Summary
İn vivo olarak dahil edilen ve mikroskopi ve akış sitometrisi ile Click kimyası kullanılarak tespit edilen bir timidin analoğu olan EdU'yu kullanarak S. cerevisiae'deki S-faz süresini doğru bir şekilde belirlemek için iki tamamlayıcı protokol tanımladık. DNA replikasyon süresinin ve mutantlarda gözden kaçan replikasyon kusurlarının kolay karakterizasyonuna izin verir.
Abstract
Ökaryotik DNA replikasyonu, bir hücrenin genetik planının kromozom ayrışmasından önce doğru şekilde kopyalanmasını sağlayan yüksek oranda düzenlenmiş bir süreçtir. DNA sentez kusurları kromozom yeniden düzenlemelerinin altında yattığından, DNA replikasyonunu izlemek, genom instabilitesinin temelini anlamak için gerekli hale gelmiştir. Saccharomyces cerevisiae , hücre döngüsü düzenlemesini incelemek için klasik bir modeldir, ancak S fazındaki hücrelerin fraksiyonu veya S-faz süresi gibi anahtar DNA replikasyon parametrelerinin belirlenmesi hala zordur. Bu protokol, mühendislik TK-hENT1 maya hücrelerinde bir timidin analoğu olan 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) kısa ve toksik olmayan darbelerini kullanır, ardından mikroskopi ve akış sitometrisi ile hem tek hücreli hem de popülasyon seviyelerinde yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte DNA replikasyonunun görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine izin vermek için Click reaksiyonu ile tespit edilir. Bu yöntem, S fazında ve maya mutantlarının hücre döngüsü ilerlemesinde daha önce göz ardı edilen kusurları tanımlayabilir, böylece genom stabilitesini sağlamak için gerekli olan yeni oyuncuların karakterizasyonuna izin verebilir.
Introduction
Mitotik bölünme yoluyla genom stabilitesi, üretilen iki hücre progenisine tam ve eşit bir kromozom setinin iletilmesiyle sağlanır. Bu, hücre döngüsünün her aşamasında belirli bir zamanda meydana gelen bir dizi olayın doğru bir şekilde tamamlanmasına dayanır. G 1'de, çoğaltma kaynakları, Cdc61 de dahil olmak üzere çeşitli lisanslama faktörlerinin işe alınması üzerine lisanslanır. S fazında, tüm genom duplikasyonu, çoklu aktif replikasyon kökenlerinden başlatılır ve replikasyon fabrikaları2 olarak adlandırılan mikroskobik olarak görünür odaklarda toplanan replikasyon makineleri tarafından gerçekleştirilir. M fazında, kopyalanmış kardeş kromatitler, mitotik hücre3'ün zıt kutuplarına ayrılmalarına izin vermek için mitotik iğ üzerine bağlanır ve çift yönlendirilir. Her fazın düzenlenmesi, uygun şekilde tamamlanması ve süresi, genom stabilitesini sağlamak için anahtardır. Gerçekten de, bu fazların herhangi birinden erken çıkış genom instabilitesine yol açar. Örneğin, tomurcuklanan maya CDK inhibitörü Sic1'in silinmesi veya G1 siklinlerinin aşırı ekspresyonu ile indüklenen daha kısa birG1, sonraki S fazı 4,5,6'yı değiştirecektir. Sonuç olarak, replikasyon stresi ile ilişkili olsun ya da olmasın, bu deregülasyonlar, kromozom kırılmalarına, yeniden düzenlemelere ve yanlış ayrışmaya neden olur 4,5,6. Bu nedenle, S fazının süresini ve daha geniş anlamda, hücre döngüsünün diğer fazlarının süresini izlemek, farklı mutantlarda ve farklı stresli koşullarda meydana gelen kusurları tanımlamak için çok önemli olabilir.
Hücre döngüsü faz süresini ölçmek için geleneksel bir yöntem, basit DNA içeriği akış sitometrisini (Şekil 1A) içerir ve popülasyonu1C ve2C zirvelerinden G 1, S ve G 2 + M faz fraksiyonlarına ayırmak için kullanılan bir uygulama algoritmasına (çoğu sitometri yazılımında mevcuttur) dayanır. Kesirler daha sonra7. zamanı ikiye katlayan nüfus ile çarpılır. Bununla birlikte, bu yöntem yalnızca tahmini değerleri verir, belirli bir fraksiyon içinde homojen bir hücre boyutu dağılımı gerektirir ve senkronize kültürlere uygulanamaz. Memeli hücrelerinde S-faz süresini incelemek için, EdU da dahil olmak üzere birkaç timidin analogu geliştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmıştır. Hücre dışı ortamdan alımları ve timidin kinaz (bundan böyle TK olarak anılacaktır) tarafından fosforilasyonları, DNA polimerazlarının onları DNA sentezi (replikasyon, rekombinasyon, onarım) bölgelerinde birleştirmeleri için kullanılabilir hale getirir. Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde TK geninin yokluğunu atlamak için, maya suşları, herpes simpleks virüsü TK8 ve insan dengeleyici nükleozid taşıyıcısının (hENT1) 9'un kararlı ve kurucu ekspresyonuna izin verecek şekilde tasarlanmıştır. DNA'ya dahil edildikten sonra, EdU, alkinini kimyasal olarak azid modifiye florokromlarla birleştiren seçici Tıklama reaksiyonu yoluyla tespit edilir10.
Bu makale, DNA replikasyon süresini ve dinamiklerini ve ayrıca hücre döngüsünün diğer fazlarının süresini hassas bir şekilde görselleştirmek ve ölçmek için EdU ile asenkron ve senkron TK-hENT1 mühendislik hücrelerini nabız etiketlemek için optimize edilmiş iki kapsamlı protokol sunmaktadır. mikroskopi ve akış sitometrisi ile hem tek hücre hem de popülasyon seviyelerinde yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. S. cerevisiae hücre kültürü
NOT: Kullanılan maya suşları Tablo 1'de listelenmiştir
NOT: S-fazı süresi farklı şekillerde izlenebilir. Ele alınacak soruya bağlı olarak, hücrelerG1 tutuklamasını takiben asenkron veya senkron olarak büyütülebilir.
- Asenkron olarak büyüyen S. cerevisiae hücrelerinden
NOT: Bu yöntem, asenkron olarak büyüyen bir hücre popülasyonunda S fazındaki hücrelerin yüzdesinin belirlenmesine izin verir. İki katına çıkma süresi belirlenerek, S fazının (ve diğer fazların) süresi tahmin edilebilir.- S. cerevisiae hücrelerini, 130 rpm'de orbital ajitasyon ile 30 ° C'de bir gece kültürü için düşük hücre konsantrasyonunda (5 × 104 hücre / mL) 10 mL sentetik tam (SC) ortamda aşılayın.
NOT: Konsantrasyon bir hücre sayacı ile ölçülür. İki katına çıkma sürelerini verimli bir şekilde hesaplamak için, kültürün hala üstel fazda olan bir gecelik kültürden (yani, ideal olarak 2 × 107 hücre / mL'nin altında) aşılanması önerilir. EdU tespiti verimli olmadığından zengin ortamda (YPD) büyüyen hücreler önerilmez. - Ertesi gün, hücreleri 20 mL taze SC ortamında 5 × 105 hücre / mL'lik son konsantrasyonda seyreltin.
- Hücreleri 30 ° C'de, 120 rpm'de yatay sallanan bir su banyosunda kültürleyin.
- Hücre konsantrasyonunu 1 × 107 hücre / mL'ye ulaşana kadar her saat başı ölçün.
NOT: Bu adım, hücre konsantrasyonunun zaman içindeki artışının grafiksel bir gösterimini yapmanıza olanak tanır. İki katına çıkma sürelerini hesaplamak için kullanılan formül Tablo 2'nin açıklamasında açıklanmıştır. - Hücre konsantrasyonu yaklaşık 2 × 10 6-5 × 106 hücre / mL olduğunda EdU etiketlemesi için adım 2'ye paralel olarak ilerleyin.
- S. cerevisiae hücrelerini, 130 rpm'de orbital ajitasyon ile 30 ° C'de bir gece kültürü için düşük hücre konsantrasyonunda (5 × 104 hücre / mL) 10 mL sentetik tam (SC) ortamda aşılayın.
- G1-senkronize S. cerevisiae hücrelerinden
NOT: Bu yöntem, akış sitometrisi ve / veya mikroskopi analizleri yoluyla S fazının ne zaman başlayıp biteceğinin belirlenmesini sağlar.- S. cerevisiae hücrelerini, 130 rpm'de orbital ajitasyon ile 30 ° C'de bir gece kültürü için düşük hücre konsantrasyonunda (5 × 104 hücre / mL) 10 mL SC ortamında aşılayın.
NOT: Adım 1.1.1'den sonraki notlara bakın. - Ertesi gün, hücreleri 20 mL taze SC ortamında 2 × 106-3 × 106 hücre / mL'lik son konsantrasyonda seyreltin.
- Suda seyreltilmiş 40 μL 1 mg / mL α faktörü ekleyin.
- Hücreleri 30 ° C'de 1 saat boyunca 130 rpm'de yörüngesel ajitasyon ile kültürleyin.
- Suda seyreltilmiş 40 μL 1 mg / mL α faktörünü tekrar ekleyin.
- Hücreleri 30 ° C'de 1 saat boyunca 130 rpm'de yörüngesel ajitasyon ile kültürleyin.
- G1 tutuklamasını izlemek için hücreleri bir ışık mikroskobu altında görselleştirin. Hücrelerin% 90'ından fazlası bir shmoo gösteriyorsa ve diğerleri yuvarlak, tomurcuklanmamış hücrelerse devam edin.
NOT: Kullanılan arka plana bağlı olarak, shmoo görselleştirmeden önce hücrelerin sonikleştirilmesi önerilir. W303 arka planı için, her seferinde 2 s için, 40-50 genliğinde 2x'i sonikleştirin. - 1.500 × g'da 3 dakika santrifüj. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- Hücreleri 20 mL SC ortamında yeniden askıya alın.
- 1.2.8-1.2.9 arasındaki adımları bir kez yineleyin.
NOT: α faktörü bu adımlarla yıkanır ve hücreler hücre döngüsünde serbest bırakılır. Alternatif olarak, α faktörü, bir vakum pompasına bağlı bir yan kollu şişe üzerine yerleştirilmiş bir huni kullanılarak maya hücrelerini 1.2 μm'lik bir nitroselüloz filtre ile filtreleyerek yıkanabilir. - Her 5 dakikada bir 2 kez 1 mL hücre toplayın ve EdU etiketlemesi için adım 2'ye geçin.
NOT: EdU ile iki tüpten yalnızca birinden gelen hücreleri darbeyle etiketleyin. Darbe etiketli olmayan hücreler, iki değişkenli propidium iyodür (PI)-EdU grafiğinde EdU-pozitif hücreleri EdU-negatif hücrelerden ayırt etmek için kullanılır. - Serbest bırakıldıktan 30 dakika sonra suda seyreltilmiş 400 μL 1 mg / mL α faktörü ekleyin.
NOT: Bu yüksek dozda α faktörü, bir sonraki hücre döngüsünün G1 fazındaki hücreleri durdurmak ve hücrelerin sonraki S fazına tekrar girmesini önlemek için gereklidir.
- S. cerevisiae hücrelerini, 130 rpm'de orbital ajitasyon ile 30 ° C'de bir gece kültürü için düşük hücre konsantrasyonunda (5 × 104 hücre / mL) 10 mL SC ortamında aşılayın.
2. EdU etiketleme
- 1 mL hücre kültürünü, 1 μL 10 mM EdU içeren 2.0 mL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın. İnversiyon ile iyice karıştırın.
NOT: PI-EdU iki değişkenli FACS'taki EdU-pozitif hücreleri EdU-negatif hücrelerden ayırmak için, 1 μL DMSO içeren 2.0 mL'lik bir mikrofüj tüpüne 1 mL hücre kültürü daha aktarın. - Sallanan bir su banyosunda ajitasyon altında 30 ° C'de 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
NOT: Mikroskopla EdU tespiti için üç dakika yeterlidir; Bir akış sitometresinde optimum EdU tespiti için 5 dakika gereklidir. - 100 μL% 100 etanol ilavesiyle reaksiyonu durdurun.
- Hücre boyutu ölçümü gerekiyorsa, 100 μL% 20 paraformaldehit ilavesiyle reaksiyonu durdurun.
NOT: Mitotik hücrelerin nükleer mimarisi, Click reaksiyonunu takiben daha ileri analizler için bozulmadan tutulacaksa, hücreleri buz üzerine koymak yerine, oda sıcaklığında (RT) %2 paraformaldehit ile sabitlemenizi öneririz, çünkü ikincisi mikrotübül depolimerizasyonuna neden olur. - 100 μL% 100 etanol ilavesinden önce hücreleri sabitlemek için hücreleri RT'de 20 dakika boyunca değişken hızlı bir rocker üzerinde 20 eğim / dak'da hafif ajitasyon altında bırakın.
- Hücre boyutu ölçümü gerekiyorsa, 100 μL% 20 paraformaldehit ilavesiyle reaksiyonu durdurun.
3. Hücre fiksasyonu ve geçirgenliği
- Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca pelet edin. Süpernatantı vakum pipeti kullanarak çıkarın.
- Hücre peletini 500 μL% 70 etanol içinde yeniden askıya alın. Girdap yaparak iyice karıştırın.
- Hücreleri geçirgenleştirmek için RT'de 20 eğim / dak'da ≥1 saat boyunca değişken hızlı bir rocker üzerinde bırakın.
NOT: SC ortamında yetiştirilen hücreler, mikrofüj duvarlarına yapışma eğiliminde oldukları için pelet yapmazlar. Etanol ilavesi peletlemeyi iyileştirir ve hücre kaybını azaltır. Hücreler gece boyunca 4 ° C'de veya -20 ° C'de daha uzun süre saklanabilir. - Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- PBS'de hücreleri 500 μL% 10 etanol ile 2 kat yıkayın.
NOT: Yıkamalar, dahil edilmemiş EdU'yu hücrelerden çıkarmak için çok önemlidir.
4. Click-it reaksiyonu
- Sitometri analizi için
- Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- Pelet, 0.1 mg / mL RNaz A ve 0.2 mg / mL proteinaz K içeren 200 μL PBS'de yeniden askıya alın.
- Ara sıra sallanarak (veya gece boyunca 37 °C'de) 50 ° C'de 1-2 saat boyunca inkübe edin.
- Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- Hücreleri 500 μL PBS ile yıkayın.
- Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- Hücre peletini 200 μL PBS +% 1 sığır serum albümini (BSA) içinde yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
NOT: Daha uzun süreler gerekli değildir ve hatta tıklama ifadelerinin verimliliğine zarar verir. - Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- Peleti 300 μL PBS +% 1 BSA içinde yeniden askıya alın.
- Hücreleri iki tüp arasında dağıtın: Click reaksiyonu için 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL ve Sytox Green boyama için başka bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 100 μL.
- Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- Sytox Green boyama için
NOT: Yüksek kaliteli DNA içeriği referans profilleri elde etmek için Sytox Green boyama (Tıklama olmadan) için bir aliquot almanızı şiddetle tavsiye ederiz. Gerçekten de, Click reaksiyonu, Sytox Green ve PI floresan dahil olmak üzere interkalant floresanı güçlü bir şekilde söndürür. Sonuç olarak, Click reaksiyonu DNA içeriğinin okunmasını bozabilir.- Hücre peletini 100 μL PBS'de yeniden askıya alın.
- 10-30 μL'yi (hücre konsantrasyonuna bağlı olarak) 300 μL 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 ve 0.5 μM Sytox Green içeren bir akış sitometre tüpüne aktarın.
- 2x, her seferinde 2 s için, 40-50 genliğinde sonikasyon.
- Numuneleri bir akış sitometresinde işleyene kadar karanlıkta bırakın.
NOT: Hücreler bu aşamada birkaç gün boyunca 4 °C'de tutulabilir.
- Click tepkisi için
- Reaktifleri aşağıdaki sırayla (bir tüp için miktar) karıştırarak taze Azid Boya tamponu hazırlayın: 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Cy5 Azide ve 2 μL 1 M askorbik asit.
NOT: Azid Boya tamponunun ana karışımını hazırlamak mümkündür. Reaktifler yukarıda belirtilenlerle aynı sırada karıştırılmalıdır. - Hücre peletini 40 μL taze yapılmış Azide Boya karışımı ile yeniden askıya alın. RT'de karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe edin.
- Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- PBS'de hücreleri 300 μL% 10 etanol ile 3 kat yıkayın.
NOT: Yıkamalar, tüm çözünür EdU-Cy5 azidini ortadan kaldırmak için çok önemlidir. - PBS'de hücreleri 100 μL'lik 50 μg / mL PI'de yeniden askıya alın. Karanlıkta 10 dakika bekletin.
- Hücre süspansiyonunun 10-30 μL'sini (hücre konsantrasyonuna bağlı olarak), 300 μL 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 içeren bir akış sitometre tüpüne aktarın.
- 2x, her seferinde 2 s için, 40-50 genliğinde sonikasyon.
- Örnekleri bir sitometre üzerinde işleyene kadar karanlıkta bırakın.
NOT: Hücreler bu aşamada birkaç gün boyunca 4 °C'de tutulabilir.
- Reaktifleri aşağıdaki sırayla (bir tüp için miktar) karıştırarak taze Azid Boya tamponu hazırlayın: 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Cy5 Azide ve 2 μL 1 M askorbik asit.
- Sytox Green örneklerini 488 nm'de bir uyarma mavisi lazer ve 530/30 BP filtresi kullanarak okuyun. Tipik sonuçlar için Şekil 1A'ya bakın. 488 nm'de bir uyarma mavisi lazer ve PI (x ekseni) için 615/20 BP filtre ve 640 nm'de bir uyarma kırmızı lazer ve bir 660/20 BP filtresi (y ekseni) kullanarak nokta grafiğindeki iki değişkenli PI-EdU örneklerini okuyun. Tipik sonuçlar için Şekil 1B'ye bakın.
NOT: Şekil 1C, EdU-negatif hücreler için tipik PI-EdU iki değişkenli FACS sonucunu temsil eder. EdU-negatif hücrelerin EdU-pozitif hücrelerden ayrılmasına izin verir.
- Mikroskopi analizi için
- Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- Peleti 200 μL PBS +% 1 BSA içinde yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
- Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- Reaktifleri aşağıdaki sırayla (bir tüp için miktar) karıştırarak taze Azit Boya tamponu hazırlayın: 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Dy-530 azid, 2 μL 1 M askorbik asit.
NOT: Azid Boya tamponunun ana karışımı, reaktiflerin yukarıda belirtilen sırayla karıştırılmasıyla taze olarak hazırlanabilir. - Peleti 40 μL taze yapılmış Azid Boya tamponu ile yeniden askıya alın. RT'de karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe edin.
- Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- PBS'de hücreleri 300 μL% 10 etanol ile 2 kat yıkayın.
NOT: Yıkamalar, çözünür tüm Dy-530 azidini ortadan kaldırmak için çok önemlidir. - Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- PBS'de hücreleri 100 μL'de 0.5 μg / mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içinde yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika bekletin.
- Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- Fazla DAPI'yi çıkarmak için 300 μL PBS ile yıkayın.
- Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca toplayın. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
- Pelet, hücre konsantrasyonuna bağlı olarak 10-50 μL PBS ile yeniden askıya alın.
- 2x, her seferinde 2 s için, 40-50 genliğinde sonikasyon.
NOT: Hücreler bu aşamada birkaç gün boyunca 4 °C'de tutulabilir. - Pipet, hücrelerin 1.7 μL'sini cam mikroskop üzerine kaydırır ve temiz bir örtü ile örter.
- Hemen DAPI ve TexasRed veya Cy3 filtreli bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S-faz süresini ve daha geniş anlamda G 1 ve G2 + M'nin süresini (protokol adımı 1.1) belirlemek için, S. cerevisiae W303 vahşi tip hücreler (WT, Tablo 1) SC ortamında 7 saat boyunca asenkron olarak yetiştirildi. Her saat, iki katına çıkma süresini belirlemek için hücre konsantrasyonu izlendi (Şekil 2B). Bu büyüme koşullarında, hesaplanan ikiye katlanma süresi 25 °C'de 120 dakika ± 13 dakika idi (Tablo 2). Hücreler üstel fazdayken (2 × 10 6-5 × 106 hücre / mL), S fazındaki hücreleri ayırmak ve G 1, S ve G2 + M fazlarındaki hücrelerin yüzdesini belirlemek için 5 dakika boyunca EdU (10 μM) ile bir hücre alikotu nabız etiketli olarak etiketlendi. İki değişkenli bir EdU-PI sitometre analizinde üç hücre popülasyonu gözlenmiştir (Şekil 1B). EdU-negatif ve EdU-pozitif popülasyonlar arasındaki ayrım, hücrelerin EdU ile nabız etiketli olmadığı, ancak Tıklama reaksiyonunun gerçekleştirildiği bir kontrol deneyi kullanılarak yapılmıştır (Şekil 1C). PI yoğunluğunda iki kat farklılık gösteren sol alt-sol ve sağ alt-alt bölgelerdeki iki EdU-negatif popülasyon, sırasıyla G1 ve G2 + M'ye karşılık geliyordu (Şekil 1B, C). Bu nedenle, üst popülasyon (yoğunluk >1× 10 4-2 × 104) nabız anında S fazında bulunan EdU-pozitif hücrelere karşılık geldi (Şekil 1B). Bu nedenle, hücre popülasyonunun% 27'si ±% 5'i G1 fazında,% 29'±% 3'ü S fazındaydı ve% 44'±% 2'si G2 + M'deydi. Bu koşullarda iki katına çıkma süresi 120 dakika ± 13 dakika olduğundan, G1, S ve G 2 + M fazlarının sırasıyla25 ° C'de 4 dakika ± 32 dakika, 6 dakika ± 35 dakika ve 7 dakika ± 53 dakika sürdüğünü tahmin ettik (Tablo 2 ve Tablo 3).
Daha sonra, bu yöntemi doğrulamayı ve şimdiye kadar göz ardı edilen DNA replikasyon kusurlarına sahip mutantları tanımlamak için yeterince hassas olduğunu göstermeyi amaçladık. DNA replikasyonunda rol oynayan faktörlerin ayarlanabilir fonksiyon kaybı alellerinin ideal doğrulama kontrolleri olacağını düşündük. Bu nedenle, sıcaklığa duyarlı cdc6-1 mutant içeren bir maya suşu kullandık (Tablo 1)11. Cdc6, daha sonra replikasyon kökenleri olarak kullanılabilecek ORC'ye bağlı kromozom bölgelerinde prereplikasyon komplekslerini (preRC) bir araya getirmek için geç M ve G1 ile ifade edilen önemli bir lisans faktörüdür. Bu nedenle, izin verilen bir sıcaklıkta, S-faz süresi WT'ninkiyle aynı olmalıdır, kısıtlayıcı bir sıcaklıkta, hiçbir orijin lisanslı olmadığından DNA replikasyonu gerçekleşmemelidir12. Bununla birlikte, daha az orijinin lisanslandığı, ancak hücre canlılığını sağlamak için yeterli olduğu yarı izin verilen bir sıcaklıkta (yayınlanmamış verilerimiz; Barba Tena ve ark., hazırlık aşamasında), her aşama için farklı süreler öngördük. Beklendiği gibi, düşme testlerine dayanarak, cdc6-1 hücreleri, izin verilen bir sıcaklıkta (yani, 25 ° C, Şekil 2A) WT hücreleri ile aynı şekilde büyüdü, aynı iki katına çıkma süresini gösterdi (Şekil 2B ve Tablo 2), ancak 34 ° C'de veya üzerinde öldü (Şekil 2A). İlginçtir ki, yarı izin verilen bir sıcaklıkta (yani, 28 ° C), cdc6-1 uygulanabilirdi (28 ° C, Şekil 2A). Bununla birlikte, iki katına çıkma süresi WT'den daha uzundu (Şekil 2B ve Tablo 2) ve her fazın süresi farklıydı. Gerçekten de, cdc6-1'de, G1 biraz daha kısaydı (12 dakika ± 1 dakikaya karşı 16 dakika ± 2 dakika), S fazı biraz uzatılmış (34 dakika ± 4 dakikaya karşı 29 dakika ± 5 dakika) ve G2 + M fazı WT'ye kıyasla önemli ölçüde daha uzundu (77 dakika ± 4 dakikaya karşı 45 dakika ± 3 dakika) (Şekil 2C, D ve Tablo 3). S fazı, şaşırtıcı bir şekilde, çok fazla uzatılmadı, ancak EdU sinyalinin ortalama yoğunluğu% 25 oranında azaldı (Şekil 2C, D), bu da daha az kökenden başlatılan bir S fazı ile tutarlıdır. Ayrıca, EdU-pozitif WT hücreleri erken (S1) ve geç S (S2) fazları arasında homojen olarak dağılmış olsa da (Şekil 2C, Ek Şekil S1A, erken [S1] ve geç S [S2] fazları, üst kapıda dikey kesikli bir çizgi ile sınırlandırılmıştır), EdU-pozitif cdc6-1 hücrelerinin% 65'i geç S fazında birikmiştir (Şekil 2D, Ek Şekil S1B). S ve G2 + M popülasyonları arasında net bir ayrım bile yoktu (Şekil 2D), hücrelerin G2 fazına girmeden önce S fazını tamamlamak için mücadele ettiğini düşündürmektedir. Bu nedenle, bu yöntem S fazında (süre ve / veya dağılım) ve hücre döngüsü faz süresinde kusurları olan mutantları tanımlamak için uygun ve hassastır.
Hücrelerin DNA replikasyonlarını ne zaman başlatıp bitirdiklerini belirlemek ve senkronize hücreleri kullanarak S-faz süresini tahmin etmek için tamamlayıcı bir yöntem geliştirilmiştir (protokol adım 1.2). Bu amaçla, G1'deki senkronize hücrelerle α faktörü kullanılarak, hücreler SC ortamında serbest bırakıldı ve her 5 dakikada bir toplandı. S fazının süresi, DNA içeriğinin Sytox Green akış sitometre profilinde 1C'den 2C'ye değiştiği zamana bağlı olarak yaklaşık 25 dakika olabilir (Şekil 3A). Bununla birlikte, bu tahmin, popülasyonun önemli bir hücre fraksiyonunun FACS profilinde görülecek kadar Sytox Green'i ne zaman içerdiğine bağlıdır. Erken ve geç çoğaltma olayları bu yöntemle algılanamaz. S fazının ne zaman başlayıp bittiğini ve ne kadar sürdüğünü doğru bir şekilde tanımlamak için, S-fazı hücreleri, G 1 salınımından sonra her 5 dakikada bir 5 dakika boyunca EdU (10 μM) ile darbe etiketlemesi üzerine bir hücre alikotundan seçildi. Beklendiği gibi, serbest bırakıldıktan sonraki ilk 10 dakika içinde, tüm hücreler sol alt alandaydı (yani, G1, Şekil 3B, Ek Şekil S2). Serbest bırakıldıktan on beş dakika sonra, EdU-pozitif hücrelerin bir kısmı zaten tespit edildi (sırasıyla Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3, EdU ile tedavi edilmiş ve EdU içermeyen hücrelerdeki ilk iki sırayı karşılaştırın), S fazının başladığını gösteriyor (Şekil 3C). S fazındaki ilerleme, iki değişkenli PI-EdU grafiğinde önce yukarı ve sonra sağa doğru hareket eden hücre bulutu tarafından görülmüştür (Şekil 3D-F). Son olarak, salınımdan 35 dakika sonra, hücrelerin bir kısmı EdU-negatifti, ancak DNA miktarının iki katıydı, bu da bu hücrelerin S fazını tamamladığını ve G2 + M fazında olduğunu gösteriyordu (Şekil 3G). Böylece, S fazı bu koşullarda 20 dakika sürer. Sytox Green ile tespit edilen DNA içeriğinin bindirilmesiyle gözlenen yüksek senkroniteye rağmen, S fazının salınımdan 40 dakika sonra tüm popülasyonda bittiğini düşündüren iki değişkenli analizler, bazı hücrelerin S fazını salınımdan 60 dakika sonra bitirdiğini ve S fazının salınımdan 65 dakika sonra tüm popülasyon için tamamlandığını göstermiştir (Şekil 3H, I ve Ek Şekil S2).
Ek olarak, S fazı ve DNA sentezi mikroskopi ile izlenebilir. Her aktive edilmiş replikasyon kaynağından, DNA sentezi iki bağlı replizom tarafından gerçekleştirilir ve bir replikasyon faktörünün ve / veya operatörler dizisinin etiketli bir versiyonunu ve karşılık gelen baskılayıcılarını bir floresan proteinine kaynaştırarak mikroskopi tarafından takip edilebilecek bir nükleer replikasyon odağı oluşturur 2,13. Alternatif olarak, DNA sentezi timidin analogları14,15 kullanılarak mikroskopi ile tespit edilebilir. DNA sentezine uğrayan subnükleer DNA bölgelerini izlemek için EdU'yu kullandık. Bu amaçla, 28 °C'de 3 dakika boyunca EdU (10 μM) ile asenkron WT ve cdc6-1 hücrelerini darbeyle etiketledik ve Click reaksiyonundan sonra görüntüledik. DNA sentez hızına ve 3 dakikalık EdU darbesi sırasında hücre döngüsündeki hücre ilerlemesine bağlı olarak EdU sinyal yoğunluklarındaki varyasyonları tespit etmeyi bekliyorduk (yani, S fazında 3 dakikanın tamamını harcayan hücreler, nabız sırasında S fazına giren veya çıkanlardan daha güçlü bir sinyal gösterecektir). Buna göre, WT S-faz hücreleri, çekirdeklerinde yoğunluk bakımından değişen bir EdU sinyali gösterdiler (Şekil 4A). S-faz süresi bu analizden kolayca tahmin edilebilir. Gerçekten de, iki biyolojik replikasyondan (en az 150 hücre sayılmıştır), WT ve cdc6-1 hücrelerinin sırasıyla% 3'ünün ±% 3 ve% 38'inin EdU pozitif ± belirlenmiştir. Bu büyüme koşullarında olduğu gibi, WT ve cdc6-1 hücreleri için iki katına çıkma süresi sırasıyla 90 dakika ve 123 dakika idi (Tablo 2), S fazının sırasıyla 31 dakika ve 47 dakika sürdüğünü tahmin ettik. İlk sonuç, FACS analizlerimizden elde edilenlerle uyumludur (Tablo 3), EdU-pozitif hücrelerin mikroskopi ile saptanmasının S-faz süresinin belirlenmesine izin verdiğini göstermektedir. Not olarak, ikincisi FACS analizlerimizden tahmin edilen S-faz süresinden daha yüksektir, çünkü S ve G2 + M popülasyonları arasında net bir ayrım yoktu (Şekil 2D). EdU odakları WT hücrelerinde kolayca gözlendi (Şekil 4B), ancak cdc6-1 hücrelerinde daha sönük ve daha azdı (Şekil 4C). WT ve cdc6-1 hücreleri arasındaki EdU sinyal yoğunluğu farkının S fazının adımına bağlı olma olasılığını dışlamak için, yoğunluk senkronize hücrelerden ölçüldü. Beklendiği gibi, ortalama EdU sinyal yoğunluğu, cdc6-1 hücrelerinde (Şekil 4D), daha az replikasyon kaynağından başlatılan DNA replikasyonu ile tutarlı olarak üç kat daha düşüktü. EdU sinyali, güçlü bir DAPI sinyaliyle birlikte lokalize olan çekirdekle sınırlıydı ve nükleer bölgelerde veya replikasyon fabrikalarında DNA replikasyonunun organizasyonu ile tutarlı olarak küresel kalıplarda organize edildi. Önemli olarak, EdU sadece tomurcuklanmamış veya küçük tomurcuklanmış hücrelerde tespit edildi ve büyük tomurcuklu hücrelerde asla mevcut değildi, bu da WT maya hücrelerinin mitoza girdiklerinde replikasyonu bitirdiğini gösteriyordu. Bu nedenle bu yöntem, DNA replikasyonunu yüksek uzamsal çözünürlükte görselleştirmek ve hafif DNA replikasyon kusurlarını tespit etmek ve ölçmek için hassastır.
Şekil 1: Temsili FACS analizleri. (A) 25 °C'de yetiştirilen WT hücreleri için Temsili Sytox Green FACS analizleri. (B,C) 25 °C'de yetiştirilen WT hücreleri için Temsili EdU-PI iki değişkenli FACS analizleri ve EdU (10 μM) veya 1 μL DMSO ile 5 dakika boyunca nabız etiketli. Poligonlar her iki analizde de aynıydı. C, EdU-pozitif hücrelerden EdU-negatifi tanımlamak için kullanıldı (genellikle, sınır bir yoğunluğa ayarlanır >1× 10 4-2 × 104). Üst poligon kapısı EdU-pozitif hücreleri (S-faz fraksiyonu) tanımladı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Asenkron hücre popülasyonlarında G 1, S ve G2 + M hücre döngüsü fazlarındaki hücrelerin fraksiyonu. (A) WT ve cdc6-1 suşları, zengin ortamda seri beş kat seyreltmelerde tespit edildi ve 25 ° C, 28 ° C veya 34 ° C'de büyüdü. (B) Popülasyon iki katına çıkma süresi. Asenkron WT ve cdc6-1 hücreleri 25 ° C veya 28 ° C'de yetiştirildi ve hücre konsantrasyonu her saat 7 saat boyunca ölçüldü. (C, D) WT ve cdc6-1 hücrelerinin 28 ° C'de yetiştirilen ve EdU (10 μM) ile 5 dakika boyunca darbe etiketli EdU-PI iki değişkenli FACS analizi. Popülasyonun iki katına çıkma süresinin S-faz fraksiyonu ile çarpılması, S-faz süresini sağlar. EdU-pozitif ve EdU-negatif hücrelerin ortalama yoğunlukları, karşılık gelen çokgendeki her bir değerin yoğunluğunun ortalaması olarak hesaplandı. WT ve cdc6-1 EdU-negatif hücrelerin (sırasıyla 5.077 ve 4.454) ortalama yoğunlukları 1'e normalleştirildi. WT ve cdc6-1 EdU-pozitif hücrelerin (sırasıyla 52.604 ve 36.141) ortalama yoğunlukları, her bir suş için kullanılan normalizasyon faktörüne bölünmüştür. Elde edilen değerler sırasıyla 10.4 ve 8.1 idi (yani, metinde belirtildiği gibi% 25'lik bir düşüş). Kısaltmalar: WT = vahşi tip; EdU = 5-etinil-2'-deoksiüridin; FACS = floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama; PI = propidium iyodür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Senkronize hücrelerde S-faz süresinin belirlenmesi. (A) 28 °C'de α faktörlü salınımdan sonra WT hücrelerinin DNA içeriğinin zaman seyri analizi. Belirtilen süre, EdU darbesinin süresini (5 dakika) dikkate alır. (B-I) EdU-PI iki değişkenli FACS analizleri, EdU (10 μM) ile 5 dakika boyunca darbe etiketli senkronize WT hücreleri için ve G1 tutuklamasından serbest bırakıldıktan sonra belirtilen zamanlarda toplanır. Kısaltmalar: WT = vahşi tip; EdU = 5-etinil-2'-deoksiüridin; FACS = floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama; PI = propidium iyodür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Mikroskopi ile EdU tespiti ve nicelleştirme. Asenkron WT ve cdc6-1 suşları 28 ° C'de 2 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra EdU (10 μM) ile 3 dakika boyunca darbe etiketli olarak etiketlendi ve yeterli uyarma / emisyon filtreleri kullanılarak geniş alan mikroskobu ile görüntülendi. (A) WT için geniş alan mikroskobundan ve (B, C) WT ve cdc6-1 için bireysel hücrelerden DIC tarafından görselleştirilen ve belirtildiği gibi DAPI veya EdU ile boyanmış temsili görüntüler. (A) ve (B,C) içindeki ölçek çubukları sırasıyla 10 μm ve 2 μm'dir. (D) G1 tutuklamasından serbest bırakıldıktan 30 dakika sonra 28 ° C'de büyüyen senkron WT ve cdc6-1 hücreleri üzerindeki EdU yoğunluk ölçümleri. Grafik, üç biyolojik replikatın havuzlanmasını temsil eder (her biyolojik replikasyonda en az 50 hücre sayılmıştır). Ortalama ± SD grafik üzerinde görüntülenir. WT ve cdc6-1 hücreleri arasında eşleşmemiş iki kuyruklu bir t-testi **** ile gösterilir (p < 0.0001). Kısaltmalar: WT = vahşi tip; EdU = 5-etinil-2'-deoksiüridin; DIC = diferansiyel girişim kontrastı; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; A.U. = keyfi birimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Ad | Genotip | Şekiller ve tablolar | ||
| WT (E3087): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | Şekil 1, Şekil 2A,B,C, Şekil 3, Şekil 4A,B,D, Ek Şekil 1,2,3 Tablolar2,3 | ||
| cdc6-1 (E5956): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 | Şekil.2A,B,D, Şekil.4 C,D, Ek Şekil 1, Tablolar2,3 | ||
| TK+ (E1000): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) | Ek Şekil 4 | ||
| TK+ hENT+ (E2031): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | Ek Şekil 4 | ||
| hENT+ (E2031): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 | Ek Şekil 4 | ||
| cdc6-1 TK+ hENT+ (E3968): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 | Ek Şekil 4 | ||
| W303-1A (E001): | MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 | Ek Şekil 4 | ||
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan suşların listesi.
| WT | cdc6-1 | |||
| 25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |
| İki katına çıkma süresi (min) | 120 | 90 | 118 | 123 |
| SD | ± 13 dk | ± 3 dk | ± 10 dk | ± 6 dk |
Tablo 2: 25 °C ve 28 °C'de yetiştirilen WT ve cdc6-1 suşlarının ortalama iki katına çıkma süreleri. İki katına çıkma süreleri, aşağıdaki formül kullanılarak üç biyolojik replikasyondan (her biyolojik replikasyon için dört teknik replikasyon) hesaplanmıştır: Δt × ln (2) / ln (CF / Ci), burada Cf ve Ci, sırasıyla son ve ilk hücre konsantrasyonlarına karşılık gelir ve Δt, Cf ve Ci ölçüldüğünde tf ve ti arasındaki dakika farkına karşılık gelir, sırasıyla.
| WT | cdc6-1 | |||||||
| 25 °C | 28 °C | 25 °C | 28 °C | |||||
| Yüzde | Süre (dk) |
Yüzde | Süre (dk) |
Yüzde | Süre (dk) |
Yüzde | Süre (dk) |
|
| G1 | 27 | 32 | 18 | 16 | 13 | 16 | 10 | 12 |
| S | 29 | 35 | 32 | 29 | 28 | 34 | 28 | 34 |
| G2+M | 44 | 53 | 50 | 45 | 59 | 71 | 62 | 77 |
| SD G1 | ±5 | ±4 | ±3 | ±2 | ±2 | ±1 | ±1 | ±1 |
| SD S | ±3 | ±6 | ±5 | ±5 | ±5 | ±7 | ±4 | ±4 |
| SD G2+M | ±2 | ±7 | ±4 | ±3 | ±4 | ±4 | ±6 | ±4 |
Tablo 3: 25 °C ve28 °C'de yetişen WT ve cdc6-1 hücrelerinde hücrelerin ortalama fraksiyonları ve G 1, S ve G 2 + M fazlarının süresi. Hücrelerin fraksiyonları üç biyolojik replikasyondan (her biyolojik replikasyon için iki teknik replikasyon) belirlendi. 28 °C'de yetiştirilen WT ve cdc6-1 hücreleri arasındaki G1, S ve G 2 + M süresindeki farklılıklar istatistiksel olarak anlamlıydı (eşleşmemiş iki kuyruklu t-testi, p < 0.1).
Ek Şekil S1: WT ve cdc6-1 hücrelerinde erken ve geç S fazlarındaki hücrelerin fraksiyonu 28 ° C'de büyüdü. Sırasıyla erken ve geç S fazları için S1 ve S2 olarak adlandırılan iki özdeş çokgen, (A) 28 ° C'de yetiştirilen WT hücreleri ve (B) 28 ° C'de yetiştirilen cdc6-1 hücreleri için EdU-PI iki değişkenli FACS analizlerinde iki yarıya bölmek üzere EdU-pozitif hücrelerin fraksiyonunda çizilmiştir.
Ek Şekil S2: EdU-PI iki değişkenli FACS tarafından görselleştirilen G1 arrestinden salındıktan sonra EdU nabız etiketli hücrelerin hücre döngüsü ilerlemesi. Bir hücre alikotu, belirtildiği gibi 28 ° C'de ve 80 dakikaya kadar α faktörlü arrestten serbest bırakıldıktan sonra her 5 dakikada bir 10 μM EdU ile 5 dakika boyunca nabız etiketli olarak etiketlendi. Kısaltmalar: EdU = 5-etinil-2'-deoksiüridin; FACS = floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama; PI = propidium iyodür. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S3: EdU-PI iki değişkenli FACS tarafından görselleştirilenG1 arrestinden salındıktan sonra DMSO ile tedavi edilen hücrelerin hücre döngüsü ilerlemesi. Bu, Ek Şekil 2 ile aynıdır, ancak hücreler 1 μL DMSO (dimetil sülfoksit) ile 5 dakika boyunca inkübe edilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S4: TK hENT1 maya hücrelerinde BrdU ve EdU toksisitesi. Belirtilen genotipin hücreleri, artan konsantrasyonlarda BrdU veya EdU içeren YPD plakaları üzerinde beş katlı seri seyreltmelerde tespit edildi ve 30 ° C'de 40 saat boyunca büyütüldü. Kısaltmalar: DMSO = dimetil sülfoksit; BrdU = bromodeoksiüridin; Edu = 5-etinil-2'-deoksiüridin; TK = timidin kinaz; hENT1 = insan dengeleyici nükleozid taşıyıcısı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Maya, hücre döngüsü çalışmaları için birincil model bir organizmadır, ancak S fazının karakterizasyonu, DNA replikasyonunun izleyicileri olarak kullanılan BrdU gibi eksojen nükleositleri dahil edememesi nedeniyle uzun zamandır engellenmiştir. Mayanın herpes simpleks timidin kinaz (TK) ekspresyonunun yüksek olması ve bir insan nükleozid taşıyıcısının (hENT) eklenmesi bu sorunu büyük ölçüde çözmüştür15,16. EdU, küçük floresan azid ve Click kimyası ile tespiti, anti-BrdU antikorlarının aksine, geçirgenleştirilmiş maya hücrelerine ve FACS analizine uygun olduğu için BrdU'dan daha çok yönlüdür17. Burada, bu TK-hENT1 suşundaki EdU etiketleme ve algılama koşullarını optimize ettik ve daha önce tespit edilmemiş replikasyon kusurlarının bu protokol kullanılarak FACS veya mikroskopi ile ölçülebileceğini gösterdik.
Aynı mekanizmaya müdahale edebilecek araçları kullanarak biyolojik bir mekanizmayı incelemek, biyolojide yaygın bir konudur. EdU'nun bilinen bir sitotoksik etkisi olduğu için, mühendislik TK-hENT1 suşuna kronik maruziyette toksik olmayan EdU konsantrasyonlarını araştırdık ve 10 μM'nin uygun bir doz olduğunu bulduk. TK-hENT1 hücreleri 25 μM EdU'da çoğalmazken, TK-tek başına veya hENT1-tek başına hücreler 100 μM EdU'ya kolayca dayanır (Ek Şekil S4). Maya hücreleri EdU'ya BrdU'dan çok daha duyarlı olmasına rağmen, proliferasyonun ancak EdU'ya maruz kaldıktan sonraki ikinci hücre döngüsünden sonra azaldığını bulduk, bu da hücre proliferasyonunu etkilemek için her iki ipliğe de dahil edilmesi gerektiğini düşündürmektedir (veriler gösterilmemiştir). Güvenli tarafta kalmak için, bu protokol boyunca sadece kısa darbelerle (mikroskopi için 3 dakika; FACS için 5 dakika) 10 μM EdU kullandık ve bunun optimize edilmiş bu protokolü kullanarak iyi algılama için uygun olduğunu bulduk.
DNA replikasyonundaki ince kusurlar, kromozom yeniden düzenlemeleri üzerinde güçlü bir etkiye sahip olabilir4. Bu nedenle, bu ince kusurları tespit edebilecek tekniklerin ve protokollerin geliştirilmesi, kromozomal anormalliklerin etiyolojisini ortaya çıkarmak için anahtardır. Burada, bu optimize edilmiş EdU birleştirme ve algılama protokolünün, sinyal yoğunluğunda üç kata kadar bir azalmayı ölçebildiğini gösteriyoruz (Şekil 2 ve Şekil 4), DNA sentez hızının, 28 ° C'de yetiştirilen sıcaklığa duyarlı cdc6-1 hücrelerinde azaldığını gösteriyor, bu da henüz plaka canlılık testlerinde herhangi bir kusur göstermiyor (Şekil 2A) ). Bu nedenle, EdU birleştirme ve nicelleştirme protokolü, başlangıçta replikasyon kusurlarından şüphelenilmeyen diğer mutantları taramak için kullanılabilir. Ek olarak, mitotik DNA sentezini (MiDAS), mayotik rekombinasyona bağımlı DNA sentezini veya diğer uzun DNA sentezini tespit etmek yararlı olabilir.
Bir dezavantajı, EdU tespitinin yalnızca sabit hücreler üzerinde gerçekleştirilebilmesi, PCNA-GFP veya görüntüleme için kullanılan lazer ışınlarının yüksek fototoksisitesinden muzdarip olan DNA replikasyonunun diğer floresan okumalarında olduğu gibi canlı analizi engellemesidir. Sentetik bir ortamda büyüyen hücreler, en iyi tespit için çok önemlidir, çünkü YPD kalıntıları Tıklama reaksiyonunu önemli ölçüde söndürüyor gibi görünmektedir. İlginç bir şekilde, senkronize popülasyonlar üzerinde iki değişkenli EdU-PI FACS analizi kullanarak S-fazı hücrelerini ayırmak, S fazının süresinin tek hücrelerde 20 dakikaya kadar tahmin edilmesini sağlar (Şekil 3, Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3). Bununla birlikte, α faktörlü salınımdan sonra senkron, klasik Sytox Green FACS analizinde (Şekil 3A) olduğu gibi mükemmele yakın görünse bile, iki değişkenli EdU-PI FACS analizinden, hücrelerin S fazına nispeten asenkron olarak girdiği anlaşılmaktadır (Şekil 3B-I).
Burada, hem tek hücreli hem de popülasyon seviyelerinde senkron ve asenkron hücrelerde akış sitometrisi ve mikroskopi kullanarak S-faz süresini belirlemek için üç yöntem açıklamaktayız. Popülasyon düzeyinde asenkron WT hücrelerinde belirlenen ortalama S-fazı süreleri, sırasıyla 29 dakika ve 31 dakikada akış sitometrisi ve mikroskopi kullanılarak benzerdir, oysa senkronize tek hücre tabanlı yaklaşımımız sürenin 20 dakika kadar kısa olabileceğini göstermektedir (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Tablo 3 ). Bu değerler arasındaki tutarsızlık şaşırtıcıdır, ancak kolayca açıklanabilir. Gerçekten de, tek hücre tabanlı yaklaşımımızla, S-fazı süresi en erken olaylara (yani, S fazına giren ve çıkan ilk hücreler, Şekil 3C, G) dayanarak belirlendi, ancak S fazının bir popülasyondaki her hücrede 20 dakika sürdüğü anlamına gelmez. Bu veriler, hücreler arasındaki S-faz süresinde belirli bir heterojenlik seviyesi olduğu yönündeki beklenmedik düşünceyi destekleyecektir.
Geliştirilmiş protokoller veya yeni teknikler uzun süredir devam eden dogmaları veya yeni fikirleri devirebilir. Bu verilerin meydan okuduğu üç tane var. İlk olarak, DNA sentezinin S. cerevisiae'de tomurcuk ortaya çıkışı ile eşzamanlı olduğuna inanılmaktadır. Şekil 4A-C, 3 dakikalık etiketleme gecikmesine rağmen, EdU boyamasının tomurcuklanmamış ve küçük tomurcuklanmış hücrelerde en güçlü olduğunu göstermektedir, bu da S fazının daha önce gösterildiği gibi tomurcuklanmadan önce açıkça başladığını göstermektedir16. İkincisi, maya hücrelerininG2 fazına sahip olmadığı, mitotik iğlerin DNA sentezi ile aynı anda oluştuğu bildirilmiştir. FACS (Şekil 3, Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3) veya mikroskopi (Şekil 4) ile hassas EdU tespiti ile birleştirilen çok kısa darbeler, S fazının tek hücrelerde ne zaman başlayıp ne zaman bittiğini tam olarak belirlemeye izin verir. Bunu yaparak, toplu DNA sentezinin α faktörlü salınımdan 40 dakika sonra bittiğini (Şekil 3, Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3), kısa mitotik iğlerin ise sadece 20 dakika sonra16 (veriler gösterilmemiştir) oluşturduğunu bulduk. Maya hücrelerininG2 fazına sahip olduğu sonucuna vardık. Üçüncüsü, son zamanlarda maya hücrelerinin% 30'una kadarının anafaz-telofaz18'de DNA sentezini tamamladığı öne sürülmüştür. Bu optimize edilmiş protokolü kullanarak, bir anafaz / telofaz mili (veriler gösterilmemiştir) gösteren hücrelerde EdU birleşmesini tespit etmedik, ancak bu ikinci DNA sentezi dalgasının kullanılan tespit eşiğinin altında olduğunu göz ardı edemeyiz. Güçlü sinyal/noise oranı göz önüne alındığında bu seçeneğin pek olası olmadığını düşünüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, Agence Nationale de la Recherche (ANR) ve Association pour la Recherche sur le Cancer'ı (ARC) J.d.D.B.T. ve Agence Nationale pour la Recherche'ye (ANR) mali destek için doktora bursları için kabul etmek istemektedir (hibe ANR-18-CE12-0018-01). Montpellier MRG BioCampus görüntüleme tesisinde sitometri ve mikroskopi yapıldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-factor | Genescript | RP01002 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Euromedex | 04-100--812-E | |
| Copper sulfate | Sigma | C1297 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) | Interchim | FP-JV6320 | Alternative to Alexa647-Azide |
| Dy-530 azide | Dyomics | 530-10 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Carbosynth | NE08701 | |
| Ethanol absolute | Carlo Erba reagents | P013A10D16 | or equivalent |
| L- ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| Proteinase K | Euromedex | EU0090 | |
| Rnase | SIGMA | R5000 | |
| Sytox Green | Invitrogen | S-7020 | |
| Equipment | |||
| Cell counter | OLS | CASY | |
| Flow cytometer | Agilent | NovoSampler Pro | |
| Shaking incubator | Infors | 444-4230 | or equivalent |
| Shaking water bath | Julabo | SW22 | or equivalent |
| Sonicator | Sonics | Vibra cell | |
| Wide-field microscopy | Leica | THUNDER Imager | or equivalent |
References
- Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
- Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
- Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
- Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
- Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
- Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
- Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
- McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
- Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120 (2003).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
- Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
- Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
- Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
- Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
- Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
- Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
- Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267 (2020).
