Summary

Eine Anreicherungsmethode für kleine extrazelluläre Vesikel aus Leberkrebsgewebe

Published: February 03, 2023
doi:

Summary

Hier beschreiben wir die Anreicherung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Leberkrebsgewebe durch eine optimierte differentielle Ultrazentrifugationsmethode.

Abstract

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs), die aus Gewebe gewonnen werden, können den funktionellen Status der Quellzellen und die Eigenschaften des interstitiellen Raums des Gewebes widerspiegeln. Die effiziente Anreicherung dieser sEVs ist eine wichtige Voraussetzung für die Untersuchung ihrer biologischen Funktion und ein Schlüssel für die Entwicklung klinischer Nachweistechniken und therapeutischer Trägertechnologien. Es ist schwierig, sEVs aus Gewebe zu isolieren, da sie in der Regel stark kontaminiert sind. Diese Studie liefert eine Methode zur schnellen Anreicherung von hochwertigen sEVs aus Leberkrebsgewebe. Das Verfahren umfasst einen vierstufigen Prozess: die Inkubation von Verdauungsenzymen (Kollagenase D und DNase Ι) mit Gewebe, die Filtration durch ein 70-μm-Zellsieb, die differentielle Ultrazentrifugation und die Filtration durch einen 0,22-μm-Membranfilter. Aufgrund der Optimierung des differentiellen Ultrazentrifugationsschritts und der Hinzufügung eines Filtrationsschritts ist die Reinheit der mit diesem Verfahren erhaltenen sEVs höher als diejenige, die durch die klassische differentielle Ultrazentrifugation erreicht wird. Es liefert eine wichtige Methodik und unterstützende Daten für die Untersuchung von aus Gewebe gewonnenen sEVs.

Introduction

Kleine extrazelluläre Vesikel (sEVs) haben einen Durchmesser von etwa 30 nm bis 150 nm und werden von verschiedenen Zellensezerniert 1. Sie können mit Gewebezellen kommunizieren und die lokale oder entfernte Mikroumgebung regulieren, indem sie wichtige biologische Moleküle wie Lipide, Proteine, DNA und RNA zu verschiedenen Organen, Geweben, Zellen und intrazellulären Teilen transportieren. Somit können sie auch das Verhalten von Empfängerzellen 2,3 verändern. Die Isolierung und Aufreinigung spezifischer sEVs ist eine wesentliche Voraussetzung, um ihr biologisches Verhalten während der Entstehung und des Krankheitsverlaufs zu untersuchen. Die differentielle Ultrazentrifugation, die als Goldstandard gilt, wird häufig verwendet, um sEVs von den Geweben zu trennen, in denen sie sich normalerweise befinden4. Gewebetrümmer, Zelltrümmer, große Vesikel und apoptotische Körper können mit dieser Technik entfernt werden, so dass nur die sEVs übrig bleiben.

Es wurde gezeigt, dass Kollagenase D und DNase I die molekularen Eigenschaften von Zellen oder Vesikeln nicht beeinflussen, wobei die Eigenschaften beider Enzyme zur Freisetzung von Vesikeln in der extrazellulären Matrix beitragen 5. Diese Enzyme wurden verwendet, um sEVs aus menschlichem metastasiertem Melanomgewebe, Darmkrebsgewebe und Dickdarmschleimhautgewebe zu extrahieren 5,6,7. Die Konzentration und Verdauungszeit von Kollagenase D und DNase I in diesen Methoden unterscheiden sich jedoch, was zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen führt. Um die Kopräzipitation anderer Subtypen von sEVs zu vermeiden, haben Forscher größere extrazelluläre Vesikel (0,1 μm oder 0,2 μm Durchmesser) durch Filtration und/oder differentielle Zentrifugation entfernt8. Je nach Ausgangsgewebe können unterschiedliche Methoden der Isolierung und Reinigung erforderlich sein 9,10.

Die Verwendung der traditionellen differentiellen Ultrazentrifugationsmethode zur Extraktion von sEVs aus Lebergewebe führt zu einer Schicht weißer Substanz auf der Oberfläche des Überstandes, ohne dass seine Eigenschaften bestimmt werden können. In einer früheren Studie11 wurde festgestellt, dass diese Schicht der weißen Substanz die Reinheit der sEVs beeinflusst. Obwohl die Partikelanzahl und die Proteinkonzentration der mit der traditionellen Methode isolierten Proben höher waren als die der aktuellen Methode, war der Variationskoeffizient groß, möglicherweise weil viele Schadstoffe zu einer schlechten Wiederholbarkeit der Ergebnisse führen können. Das heißt, unter Verwendung von Detergens (d.h. Nachweis der Löslichkeit von Partikeln in 1% Triton X-100) stellten wir fest, dass die Reinheit der mit dieser Methode erhaltenen sEVs größer war. Daher verwenden wir diese Methode, um sEVs aus Darmkrebsgewebe für die Proteomforschung zu isolieren und zu reinigen.

Gegenwärtig konzentriert sich die Forschung zu sEVs bei Leberkrebs hauptsächlich auf Serum, Plasma und den Überstand der Zellkultur12,13,14. Aus Leberkrebsgewebe gewonnene sEVs können jedoch die physiologische Pathologie und die umgebende Mikroumgebung von Leberkrebs genauer widerspiegeln und den Abbau und die Verschmutzung anderer EVs wirksam verhindern15,16. Durch den Einsatz der differentiellen Ultrazentrifugation kann diese Methode die Ausbeute anreichern und qualitativ hochwertige sEVs erhalten, was eine wichtige Grundlage für die weitere Untersuchung von Leberkrebs darstellt. Diese Methode ermöglicht es, das Leberkrebsgewebe durch scharfe Trennung zu trennen und durch Kollagenase D und DNase I zu dissoziieren. Dann werden die zellulären Trümmer, großen Vesikel und apoptotischen Körper durch Filtration und differentielle Ultrazentrifugation weiter entfernt. Schließlich werden die sEVs isoliert und für spätere Studien gereinigt.

Protocol

Menschliches Leberkrebsgewebe wurde von Patienten gesammelt, bei denen im First Affiliated Hospital der Gannan Medical University eine maligne Lebererkrankung diagnostiziert wurde. Alle Patienten unterschrieben eine Einverständniserklärung, und die Entnahme von menschlichen Gewebeproben wurde von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital der Gannan Medical University genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwend…

Representative Results

sEVs aus menschlichem Leberkrebsgewebe haben eine entscheidende Rolle bei der Diagnose, Behandlung und Prognose von Patienten mit Leberkrebs gespielt. Bei dieser Methode wurden gängige Laborinstrumente verwendet, um sEVs aus Leberkrebsgewebe zu isolieren und zu reinigen. Dies kann eine methodische Unterstützung für die Untersuchung von sEVs bieten. Abbildung 2 veranschaulicht den allgemeinen Prozess der Anreicherung von sEVs aus Leberkrebsgewebe. sEVs in den Interzellularräumen von Geweb…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine wiederholbare Methode zur Extraktion von sEVs aus Leberkrebsgewebe. Hochwertige sEVs werden durch scharfe Gewebeisolierung, Behandlung mit Verdauungsenzymen, differentielle Ultrazentrifugation und 0,22-μm-Filtermembranfiltration und -reinigung erhalten. Für die nachgeschaltete Analyse ist es äußerst wichtig, die hohe Reinheit der sEVs sicherzustellen. Bei der differentiellen Zentrifugation erscheint eine Schicht weißer Substanzen (unbekannte Zusammensetzung) auf der Oberfläche des ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken dem First Affiliated Hospital der Gannan Medical University für die Unterstützung dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Fördernummern 82260422).

Materials

0.22 µm Membrane Filter Unit Millex SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe Hubei Xianming Medical Instrument Company YL01329
2% Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube Beckman Coulter 361621
6-well Cell cuture plate LABSELECT 11110
50 mL Beaker Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company CF2100800
70 µm Cell strainer Biosharp BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish CELL TER CS016-0128
600 µL Centrifuge tube Axygen MCT060C
BCA protein quantification kit Thermo Fisher RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL Beckman  A95761
BioRad Mini trans-blot Bio-Rad 1703930
BioRad Mini-Protean Bio-Rad 1645050
CD63 Antibody Abcam ab134045
CD9 Antibody Abcam ab263019
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428HQ527333
Cleaning Solution NanoFCM C1801
Collagenase D Roche 11088866001
Copper net Henan Zhongjingkeyi Technology Company DJZCM-15-N1
Dry Thermostat Hangzhou allsheng instruments company AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody Elabscience E-AB-F1086C
Glycine Solarbio G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody  Proteintech SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody  Proteintech SA00001-2
Methanol Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer NanoFCM INC FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) Roche 4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS) Servicebio G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane Solarbio ISEQ00010
QC Beads NanoFCM QS2502
RPMI-1640 basic medium Biological Industries  C11875500BT
Scalpel Guangzhou Kehua Trading Company NN-0623-1
Silica Nanospheres NanoFCM S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8 Kylin-Bell E0018
Transmission Electron Microscope Thermo Scientific Talos L120C
Tris Solarbio T8060
TSG101 Antibody Proteintech 28283-1-AP
Tweezer Guangzhou Lige Technology Company LG01-105-4X

References

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Cite This Article
Wang, X., Chen, J., Li, Z., Huang, D., Yi, X., Wu, J., Zhong, T. An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue. J. Vis. Exp. (192), e64499, doi:10.3791/64499 (2023).

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