-replikation, som lider af den høje fototoksicitet af laserstrålerne, der anvendes til billeddannelse. Dyrkning af celler i et syntetisk medium er afgørende for den bedste detektion, da YPD-rester ser ud til at slukke klikreaktionen betydeligt. Interessant nok tillader udpegning af S-fasecellerne ved hjælp af bivariat EdU-PI FACS-analyse på synkroniserede populationer estimering af varigheden af S-fasen til 20 minutter i enkeltceller (figur 3, supplerende figur S2 og supplerende figur S3). Men selv når synkronitet efter α-faktorfrigivelse fremstår lige så næsten perfekt som i klassisk Sytox Green FACS-analyse (figur 3A), bliver det klart fra bivariat EdU-PI FACS-analyse, at celler kommer relativt asynkront ind i S-fasen (figur 3B-I).

Her beskriver vi tre metoder til at bestemme S-fasevarighed ved hjælp af flowcytometri og mikroskopi på synkrone og asynkrone celler på både enkeltcelle- og populationsniveau. De gennemsnitlige S-fasevarigheder bestemt i asynkrone WT-celler på populationsniveau er ens ved hjælp af flowcytometri og mikroskopi ved henholdsvis 29 minutter og 31 minutter, mens vores synkroniserede enkeltcellebaserede tilgang viser, at varigheden kan være så kort som 20 minutter (figur 2, figur 3, figur 4 og tabel 3 ). Uoverensstemmelsen mellem disse værdier er overraskende, men kan let forklares. Faktisk blev S-fasevarigheden med vores enkeltcellebaserede tilgang bestemt ud fra de tidligste begivenheder (dvs. de første celler, der kommer ind og ud af S-fasen, figur 3C, G), men det betyder ikke, at S-fasen varer 20 minutter i hver celle i en population. Disse data ville understøtte den uventede forestilling om, at der er et vist niveau af heterogenitet i S-fasevarighed mellem celler.

Forbedrede protokoller eller nye teknikker kan vælte mangeårige dogmer eller nye ideer. Der er tre, som disse data udfordrer. For det første menes det, at DNA-syntese er samtidig med knoppefremkomsten i S. cerevisiae. Figur 4A-C viser, at EdU-farvning er stærkest i ubudded og små-budded celler, på trods af 3 minutters mærkningsforsinkelse, hvilket indikerer, at S-fasen tydeligt starter før spirende, som vist tidligere16. For det andet rapporteres det, at gærceller ikke har en G2-fase, hvor mitotiske spindler dannes samtidig med DNA-syntese. De meget korte impulser kombineret med følsom EdU-detektion af FACS (figur 3, supplerende figur S2 og supplerende figur S3) eller mikroskopi (figur 4) gør det muligt præcist at bestemme, hvornår S-fasen begynder og slutter i enkeltceller. Ved at gøre det fandt vi, at bulk-DNA-syntese slutter 40 minutter efter frigivelse af α faktor (figur 3, supplerende figur S2 og supplerende figur S3), mens korte mitotiske spindler kun dannes 20 minutter senere16 (data vises ikke). Vi konkluderer, at gærceller har en G2-fase. For det tredje blev det for nylig foreslået, at op til 30% af gærcellerne fuldfører DNA-syntese i anafase-telofase18. Ved hjælp af denne optimerede protokol detekterede vi ikke EdU-inkorporering i celler, der viser en anafase / telofasespindel (data ikke vist), men vi kan ikke udelukke, at denne anden bølge af DNA-syntese er under den anvendte detektionstærskel. I betragtning af det stærke signal/støjforhold anser vi sidstnævnte mulighed for usandsynlig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende Agence Nationale de la Recherche (ANR) og Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) for ph.d.-stipendierne til J.D.D.B.T. og Agence Nationale pour la Recherche (ANR) for økonomisk støtte (tilskud ANR-18-CE12-0018-01). Cytometri og mikroskopi blev udført på Montpellier MRI BioCampus billeddannelsesfacilitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-factor  Genescript RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100--812-E
Copper sulfate Sigma C1297
DAPI Sigma D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) Interchim FP-JV6320 Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Carbosynth NE08701
Ethanol absolute Carlo Erba reagents P013A10D16 or equivalent
L- ascorbic acid Sigma A4544
Propidium iodide Sigma P4864
Proteinase K Euromedex EU0090
Rnase SIGMA R5000
Sytox Green Invitrogen S-7020
Equipment
Cell counter OLS CASY
Flow cytometer Agilent NovoSampler Pro
Shaking incubator Infors 444-4230 or equivalent
Shaking water bath Julabo SW22 or equivalent
Sonicator Sonics Vibra cell
Wide-field microscopy Leica THUNDER Imager or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).

Tags

Biologi udgave 188
Bestemmelse af S-fase varighed ved anvendelse af 5-ethynyl-2'-deoxyuridin inkorporering i <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E.,… More

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E., Talarek, N. Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64490, doi:10.3791/64490 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter