Summary

Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Published: February 03, 2023
doi:

Summary

Burada, karaciğer kanseri dokusundan elde edilen küçük hücre dışı veziküllerin optimize edilmiş bir diferansiyel ultrasantrifüjleme yöntemi ile zenginleştirilmesini açıklıyoruz.

Abstract

Dokudan türetilen küçük hücre dışı veziküller (sEV’ler), kaynak hücrelerin fonksiyonel durumunu ve dokunun interstisyel boşluğunun özelliklerini yansıtabilir. Bu sEV’lerin verimli bir şekilde zenginleştirilmesi, biyolojik işlevlerinin incelenmesi için önemli bir önkoşuldur ve klinik tespit tekniklerinin ve terapötik taşıyıcı teknolojisinin geliştirilmesinin anahtarıdır. SEV’leri dokudan izole etmek zordur, çünkü genellikle ağır kirlenirler. Bu çalışma, karaciğer kanseri dokusundan yüksek kaliteli sEV’lerin hızlı bir şekilde zenginleştirilmesi için bir yöntem sunmaktadır. Yöntem dört aşamalı bir işlem içerir: sindirim enzimlerinin (kollajenaz D ve DNaz Ι) doku ile inkübasyonu, 70 μm hücre süzgecinden filtrasyon, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve 0.22 μm membran filtresi ile filtrasyon. Diferansiyel ultrasantrifüjleme adımının optimizasyonu ve bir filtreleme adımının eklenmesi sayesinde, bu yöntemle elde edilen sEV’lerin saflığı, klasik diferansiyel ultrasantrifüjleme ile elde edilenden daha yüksektir. Doku kaynaklı sEV’lerin incelenmesi için önemli bir metodoloji ve destekleyici veriler sağlar.

Introduction

Küçük hücre dışı veziküller (sEV’ler) yaklaşık 30 nm ila 150 nm çapındadır ve çeşitli hücreler tarafından salgılanır1. Doku hücreleri ile iletişim kurabilir ve lipitler, proteinler, DNA ve RNA gibi önemli biyolojik molekülleri çeşitli organlara, dokulara, hücrelere ve hücre içi parçalara taşıyarak yerel veya uzak mikro ortamı düzenleyebilirler. Böylece, alıcı hücrelerin davranışını da değiştirebilirler 2,3. Belirli sEV’lerin izolasyonu ve saflaştırılması, hastalığın gelişimi ve seyri sırasında biyolojik davranışlarını incelemek için gerekli bir ön koşuldur. Altın standart olarak kabul edilen diferansiyel ultrasantrifüjleme, sEV’leri normalde bulundukları dokulardan ayırmak için yaygın olarak kullanılır4. Doku kalıntıları, hücre kalıntıları, büyük veziküller ve apoptotik cisimler bu teknikle çıkarılabilir ve sadece sEV’ler bırakılabilir.

Kollajenaz D ve DNaz I’in, hücrelerin veya veziküllerin moleküler özelliklerini etkilemediği, her iki enzimin özelliklerinin hücre dışı matris 5’teki veziküllerin salınımına katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Bu enzimler, insan metastatik melanom dokusundan, kolon kanseri dokusundan ve kolonik mukozal dokudan sEV’leri çıkarmak için kullanılmıştır 5,6,7. Bununla birlikte, bu yöntemlerde kollajenaz D ve DNaz I’in konsantrasyonu ve sindirim süresi farklılık göstermekte ve tutarsız sonuçlara yol açmaktadır. Diğer sEV alt tiplerinin kopyalanmasını önlemek için, araştırmacılar filtrasyon ve / veya diferansiyel santrifüjleme8 ile daha büyük hücre dışı vezikülleri (0.1 μm veya 0.2 μm çapında) çıkardılar. Kaynak dokuya bağlı olarak, farklı izolasyon ve saflaştırma yöntemleri gerekebilir 9,10.

Karaciğer dokusundan sEV’leri çıkarmak için geleneksel diferansiyel ultrasantrifüjleme yönteminin kullanılması, özelliklerini belirlemenin herhangi bir yolu olmadan, süpernatanın yüzeyinde bir beyaz madde tabakası ile sonuçlanır. Önceki bir çalışmada11, bu beyaz madde tabakasının sEV’lerin saflığını etkilediği bulunmuştur. Geleneksel yöntemle izole edilen numunelerin partikül sayısı ve protein konsantrasyonu mevcut yöntemden daha yüksek olmasına rağmen, varyasyon katsayısı büyüktü, çünkü muhtemelen birçok kirletici sonuçların zayıf tekrarlanabilirliğine yol açabilir. Yani, deterjan kullanarak (yani,% 1 Triton X-100’deki parçacıkların çözünürlüğünü tespit ederek), bu yöntemle elde edilen sEV’lerin saflığının daha büyük olduğunu bulduk. Bu nedenle, proteomik araştırmalar için kolorektal kanser dokusundan türetilen sEV’leri izole etmek ve saflaştırmak için bu yöntemi kullanıyoruz.

Şu anda, karaciğer kanserinde sEV’ler üzerine yapılan araştırmalar esas olarak serum, plazma ve hücre kültürünün süpernatantı12,13,14’e odaklanmıştır. Bununla birlikte, karaciğer kanseri dokusundan türetilen sEV’ler, fizyolojik patolojiyi ve karaciğer kanserinin çevresindeki mikro ortamı daha doğru bir şekilde yansıtabilir ve diğer EV’lerin bozulmasını ve kirlenmesini etkili bir şekilde önleyebilir15,16. Diferansiyel ultrasantrifüjleme kullanımı ile, bu yöntem verimi zenginleştirebilir ve yüksek kaliteli sEV’ler elde edebilir ve karaciğer kanserinin daha ileri çalışmaları için önemli bir temel sağlar. Bu yöntem, karaciğer kanseri dokusunun keskin bir ayırma ile ayrılmasını ve kollajenaz D ve DNaz I ile ayrışmasını sağlar. Daha sonra, hücresel enkaz, büyük veziküller ve apoptotik cisimler filtrasyon ve diferansiyel ultrasantrifüjleme ile daha da uzaklaştırılır. Son olarak, sEV’ler daha sonraki çalışmalar için izole edilir ve saflaştırılır.

Protocol

İnsan karaciğer kanseri dokusu, Gannan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi’nde karaciğer malignitesi teşhisi konan hastalardan toplandı. Tüm hastalar bilgilendirilmiş onam formu imzaladı ve insan doku örneklerinin toplanması Gannan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi’nin etik komitesi tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. 1. Hazırlık…

Representative Results

İnsan karaciğer kanseri dokularından elde edilen sEV’ler, karaciğer kanserli hastaların tanı, tedavi ve prognozunda çok önemli bir rol oynamıştır. Bu yöntem, karaciğer kanseri dokularından türetilen sEV’leri izole etmek ve saflaştırmak için yaygın laboratuvar araçlarını kullandı; bu, sEV’lerin incelenmesi için metodolojik destek sağlayabilir. Şekil 2, karaciğer kanseri dokularından sEV’leri zenginleştirmenin genel sürecini göstermektedir. Dokuların hücreler a…

Discussion

Bu protokol, karaciğer kanseri dokusundan sEV’leri çıkarmak için tekrarlanabilir bir yöntemi tanımlar. Yüksek kaliteli sEV’ler keskin doku izolasyonu, sindirim enzimleri ile tedavi, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve 0.22 μm filtre membranı filtrasyonu ve saflaştırılması ile elde edilir. Aşağı akış analizi için, sEV’lerin yüksek saflığını sağlamak son derece önemlidir. Diferansiyel santrifüjleme sürecinde, süpernatanın yüzeyinde bir beyaz madde tabakası (bilinmeyen bileşim) görünecekti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Gannan Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi’ne bu çalışmayı destekledikleri için teşekkür eder. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe numaraları 82260422).

Materials

0.22 µm Membrane Filter Unit Millex SLGPR33RB
1 mL Sterile syringe Hubei Xianming Medical Instrument Company YL01329
2% Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400-2
4.7 mL Centrifuge Tube Beckman Coulter 361621
6-well Cell cuture plate LABSELECT 11110
50 mL Beaker Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company CF2100800
70 µm Cell strainer Biosharp BS-70-XBS
100 mm Cell culture dish CELL TER CS016-0128
600 µL Centrifuge tube Axygen MCT060C
BCA protein quantification kit Thermo Fisher RJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TL Beckman  A95761
BioRad Mini trans-blot Bio-Rad 1703930
BioRad Mini-Protean Bio-Rad 1645050
CD63 Antibody Abcam ab134045
CD9 Antibody Abcam ab263019
Centrifuge 5430R Eppendorf 5428HQ527333
Cleaning Solution NanoFCM C1801
Collagenase D Roche 11088866001
Copper net Henan Zhongjingkeyi Technology Company DJZCM-15-N1
Dry Thermostat Hangzhou allsheng instruments company AS-01030-00
FITC Anti Human CD9 Antibody Elabscience E-AB-F1086C
Glycine Solarbio G8200
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody  Proteintech SA00001-1
Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody  Proteintech SA00001-2
Methanol Shanghai Zhenxing Chemical Company
Nanoparticle flow cytometer NanoFCM INC FNAN30E20112368
Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) Roche 4906845001
Phosphate Buffered Saline(PBS) Servicebio G4202
Polyvinylidene Difluoride Membrane Solarbio ISEQ00010
QC Beads NanoFCM QS2502
RPMI-1640 basic medium Biological Industries  C11875500BT
Scalpel Guangzhou Kehua Trading Company NN-0623-1
Silica Nanospheres NanoFCM S16M-Exo
Transference Decoloring Shaker TS-8 Kylin-Bell E0018
Transmission Electron Microscope Thermo Scientific Talos L120C
Tris Solarbio T8060
TSG101 Antibody Proteintech 28283-1-AP
Tweezer Guangzhou Lige Technology Company LG01-105-4X

References

  1. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  2. Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
  3. Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
  4. Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  5. Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  6. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
  7. Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
  8. Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
  9. Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
  10. Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
  11. Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
  12. Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
  13. Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
  14. Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
  15. Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
  16. Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).

Play Video

Cite This Article
Wang, X., Chen, J., Li, Z., Huang, D., Yi, X., Wu, J., Zhong, T. An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue. J. Vis. Exp. (192), e64499, doi:10.3791/64499 (2023).

View Video