Summary
我々は、in vivoに組み込まれ、顕微鏡およびフローサイトメトリーによってクリックケミストリーを使用して検出されるチミジン類似体であるEdUを使用して、S.cerevisiaeのS期持続時間を正確に決定するための2つの補完的なプロトコルについて説明します。これにより、DNA複製の持続時間や変異体の見落とされた複製欠陥を簡単に特徴付けることができます。
Abstract
真核生物のDNA複製は、染色体分離の前に細胞の遺伝的青写真が正しく複製されることを保証する高度に制御されたプロセスです。DNA合成の欠陥は染色体再配列の根底にあるため、DNA複製のモニタリングは、ゲノム不安定性の基礎を理解するために不可欠になっています。 Saccharomyces cerevisiae は、細胞周期調節を研究するための古典的なモデルですが、S期の細胞の割合やS期の持続時間などの重要なDNA複製パラメータを決定することは依然として困難です。このプロトコルは、チミジン類似体である5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)の短い非毒性パルスを改変されたTK-hENT1酵母細胞で使用し、続いてクリック反応で検出することで、顕微鏡およびフローサイトメトリーによる単一細胞レベルと集団レベルの両方で高い空間的および時間的分解能でDNA複製の視覚化と定量を可能にします。この方法は、酵母変異体のS期および細胞周期進行におけるこれまで見過ごされてきた欠陥を特定し、それによってゲノム安定性を確保するために不可欠な新しいプレーヤーの特性評価を可能にする可能性があります。
Introduction
有糸分裂によるゲノム安定性は、2つの産生された細胞子孫への完全かつ等しい染色体のセットの伝達によって保証される。これは、細胞周期の各段階において所与の時間に起こる一連の事象の正確な完了に依存する。G 1では、複製元は、Cdc61を含むいくつかのライセンス要素の採用時にライセンスされます。S期では、全ゲノム複製は複数のアクティブな複製起点から開始され、複製ファクトリー2と呼ばれる顕微鏡的に見える焦点に集まる複製機械によって実行されます。M期では、複製された姉妹染色分体が有糸分裂紡錘体上に付着し、双配向して、有糸分裂細胞3の反対側の極に分離することを可能にする。各フェーズの調節、適切な完了、および期間は、ゲノムの安定性を確保するための鍵です。実際、これらの段階のいずれかからの時期尚早の終了は、ゲノムの不安定性につながります。例えば、出芽酵母CDK阻害剤Sic1の欠失またはG1サイクリンの過剰発現によって誘導されるより短いG1は、その後のS期4,5,6を変化させるであろう。その結果、複製ストレスに関連するかどうかにかかわらず、これらの規制緩和は、染色体の切断、再配列、および誤分離をもたらします4,5,6。したがって、S期の持続時間、より広義には細胞周期の他の段階の持続時間を監視することは、異なる変異体および異なるストレスの多い条件で発生する欠陥を特定するために重要であり得る。
細胞周期の持続時間を測定する従来の方法には、単純なDNA含有フローサイトメトリー(図1A)が含まれ、1Cおよび2Cピークから集団をG1、S、およびG2 + Mフェーズフラクションに分離するために使用されるフィッティングアルゴリズム(ほとんどのサイトメトリーソフトウェアで利用可能)に依存します。次に、分数に母集団倍増時間7を掛けます。ただし、この方法は推定値のみを提供し、特定のフラクション内で均一な細胞サイズ分布を必要とし、同期培養には適用できません。哺乳類細胞におけるS期持続時間を研究するために、EdUを含むいくつかのチミジン類似体が開発され、広く使用されている。細胞外培地からの取り込みとチミジンキナーゼ(以下TK)によるリン酸化により、DNAポリメラーゼがDNA合成(複製、組換え、修復)の部位に取り込むことができます。 サッカロミセス・セレビシエ 細胞におけるTK遺伝子の不在を回避するために、酵母株は、単純ヘルペスウイルスTK8 およびヒト平衡ヌクレオシドトランスポーター(hENT1)9の安定かつ構成的発現を可能にするように操作されている。DNAに取り込まれると、EdUは選択的クリック反応 を介して 検出され、そのアルキン部分をアジド修飾蛍光色素10に化学的に結合します。
この論文は、顕微鏡とフローサイトメトリーによって単一細胞レベルと集団レベルの両方で高い空間的および時間的分解能で、DNA複製期間とダイナミクス、および細胞周期の他のフェーズの持続時間を正確に視覚化および測定するために、EdUで非同期および同期TK-hENT1操作細胞をパルス標識するための2つの最適化された包括的なプロトコルを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. S. セレビシエ 細胞培養
注:使用した酵母株は表1に記載されています
注意: Sフェーズの持続時間は、さまざまな方法で監視できます。対処すべき問題に応じて、細胞は、G1 停止後に非同期または同期的に増殖させることができる。
- 非同期に増殖 するS.セレビシエ 細胞から
注:この方法では、非同期的に成長する細胞集団におけるS期の細胞の割合を決定できます。倍増時間を決定することにより、Sフェーズ(および他のフェーズ)の持続時間を外挿できます。- 10 mLの合成完全(SC)培地に S. cerevisiae 細胞を低細胞濃度(5 ×10 4 細胞/mL)で接種し、130 rpmで軌道攪拌しながら30°Cで一晩培養します。
注:濃度はセルカウンターで測定されます。倍加時間を効率的に計算するには、まだ指数関数的段階にある(理想的には2 ×10 7 cells/mL未満)の一晩培養から培養物を接種することをお勧めします。リッチ培地(YPD)で細胞を増殖させることは、EdU検出が効率的ではないため推奨されません。 - 翌日、細胞を20 mLの新鮮なSC培地で最終濃度5×105 細胞/mLで希釈します。
- 細胞を120rpmで横振とうしながら振とう水浴中で30°Cで培養した。
- 細胞濃度は、1 ×10 7 cells/mLに達するまで1時間ごとに測定します。
注:この手順により、時間の経過に伴う細胞濃度の増加をグラフィカルに表示できます。倍増時間の計算に使用される式は、 表2の凡例で説明されています。 - 細胞濃度が約2 ×10 6-5×10 6 細胞/mLの場合、EdU標識のステップ2と並行して進めます。
- 10 mLの合成完全(SC)培地に S. cerevisiae 細胞を低細胞濃度(5 ×10 4 細胞/mL)で接種し、130 rpmで軌道攪拌しながら30°Cで一晩培養します。
- G1- 同期したS.セレビシエ 細胞から
注:この方法では、フローサイトメトリーおよび/または顕微鏡分析によってS期の開始時期と終了時期を決定できます。- S. cerevisiae細胞を10 mLのSC培地に低細胞濃度(5 ×10 4 cells/mL)で接種し、130 rpmで軌道攪拌しながら30°Cで一晩培養します。
メモ: 手順 1.1.1 以降の注を参照してください。 - 翌日、細胞を20 mLの新鮮なSC培地で最終濃度2 ×10 6-3×106 細胞/mLで希釈します。
- 水で希釈した1 mg/mLのα因子を40 μL加えます。
- 細胞を30°Cで130rpmで1時間軌道撹拌しながら培養する。
- 水で希釈した1 mg/mLのα因子を40 μL再度加えます。
- 細胞を30°Cで130rpmで1時間軌道撹拌しながら培養する。
- 光学顕微鏡下で細胞を可視化し、G1 停止をモニターする。セルの90%以上がshmooを表示し、他のセルが丸みを帯びた芽のないセルである場合に進みます。
注:使用する背景に応じて、shmoo視覚化の前に細胞を超音波処理することをお勧めします。W303の背景のために、40-50の振幅で、毎回2秒間、2x超音波処理します。 - 1,500 × gで3分間遠心分離します。上清を真空ピペットで捨てる。
- 細胞を20 mLのSC培地に再懸濁します。
- 手順1.2.8〜1.2.9を1回繰り返します。
注:これらのステップでα因子が洗い流され、細胞が細胞周期で放出されます。あるいは、真空ポンプに接続されたサイドアームフラスコにセットされた漏斗を使用して、1.2μmのニトロセルロースフィルターで酵母細胞をろ過することにより、α因子を洗い流すことができます。 - 5分ごとに1 mLの細胞を2回収集し、EdU標識のステップ2に進みます。
注:2本のチューブのうち1本のみの細胞にEdUをパルスラベル付けします。非パルス標識細胞は、二変量ヨウ化プロピジウム(PI)-EdUグラフ上でEdU陽性細胞とEdU陰性細胞を区別するために使用されます。 - 放出後30分で水で希釈した1 mg/mL α因子400 μLを加えます。.
注:この高用量のα因子は、次の細胞周期のG1 期で細胞を阻止し、細胞が次のS期に再入するのを防ぐために必要です。
- S. cerevisiae細胞を10 mLのSC培地に低細胞濃度(5 ×10 4 cells/mL)で接種し、130 rpmで軌道攪拌しながら30°Cで一晩培養します。
2. EdUラベリング
- 1 mLの細胞培養液を、1 μLの10 mM EdUを含む2.0 mLの微量遠心チューブに移します。反転でよく混ぜます。
注:PI-EdU二変量FACSでEdU陽性細胞とEdU陰性細胞を区別するには、さらに1 mLの細胞培養液を、1 μLのDMSOを含む2.0 mLのマイクロフュージチューブに移します。 - 振とう水浴中で攪拌しながら30°Cで3〜5分間インキュベートします。
注:顕微鏡でのEdU検出には3分で十分です。フローサイトメーターで最適なEdUを検出するには5分かかります。 - 100 μLの100%エタノールを加えて反応を停止します。
- 細胞サイズの測定が必要な場合は、100 μLの20%パラホルムアルデヒドを添加して反応を停止します。
注:Click反応後のさらなる分析のために有糸分裂細胞の核構造をそのまま維持する場合は、細胞を氷上に置くのではなく、室温(RT)で2%パラホルムアルデヒドで細胞を固定することをお勧めします。 - 100 μLの100%エタノールを添加する前に、可変速ロッカーで20チルト/分で穏やかに攪拌しながら、細胞をRTで20分間放置します。
- 細胞サイズの測定が必要な場合は、100 μLの20%パラホルムアルデヒドを添加して反応を停止します。
3. 細胞の固定と透過処理
- 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。真空ピペットを使用して上清を除去します。
- 細胞ペレットを500 μLの70%エタノールに再懸濁します。ボルテックスでよく混ぜます。
- 可変速ロッカーでRTで20チルト/分で≥1時間放置し、細胞を透過させます。
注:SC培地で増殖した細胞は、マイクロフュージ壁に付着する傾向があるため、うまくペレット化されません。エタノールの添加はペレット化を改善し、細胞損失を減少させる。細胞は4°Cで一晩保存することも、-20°Cで長期間保存することもできます。 - 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- 細胞をPBS中の500 μLの10%エタノールで2回洗浄します。
注:洗浄は、細胞から取り込まれていないEdUを除去するために重要です。
4.クリック反応
- サイトメトリー分析用
- 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- 0.1 mg/mL RNase Aおよび0.2 mg/mLプロテイナーゼKを含む200 μLのPBSにペレットを再懸濁します。
- 時々振とうしながら50°Cで1〜2時間インキュベートします(または37°Cで一晩)。
- 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- 細胞を500 μLのPBSで洗浄します。
- 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- 細胞ペレットを200 μLのPBS + 1%ウシ血清アルブミン(BSA)に再懸濁します。RTで30分間インキュベートします。
注:より長い時間は必要ではなく、クリック反応の効率にさえ悪影響を及ぼします。 - 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- ペレットを300 μLのPBS + 1%BSAに再懸濁します。
- 細胞を2本のチューブに分配します:クリック反応用の1.5 mLマイクロ遠心チューブに200 μL、Sytox Green染色用に別の1.5 mLマイクロ遠心チューブに100 μL。
- 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- シトックスグリーン染色用
注:高品質のDNA含有量参照プロファイルを取得するために、Sytox Green染色(クリックなし)のアリコートを採取することを強くお勧めします。実際、クリック反応は、Sytox GreenおよびPI蛍光を含むインターカラント蛍光を強く消光します。その結果、クリック反応はDNA含有量の読み取りを歪める可能性があります。- 細胞ペレットを100 μLのPBSに再懸濁します。
- 10-30 μL(細胞濃度に応じて)を、300 μLの50 mM Tris-HCl、pH 7.5、および0.5 μMのSytox Greenを含むフローサイトメーターチューブに移します。
- 40-50の振幅で、毎回2秒間、2倍超音波処理します。
- フローサイトメーターでサンプルを処理するまで、暗所に置いてください。
注:細胞はこの段階で4°Cで数日間保持できます。
- クリック反応の場合
- 36 μLのPBS、2 μLの0.2 M CuSO4、0.2 μLの2 mM Cy5アジド、および2 μLの1 Mアスコルビン酸の順(1本のチューブの量)で試薬を混合して、新しいアジ化物色素バッファーを調製します。
注:アジド色素バッファーのマスターミックスを調製することが可能です。試薬は、上記と同じ順序で混合する必要があります。 - 細胞ペレットを40 μLの新しく作られたアジド染料ミックスで再懸濁します。暗闇の中でRTで60分間インキュベートします。
- 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- PBS中の300 μLの10%エタノールで細胞を3回洗浄します。
注:洗浄は、すべての可溶性EdU-Cy5アジドを除去するために重要です。 - 細胞を 100 μL の 50 μg/mL PI の PBS に再懸濁します。暗闇の中で10分間放置してください。
- 10〜30 μLの細胞懸濁液(細胞濃度に応じて)を、300 μLの50 mM Tris-HCl、pH 7.5を含むフローサイトメーターチューブに移します。
- 40-50の振幅で、毎回2秒間、2倍超音波処理します。
- サイトメーターでサンプルを処理するまで暗所に置いてください。
注:細胞はこの段階で4°Cで数日間保持できます。
- 36 μLのPBS、2 μLの0.2 M CuSO4、0.2 μLの2 mM Cy5アジド、および2 μLの1 Mアスコルビン酸の順(1本のチューブの量)で試薬を混合して、新しいアジ化物色素バッファーを調製します。
- 488 nmの励起青色レーザーと530/30 BPフィルターを使用して、Sytox Greenサンプルを読み取ります。典型的な結果については 、図1A を参照してください。PI(x軸)には488nmの励起青色レーザーと615/20 BPフィルター、640 nmの励起赤色レーザーと660/20 BPフィルター(y軸)を使用して、ドットプロット上の二変量PI-EdUサンプルを読み取ります。典型的な結果については 、図1B を参照してください。
注: 図1C は、EdU陰性細胞の典型的なPI-EdU二変量FACS結果を表しています。これにより、EdU陰性細胞とEdU陽性細胞との識別が可能になります。
- 顕微鏡分析用
- 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- ペレットを200 μLのPBS + 1%BSAに再懸濁します。RTで30分間インキュベートします。
- 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- 試薬を次の順序(1本のチューブに対する量)で混合して、新鮮なアジ化物色素バッファーを調製します:36 μLのPBS、2 μLの0.2 M CuSO4、0.2 μLの2 mM Dy-530アジ化物、2 μLの1 Mアスコルビン酸。
注:アジド色素バッファーのマスターミックスは、前述の順序で試薬を混合することにより、新鮮に調製できます。 - ペレットを40 μLの新しく作られたアジド染料バッファーで再懸濁します。暗闇の中でRTで60分間インキュベートします。
- 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- 細胞をPBS中の300 μLの10%エタノールで2回洗浄します。
注意: 洗浄は、すべての可溶性Dy-530アジドを除去するために重要です。 - 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- 細胞を0.5 μg/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)の 100 μL に PBS で再懸濁します。室温で暗所に30分間放置します。
- 細胞をマイクロ遠心分離機で10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- 300 μLのPBSで洗浄し、余分なDAPIを除去します。
- 細胞をマイクロフュージで10,000 × g で2分間ペレット化します。上清を真空ピペットで捨てる。
- 細胞濃度に応じて、ペレットを10〜50 μLのPBSで再懸濁します。
- 40-50の振幅で、毎回2秒間、2倍超音波処理します。
注:細胞はこの段階で4°Cで数日間保持できます。 - 1.7 μLの細胞を顕微鏡スライドガラス上にピペットで移し、清潔なカバーガラスで覆います。
- DAPIおよびTexasRedまたはCy3フィルターを備えた蛍光顕微鏡で直ちに観察してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S期持続時間および、より広義には、G1 およびG2 +Mの持続時間を決定するために(プロトコルステップ1.1)、 S. cerevisiae W303野生型細胞(WT、 表1)をSC培地中で7時間非同期に増殖させた。1時間毎に、細胞濃度をモニターし、倍加時間を決定した(図2B)。これらの増殖条件において、計算された倍加時間は、25°Cで120分±13分であった(表2)。細胞が指数関数的段階(2 × 106-5 × 106 cells/mL)にある場合、細胞のアリコートをEdU(10 μM)で5分間パルス標識して、S期の細胞を選び出し、G1、S、およびG2 + M期にあった細胞の割合を決定しました。3つの細胞集団が二変量EdU−PIサイトメーター分析において観察された(図1B)。EdU陰性集団とEdU陽性集団の鑑別は、細胞をEdUでパルス標識せず、クリック反応を行った対照実験を用いて行った(図1C)。PI強度が2倍異なる左下および右下の領域の2つのEdU陰性集団は、それぞれG1 およびG2 + Mに対応していた(図1B、C)。したがって、上位集団(強度>1× 104-2 ×10 4)は、パルス時にS期にあったEdU陽性細胞に対応しました(図1B)。したがって、細胞集団の27%±5%がG1 期にあり、29%±3%がS期にあり、44%±2%がG2 + Mであった。これらの条件での倍加時間は120分±13分であったので、我々は、G1、S、およびG2 +M相が25°Cでそれぞれ32分±4分、35分±6分、および53分±7分持続することを外挿した(表2 および 表3)。
次に、この方法を検証し、これまで見過ごされてきたDNA複製障害のある変異体を特定するのに十分な感度があることを示すことを目指しました。我々は、DNA複製に関与する因子の調整可能な機能喪失対立遺伝子が理想的な検証コントロールであると推論した。したがって、我々は、温度感受性cdc6-1変異体を含む酵母株を使用した(表1)11。Cdc6は、後に複製起点として使用される可能性のあるORC結合染色体部位上に複製前複合体(preRC)を組み立てるために、後期MおよびG1で発現する必須のライセンス因子です。したがって、許容温度では、そのS相持続時間はWTの持続時間と同じである必要がありますが、制限温度では、起源が認可されていないため、DNA複製は発生しないはずです12。しかし、半許容温度では、ライセンスされている起源は少ないが、細胞の生存率を付与するのに十分である(私たちの未発表データ;Barba Tenaら、準備中)、各フェーズで異なる期間を予想しました。予想通り、落下試験に基づいて、cdc6-1細胞は許容温度(すなわち、25°C、図2A)でWT細胞と同じように増殖し、同じ倍加時間を示し(図2Bおよび表2)、34°C以上では死滅した(図2A)。興味深いことに、半許容温度(すなわち、28°C)で、cdc6-1は生存可能であった(28°C、図2A)。しかし、倍加時間はWTよりも長く(図2Bおよび表2)、各相の持続時間は異なっていた。実際、cdc6-1では、G1はわずかに短く(12分±1分対16分±2分)、S相はわずかに伸長し(34分±4分対29分±5分)、G2 + M相はWTと比較して有意に長く(77分±4分対45分±3分)、G2 + M相はWTと比較して有意に長かった(図2C、Dおよび表3)。驚くべきことに、Sフェーズはあまり拡張されていませんでしたが、EdU信号の平均強度は25%減少し(図2C、D)、これはより少ない起源から開始されたSフェーズと一致しています。また、EdU陽性WT細胞は初期(S1)期と後期S(S2)期の間で均一に分布していたが(図2C、補足図S1A、初期[S1]期と後期S[S2]期は上段に縦破線で区切られている)、EdU陽性cdc6-1細胞の65%が後期S期に集積した(図2D、補足図S1B)。 S集団とG2+M集団の間に明確な区別さえなく(図2D)、細胞がG2期に入る前にS期を完了するのに苦労したことを示唆している。したがって、この方法は、S期(持続時間および/または分布)および細胞周期期期間に欠陥を有する変異体を同定するのに適しており、感度が高い。
細胞がDNA複製を開始および終了する時期を決定し、同期細胞を使用してS期の持続時間を推定するための補完的な方法が考案されました(プロトコルステップ1.2)。この目的のために、G1で細胞を同期させたα因子を用いて、細胞をSC培地に放出し、5分毎に回収した。S期の持続時間は、Sytox Greenフローサイトメータープロファイル上でDNA含量が1Cから2Cに変化した時間に基づいて約25分であり得る(図3A)。ただし、この推定値は、集団のかなりの細胞画分がFACSプロファイルに見られるのに十分なSytox Greenを組み込んだ時期によって異なります。この方法では、初期レプリケーション イベントと遅延レプリケーション イベントは検出できません。S期の開始と終了の時期、およびS期がどのくらい続くかを正確に定義するために、G1放出後5分ごとにEdU(10 μM)でパルス標識した細胞アリコートからS期細胞を選び出しました。予想通り、放出後最初の10分以内に、全ての細胞が左下の領域に存在した(すなわち、G1において、図3B、補足図S2)。放出から15分後、EdU陽性細胞の一部がすでに検出されており(補足図S2および補足図S3の最初の2行をそれぞれ比較し、それぞれEdU処理細胞とEdUフリー細胞)、S期が始まったことを示しています(図3C)。S期を通る進行は、二変量PI-EdUグラフで細胞雲が最初に上向きに移動し、次に右に移動することによって見られました(図3D-F)。最後に、放出から35分で、細胞の一部がEdU陰性であったが、2倍の量のDNAを有し、それらの細胞がS期を完了し、G2 + M期にあったことを示している(図3G)。したがって、S期はこれらの条件で20分間持続する。注目すべきは、Sytox Greenで検出されたDNA含有量のオーバーレイと高い同期が観察され、放出後40分で全集団でS期が終了したことを示唆しているにもかかわらず、二変量解析では、一部の細胞は放出後60分でS期を終了し、放出後65分で集団全体でS期が完了していることが示されました(図3H、I)と補足図S2)。
さらに、S期およびDNA合成は顕微鏡でモニターすることができます。活性化された各複製起点から、DNA合成は2つのつながれたレプリソームによって行われ、核複製の焦点を形成し、続いて複製因子および/またはオペレーターアレイのタグ付きバージョンおよび蛍光タンパク質に融合されたそれらの対応するリプレッサーを画像化することによって顕微鏡検査を行い得る2,13。あるいは、DNA合成は、チミジン類似体14,15を用いた顕微鏡観察によって検出することができる。EdUを使用して、DNA合成を受ける核内DNA領域をモニターしました。この目的のために、非同期WTおよびcdc6-1細胞をEdU(10 μM)で28°Cで3分間パルス標識し、Click反応後にイメージングしました。3分間のEdUパルス中のDNA合成速度と細胞周期の細胞進行に応じて、EdUシグナル強度の変動を検出することを期待していました(つまり、S期に3分間全体を費やす細胞は、パルス中にS期に出入りする細胞よりも強いシグナルを示します)。したがって、WT S期細胞は、強度が変化するEdUシグナルを核内に示しました(図4A)。S相の持続時間は、この分析から容易に推定できます。実際、2つの生物学的複製(少なくとも150個の細胞が数えられた)から、WTおよびcdc6-1細胞の34%±3%および38%±3%がそれぞれEdU陽性であることが決定された。これらの増殖条件と同様に、WT細胞およびcdc6-1細胞について倍加時間はそれぞれ90分および123分であり(表2)、S期がそれぞれ31分および47分持続したと外挿した。前者の結果は、FACS分析(表3)から得られた結果と一致しており、顕微鏡によるEdU陽性細胞の検出により、S期の持続時間を決定できることを示しています。注目すべきことに、後者は、S母集団とG2 + M母集団の間に明確な区別がなかったため、FACS分析から外挿されたS期期間よりも高くなっています(図2D)。EdU病巣はWT細胞では容易に観察されたが(図4B)、cdc6-1細胞では暗く、少なかった(図4C)。WT細胞とcdc6-1細胞との間のEdUシグナル強度差がS期の段階に依存する可能性を排除するために、強度を同期細胞から定量化した。予想通り、平均EdUシグナル強度はcdc6-1細胞で3倍低く(図4D)、より少ない複製起点から開始されたDNA複製と一致しました。EdUシグナルは核に限定され、強力なDAPIシグナルと共局在し、核領域または複製工場でのDNA複製の組織化と一致する球状パターンで編成されました。重要なことに、EdUは出芽していない細胞または小さな芽のある細胞でのみ検出され、大きな芽のある細胞には存在せず、WT酵母細胞が有糸分裂に入るまでに複製を完了していたことを示しています。したがって、この方法は、高い空間分解能でDNA複製を視覚化し、軽度のDNA複製欠陥を検出および定量するのに敏感です。
図1:代表的なFACS分析。 (A)25°Cで増殖したWT細胞の代表的なSytox Green FACS分析。 (B,C)25°Cで増殖し、EdU(10 μM)または1 μLのDMSOで5分間パルス標識したWT細胞の代表的なEdU-PI二変量FACS分析。ポリゴンは両方の解析で同じでした。Cは、EdU陽性細胞からEdU陰性を線引きするために使用した(一般に、限界は強度>1×10 4-2×104)に設定される)。一番上のポリゴンゲートは、EdU陽性細胞(S期分画)を描いた。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:非同期細胞集団におけるG1、S、およびG2 +M細胞周期相における細胞の画分 。 (A)WTおよび cdc6-1 株をリッチ培地上で段階的な5倍希釈でスポットし、25°C、28°C、または34°Cのいずれかで増殖させた。 (B)人口倍増時間。非同期WTおよび cdc6-1 細胞を25°Cまたは28°Cで増殖させ、細胞濃度を7時間毎に測定した。 (C、D)28°Cで増殖し、EdU(10μM)で5分間パルス標識したWTおよび cdc6-1細胞のEdU-PI 二変量FACS分析。母集団倍増時間にS期分数を掛けると、S期期間が得られます。EdU陽性およびEdU陰性セルの平均強度は、対応するポリゴンにおける各値の強度の平均として計算した。WTおよび cdc6-1 EdU陰性細胞(それぞれ5,077および4,454)の平均強度を1に正規化した。WTおよび cdc6-1 EdU陽性細胞(それぞれ52,604および36,141)の平均強度を、各株に用いた正規化係数で割った。得られた値は、それぞれ10.4と8.1でした(つまり、本文に記載されているように、25%の減少)。略語:WT =野生型;EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン;FACS = 蛍光活性化細胞選別;PI =ヨウ化プロピジウム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:同期セルのS期期間の決定。 (A)28°Cでのα因子遊離後のWT細胞のDNA含量の経時変化解析。 示された時間は、EdUパルスの持続時間(5分)を考慮に入れています。(B-I)EdU(10μM)で5分間パルス標識し、G1停止からの放出後の指示された時間に収集された同期WT細胞のEdU-PI二変量FACS分析。略語:WT =野生型;EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン;FACS = 蛍光活性化細胞選別;PI =ヨウ化プロピジウム。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:顕微鏡によるEdUの検出と定量。非同期WT株およびcdc6-1株を28°Cで2時間増殖させた後、EdU(10 μM)で3分間パルス標識し、適切な励起/発光フィルターを使用した広視野顕微鏡で画像化しました。(A)WTについては広視野顕微鏡から、(B,C)WTおよびcdc6-1については個々の細胞をDICで可視化し、DAPIまたはEdUで染色した代表的な画像。(A)と(B,C)のスケールバーはそれぞれ10μmと2μmです。(d)G1停止からの放出から30分後に28°Cで増殖した同期WTおよびcdc6-1細胞に関するEdU強度測定。グラフは、3つの生物学的複製物のプールを表す(各生物学的複製において少なくとも50個の細胞がカウントされた)。平均±SDがグラフに表示されます。WT細胞とcdc6-1細胞の間の対応のない両側t検定は****(p < 0.0001)によって示されます。略語:WT =野生型;EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン;DIC = 微分干渉コントラスト;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;A.U. = 任意の単位。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前 | 遺伝子型 | 図と表 | ||
| 重量 (E3087): | MATa, ADE2-1, TRP1-1, CAN1-100, Leu2-3,112, HIS3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | 図1, 図2A,B,C, 図3, 図4A,B,D, サップ 図1,2,3 表2,3 | ||
| CDC6-1 (E5956): | MATa, ADE2-1, TRP1-1, CAN1-100, Leu2-3,112, HIS3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | 図2A,B,D, 図4 C,D, 補足 図1, 表2,3 | ||
| TK+ (E1000): | MATa, ADE2-1, TRP1-1, CAN1-100, LEU2-3,112, HIS3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) | サップ図4 | ||
| TK+ hENT+ (E2031): | MATa, ADE2-1, TRP1-1, CAN1-100, Leu2-3,112, HIS3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | サップ図4 | ||
| hENT+ (E2031): | マットa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 | サップ図4 | ||
| CDC6-1 TK+ hENT+ (E3968): | MATa, ADE2-1, TRP1-1, CAN1-100, Leu2-3,112, HIS3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | サップ図4 | ||
| W303-1A (E001): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 | サップ図4 | ||
表1:本研究で使用した菌株のリスト。
| 重量 | CDC6-1 | |||
| 25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |
| 倍増時間(分) | 120 | 90 | 118 | 123 |
| ティッカー | ± 13 分 | ± 3 分 | ± 10 分 | ± 6 分 |
表2:25°Cおよび28°Cで増殖したWTおよび cdc6-1 株の平均倍加時間。 倍加時間は、次の式を使用して3つの生物学的反復(各生物学的複製に対して4つの技術的反復)から計算されました:Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci)、ここで、CfとCiはそれぞれ最終および初期細胞濃度に対応し、ΔtはCfとCiを測定したときのtfとtiの間の分単位の差に対応します。 それぞれ。
| 重量 | CDC6-1 | |||||||
| 25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |||||
| パーセント | 期間 (分) |
パーセント | 期間 (分) |
パーセント | 期間 (分) |
パーセント | 期間 (分) |
|
| G1 | 27 | 32 | 18 | 16 | 13 | 16 | 10 | 12 |
| S | 29 | 35 | 32 | 29 | 28 | 34 | 28 | 34 |
| G2+M | 44 | 53 | 50 | 45 | 59 | 71 | 62 | 77 |
| SD G1 | ±5 | ±4 | ±3 | ±2 | ±2 | ±1 | ±1 | ±1 |
| SD S | ±3 | ±6 | ±5 | ±5 | ±5 | ±7 | ±4 | ±4 |
| SD G2+M | ±2 | ±7 | ±4 | ±3 | ±4 | ±4 | ±6 | ±4 |
表3:25°Cおよび28°Cで増殖したWTおよびcdc6-1細胞における細胞の平均画分およびG1、S、およびG2+M相の持続時間。 細胞の画分を、3つの生物学的複製(各生物学的複製について2つの技術的複製)から決定した。28°Cで増殖したWT細胞とcdc6-1細胞との間のG1、S、およびG2+M持続時間の差は統計的に有意であった(対応のない両側t検定、p < 0.1)。
補足図S1:28°Cで増殖したWTおよび cdc6-1 細胞におけるS期初期および後期の細胞の割合。 (A)28°Cで増殖したWT細胞と(B)28°Cで増殖した cdc6-1 細胞のEdU-PI二変量FACS分析では、EdU陽性細胞の割合にそれぞれS1と後期S2という2つの同一のポリゴンを描画し、2つに分割しました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:EdU-PI二変量FACSにより可視化されたG1 停止からの放出後のEdUパルス標識細胞の細胞周期進行。 示されているように、細胞のアリコートを、28°Cでのα因子停止から放出してから80分まで、5分ごとに10 μM EdUで5分間パルス標識しました。略語:EdU = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン;FACS = 蛍光活性化細胞選別;PI =ヨウ化プロピジウム。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:G1からの放出後のDMSO処理細胞の細胞周期進行をEdU-PI二変量FACSにより可視化した。これは補足図2と同じですが、細胞を1 μLのDMSO(ジメチルスルホキシド)で5分間インキュベートしました。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S4:TK hENT1酵母細胞におけるBrdUおよびEdU毒性。 示された遺伝子型の細胞を、BrdUまたはEdUの濃度の増加を含むYPDプレート上で5倍段階希釈でスポットし、30°Cで40時間増殖させた。 略語:DMSO =ジメチルスルホキシド;BrdU = ブロモデオキシウリジン;Edu = 5-エチニル-2'-デオキシウリジン;TK =チミジンキナーゼ;hENT1 = ヒト平衡ヌクレオシドトランスポーター。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
酵母は細胞周期研究の主要なモデル生物ですが、そのS期の特徴付けは、DNA複製のトレーサーとして使用されるBrdUなどの外因性ヌクレオシドを組み込むことができないために長い間妨げられてきました。酵母に単純ヘルペスチミジンキナーゼ(TK)の高発現を装備し、ヒトヌクレオシドトランスポーター(hENT)を添加することで、この問題は大部分が解決されました15,16。EdUは、抗BrdU抗体とは異なり、小さな蛍光アジドおよびクリックケミストリーによる検出が透過処理酵母細胞およびFACS分析に適しているため、BrdUよりも用途が広い17。ここでは、このTK-hENT1株におけるEdUの標識と検出の条件を最適化し、これまで検出されなかった複製欠陥をFACSまたは顕微鏡によってこのプロトコルを使用して定量できることを示しました。
同じメカニズムに干渉する可能性のあるツールを使用して生物学的メカニズムを研究することは、生物学の一般的な問題です。EdUには既知の細胞毒性作用があるため、操作されたTK-hENT1株への慢性曝露で毒性のないEdU濃度を検索し、10μMが適切な用量であることがわかりました。TK-hENT1細胞は25 μM EdUでは増殖しませんが、TK単独またはhENT1単独の細胞は100 μM EdUに容易に耐えます(補足図S4)。酵母細胞はBrdUよりもEdUに対してかなり敏感ですが、増殖はEdU曝露後の第2細胞周期の後にのみ減少することを発見し、細胞増殖に影響を与えるために両方の鎖に組み込む必要があることを示唆しています(データ示されていません)。安全のために、このプロトコル全体で10 μM EdUを使用し、短いパルスのみ(顕微鏡では3分、FACSでは5分)を使用し、この最適化されたプロトコルを使用した良好な検出に適していることがわかりました。
DNA複製の微妙な欠陥は、染色体の再配列に強い影響を与える可能性があります4。したがって、これらの微妙な欠陥を検出できる技術とプロトコルの開発は、染色体異常の病因を明らかにするための鍵となります。ここでは、この最適化されたEdUの取り込みと検出のプロトコルが、シグナル強度の最大3倍の減少を測定できることを示し(図2および図4)、28°Cで増殖した温度感受性cdc6-1細胞ではDNA合成速度が低下し、プレート生存率アッセイに欠陥がないことを示しています(図2A).したがって、EdUの取り込みと定量のこのプロトコルは、複製欠陥が最初に疑われない他の変異体をスクリーニングするために使用できます。さらに、有糸分裂DNA合成(MiDAS)、減数分裂組換え依存性DNA合成、または他の長路DNA合成を検出することが有用な場合があります。
欠点の1つは、EdU検出は固定細胞でのみ実行できるため、イメージングに使用されるレーザービームの高い光毒性に悩まされるPCNA-GFPやその他のDNA複製の蛍光読み出しのようにライブ分析ができないことです。YPD残骸はクリック反応を有意に消滅させるように見えるため、合成培地中で細胞を増殖させることは最良の検出に不可欠です。興味深いことに、同期集団の二変量EdU-PI FACS分析を使用してS期細胞を選び出すことで、単一細胞におけるS期の持続時間を20分まで推定することができます(図3、補足図S2、および補足図S3)。しかし、α因子放出後の同期が古典的なSytox Green FACS解析(図3A)のようにほぼ完璧に見える場合でも、二変量EdU-PI FACS解析から、細胞が比較的非同期でS期に入ることが明らかになります(図3B-I)。
ここでは、フローサイトメトリーと顕微鏡を使用して、同期細胞と非同期細胞を単一細胞レベルと集団レベルの両方でS期期間を決定する3つの方法について説明します。集団レベルで非同期WT細胞で決定された平均S期持続時間は、フローサイトメトリーと顕微鏡を使用してそれぞれ29分と31分で類似していますが、同期シングルセルベースのアプローチでは、持続時間が20分と短くなることを示しています(図2、図3、図4、および表3 ).これらの値の不一致は驚くべきことですが、簡単に説明できます。実際、私たちの単一細胞ベースのアプローチでは、S期の持続時間は最も初期のイベント(すなわち、S期に出入りする最初の細胞、図3C、G)に基づいて決定されましたが、S期が集団内のすべての細胞で20分続くことを意味するものではありません。これらのデータは、細胞間のS期持続時間に一定レベルの不均一性があるという予想外の概念を支持するであろう。
改善されたプロトコルや新しい技術は、長年の教義や斬新なアイデアを覆すことができます。これらのデータが挑戦することは3つあります。第一に、DNA合成はS. cerevisiaeの芽の出現と同時に起こると考えられている。図4A-Cは、3分の標識遅れにもかかわらず、EdU染色が未出芽細胞および小出芽細胞において最も強いことを示し、前述のようにS期が明らかに出芽前に開始することを示している16。第二に、酵母細胞はG2期を持たず、DNA合成と同時に有糸分裂紡錘体が形成されることが報告されています。非常に短いパルスとFACS(図3、補足図S2、補足図S3)または顕微鏡(図4)による高感度EdU検出を組み合わせることで、単一細胞でS期がいつ開始および終了するかを正確に決定できます。そうすることで、バルクDNA合成はα因子放出の40分後に終了することがわかりましたが(図3、補足図S2、補足図S3)、短い有糸分裂紡錘体は20分後にのみ形成されます16(データ示さず)。酵母細胞はG2期を有すると結論付ける。第三に、酵母細胞の最大30%が後期-終期18でDNA合成を完了することが最近提案されました。この最適化されたプロトコルを使用して、後期/終期紡錘体を示す細胞へのEdU取り込みを検出しませんでした(データは示されていません)が、このDNA合成の第2波が使用された検出閾値を下回っていることを除外することはできません。信号/雑音比が強いため、後者の選択肢はありそうもないと考えています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、競合する経済的利益はないと宣言しています。
Acknowledgments
著者らは、J.d.D.B.T.およびAgence Nationale pour la Recherche sur le Cancer(ARC)が博士課程のフェローシップをJ.d.D.B.T.およびAgence Nationale pour la Recherche(ANR)に財政支援(助成金ANR-18-CE12-0018-01)として認める。サイトメトリーと顕微鏡検査は、モンペリエMRIバイオキャンパスイメージング施設で実施されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100--812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
References
- Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
- Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
- Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
- Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
- Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
- Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
- McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
- Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
- Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
- Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
- Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
- Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
- Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
- Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
- Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).
