Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Определение длительности S-фазы с использованием включения 5-этинил-2'-дезоксиуридина в Saccharomyces cerevisiae

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64490
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Summary

Мы описываем два дополнительных протокола для точного определения длительности S-фазы в S. cerevisiae с использованием EdU, аналога тимидина, который включен in vivo и обнаружен с помощью химии Click с помощью микроскопии и проточной цитометрии. Это позволяет легко характеризовать продолжительность репликации ДНК и упущенные дефекты репликации у мутантов.

Abstract

Репликация эукариотической ДНК является строго регулируемым процессом, который гарантирует, что генетический чертеж клетки правильно дублируется до сегрегации хромосом. Поскольку дефекты синтеза ДНК лежат в основе хромосомных перестроек, мониторинг репликации ДНК стал необходимым для понимания основы нестабильности генома. Saccharomyces cerevisiae является классической моделью для изучения регуляции клеточного цикла, но ключевые параметры репликации ДНК, такие как доля клеток в S-фазе или длительность S-фазы, все еще трудно определить. Этот протокол использует короткие и нетоксичные импульсы 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU), аналога тимидина, в инженерных дрожжевых клетках TK-hENT1 с последующим его обнаружением реакцией Клика, чтобы обеспечить визуализацию и количественную оценку репликации ДНК с высоким пространственным и временным разрешением как на одноклеточном, так и на популяционном уровнях с помощью микроскопии и проточной цитометрии. Этот метод может идентифицировать ранее упущенные дефекты в S-фазе и прогрессии клеточного цикла дрожжевых мутантов, тем самым позволяя характеризовать новых игроков, необходимых для обеспечения стабильности генома.

Introduction

Стабильность генома посредством митотического деления обеспечивается передачей полного и равного набора хромосом двум продуцируемым клеточным потомкам. Это зависит от точного завершения серии событий, происходящих в данное время в каждой фазе клеточного цикла. В G1 источники репликации лицензируются после набора нескольких лицензионных факторов, включая Cdc61. В S-фазе дупликация всего генома инициируется из нескольких активных источников репликации и выполняется механизмами репликации, которые собираются в микроскопически видимые очаги, называемые фабриками репликации2. В М-фазе дублированные сестринские хроматиды прикрепляются и биоориентируются на митотическом веретене, чтобы обеспечить их сегрегацию к противоположным полюсам митотической клетки3. Регуляция, правильное завершение и продолжительность каждой фазы являются ключом к обеспечению стабильности генома. Действительно, преждевременный выход из любой из этих фаз приводит к нестабильности генома. Например, более короткийG1, индуцированный делецией бутонирующего ингибитора CDK ДРОЖЖЕЙ Sic1 или сверхэкспрессией циклиновG1, изменит последующую S-фазу 4,5,6. Следовательно, эти дерегуляции, связанные или не связанные со стрессом репликации, приводят к разрывам хромосом, перестройкам и неправильной сегрегации 4,5,6. Поэтому мониторинг продолжительности S-фазы и, в более широком смысле, продолжительности других фаз клеточного цикла может иметь решающее значение для выявления дефектов, возникающих у разных мутантов и в разных стрессовых условиях.

Традиционный метод измерения длительности фазы клеточного цикла включает простую цитометрию потока содержания ДНК (рисунок 1A) и опирается на алгоритм подгонки (доступный в большинстве программ для цитометрии), используемый для разделения популяции на фазовые фракции G1, S и G2 + M от пиков 1C и 2C. Затем дроби умножаются на время удвоения популяции7. Однако этот метод дает только оценочные значения, требует однородного распределения размеров клеток в пределах заданной фракции и не применим к синхронизированным культурам. Для изучения длительности S-фазы в клетках млекопитающих было разработано и широко использовано несколько аналогов тимидина, включая EdU. Их поглощение из внеклеточной среды и фосфорилирование тимидинкиназой (далее именуемой ТЗ) делают их доступными для ДНК-полимераз для включения их в места синтеза ДНК (репликация, рекомбинация, репарация). Чтобы обойти отсутствие гена TK в клетках Saccharomyces cerevisiae , штаммы дрожжей были спроектированы таким образом, чтобы обеспечить стабильную и конститутивную экспрессию вируса простого герпеса TK8 и уравновешивающего транспортера нуклеозидов человека (hENT1)9. После включения в ДНК EdU обнаруживается с помощью селективной реакции Click, которая химически связывает его алкиновый фрагмент с азид-модифицированными фторхромами10.

В этой статье представлены два оптимизированных комплексных протокола для импульсной маркировки асинхронных и синхронных клеток, спроектированных TK-hENT1 с EdU, чтобы точно визуализировать и измерить продолжительность и динамику репликации ДНК, а также продолжительность других фаз клеточного цикла с высоким пространственным и временным разрешением как на одноклеточном, так и на популяционном уровнях с помощью микроскопии и проточной цитометрии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Клеточная культура S. cerevisiae

ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые штаммы дрожжей перечислены в таблице 1

ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность S-фазы можно контролировать различными способами. В зависимости от вопроса, который необходимо решить, клетки могут быть выращены асинхронно или синхронно после остановкиG1 .

  1. Из асинхронно растущих клеток S. cerevisiae
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод позволяет определить процент клеток в S-фазе в асинхронно растущей клеточной популяции. Определяя время удвоения, продолжительность S-фазы (и других фаз) может быть экстраполирована.
    1. Инокулируют клетки S. cerevisiae в 10 мл синтетической полной (SC) среды при низкой концентрации клеток (5 × 104 клеток/мл) для ночной культуры при 30 °C с орбитальным перемешиванием при 130 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация измеряется с помощью счетчика клеток. Чтобы эффективно рассчитать время удвоения, рекомендуется привить культуру из ночной культуры, которая все еще находится в экспоненциальной фазе (т. Е. В идеале ниже 2 × 107 клеток / мл). Выращивание клеток в богатой среде (YPD) не рекомендуется, так как обнаружение EdU неэффективно.
    2. На следующий день разводят клетки в 20 мл свежей среды SC в конечной концентрации 5 × 105 клеток/мл.
    3. Культивируйте клетки при 30 °C на встряхивающей водяной бане с горизонтальным встряхиванием при 120 об/мин.
    4. Измеряйте концентрацию клеток каждый час, пока она не достигнет 1 × 107 клеток / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет сделать графическое представление увеличения концентрации клеток с течением времени. Формула, используемая для расчета времени удвоения, объясняется в легенде таблицы 2.
    5. Параллельно с этапом 2 для маркировки EdU, когда концентрация в клетке составляет около 2 × 106-5 × 106 клеток/мл.
  2. Из G1-синхронизированных клеток S. cerevisiae
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод позволяет определить, когда начинается и заканчивается S-фаза, с помощью проточной цитометрии и/или микроскопического анализа.
    1. Инокулируют клетки S. cerevisiae в 10 мл среды SC при низкой концентрации клеток (5 × 104 клеток/мл) для ночной культуры при 30 °C с орбитальным перемешиванием при 130 об/мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. примечания после шага 1.1.1.
    2. На следующий день разводят клетки в 20 мл свежей среды SC в конечной концентрации 2 × 106-3 × 106 клеток/мл.
    3. Добавьте 40 мкл 1 мг/мл α-фактора, разбавленного в воде.
    4. Культивируйте клетки при 30 °C с орбитальным перемешиванием при 130 об/мин в течение 1 ч.
    5. Добавьте еще раз 40 мкл 1 мг/мл α-фактора, разбавленного в воде.
    6. Культивируйте клетки при 30 °C с орбитальным перемешиванием при 130 об/мин в течение 1 ч.
    7. Визуализируйте клетки под световым микроскопом для мониторинга остановки G1 . Продолжайте, если более 90% ячеек отображают shmoo, а остальные представляют собой округлые, неочищенные ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемого фона, рекомендуется обрабатывать клетки ультразвуком перед визуализацией shmoo. Для фона W303 снаряжайте ультразвуком 2x, в течение 2 с каждый раз, с амплитудой 40-50.
    8. Центрифуга в течение 3 мин при 1 500 × г. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    9. Повторное суспендирование клеток в 20 мл среды SC.
    10. Повторите шаги 1.2.8-1.2.9 один раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Α-фактор смывается этими шагами, и клетки высвобождаются в клеточном цикле. Альтернативно, α-фактор может быть смыт путем фильтрации дрожжевых клеток с помощью нитроцеллюлозного фильтра 1,2 мкм с использованием воронки, установленной на колбе с боковым рычагом, соединенной с вакуумным насосом.
    11. Соберите 1 мл клеток 2 раза каждые 5 минут и перейдите к шагу 2 для маркировки EdU.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Импульсная метка клеток только из одной из двух трубок с EdU. Неимпульсно-меченые клетки используются для различения EdU-положительных и EdU-отрицательных клеток на бивариатном графике пропидидия йодида (PI)-EdU.
    12. Добавьте 400 мкл 1 мг/мл α-фактора, разбавленного в воде через 30 мин после высвобождения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта высокая доза α-фактора необходима для остановки клеток в фазе G1 следующего клеточного цикла и предотвращения повторного входа клеток в последующую S-фазу.

2. Маркировка EdU

  1. Переложите 1 мл клеточной культуры в микрофьюжную трубку объемом 2,0 мл, содержащую 1 мкл 10 мМ EdU. Хорошо перемешать путем инверсии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы отличить EdU-положительные клетки от EdU-отрицательных клеток на PI-EdU бивариатном FACS, переведите еще 1 мл клеточной культуры в микрофьюжную трубку объемом 2,0 мл, содержащую 1 мкл DMSO.
  2. Инкубировать в течение 3-5 мин при 30 °С при перемешивании на встряхивающей водяной бане.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трех минут достаточно для обнаружения EdU с помощью микроскопа; Для оптимального обнаружения EdU на проточном цитометре требуется 5 мин.
  3. Прекращают реакцию добавлением 100 мкл 100% этанола.
    1. Прекращают реакцию добавлением 100 мкл 20% параформальдегида, если требуется измерение размера клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ядерная архитектура митотических клеток должна быть сохранена нетронутой для дальнейшего анализа после реакции Клика, мы рекомендуем фиксировать клетки с 2% параформальдегидом при комнатной температуре (RT), а не помещать клетки на лед, поскольку последний вызывает деполимеризацию микротрубочек.
    2. Оставьте ячейки на 20 мин при РТ при мягком перемешивании на коромысле с переменной скоростью при 20 наклонах/мин, чтобы зафиксировать ячейки перед добавлением 100 мкл 100% этанола.

3. Фиксация и пермеабилизация клеток

  1. Гранулируют клетки в течение 2 мин по 10 000 × г в микрофуге. Удалите супернатант с помощью вакуумной пипетки.
  2. Повторно суспендировать ячейку гранулы в 500 мкл 70% этанола. Хорошо перемешать путем вихря.
  3. Оставьте на ≥1 ч при RT со скоростью 20 наклонов/мин на коромысле с переменной скоростью, чтобы пропитать ячейки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, выращенные в среде SC, плохо гранулируются, поскольку они, как правило, прилипают к стенкам микрофуге. Добавление этанола улучшает гранулирование и уменьшает потерю клеток. Клетки могут храниться при 4 °C в течение ночи или в течение более длительных периодов при −20 °C.
  4. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
  5. Промыть клетки 2x с 500 мкл 10% этанола в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки имеют решающее значение для удаления неинкорпорированного EdU из клеток.

4. Реакция клик-ит

  1. Для цитометрического анализа
    1. Гранулируют клетки в течение 2 мин по 10 000 × г в микрофуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    2. Повторно суспендируют гранулы в 200 мкл ПБС, содержащих 0,1 мг/мл РНКазы А и 0,2 мг/мл протеиназы К.
    3. Инкубировать в течение 1-2 ч при 50 °C с периодическим встряхиванием (или на ночь при 37 °C).
    4. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    5. Промыть клетки 500 мкл PBS.
    6. Гранулируют клетки в течение 2 мин по 10 000 × г в микрофуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    7. Повторное суспендирование клеточной гранулы в 200 мкл PBS + 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Инкубировать в течение 30 мин на РТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время не требуется и даже наносит ущерб эффективности реакций Клика.
    8. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    9. Повторно суспендировать гранулы в 300 мкл PBS + 1% BSA.
    10. Распределите ячейки между двумя трубками: 200 мкл в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл для реакции Клика и 100 мкл в другой микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл для окрашивания Sytox Green.
    11. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    12. Для окрашивания Sytox Green
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы настоятельно рекомендуем использовать аликвоту для окрашивания Sytox Green (без Click), чтобы получить высококачественные справочные профили содержания ДНК. Действительно, реакция Клика сильно гасит интеркалантную флуоресценцию, включая флуоресценцию Sytox Green и PI. Следовательно, реакция Клика может исказить чтение содержимого ДНК.
      1. Повторное суспендирование клеточной гранулы в 100 мкл PBS.
      2. Переложить 10-30 мкл (в зависимости от концентрации в клетке) в проточную цитометрическую трубку, содержащую 300 мкл 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5 и 0,5 мкМ Sytox Green.
      3. Ультразвук 2x, в течение 2 с каждый раз, с амплитудой 40-50.
      4. Оставить в темноте до обработки образцов на проточном цитометре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут храниться на этой стадии при 4 °C в течение нескольких дней.
    13. Для реакции клика
      1. Готовят свежий буфер азидного красителя путем смешивания реагентов в следующем порядке (количество для одной пробирки): 36 мкл PBS, 2 мкл 0,2 M CuSO4, 0,2 мкл 2 мМ Cy5 Azide и 2 мкл 1 M аскорбиновой кислоты.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Можно приготовить мастер-микс буфера Азидного красителя. Реагенты должны быть смешаны в том же порядке, что и упомянутый выше.
      2. Повторно суспендируйте ячейку гранулы 40 мкл свежеприготовленной смеси Azide Dye. Инкубировать в RT в темноте в течение 60 мин.
      3. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
      4. Промыть ячейки 3x с 300 мкл 10% этанола в PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки имеют решающее значение для устранения всего растворимого азида EdU-Cy5.
      5. Повторное суспендирование клеток в 100 мкл 50 мкг/мл PI в PBS. Оставить на 10 мин в темноте.
      6. Переложить 10-30 мкл клеточной суспензии (в зависимости от концентрации в клетке) в проточную трубку цитометра, содержащую 300 мкл 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5.
      7. Ультразвук 2x, в течение 2 с каждый раз, с амплитудой 40-50.
      8. Оставить в темноте до обработки образцов на цитометре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут храниться на этой стадии при 4 °C в течение нескольких дней.
    14. Считывайте образцы Sytox Green с помощью синего лазера возбуждения при 488 нм и фильтра BP 530/30. Типичные результаты см. на рисунке 1A . Считывание двухмерных образцов PI-EdU на точечном графике с помощью синего лазера возбуждения при 488 нм и фильтра 615/20 BP для PI (ось x) и красного лазера возбуждения при 640 нм и фильтра 660/20 BP (ось Y). Типичные результаты см. на рисунке 1B .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 1C представляет типичный двухмерный результат PI-EdU FACS для EdU-отрицательных клеток. Он позволяет различать EdU-отрицательные клетки от EdU-положительных клеток.
  2. Для микроскопического анализа
    1. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    2. Повторно суспендировать гранулы в 200 мкл PBS + 1% BSA. Инкубировать в течение 30 мин на РТ.
    3. Гранулируют клетки в течение 2 мин по 10 000 × г в микрофуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    4. Готовят свежий буфер азидного красителя путем смешивания реагентов в следующем порядке (количество для одной пробирки): 36 мкл PBS, 2 мкл 0,2 М CuSO4, 0,2 мкл 2 мМ Ди-530 азида, 2 мкл 1 М аскорбиновой кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мастер-смесь буфера азидных красителей может быть приготовлена в свежем виде путем смешивания реагентов в указанном порядке.
    5. Повторно суспендируйте гранулы 40 мкл свежеприготовленного буфера азидного красителя. Инкубировать в RT в темноте в течение 60 мин.
    6. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микрофуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    7. Промыть клетки в 2 раза 300 мкл 10% этанола в PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывки имеют решающее значение для устранения всех растворимых азидов Dy-530.
    8. Гранулируйте клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    9. Повторное суспендирование клеток в 100 мкл 0,5 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в PBS. Оставить на 30 мин в темноте при комнатной температуре.
    10. Гранулируют клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микроцентрифуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    11. Промыть 300 мкл PBS, чтобы удалить избыток DAPI.
    12. Гранулируют клетки в течение 2 мин при 10 000 × г в микрофуге. Выбросьте супернатант вакуумной пипеткой.
    13. Повторно суспендировать гранулу с 10-50 мкл PBS в зависимости от концентрации в клетке.
    14. Ультразвук 2x, в течение 2 с каждый раз, с амплитудой 40-50.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут храниться на этой стадии при 4 °C в течение нескольких дней.
    15. Пипетка 1,7 мкл клеток на стеклянный микроскоп скользит и покрывается чистым чехлом.
    16. Сразу же наблюдать под флуоресцентным микроскопом с помощью фильтров DAPI и TexasRed или Cy3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для определения длительности S-фазы и, в более широком смысле, длительностиG1 иG2 +M (этап протокола 1.1) клетки S. cerevisiae W303 дикого типа (WT, таблица 1) выращивали асинхронно в среде SC в течение 7 ч. Каждый час концентрацию клеток контролировали для определения времени удвоения (рисунок 2B). В этих условиях роста расчетное время удвоения составляло 120 мин ± 13 мин при 25 °C (таблица 2). Когда клетки находились в экспоненциальной фазе (2 × 106-5 × 106 клеток/мл), аликвоту клеток пульсировали EdU (10 мкМ) в течение 5 мин, чтобы выделить клетки в S-фазе и определить процент клеток, которые находились в фазах G1, S иG2 + M. Три популяции клеток наблюдались при двумерном анализе цитометра EdU-PI (рисунок 1B). Различение между EdU-отрицательной и EdU-положительной популяциями было сделано с использованием контрольного эксперимента, в котором клетки не были помечены пульсом EdU, но была проведена реакция Клика (рисунок 1C). Две EdU-отрицательные популяции в нижней левой и нижней правой областях, которые отличались по интенсивности PI в два раза, соответствовали G1 и G2 + M соответственно (рисунок 1B, C). Поэтому верхняя популяция (с интенсивностью >1× 104-2 × 104) соответствовала EdU-положительным клеткам, находившимся в S-фазе в момент пульса (рис. 1В). Следовательно, 27% ± 5% клеточной популяции находились в фазеG1 , 29% ± 3% - в S-фазе, а 44% ± 2% - вG2 + M. Поскольку время удвоения составляло 120 мин ± 13 мин в этих условиях, мы экстраполировали, что фазы G1, S и G2 + M длились 32 мин ± 4 мин, 35 мин ± 6 мин и 53 мин ± 7 мин соответственно при 25 °C (таблица 2 и таблица 3).

Затем мы стремились проверить этот метод и показать, что он достаточно чувствителен, чтобы идентифицировать мутантов с дефектами репликации ДНК, которые до сих пор не были упущены. Мы пришли к выводу, что настраиваемые аллели потери функции факторов, участвующих в репликации ДНК, были бы идеальными средствами контроля проверки. Следовательно, мы использовали штамм дрожжей, содержащий чувствительный к температуре мутант cdc6-1 (таблица 1)11. Cdc6 является важным лицензионным фактором, который выражается в поздних M и G1 для сборки комплексов предварительной репликации (preRC) на ORC-связанных участках хромосом, которые впоследствии могут быть использованы в качестве источников репликации. Поэтому при разрешительной температуре его длительность S-фазы должна быть такой же, как у WT, в то время как при ограничительной температуре репликация ДНК не должна происходить, поскольку происхождение не лицензируется12. Тем не менее, при полуразрешительной температуре, когда лицензируется меньше источников, но их достаточно, чтобы придать жизнеспособность клетки (наши неопубликованные данные; Barba Tena et al., в процессе подготовки), мы предвидели разные продолжительности для каждой фазы. Как и ожидалось, основываясь на тестах на падение, клетки cdc6-1 росли так же, как и клетки WT при разрешительной температуре (т.е. 25 ° C, рисунок 2A), показывая то же время удвоения (рисунок 2B и таблица 2), но были мертвы при или выше 34 ° C (рисунок 2A). Интересно, что при полуразрешительной температуре (т.е. 28 °C) cdc6-1 был жизнеспособным (28 °C, рисунок 2A). Однако время удвоения было больше, чем для WT (рисунок 2B и таблица 2), и продолжительность каждого этапа была различной. Действительно, в cdc6-1 G1 был немного короче (12 мин ± 1 мин против 16 мин ± 2 мин), в то время как фаза S была немного расширена (34 мин ± 4 мин против 29 мин ± 5 мин), а фаза G2 + M была значительно длиннее (77 мин ± 4 мин против 45 мин ± 3 мин) по сравнению с WT (рисунок 2C, D и таблица 3). S-фаза была, на удивление, не очень сильно расширена, но средняя интенсивность сигнала EdU была уменьшена на 25% (рисунок 2C, D), что согласуется с фазой S, инициированной из меньшего количества источников. Более того, в то время как эду-положительные WT-клетки были гомогенно распределены между ранней (S1) и поздней S (S2) фазами (рисунок 2C, дополнительный рисунок S1A, ранняя [S1] и поздняя фазы S [S2], разграниченные вертикальной пунктирной линией в верхнем затворе), 65% EdU-положительных клеток cdc6-1 накапливались в поздней S-фазе (рисунок 2D, дополнительный рисунок S1B). Не было даже четкого различия между популяциями S и G2 + M (рисунок 2D), предполагая, что клетки изо всех сил пытались завершить S-фазу до входа в фазу G2 . Таким образом, этот метод подходит и чувствителен для идентификации мутантов с дефектами в S-фазе (продолжительность и/или распределение) и в продолжительности фазы клеточного цикла.

Был разработан комплементарный метод для определения того, когда клетки начинают и заканчивают репликацию ДНК, и оценки длительности S-фазы с использованием синхронизированных клеток (этап протокола 1.2). С этой целью, используя α-фактор с синхронизированными клетками вG1, клетки высвобождали в среде SC и собирали каждые 5 мин. Продолжительность S-фазы может составлять около 25 мин в зависимости от времени, когда содержание ДНК изменилось от 1С до 2С на профиле проточного цитометра Sytox Green (фиг.3А). Однако эта оценка зависит от того, когда значительная клеточная часть популяции включила достаточное количество Sytox Green, чтобы ее можно было увидеть в профиле FACS. События ранней и поздней репликации не могут быть обнаружены с помощью этого метода. Чтобы точно определить, когда начинается и заканчивается S-фаза и как долго она длится, клетки S-фазы выделяли из аликвоты клеток при импульсной маркировке EdU (10 мкМ) в течение 5 мин каждые 5 мин после высвобожденияG1. Как и ожидалось, в течение первых 10 мин после высвобождения все клетки находились в нижней левой области (т.е. вG1, Фиг.3В, Дополнительный рисунок S2). Через пятнадцать минут после высвобождения уже была обнаружена часть EdU-положительных клеток (сравните первые две строки на дополнительном рисунке S2 и дополнительном рисунке S3, обработанных EdU и EdU-свободных клеток соответственно), что указывает на то, что S-фаза началась (рисунок 3C). Прогрессия через S-фазу была замечена клеточным облаком, движущимся сначала вверх, а затем вправо на двухмерном графике PI-EdU (рисунок 3D-F). Наконец, через 35 мин после высвобождения часть клеток была EdU-отрицательной, но с удвоенным количеством ДНК, что указывает на то, что эти клетки завершили S-фазу и находились в фазе G2 + M (рисунок 3G). Таким образом, S-фаза длится в этих условиях 20 мин. Следует отметить, что, несмотря на высокую синхронность, наблюдаемую с наложением содержимого ДНК, обнаруженного с помощью Sytox Green, предполагая, что S-фаза закончилась во всей популяции через 40 мин после высвобождения, двумерные анализы показали, что некоторые клетки закончили S-фазу через 60 мин после высвобождения и что S-фаза была завершена для всей популяции через 65 мин после высвобождения (рисунок 3H, I и дополнительный рисунок S2).

Кроме того, синтез S-фазы и ДНК может контролироваться с помощью микроскопии. Из каждого активированного источника репликации синтез ДНК осуществляется двумя привязанными репликами, образуя ядерный фокус репликации, за которым может следовать микроскопия путем визуализации помеченной версии фактора репликации и/или массива операторов и их соответствующего репрессора, сплавленного с флуоресцентным белком 2,13. Альтернативно, синтез ДНК может быть обнаружен с помощью микроскопии с использованием аналогов тимидина 14,15. Мы использовали EdU для мониторинга субядерных областей ДНК, которые подвергаются синтезу ДНК. С этой целью мы пометили импульсно-асинхронные клетки WT и cdc6-1 с EdU (10 мкМ) в течение 3 мин при 28 °C и визуализировали их после реакции Click. Мы ожидали обнаружить изменения интенсивности сигнала EdU в зависимости от скорости синтеза ДНК и от прогрессирования клеток в клеточном цикле во время 3-минутного импульса EdU (то есть клетки, проводящие все 3 мин в S-фазе, будут отображать более сильный сигнал, чем те, которые входят или выходят из S-фазы во время импульса). Соответственно, клетки WT S-фазы отображали сигнал EdU в своем ядре, который различался по интенсивности (рисунок 4A). Длительность S-фазы может быть легко экстраполирована из этого анализа. Действительно, было определено из двух биологических реплик (было подсчитано не менее 150 клеток), что 34% ± 3% и 38% ± 3% клеток WT и cdc6-1 были EdU-положительными соответственно. Поскольку в этих условиях роста время удвоения составляло 90 мин и 123 мин для клеток WT и cdc6-1 соответственно (таблица 2), мы экстраполировали, что S-фаза длилась 31 мин и 47 мин соответственно. Первый результат соответствует результату, полученному из наших анализов FACS (таблица 3), что указывает на то, что обнаружение EdU-положительных клеток с помощью микроскопии позволяет определить продолжительность S-фазы. Следует отметить, что последняя выше, чем длительность S-фазы, экстраполированная из наших анализов FACS, поскольку не было четкого различия между популяциями S и G2 + M (рисунок 2D). Очаги EdU легко наблюдались в клетках WT (рисунок 4B), но были тусклее и меньше в клетках cdc6-1 (рисунок 4C). Чтобы исключить возможность того, что разница интенсивности сигнала EdU между клетками WT и cdc6-1 зависела от стадии S-фазы, интенсивность была количественно определена из синхронизированных клеток. Как и ожидалось, средняя интенсивность сигнала EdU была в три раза ниже в клетках cdc6-1 (рисунок 4D), что согласуется с репликацией ДНК, инициированной из меньшего количества источников репликации. Сигнал EdU был ограничен ядром, колокализуясь сильным сигналом DAPI, и организован в шаровые паттерны, что согласуется с организацией репликации ДНК в ядерных областях или фабриках репликации. Важно отметить, что EdU был обнаружен только в ненаклеенных или мелковидных клетках и никогда не присутствовал в клетках с большими почками, что указывает на то, что дрожжевые клетки WT закончили репликацию к тому времени, когда они вошли в митоз. Поэтому этот метод чувствителен для визуализации репликации ДНК с высоким пространственным разрешением, а также для обнаружения и количественной оценки легких дефектов репликации ДНК.

Figure 1
Рисунок 1: Репрезентативные анализы FACS. (A) Репрезентативные анализы Sytox Green FACS для клеток WT, выращенных при 25 °C. (B,C) Репрезентативные анализы EdU-PI для клеток FACS, выращенных при 25 °C и меченых импульсами в течение 5 мин с EdU (10 мкМ) или 1 мкл DMSO. Полигоны были одинаковыми в обоих анализах. C использовали для очерчивания EdU-отрицательных от EdU-положительных клеток (как правило, предел установлен при интенсивности >1× 104-2 × 104). Верхний многоугольный затвор очертил Эду-положительные ячейки (фракция S-фазы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Фракция клеток в фазах клеточного цикла G1, S и G2 + M в асинхронных клеточных популяциях. (A) Штаммы WT и cdc6-1 были обнаружены при последовательных пятикратных разведениях на богатой среде и выращены либо при 25 °C, 28 °C или 34 °C. (B) Время удвоения популяции. Асинхронные клетки WT и cdc6-1 выращивали при 25 °C или 28 °C, а концентрацию клеток измеряли каждый час в течение 7 ч. (C,D) EdU-PI бивариатный FACS-анализ клеток WT и cdc6-1, выращенных при 28 °C и меченых импульсом в течение 5 мин с EdU (10 мкМ). Умножение времени удвоения популяции на фракцию S-фазы обеспечивает длительность S-фазы. Средние интенсивности ЭдУ-положительных и ЭдУ-отрицательных клеток вычислялись как среднее значение интенсивности каждого значения в соответствующем многоугольнике. Средние интенсивности WT и cdc6-1 EdU-отрицательных клеток (5,077 и 4,454 соответственно) были нормализованы до 1. Средние интенсивности WT и cdc6-1 EdU-положительных клеток (52 604 и 36 141 соответственно) были разделены на коэффициент нормализации, используемый для каждого штамма. Полученные значения составили 10,4 и 8,1 соответственно (т.е. снижение на 25%, как указано в тексте). Сокращения: WT = дикий тип; EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток; PI = йодид пропидия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Определение длительности S-фазы на синхронизированных клетках. (A) Анализ времени содержания ДНК в клетках WT после высвобождения α-фактора при 28 °C. Указанное время учитывает длительность импульса EdU (5 мин). (Б-И) Двухмерные анализы EdU-PI FACS для синхронизированных WT-клеток, меченые пульсом в течение 5 мин с EdU (10 мкМ) и собранные в указанное время после освобождения от арестаG1. Сокращения: WT = дикий тип; EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток; PI = йодид пропидия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Обнаружение и количественная оценка EdU с помощью микроскопии. Асинхронные штаммы WT и cdc6-1 выращивали в течение 2 ч при 28 °C, а затем мечили импульсом в течение 3 мин с помощью EdU (10 мкМ) и визуализировали широкоугольной микроскопией с использованием адекватных фильтров возбуждения/эмиссии. (A) Репрезентативные изображения из широкоугольной микроскопии для WT и (B,C) отдельных клеток для WT и cdc6-1, визуализированные СВС и окрашенные DAPI или для EdU, как указано. Шкалы в (A) и (B,C) составляют 10 мкм и 2 мкм соответственно. (D) Измерения интенсивности EdU на синхронных клетках WT и cdc6-1, выращенных при 28 °C через 30 мин после высвобождения изG1 ареста. График представляет собой объединение трех биологических реплик (в каждой биологической реплике было подсчитано не менее 50 клеток). На графике отображаются средние ± SD. Непарный двуххвостый т-тест между клетками WT и cdc6-1 обозначается **** (p < 0,0001). Сокращения: WT = дикий тип; EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; DIC = дифференциальный интерференционный контраст; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; A.U. = произвольные единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Имя Генотип Рисунки и таблицы
ВС (E3087): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Рис.1, Рис.2A,B,C, Фиг.3, Рис.4A,B,D, Супп Рис.1,2,3 Таблицы2,3
cdc6-1 (E5956): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Рис.2A,B,D, Рис.4 C,D, Супп Рис.1, Таблицы2,3
TK+ (E1000): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) Супп Рис.4
TK+ hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Супп Рис.4
hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 Супп Рис.4
cdc6-1 TK+ hENT+ (E3968): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Супп Рис.4
В303-1А (Э001): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 Супп Рис.4

Таблица 1: Список штаммов, используемых в данном исследовании.

ВТ cdc6-1
25 °С 28 °С 25 °С 28 °С
Время удвоения (мин) 120 90 118 123
СД ± 13 мин ± 3 мин ± 10 мин ± 6 мин

Таблица 2: Среднее время удвоения штаммов WT и cdc6-1 , выращенных при 25 °C и 28 °C. Время удвоения было рассчитано из трех биологических реплик (четыре технических реплики для каждой биологической реплики) с использованием следующей формулы: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), где Cf и Ci соответствуют конечной и начальной клеточным концентрациям соответственно, а Δt соответствует разнице в минутах между tf и ti, когда измеряли Cf и Ci, соответственно.

ВТ cdc6-1
25 °С 28 °С 25 °С 28 °С
Процент Длительность
(мин)		 Процент Длительность
(мин)		 Процент Длительность
(мин)		 Процент Длительность
(мин)
Г1 27 32 18 16 13 16 10 12
S 29 35 32 29 28 34 28 34
G2+M 44 53 50 45 59 71 62 77
СД Г1 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±1 ±1 ±1
СД С ±3 ±6 ±5 ±5 ±5 ±7 ±4 ±4
СД Г2+М ±2 ±7 ±4 ±3 ±4 ±4 ±6 ±4

Таблица 3: Средние фракции клеток и продолжительность фазG1, S иG2 + M в клетках WT и cdc6-1 , выращенных при 25 °C и 28 °C. Фракции клеток определяли из трех биологических реплик (две технические реплики для каждой биологической реплики). Различия в длительности G1, S иG2 + M между клетками WT и cdc6-1 , выращенными при 28 °C, были статистически значимыми (непарный двуххвостый t-тест, p < 0,1).

Дополнительный рисунок S1: Доля клеток в ранней и поздней S-фазах в клетках WT и cdc6-1 , выращенных при 28 °C. Два идентичных многоугольника, названных S1 и S2 для ранней и поздней S-фаз, соответственно, были нарисованы в фракции EdU-положительных клеток, чтобы разделить ее на две половины на двухмерных анализах FACS EdU-PI для клеток (A) WT, выращенных при 28 ° C и (B) cdc6-1 клеток, выращенных при 28 ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Прогрессирование клеточного цикла меченых пульсом клеток EdU после высвобождения из арестаG1 , визуализированного двумерным FACS EdU-PI. Аликвота клеток мечили пульсом в течение 5 мин с 10 мкМ EdU каждые 5 мин после высвобождения из α-факторной остановки при 28 °C и до 80 мин, как указано. Сокращения: EdU = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток; PI = йодид пропидия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Прогрессирование клеточного цикла клеток, обработанных ДМСО, после высвобождения из арестаG1 , визуализированного двумерным FACS EdU-PI. Это то же самое, что и на дополнительном рисунке 2, но клетки инкубировали в течение 5 мин с 1 мкл DMSO (диметилсульфоксид). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S4: Токсичность BrdU и EdU в клетках дрожжей TK hENT1. Клетки указанного генотипа были замечены в пятикратном серийном разведении на пластинах YPD, содержащих повышенные концентрации BrdU или EdU, и выращивались в течение 40 ч при 30 °C. Сокращения: ДМСО = диметилсульфоксид; BrdU = бромодеоксиуридин; Edu = 5-этинил-2'-дезоксиуридин; TK = тимидинкиназа; hENT1 = уравновешивающий транспортер нуклеозидов человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Дрожжи являются основным модельным организмом для исследований клеточного цикла, но характеристика их S-фазы уже давно затруднена их неспособностью включать экзогенные нуклеозиды, такие как BrdU, которые используются в качестве индикаторов репликации ДНК. Оснащение дрожжей высокой экспрессией простого герпеса тимидинкиназы (TK) и добавление транспортера нуклеозидов человека (hENT) в значительной степени решило эту проблему 15,16. EdU более универсален, чем BrdU, поскольку его обнаружение с помощью небольших флуоресцентных азидов и химии Click поддается проницаемым дрожжевым клеткам и анализу FACS, в отличие от антител против BrdU17. Здесь мы оптимизировали условия маркировки и обнаружения EdU в этом штамме TK-hENT1 и показали, что ранее необнаруженные дефекты репликации могут быть количественно определены с помощью этого протокола с помощью FACS или микроскопии.

Изучение биологического механизма с использованием инструментов, которые могут мешать тому же механизму, является общей проблемой в биологии. Поскольку EdU обладает известным цитотоксическим эффектом, мы искали концентрации EdU, которые не токсичны при хроническом воздействии сконструированного штамма TK-hENT1, и обнаружили, что 10 мкМ являются подходящей дозой. Клетки TK-hENT1 не пролиферируют при 25 мкМ EdU, в то время как клетки только TK или hENT1 легко выдерживают 100 мкМ EdU (дополнительный рисунок S4). Хотя дрожжевые клетки значительно более чувствительны к EdU, чем BrdU, мы обнаружили, что пролиферация уменьшается только после второго клеточного цикла после воздействия EdU, предполагая, что она должна быть включена в обе нити, чтобы повлиять на пролиферацию клеток (данные не показаны). Чтобы оставаться в безопасности, мы использовали 10 мкМ EdU во всем этом протоколе, только с короткими импульсами (3 мин для микроскопии; 5 мин для FACS), и обнаружили, что это подходит для хорошего обнаружения с использованием этого оптимизированного протокола.

Тонкие дефекты репликации ДНК могут оказывать сильное влияние на хромосомные перестройки4. Поэтому разработка методов и протоколов, способных обнаружить эти тонкие дефекты, является ключом к раскрытию этиологии хромосомных аберраций. Здесь мы показываем, что этот оптимизированный протокол включения и обнаружения EdU может измерять до трехкратного снижения интенсивности сигнала (рисунок 2 и рисунок 4), что указывает на то, что скорость синтеза ДНК снижается в чувствительных к температуре клетках cdc6-1 , выращенных при 28 °C, которые пока не показывают дефектов на анализах жизнеспособности пластин (рисунок 2A). ). Таким образом, этот протокол включения и количественной оценки EdU может быть использован для скрининга других мутантов, для которых дефекты репликации изначально не подозреваются. Кроме того, может быть полезно обнаружить синтез митотической ДНК (MiDAS), мейотический рекомбинационный синтез ДНК или другой синтез ДНК с длинным трактом.

Одним из недостатков является то, что обнаружение EdU может быть выполнено только на фиксированных клетках, исключая живой анализ, как с PCNA-GFP или другими флуоресцентными показаниями репликации ДНК, которые сами страдают от высокой фототоксичности лазерных лучей, используемых для визуализации. Выращивание клеток в синтетической среде имеет решающее значение для наилучшего обнаружения, поскольку остатки YPD, по-видимому, значительно подавляют реакцию Клика. Интересно, что выделение S-фазовых клеток с использованием двумерного анализа FACS EdU-PI на синхронизированных популяциях позволяет оценить продолжительность S-фазы до 20 мин в отдельных клетках (Рисунок 3, Дополнительный рисунок S2 и Дополнительный рисунок S3). Однако, даже когда синхронность после высвобождения α фактора кажется такой же почти идеальной, как в классическом анализе Sytox Green FACS (рисунок 3A), из бивариативного анализа EdU-PI FACS становится ясно, что клетки входят в S-фазу относительно асинхронно (рисунок 3B-I).

Здесь мы описываем три метода определения длительности S-фазы с помощью проточной цитометрии и микроскопии на синхронных и асинхронных клетках как на одноклеточном, так и на популяционном уровнях. Средняя длительность S-фазы, определяемая в асинхронных клетках WT на популяционном уровне, аналогична с использованием проточной цитометрии и микроскопии при 29 мин и 31 мин соответственно, тогда как наш синхронизированный одноклеточный подход показывает, что продолжительность может составлять всего 20 мин (рисунок 2, рисунок 3, рисунок 4 и таблица 3). ). Расхождение между этими значениями удивительно, но может быть легко объяснено. Действительно, при нашем подходе, основанном на одной клетке, длительность S-фазы была определена на основе самых ранних событий (то есть первых клеток, входящих и выходящих из S-фазы, рисунок 3C, G), но это не означает, что S-фаза длится 20 минут в каждой клетке в популяции. Эти данные подтверждают неожиданное представление о том, что существует определенный уровень неоднородности в длительности S-фазы между клетками.

Улучшенные протоколы или новые методы могут опровергнуть давние догмы или новые идеи. Есть три, которые эти данные оспаривают. Во-первых, считается, что синтез ДНК сопровождается появлением почек у S. cerevisiae. На рисунке 4A-C показано, что окрашивание EdU является самым сильным в неочищенных и мелковидных клетках, несмотря на 3-минутную задержку маркировки, что указывает на то, что S-фаза явно начинается до бутонизации, как показано ранее16. Во-вторых, сообщается, что дрожжевые клетки не имеют фазыG2, при этом митотические веретена образуются одновременно с синтезом ДНК. Очень короткие импульсы в сочетании с чувствительным обнаружением EdU с помощью FACS (рисунок 3, дополнительный рисунок S2 и дополнительный рисунок S3) или микроскопии (рисунок 4) позволяет точно определить, когда начинается и заканчивается фаза S в отдельных клетках. Таким образом, мы обнаружили, что объемный синтез ДНК завершается через 40 мин после высвобождения α фактора (рисунок 3, дополнительный рисунок S2 и дополнительный рисунок S3), в то время как короткие митотические веретена образуются только через 20 мин16 (данные не показаны). Мы пришли к выводу, что дрожжевые клетки имеют фазу G2. В-третьих, недавно было высказано предположение, что до 30% дрожжевых клеток завершают синтез ДНК в анафазе-телофазе18. Используя этот оптимизированный протокол, мы не обнаружили инкорпорацию EdU в клетках, отображающих анафазное / телофазное веретено (данные не показаны), но мы не можем исключить, что эта вторая волна синтеза ДНК ниже используемого порога обнаружения. Учитывая сильное соотношение сигнал/шум, мы считаем последний вариант маловероятным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность Национальному агентству исследований (ANR) и Ассоциации по исследованиям в области рака (ARC) за стипендии phD для J.d.D.B.T. и Agence Nationale pour la Recherche (ANR) за финансовую поддержку (грант ANR-18-CE12-0018-01). Цитометрия и микроскопия были выполнены в центре визуализации МРТ BioCampus в Монпелье.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-factor  Genescript RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100--812-E
Copper sulfate Sigma C1297
DAPI Sigma D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) Interchim FP-JV6320 Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Carbosynth NE08701
Ethanol absolute Carlo Erba reagents P013A10D16 or equivalent
L- ascorbic acid Sigma A4544
Propidium iodide Sigma P4864
Proteinase K Euromedex EU0090
Rnase SIGMA R5000
Sytox Green Invitrogen S-7020
Equipment
Cell counter OLS CASY
Flow cytometer Agilent NovoSampler Pro
Shaking incubator Infors 444-4230 or equivalent
Shaking water bath Julabo SW22 or equivalent
Sonicator Sonics Vibra cell
Wide-field microscopy Leica THUNDER Imager or equivalent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).

Tags

Биология выпуск 188
Определение длительности S-фазы с использованием включения 5-этинил-2'-дезоксиуридина в <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E.,… More

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E., Talarek, N. Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64490, doi:10.3791/64490 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter