Summary
Descriviamo due protocolli complementari per determinare con precisione la durata della fase S in S. cerevisiae utilizzando EdU, un analogo della timidina, che viene incorporato in vivo e rilevato utilizzando la chimica Click mediante microscopia e citometria a flusso. Permette una facile caratterizzazione della durata della replicazione del DNA e dei difetti di replicazione trascurati nei mutanti.
Abstract
La replicazione del DNA eucariotico è un processo altamente regolato che assicura che il progetto genetico di una cellula sia correttamente duplicato prima della segregazione cromosomica. Poiché i difetti di sintesi del DNA sono alla base dei riarrangiamenti cromosomici, il monitoraggio della replicazione del DNA è diventato essenziale per comprendere le basi dell'instabilità del genoma. Saccharomyces cerevisiae è un modello classico per studiare la regolazione del ciclo cellulare, ma i parametri chiave di replicazione del DNA, come la frazione di cellule nella fase S o la durata della fase S, sono ancora difficili da determinare. Questo protocollo utilizza impulsi brevi e non tossici di 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), un analogo della timidina, in cellule di lievito TK-hENT1 ingegnerizzate, seguite dalla sua rilevazione mediante reazione Click per consentire la visualizzazione e la quantificazione della replicazione del DNA con elevata risoluzione spaziale e temporale sia a livello di singola cellula che di popolazione mediante microscopia e citometria a flusso. Questo metodo può identificare difetti precedentemente trascurati nella fase S e nella progressione del ciclo cellulare dei mutanti del lievito, consentendo così la caratterizzazione di nuovi attori essenziali per garantire la stabilità del genoma.
Introduction
La stabilità del genoma attraverso la divisione mitotica è assicurata dalla trasmissione di un insieme completo ed equo di cromosomi alle due progenie cellulari prodotte. Ciò si basa sul completamento accurato di una serie di eventi che si verificano in un dato momento in ogni fase del ciclo cellulare. In G 1, le origini della replica sono concesse in licenza dopo il reclutamento di diversi fattori di licenza, tra cui Cdc61. Nella fase S, la duplicazione dell'intero genoma viene avviata da più origini di replicazione attive ed eseguita da macchinari di replicazione che si riuniscono in fuochi microscopicamente visibili denominati fabbriche di replica2. Nella fase M, i cromatidi fratelli duplicati sono attaccati e biorientati sul fuso mitotico per consentire la loro segregazione ai poli opposti della cellula mitotica3. La regolazione, il corretto completamento e la durata di ogni fase sono fondamentali per garantire la stabilità del genoma. In effetti, l'uscita prematura da una qualsiasi di queste fasi porta all'instabilità del genoma. Ad esempio, un G 1 più corto indotto dalla delezione dell'inibitore CDK del lievito in erba Sic1 o dalla sovraespressione delle cicline G1 altererà la successiva fase S 4,5,6. Di conseguenza, queste deregolazioni, associate o meno allo stress di replicazione, provocano rotture cromosomiche, riarrangiamenti e cattiva segregazione 4,5,6. Pertanto, il monitoraggio della durata della fase S e, più in generale, la durata delle altre fasi del ciclo cellulare può essere cruciale per identificare i difetti che si verificano in diversi mutanti e in diverse condizioni di stress.
Un metodo tradizionale per misurare la durata della fase del ciclo cellulare include una semplice citometria a flusso del contenuto di DNA (Figura 1A) e si basa su un algoritmo di adattamento (disponibile nella maggior parte dei software di citometria) utilizzato per separare la popolazione in frazioni di fase G1, S e G2 + M dai picchi 1C e 2C. Le frazioni vengono quindi moltiplicate per il tempo di raddoppio della popolazione7. Tuttavia, questo metodo fornisce solo valori stimati, richiede una distribuzione omogenea delle dimensioni delle celle all'interno di una data frazione e non è applicabile alle colture sincronizzate. Per studiare la durata della fase S nelle cellule di mammifero, sono stati sviluppati e ampiamente utilizzati diversi analoghi della timidina, tra cui EdU. Il loro assorbimento dal mezzo extracellulare e la fosforilazione da parte della timidina chinasi (di seguito denominata TK) li rendono disponibili per le DNA polimerasi per incorporarli nei siti di sintesi del DNA (replicazione, ricombinazione, riparazione). Per bypassare l'assenza del gene TK nelle cellule di Saccharomyces cerevisiae , sono stati ingegnerizzati ceppi di lievito per consentire l'espressione stabile e costitutiva del virus dell'herpes simplex TK8 e del trasportatore nucleosidico equilibrativo umano (hENT1)9. Una volta incorporato nel DNA, l'EdU viene rilevato tramite la reazione selettiva di Click, che accoppia chimicamente la sua porzione alchina ai fluorocromi10 modificati con azouro.
Questo articolo fornisce due protocolli completi ottimizzati per l'etichettatura a impulsi asincroni e sincroni di cellule ingegnerizzate TK-hENT1 con EdU al fine di visualizzare e misurare con precisione la durata e la dinamica della replicazione del DNA, nonché la durata delle altre fasi del ciclo cellulare, con un'elevata risoluzione spaziale e temporale sia a livello di singola cellula che di popolazione mediante microscopia e citometria a flusso.
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Protocol
1. Coltura cellulare di S. cerevisiae
NOTA: I ceppi di lievito utilizzati sono elencati nella Tabella 1
NOTA: la durata della fase S può essere monitorata in diversi modi. A seconda della domanda da affrontare, le cellule possono essere coltivate in modo asincrono o sincrono dopo l'arresto di G1 .
- Da cellule di S. cerevisiae in crescita asincrona
NOTA: Questo metodo consente di determinare la percentuale di cellule nella fase S in una popolazione cellulare a crescita asincrona. Determinando il tempo di raddoppio, è possibile estrapolare la durata della fase S (e delle altre fasi).- Inoculare cellule di S. cerevisiae in 10 mL di terreno sintetico completo (SC) a bassa concentrazione cellulare (5 × 104 cellule/ml) per una coltura notturna a 30 °C con agitazione orbitale a 130 rpm.
NOTA: La concentrazione viene misurata con un contatore di cellule. Per calcolare in modo efficiente i tempi di raddoppio, si raccomanda di inoculare la coltura da una coltura notturna che è ancora in fase esponenziale (cioè, idealmente al di sotto di 2 × 107 cellule / ml). La crescita di cellule in mezzo ricco (YPD) non è raccomandata, poiché il rilevamento di EdU non è efficiente. - Il giorno seguente, diluire le cellule in 20 ml di terreno SC fresco alla concentrazione finale di 5 × 105 cellule/ml.
- Coltura delle cellule a 30 °C in bagnomaria agitante con agitazione orizzontale a 120 giri/min.
- Misurare la concentrazione cellulare ogni ora fino a raggiungere 1 × 107 cellule / ml.
NOTA: questo passaggio consente di effettuare una rappresentazione grafica dell'aumento della concentrazione cellulare nel tempo. La formula utilizzata per calcolare i tempi di raddoppio è spiegata nella legenda della Tabella 2. - Procedere in parallelo al passaggio 2 per l'etichettatura EdU quando la concentrazione cellulare è di circa 2 × 10 6-5 × 106 cellule / ml.
- Inoculare cellule di S. cerevisiae in 10 mL di terreno sintetico completo (SC) a bassa concentrazione cellulare (5 × 104 cellule/ml) per una coltura notturna a 30 °C con agitazione orbitale a 130 rpm.
- Da cellule G 1-sincronizzate di S. cerevisiae
NOTA: Questo metodo consente di determinare quando inizia e finisce la fase S mediante citometria a flusso e/o analisi microscopiche.- Inoculare le cellule di S. cerevisiae in 10 mL di terreno SC a bassa concentrazione cellulare (5 × 104 cellule/ml) per una coltura notturna a 30 °C con agitazione orbitale a 130 rpm.
NOTA: vedere le note dopo il punto 1.1.1. - Il giorno seguente, diluire le cellule in 20 ml di terreno SC fresco ad una concentrazione finale di 2 × 10 6-3 × 106 cellule/ml.
- Aggiungere 40 μL di 1 mg/mL di fattore α diluito in acqua.
- Coltura delle cellule a 30 °C con agitazione orbitale a 130 giri/min per 1 ora.
- Aggiungere nuovamente 40 μL di 1 mg/mL di fattore α diluito in acqua.
- Coltura delle cellule a 30 °C con agitazione orbitale a 130 giri/min per 1 ora.
- Visualizza le cellule al microscopio ottico per monitorare l'arresto G1 . Procedere se più del 90% delle celle mostra uno shmoo e le altre sono cellule arrotondate e non gemmate.
NOTA: A seconda dello sfondo utilizzato, si consiglia di sonicare le celle prima della visualizzazione shmoo. Per lo sfondo W303, sonicare 2x, per 2 s ogni volta, con un'ampiezza di 40-50. - Centrifugare per 3 min a 1.500 × g. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Risospendere le cellule in 20 mL di mezzo SC.
- Ripetere i passaggi 1.2.8-1.2.9 una volta.
NOTA: il fattore α viene lavato via con questi passaggi e le cellule vengono rilasciate nel ciclo cellulare. In alternativa, il fattore α può essere lavato via filtrando le cellule di lievito con un filtro nitrocellulosa da 1,2 μm utilizzando un imbuto posto su un pallone a braccio laterale collegato a una pompa per vuoto. - Raccogliere 1 ml di celle 2 volte ogni 5 minuti e procedere al passaggio 2 per l'etichettatura EdU.
NOTA: Etichettare a impulsi le celle di uno solo dei due tubi con EdU. Le cellule non marcate con impulso sono utilizzate per distinguere le cellule EdU-positive da quelle EdU-negative su un grafico bivariato di ioduro di propidio (PI)-EdU. - Aggiungere 400 μL di 1 mg/mL di fattore α diluito in acqua 30 minuti dopo il rilascio.
NOTA: Questa alta dose di fattore α è necessaria per arrestare le cellule nella fase G1 del ciclo cellulare successivo e per impedire alle cellule di rientrare nella successiva fase S.
- Inoculare le cellule di S. cerevisiae in 10 mL di terreno SC a bassa concentrazione cellulare (5 × 104 cellule/ml) per una coltura notturna a 30 °C con agitazione orbitale a 130 rpm.
2. Etichettatura EdU
- Trasferire 1 mL di coltura cellulare in una provetta microfuge da 2,0 mL contenente 1 μL di 10 mM EdU. Mescolare bene per inversione.
NOTA: Per discriminare le cellule EdU-positive dalle cellule EdU-negative su un FACS bivariato PI-EdU, trasferire un altro 1 mL di coltura cellulare in una provetta microfughe da 2,0 mL contenente 1 μL di DMSO. - Incubare per 3-5 minuti a 30 °C agitando a bagnomaria.
NOTA: Tre minuti sono sufficienti per il rilevamento EdU con un microscopio; Sono necessari 5 minuti per il rilevamento ottimale di EdU su un citometro a flusso. - Interrompere la reazione con l'aggiunta di 100 μL di etanolo al 100%.
- Interrompere la reazione con l'aggiunta di 100 μL di paraformaldeide al 20% se è richiesta la misurazione delle dimensioni delle cellule.
NOTA: Se l'architettura nucleare delle cellule mitotiche deve essere mantenuta intatta per ulteriori analisi a seguito della reazione di Click, si consiglia di fissare le celle con paraformaldeide al 2% a temperatura ambiente (RT) piuttosto che mettere le cellule sul ghiaccio, poiché quest'ultima causa la depolimerizzazione dei microtubuli. - Lasciare le celle per 20 minuti a RT sotto lieve agitazione su un bilanciere a velocità variabile a 20 inclinazioni / min per fissare le celle prima dell'aggiunta di 100 μL di etanolo al 100%.
- Interrompere la reazione con l'aggiunta di 100 μL di paraformaldeide al 20% se è richiesta la misurazione delle dimensioni delle cellule.
3. Fissazione e permeabilizzazione cellulare
- Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta a vuoto.
- Risospendere il pellet cellulare in 500 μL di etanolo al 70%. Mescolare bene vortexing.
- Lasciare agire per ≥1 h a RT a 20 inclinazioni/min su un bilanciere a velocità variabile per permeabilizzare le celle.
NOTA: Le cellule coltivate in mezzo SC non pellettano bene in quanto tendono ad aderire alle pareti dei microfuge. L'aggiunta di etanolo migliora la pellettizzazione e riduce la perdita di cellule. Le cellule possono essere conservate a 4 °C durante la notte o per periodi più lunghi a -20 °C. - Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Lavare le celle 2x con 500 μL di etanolo al 10% in PBS.
NOTA: I lavaggi sono fondamentali per rimuovere l'EdU non incorporato dalle celle.
4. Reazione click-it
- Per l'analisi citometrica
- Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Risospendere il pellet in 200 μL di PBS contenente 0,1 mg/mL di RNasi A e 0,2 mg/mL di proteinasi K.
- Incubare per 1-2 ore a 50 °C con agitazione occasionale (o per una notte a 37 °C).
- Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Lavare le cellule con 500 μL di PBS.
- Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Risospendere il pellet cellulare in 200 μL di PBS + 1% di sieroalbumina bovina (BSA). Incubare per 30 minuti a RT.
NOTA: tempi più lunghi non sono necessari e sono persino dannosi per l'efficienza delle reazioni di clic. - Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Risospendere il pellet in 300 μL di PBS + 1% BSA.
- Distribuire le celle tra due provette: 200 μL in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per la reazione Click e 100 μL in un'altra provetta da microcentrifuga da 1,5 mL per la colorazione Sytox Green.
- Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Per la colorazione Sytox Green
NOTA: Si consiglia vivamente di prendere un'aliquota per la colorazione Sytox Green (senza clic) al fine di ottenere profili di riferimento del contenuto di DNA di alta qualità. Infatti, la reazione Click spegne fortemente la fluorescenza intercalante, compresa la fluorescenza Sytox Green e PI. Di conseguenza, la reazione Click può distorcere la lettura del contenuto di DNA.- Risospendere il pellet cellulare in 100 μL di PBS.
- Trasferire 10-30 μL (a seconda della concentrazione cellulare) in un tubo citometrico a flusso contenente 300 μL di 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 e 0,5 μM Sytox Green.
- Sonicate 2x, per 2 s ogni volta, ad un'ampiezza di 40-50.
- Lasciare al buio fino all'elaborazione dei campioni su un citometro a flusso.
NOTA: Le celle possono essere mantenute in questa fase a 4 °C per alcuni giorni.
- Per la reazione Click
- Preparare il tampone Azide Dye fresco mescolando i reagenti nel seguente ordine (quantità per un tubo): 36 μL di PBS, 2 μL di 0,2 M CuSO4, 0,2 μL di 2 mM di Cy5 Azide e 2 μL di acido ascorbico 1 M.
NOTA: È possibile preparare un master mix del tampone Azide Dye. I reagenti devono essere miscelati nello stesso ordine di quello sopra menzionato. - Risospendere il pellet cellulare con 40 μL di miscela Azide Dye appena fatta. Incubare a RT al buio per 60 min.
- Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Lavare le celle 3x con 300 μL di etanolo al 10% in PBS.
NOTA: I lavaggi sono fondamentali per eliminare tutto l'azoturo solubile EdU-Cy5. - Risospendere le cellule in 100 μL di 50 μg/mL PI in PBS. Lasciare agire per 10 minuti al buio.
- Trasferire 10-30 μL della sospensione cellulare (a seconda della concentrazione cellulare) in un tubo citometrico a flusso contenente 300 μL di 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
- Sonicate 2x, per 2 s ogni volta, ad un'ampiezza di 40-50.
- Lasciare al buio fino a quando non si elaborano i campioni su un citometro.
NOTA: Le celle possono essere mantenute in questa fase a 4 °C per alcuni giorni.
- Preparare il tampone Azide Dye fresco mescolando i reagenti nel seguente ordine (quantità per un tubo): 36 μL di PBS, 2 μL di 0,2 M CuSO4, 0,2 μL di 2 mM di Cy5 Azide e 2 μL di acido ascorbico 1 M.
- Leggere i campioni di Sytox Green utilizzando un laser blu di eccitazione a 488 nm e un filtro 530/30 BP. Vedere la Figura 1A per i risultati tipici. Leggere i campioni bivariati PI-EdU su un dot plot utilizzando un laser blu di eccitazione a 488 nm e un filtro 615/20 BP per il PI (asse x) e un laser rosso di eccitazione a 640 nm e un filtro 660/20 BP (asse y). Vedere la Figura 1B per i risultati tipici.
NOTA: La Figura 1C rappresenta il tipico risultato FACS bivariato PI-EdU per le cellule EdU-negative. Permette la discriminazione delle cellule EdU-negative dalle cellule EdU-positive.
- Per l'analisi al microscopio
- Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Risospendere il pellet in 200 μL di PBS + 1% BSA. Incubare per 30 minuti a RT.
- Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Preparare il tampone Azide Dye fresco mescolando i reagenti nel seguente ordine (quantità per una provetta): 36 μL di PBS, 2 μL di 0,2 M CuSO4, 0,2 μL di 2 mM di Dy-530 azide, 2 μL di acido ascorbico 1 M.
NOTA: Una miscela master del tampone Azide Dye può essere preparata fresca mescolando i reagenti nell'ordine sopra indicato. - Risospendere il pellet con 40 μL di tampone Azide Dye appena fatto. Incubare a RT al buio per 60 min.
- Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Lavare le celle 2x con 300 μL di etanolo al 10% in PBS.
NOTA: I lavaggi sono fondamentali per eliminare tutto l'azide solubile Dy-530. - Pellettare le cellule per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Risospendere le cellule in 100 μL di 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in PBS. Lasciare agire per 30 minuti al buio a temperatura ambiente.
- Pellettare le celle per 2 minuti a 10.000 × g in una microcentrifuga. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Lavare con 300 μL di PBS per rimuovere l'eccesso di DAPI.
- Pellettare le celle per 2 minuti a 10.000 × g in un microfugo. Scartare il surnatante con una pipetta a vuoto.
- Risospendere il pellet con 10-50 μL di PBS a seconda della concentrazione cellulare.
- Sonicate 2x, per 2 s ogni volta, ad un'ampiezza di 40-50.
NOTA: Le celle possono essere mantenute in questa fase a 4 °C per alcuni giorni. - Pipettare 1,7 μL delle cellule su un vetrino da microscopio di vetro e coprire con un vetrino pulito.
- Osservare immediatamente al microscopio a fluorescenza con filtri DAPI e TexasRed o Cy3.
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Representative Results
Per determinare la durata della fase S e, più in generale, la durata di G 1 e G2 + M (fase del protocollo 1.1), le cellule wild-type di S. cerevisiae W303 (WT, Tabella 1) sono state coltivate in modo asincrono in mezzo SC per 7 ore. Ogni ora, la concentrazione cellulare è stata monitorata per determinare il tempo di raddoppio (Figura 2B). In queste condizioni di crescita, il tempo di raddoppio calcolato è stato di 120 minuti ± 13 minuti a 25 °C (Tabella 2). Quando le cellule erano nella fase esponenziale (2 × 10 6-5 × 106 cellule / ml), un'aliquota di cellule è stata marcata a impulsi con EdU (10 μM) per 5 minuti per individuare le cellule nella fase S e determinare la percentuale di cellule che si trovavano nelle fasi G1, S e G2 + M. Tre popolazioni di cellule sono state osservate in un'analisi citometrica bivariata EdU-PI (Figura 1B). La discriminazione tra le popolazioni EdU-negative e EdU-positive è stata effettuata utilizzando un esperimento di controllo in cui le cellule non sono state marcate a impulsi con EdU, ma è stata effettuata la reazione Click (Figura 1C). Le due popolazioni EdU-negative nelle aree in basso a sinistra e in basso a destra che differivano nell'intensità PI corrispondevano rispettivamente a G1 e G2 + M (Figura 1B, C). Pertanto, la popolazione superiore (con un'intensità >1× 10 4-2 × 104) corrispondeva alle cellule EdU-positive che erano nella fase S al momento dell'impulso (Figura 1B). Quindi, il 27% ± il 5% della popolazione cellulare era nella fase G1, il 29% ± il 3% era nella fase S e il 44% ± il 2% era in G2 + M. Poiché il tempo di raddoppio era di 120 minuti ± 13 minuti in queste condizioni, abbiamo estrapolato che le fasi G1, S e G 2 + M duravano 32 minuti ± 4 minuti, 35 minuti ± 6 minuti e 53 minuti ± 7 minuti, rispettivamente, a 25 ° C (Tabella2 e Tabella 3).
Successivamente, abbiamo mirato a convalidare questo metodo e dimostrare che è abbastanza sensibile da identificare mutanti con difetti di replicazione del DNA che sono stati trascurati finora. Abbiamo ragionato che gli alleli regolabili con perdita di funzione dei fattori coinvolti nella replicazione del DNA sarebbero stati controlli di convalida ideali. Quindi, abbiamo usato un ceppo di lievito contenente un mutante cdc6-1 sensibile alla temperatura (Tabella 1) 11. Cdc6 è un fattore di licenza essenziale che viene espresso in M e G1 tardivi per assemblare complessi di prereplicazione (preRC) su siti cromosomici legati all'ORC che possono essere successivamente utilizzati come origini di replicazione. Pertanto, a una temperatura permissiva, la sua durata della fase S dovrebbe essere uguale a quella del WT, mentre a una temperatura restrittiva, non dovrebbe verificarsi alcuna replicazione del DNA poiché nessuna origine è autorizzata12. Tuttavia, a una temperatura semi-permissiva, dove meno origini sono autorizzate ma ce ne sono abbastanza per conferire vitalità cellulare (i nostri dati non pubblicati; Barba Tena et al., in preparazione), abbiamo anticipato durate diverse per ogni fase. Come previsto, sulla base dei test di caduta, le cellule cdc6-1 sono cresciute allo stesso modo delle cellule WT a una temperatura permissiva (cioè 25 ° C, Figura 2A), mostrando lo stesso tempo di raddoppio (Figura 2B e Tabella 2), ma erano morte a o sopra 34 ° C (Figura 2A). Di interesse, a una temperatura semi-permissiva (cioè 28 °C), cdc6-1 era vitale (28 °C, Figura 2A). Tuttavia, il tempo di raddoppio è stato più lungo rispetto al WT (Figura 2B e Tabella 2) e la durata di ciascuna fase è stata diversa. Infatti, in cdc6-1, G 1 era leggermente più breve (12 min ±1 min vs. 16 min ± 2 min), mentre la fase S era leggermente estesa (34 min ± 4 min vs. 29 min ± 5 min), e la fase G2 + M era significativamente più lunga (77 min ± 4 min vs. 45 min ± 3 min) rispetto a WT (Figura 2C, D e tabella 3). La fase S non è stata, sorprendentemente, estesa molto, ma l'intensità media del segnale EdU è diminuita del 25% (Figura 2C, D), che è coerente con una fase S iniziata da un minor numero di origini. Inoltre, mentre le cellule WT EdU-positive erano distribuite omogeneamente tra le fasi S (S2) precoce (S1) e tardiva (S2) (Figura 2C, Figura supplementare S1A, fasi S [S1] precoce e tardiva [S2] delimitate con una linea tratteggiata verticale nel cancello superiore), il 65% delle cellule cdc6-1 EdU-positive si è accumulato nella fase S tardiva (Figura 2D, Figura supplementare S1B). Non c'era nemmeno una chiara distinzione tra le popolazioni S e G 2 + M (Figura 2D), suggerendo che le cellule faticavano a completare la fase S prima di entrare nella fase G2. Pertanto, questo metodo è adatto e sensibile per identificare mutanti con difetti nella fase S (durata e/o distribuzione) e nella durata della fase del ciclo cellulare.
È stato ideato un metodo complementare per determinare quando le cellule iniziano e terminano la loro replicazione del DNA e stimare la durata della fase S utilizzando cellule sincronizzate (fase 1.2 del protocollo). A tal fine, utilizzando α-factor con cellule sincronizzate in G1, le cellule sono state rilasciate in mezzo SC e raccolte ogni 5 minuti. La durata della fase S può essere di circa 25 minuti in base al momento in cui il contenuto di DNA è cambiato da 1C a 2C sul profilo citometrico a flusso Sytox Green (Figura 3A). Tuttavia, questa stima dipende da quando una frazione cellulare significativa della popolazione ha incorporato abbastanza Sytox Green da essere vista nel profilo FACS. Gli eventi di replica precoce e tardiva non possono essere rilevati con questo metodo. Per definire con precisione quando inizia e finisce la fase S e quanto dura, le celle della fase S sono state individuate da un'aliquota di cellule su marcatura a impulsi con EdU (10 μM) per 5 minuti ogni 5 minuti dopo il rilascio di G1. Come previsto, entro i primi 10 minuti dopo il rilascio, tutte le celle erano nell'area in basso a sinistra (cioè, in G1, Figura 3B, Figura supplementare S2). Quindici minuti dopo il rilascio, una frazione di cellule EdU-positive era già stata rilevata (confrontare le prime due righe in Figura supplementare S2 e Figura supplementare S3, cellule trattate con EdU e libere da EdU, rispettivamente), indicando che la fase S era iniziata (Figura 3C). La progressione attraverso la fase S è stata osservata dalla nube cellulare che si muove prima verso l'alto e poi verso destra nel grafico bivariato PI-EdU (Figura 3D-F). Infine, a 35 minuti dal rilascio, una frazione di cellule era EdU-negativa ma con il doppio della quantità di DNA, indicando che quelle cellule avevano completato la fase S ed erano nella fase G2 + M (Figura 3G). Pertanto, la fase S dura 20 minuti in queste condizioni. Da notare, nonostante l'elevata sincronia osservata con la sovrapposizione del contenuto di DNA rilevato con Sytox Green, suggerendo che la fase S era finita in tutta la popolazione 40 minuti dopo il rilascio, le analisi bivariate hanno mostrato che alcune cellule hanno terminato la fase S 60 minuti dopo il rilascio e che la fase S era completa per l'intera popolazione 65 minuti dopo il rilascio (Figura 3H, I e figura supplementare S2).
Inoltre, la fase S e la sintesi del DNA possono essere monitorate al microscopio. Da ogni origine di replicazione attivata, la sintesi del DNA viene effettuata da due replisomi legati, formando un focus di replicazione nucleare che può essere seguito dalla microscopia mediante imaging di una versione marcata di un fattore di replicazione e / o array di operatori e il loro corrispondente repressore fuso a una proteina fluorescente 2,13. In alternativa, la sintesi del DNA può essere rilevata al microscopio utilizzando analoghi della timidina14,15. Abbiamo usato EdU per monitorare le regioni subnucleari del DNA che subiscono la sintesi del DNA. A tal fine, abbiamo marcato a impulsi cellule asincrone WT e cdc6-1 con EdU (10 μM) per 3 minuti a 28 °C e le abbiamo visualizzate dopo la reazione Click. Ci aspettavamo di rilevare variazioni nelle intensità del segnale EdU a seconda della velocità di sintesi del DNA e della progressione cellulare nel ciclo cellulare durante l'impulso EdU di 3 minuti (cioè, le cellule che trascorrono tutti i 3 minuti nella fase S mostreranno un segnale più forte di quelle che entrano o escono dalla fase S durante l'impulso). Di conseguenza, le cellule di fase S WT mostravano un segnale EdU nel loro nucleo che variava di intensità (Figura 4A). La durata della fase S può essere facilmente estrapolata da questa analisi. Infatti, è stato determinato da due repliche biologiche (sono state contate almeno 150 cellule), che il 34% ± il 3% e il 38% ± 3% delle cellule WT e cdc6-1 erano rispettivamente EdU positive. Come in queste condizioni di crescita, il tempo di raddoppio è stato di 90 minuti e 123 minuti per le cellule WT e cdc6-1, rispettivamente (Tabella 2), abbiamo estrapolato che la fase S è durata rispettivamente 31 minuti e 47 minuti. Il primo risultato è in linea con quello ottenuto dalle nostre analisi FACS (Tabella 3), indicando che la rilevazione di cellule EdU-positive al microscopio consente la determinazione della durata della fase S. Da notare che quest'ultima è superiore alla durata della fase S estrapolata dalle nostre analisi FACS perché non c'era una chiara distinzione tra le popolazioni S e G2 + M (Figura 2D). I focolai di EdU sono stati prontamente osservati nelle cellule WT (Figura 4B) ma erano più deboli e meno nelle cellule cdc6-1 (Figura 4C). Per escludere la possibilità che la differenza di intensità del segnale EdU tra le celle WT e cdc6-1 dipendesse dalla fase della fase S, l'intensità è stata quantificata da celle sincronizzate. Come previsto, l'intensità media del segnale EdU era tre volte inferiore nelle cellule cdc6-1 (Figura 4D), coerente con la replicazione del DNA iniziata da un minor numero di origini di replicazione. Il segnale EdU era limitato al nucleo, colocalizzandosi con un forte segnale DAPI, e organizzato in schemi globulari, coerenti con l'organizzazione della replicazione del DNA nelle regioni nucleari o nelle fabbriche di replicazione. È importante sottolineare che l'EdU è stata rilevata solo in cellule non gemmate o piccole e non è mai stata presente in cellule con grandi gemme, indicando che le cellule di lievito WT avevano terminato la replicazione nel momento in cui sono entrate in mitosi. Questo metodo è, quindi, sensibile per visualizzare la replicazione del DNA ad alta risoluzione spaziale, nonché per rilevare e quantificare lievi difetti di replicazione del DNA.
Figura 1: Analisi FACS rappresentative. (A) Analisi rappresentative di Sytox Green FACS per cellule WT cresciute a 25 °C. (B,C) Analisi FACS bivariate rappresentative EdU-PI per cellule WT cresciute a 25 °C e marcate con impulsi per 5 minuti con EdU (10 μM) o 1 μL di DMSO. I poligoni erano gli stessi in entrambe le analisi. C è stato utilizzato per delineare le cellule EdU-negative dalle cellule EdU-positive (generalmente, il limite è fissato ad un'intensità >1× 10 4-2 × 104). Il gate poligonale superiore delineava le celle EdU-positive (frazione di fase S). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Frazione di cellule nelle fasi del ciclo cellulare G 1, S e G2 + M in popolazioni cellulari asincrone. (A) I ceppi WT e cdc6-1 sono stati individuati a diluizioni seriali cinque volte su terreno ricco e cresciuti a 25 °C, 28 °C o 34 °C. (B) Tempo di raddoppio della popolazione. Le cellule asincrone WT e cdc6-1 sono state coltivate a 25 °C o 28 °C e la concentrazione cellulare è stata misurata ogni ora per 7 ore. (C,D) Analisi FACS bivariata EdU-PI di cellule WT e cdc6-1 cresciute a 28 °C e marcate a impulsi per 5 minuti con EdU (10 μM). Moltiplicando il tempo di raddoppio della popolazione per la frazione di fase S si ottiene la durata della fase S. Le intensità medie delle celle EdU-positive e EdU-negative sono state calcolate come media dell'intensità di ciascun valore nel poligono corrispondente. Le intensità medie delle cellule EdU-negative WT e cdc6-1 (5.077 e 4.454, rispettivamente) sono state normalizzate a 1. Le intensità medie delle cellule EdU-positive WT e cdc6-1 (52.604 e 36.141, rispettivamente) sono state divise per il fattore di normalizzazione utilizzato per ciascun ceppo. I valori ottenuti sono stati rispettivamente 10,4 e 8,1 (cioè una diminuzione del 25%, come menzionato nel testo). Abbreviazioni: WT = wild-type; EdU = 5-etinil-2'-deossiuridina; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza; PI = ioduro di propidio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Determinazione della durata della fase S su cellule sincronizzate. (A) Analisi del tempo del contenuto di DNA delle cellule WT dopo rilascio di α fattore a 28 °C. Il tempo indicato tiene conto della durata dell'impulso EdU (5 min). (B-I) Analisi FACS bivariate EdU-PI per cellule WT sincronizzate marcate a impulsi per 5 minuti con EdU (10 μM) e raccolte nei tempi indicati dopo il rilascio dall'arresto G1. Abbreviazioni: WT = wild-type; EdU = 5-etinil-2'-deossiuridina; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza; PI = ioduro di propidio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Rilevazione e quantificazione dell'EdU mediante microscopia. I ceppi asincroni WT e cdc6-1 sono stati coltivati per 2 ore a 28 °C, quindi marcati a impulsi per 3 minuti con EdU (10 μM) e ripresi mediante microscopia a campo ampio utilizzando adeguati filtri di eccitazione/emissione. (A) Immagini rappresentative da microscopia a grande campo per WT e (B,C) singole cellule per WT e cdc6-1 visualizzate mediante DIC e colorate con DAPI o per EdU, come indicato. Le barre della scala in (A) e (B,C) sono rispettivamente 10 μm e 2 μm. (D) Misure di intensità EdU su cellule sincrone WT e cdc6-1 cresciute a 28 °C 30 minuti dopo il rilascio dall'arresto G1. Il grafico rappresenta il raggruppamento di tre repliche biologiche (almeno 50 cellule sono state contate in ogni replica biologica). Le ± SD medie sono visualizzate sul grafico. Un test t a due code spaiato tra le cellule WT e cdc6-1 è indicato da **** (p < 0,0001). Abbreviazioni: WT = wild-type; EdU = 5-etinil-2'-deossiuridina; DIC = contrasto di interferenza differenziale; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; U.A. = unità arbitrarie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Nome | Genotipo | Figure e tabelle | ||
| WT (E3087): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | Fig.1, Fig.2A,B,C, Fig3, Fig.4A,B,D, SUPP Fig.1,2,3 Tabelle2,3 | ||
| cdc6-1 (E5956): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | Fig.2A,B,D, Fig.4 C,D, Supp Fig.1, Tabelle2,3 | ||
| TK+ (E1000): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) | Supp Fig.4 | ||
| TK+ hENT+ (E2031): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | Supp Fig.4 | ||
| hENT+ (E2031): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 | Supp Fig.4 | ||
| CDC6-1 TK+ hENT+ (E3968): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | Supp Fig.4 | ||
| W303-1A (E001): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 | Supp Fig.4 | ||
Tabella 1: Elenco dei ceppi utilizzati in questo studio.
| WT | CDC6-1 | |||
| 25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |
| Tempo di raddoppio (min) | 120 | 90 | 118 | 123 |
| SD | ± 13 min | ± 3 min | ± 10 min | ± 6 min |
Tabella 2: Tempi medi di raddoppio dei ceppi WT e cdc6-1 cresciuti a 25 °C e 28 °C. I tempi di raddoppio sono stati calcolati da tre repliche biologiche (quattro repliche tecniche per ogni replica biologica) utilizzando la seguente formula: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), dove Cf e Ci corrispondono rispettivamente alle concentrazioni cellulari finali e iniziali e Δt corrisponde alla differenza in minuti tra tf e ti, quando sono stati misurati Cf e Ci, rispettivamente.
| WT | CDC6-1 | |||||||
| 25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |||||
| Percento | Durata (min) |
Percento | Durata (min) |
Percento | Durata (min) |
Percento | Durata (min) |
|
| G1 | 27 | 32 | 18 | 16 | 13 | 16 | 10 | 12 |
| S | 29 | 35 | 32 | 29 | 28 | 34 | 28 | 34 |
| G2+M | 44 | 53 | 50 | 45 | 59 | 71 | 62 | 77 |
| SD G1 | ±5 | ±4 | ±3 | ±2 | ±2 | ±1 | ±1 | ±1 |
| SD S | ±3 | ±6 | ±5 | ±5 | ±5 | ±7 | ±4 | ±4 |
| SD G2+M | ±2 | ±7 | ±4 | ±3 | ±4 | ±4 | ±6 | ±4 |
Tabella 3: Frazioni medie di cellule e durata delle fasi G 1, S e G2 + M in cellule WT e cdc6-1 cresciute a 25 °C e 28 °C. Le frazioni di cellule sono state determinate da tre repliche biologiche (due repliche tecniche per ogni replica biologica). Le differenze nella durata di G 1, S e G2 + M tra le cellule WT e cdc6-1 cresciute a 28 °C erano statisticamente significative (test t a due code spaiato, p <0,1).
Figura supplementare S1: Frazione di cellule nelle fasi S precoce e tardiva in cellule WT e cdc6-1 cresciute a 28 °C. Due poligoni identici denominati S1 e S2 per le fasi S precoce e tardiva, rispettivamente, sono stati disegnati nella frazione di cellule EdU-positive per dividerla in due metà sulle analisi FACS bivariate EdU-PI per (A) cellule WT cresciute a 28 °C e (B) cellule cdc6-1 cresciute a 28 °C. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Progressione del ciclo cellulare di cellule marcate con impulso EdU dopo rilascio dall'arresto G1 visualizzato da FACS bivariato EdU-PI. Un'aliquota di cellule è stata marcata a impulsi per 5 minuti con 10 μM di EdU ogni 5 minuti dopo il rilascio dall'arresto del fattore α a 28 °C e fino a 80 minuti, come indicato. Abbreviazioni: EdU = 5-etinil-2'-deossiuridina; FACS = selezione cellulare attivata dalla fluorescenza; PI = ioduro di propidio. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Progressione del ciclo cellulare delle cellule trattate con DMSO dopo il rilascio dall'arresto G1 visualizzato da FACS bivariato EdU-PI. Questo è lo stesso della figura supplementare 2, ma le cellule sono state incubate per 5 minuti con 1 μL di DMSO (dimetilsolfossido). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S4: Tossicità di BrdU e EdU nelle cellule di lievito TK hENT1. Le cellule del genotipo indicato sono state individuate in diluizioni seriali cinque volte su piastre YPD contenenti concentrazioni crescenti di BrdU o EdU e cresciute per 40 ore a 30 °C. Abbreviazioni: DMSO = dimetil solfossido; BrdU = bromodeossiuridina; Edu = 5-etinil-2'-deossiuridina; TK = timidina chinasi; hENT1 = trasportatore nucleosidico equilibrante umano. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il lievito è un organismo modello primario per gli studi del ciclo cellulare, ma la caratterizzazione della sua fase S è stata a lungo ostacolata dalla sua incapacità di incorporare nucleosidi esogeni, come BrdU, che sono usati come traccianti della replicazione del DNA. Dotare il lievito di un'alta espressione di herpes simplex timidina chinasi (TK) e l'aggiunta di un trasportatore nucleosidico umano (hENT) ha ampiamente risolto questo problema15,16. EdU è più versatile di BrdU in quanto il suo rilevamento con azoturo fluorescente e chimica Click è suscettibile di cellule di lievito permeabilizzate e analisi FACS, a differenza degli anticorpi anti-BrdU17. Qui, abbiamo ottimizzato le condizioni di etichettatura e rilevamento EdU in questo ceppo TK-hENT1 e abbiamo dimostrato che i difetti di replicazione precedentemente non rilevati possono essere quantificati utilizzando questo protocollo mediante FACS o microscopia.
Studiare un meccanismo biologico utilizzando strumenti che possono interferire con lo stesso meccanismo è un problema comune in biologia. Poiché l'EdU ha un noto effetto citotossico, abbiamo cercato concentrazioni di EdU che non sono tossiche nell'esposizione cronica al ceppo ingegnerizzato TK-hENT1 e abbiamo trovato 10 μM come dose adatta. Le cellule TK-hENT1 non riescono a proliferare a 25 μM EdU, mentre le cellule TK-alone o hENT1-alone resistono facilmente a 100 μM EdU (Figura supplementare S4). Sebbene le cellule di lievito siano considerevolmente più sensibili all'EdU rispetto al BrdU, abbiamo scoperto che la proliferazione è diminuita solo dopo il secondo ciclo cellulare dopo l'esposizione all'EdU, suggerendo che deve essere incorporata su entrambi i filamenti per influenzare la proliferazione cellulare (dati non mostrati). Per stare al sicuro, abbiamo usato 10 μM EdU in tutto questo protocollo, con solo impulsi brevi (3 minuti per la microscopia; 5 minuti per FACS), e abbiamo trovato che questo era adatto per un buon rilevamento utilizzando questo protocollo ottimizzato.
Difetti sottili nella replicazione del DNA possono avere un forte impatto sui riarrangiamenti cromosomici4. Pertanto, lo sviluppo di tecniche e protocolli in grado di rilevare questi difetti sottili è la chiave per scoprire l'eziologia delle aberrazioni cromosomiche. Qui, mostriamo che questo protocollo ottimizzato di incorporazione e rilevamento di EdU può misurare fino a una riduzione di tre volte dell'intensità del segnale (Figura 2 e Figura 4), indicando che il tasso di sintesi del DNA è ridotto nelle cellule cdc6-1 sensibili alla temperatura cresciute a 28 °C, che, ancora, non mostrano difetti nei saggi di vitalità della piastra (Figura 2A ). Questo protocollo di incorporazione e quantificazione dell'EdU può, quindi, essere utilizzato per lo screening di altri mutanti per i quali inizialmente non si sospettano difetti di replicazione. Inoltre, può essere utile rilevare la sintesi del DNA mitotico (MiDAS), la sintesi del DNA dipendente dalla ricombinazione meiotica o altre sintesi del DNA a lungo tratto.
Uno svantaggio è che il rilevamento EdU può essere eseguito solo su cellule fisse, precludendo l'analisi dal vivo come con PCNA-GFP o altre letture fluorescenti della replicazione del DNA, che soffrono dell'elevata fototossicità dei raggi laser utilizzati per l'imaging. La crescita delle cellule in un mezzo sintetico è fondamentale per il miglior rilevamento, poiché i resti di YPD sembrano estinguere significativamente la reazione di Click. È interessante notare che l'individuazione delle cellule in fase S utilizzando l'analisi FACS bivariata EdU-PI su popolazioni sincronizzate consente la stima della durata della fase S a 20 minuti in singole cellule (Figura 3, Figura supplementare S2 e Figura supplementare S3). Tuttavia, anche quando la sincronia dopo il rilascio di α fattori appare quasi perfetta come nella classica analisi Sytox Green FACS (Figura 3A), diventa chiaro dall'analisi bivariata EdU-PI FACS che le cellule entrano nella fase S in modo relativamente asincrono (Figura 3B-I).
Qui, descriviamo tre metodi per determinare la durata della fase S utilizzando la citometria a flusso e la microscopia su cellule sincrone e asincrone sia a livello di singola cellula che di popolazione. Le durate medie della fase S determinate nelle cellule WT asincrone a livello di popolazione sono simili utilizzando la citometria a flusso e la microscopia, rispettivamente a 29 minuti e 31 minuti, mentre il nostro approccio sincronizzato basato su singole cellule mostra che la durata può essere breve come 20 minuti (Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Tabella 3 ). La discrepanza tra questi valori è sorprendente ma può essere facilmente spiegata. Infatti, con il nostro approccio basato su una singola cellula, la durata della fase S è stata determinata in base ai primi eventi (cioè le prime cellule che entrano ed escono dalla fase S, Figura 3C, G), ma non implica che la fase S duri 20 minuti in ogni cellula all'interno di una popolazione. Questi dati supporterebbero l'idea inaspettata che ci sia un certo livello di eterogeneità nella durata della fase S tra le cellule.
Protocolli migliorati o nuove tecniche possono rovesciare dogmi di vecchia data o nuove idee. Ce ne sono tre che questi dati sfidano. In primo luogo, si ritiene che la sintesi del DNA sia concomitante con l'emergenza delle gemme in S. cerevisiae. La figura 4A-C mostra che la colorazione EdU è più forte nelle cellule non budded e small-budded, nonostante il ritardo di etichettatura di 3 minuti, indicando che la fase S inizia chiaramente prima del germogliamento, come mostrato in precedenza16. In secondo luogo, è stato riferito che le cellule di lievito non hanno una fase G2, con fusi mitotici che si formano contemporaneamente alla sintesi del DNA. Gli impulsi molto brevi combinati con il rilevamento sensibile EdU mediante FACS (Figura 3, Figura supplementare S2 e Figura supplementare S3) o microscopia (Figura 4) consentono di determinare con precisione quando inizia e finisce la fase S nelle singole cellule. In questo modo, abbiamo scoperto che la sintesi del DNA di massa termina 40 minuti dopo il rilascio del fattore α (Figura 3, Figura supplementare S2 e Figura supplementare S3), mentre i fusi mitotici corti si formano solo 20 minuti dopo16 (dati non mostrati). Concludiamo che le cellule di lievito hanno una fase G2. In terzo luogo, è stato recentemente proposto che fino al 30% delle cellule di lievito completi la sintesi del DNA in anafase-telofase18. Utilizzando questo protocollo ottimizzato, non abbiamo rilevato l'incorporazione di EdU in cellule che mostrano un fuso anafase/telofase (dati non mostrati), ma non possiamo escludere che questa seconda ondata di sintesi del DNA sia al di sotto della soglia di rilevazione utilizzata. Dato il forte rapporto segnale/rumore, riteniamo improbabile quest'ultima opzione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere l'Agence Nationale de la Recherche (ANR) e l'Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) per le borse di dottorato a J.d.D.B.T. e l'Agence Nationale pour la Recherche (ANR) per il sostegno finanziario (sovvenzione ANR-18-CE12-0018-01). La citometria e la microscopia sono state eseguite presso la struttura di imaging MRI BioCampus di Montpellier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100--812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
References
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