Summary
העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול ניסיוני חדשני המשתמש במחזיק מודפס בתלת-ממד כדי לאפשר הדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה של גלובוסים דחוסים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לצפות בפעילות איתות הסידן התאי באפיתל קרנית פצועה מגלובוסים ex vivo בזמן אמת.
Abstract
ריפוי פצעי אפיתל בקרנית הוא תהליך נדידה היזום על ידי הפעלת קולטנים פורינרגיים המתבטאים בתאי אפיתל. הפעלה זו גורמת לאירועי גיוס סידן המתפשטים מתא לתא, החיוניים לייזום תנועתיות תאית לתוך מיטת הפצע, ומקדמים ריפוי פצעים יעיל. מעבדת טרינקאוס-רנדל פיתחה מתודולוגיה להדמיית תגובת ריפוי פצעי הקרנית בגלובוסים ex vivo murine בזמן אמת. גישה זו כוללת הרטבת גלובוס שלם מעכבר שעבר המתת חסד על פי פרוטוקולים שנקבעו ומיד דגירה של כדור הארץ באמצעות צבע מחוון סידן. בשלב זה ניתן ליישם כתם נגדי שמכתים תכונות אחרות של התא כדי לסייע בהדמיה ולהראות ציוני דרך תאיים. הפרוטוקול עבד היטב עם מספר צבעים שונים של תאים חיים המשמשים להכתמה נגדית, כולל אקטין SiR לצביעת אקטין וכתם קרום פלזמה אדום עמוק כדי להכתים את קרום התא. כדי לבחון את התגובה לפצע, אפיתל הקרנית נפגע באמצעות מחט 25 גרם, והגלובוסים ממוקמים במחזיק מודפס בתלת מימד. הממדים של המחזיק המודפס בתלת-ממד מכוילים כדי להבטיח אימוביליזציה של כדור הארץ לאורך כל משך הניסוי, וניתן לשנותם כך שיתאימו לעיניים בגדלים שונים. הדמיית תאים חיים של תגובת הפצע מבוצעת באופן רציף בעומקים שונים ברחבי הרקמה לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פרוטוקול זה מאפשר לנו להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה ובאיכות פרסום באמצעות מטרה אווירית של פי 20 במיקרוסקופ קונפוקלי. מטרות אחרות יכולות לשמש גם עבור פרוטוקול זה. הוא מייצג שיפור משמעותי באיכות הדמיית התאים החיים בגלובוסים ex vivo murine ומאפשר זיהוי של עצבים ואפיתל.
Introduction
קרנית
הקרנית היא מבנה שקוף ואווסקולרי המכסה את המשטח הקדמי של העין אשר שובר את האור כדי לאפשר ראייה ומגן על פנים העין מפני נזק. מכיוון שהקרנית חשופה לסביבה, היא רגישה לנזקים הן מסיבות מכניות (גירוד) והן מזיהום. פגיעה בקרנית אצל חולה בריא בדרך כלל מחלימה תוך 1-3 ימים. עם זאת, בחולים עם מחלות רקע, כולל מחסור בתאי גזע לימבליים וסוכרת מסוג II, תהליך הריפוי של פצעי הקרנית יכול להיות ממושך מאוד1. מכיוון שהקרנית מאוד מופנמת, כיבים אלה שאינם מרפאים את הקרנית ושחיקות חוזרות ונשנות של הקרנית כואבים מאוד ופוגעים מאוד באיכות החיים של המטופלים החווים אותם1.
איתות תאי
כאשר קרנית בריאה נפגעת, אירועי איתות סידן בתאים הסמוכים לפצע מקדימים וגורמים לנדידה תאית לתוך מיטת הפצע, שם הם סוגרים את הפציעה ללא סיכון של הצטלקות 2,3. אירועי איתות אלה אופיינו היטב במודלים של תרביות תאי אפיתל בקרנית באמצעות הדמיית תאים חיים2. ניסויים ראשוניים הדגימו איתות סידן גבוה יותר באופן משמעותי לאחר פציעה בתאים שאינם סוכרתיים בהשוואה לתאים סוכרתיים. עם זאת, אפיון אירועי האיתות הסלולרי בגלובוסים ex vivo התגלה כאתגר טכני.
הדמיית תאים חיים
מחקרים קודמים תיעדו בהצלחה אירועי איתות סידן ממודלים של תרביות תאים במבחנה של ריפוי פצעי בקרנית 4,5,6. פיתוח מתודולוגיה להפקת תמונות באיכות גבוהה של אירועי איתות אלה ברקמת ex vivo הוא עניין רב מכיוון שהוא יאפשר לחקור אירועים אלה במערכת מורכבת ונאמנה יותר לחיים. גישות קודמות כללו כריתה של הקרנית ואחריה אימוביליזציה בג'ל PEGהמושרה על ידי UV 7,8,9. אימוביליזציה היא צעד חיוני אך מאתגר בעבודה עם רקמות חיות, מכיוון שהיא חייבת להישאר בת קיימא ולחות לאורך כל הניסוי. יתר על כן, אסור שאימוביליזציה תפגע ברקמה. בעוד שתמיסת PEG שיתקה את הרקמה, הרזולוציה והאיכות של התמונות שהופקו לא היו עקביות. לכן, מחזיקי הדפסה בתלת-ממד פותחו כדי לשתק גלובוסים שלמים כדי להפיק תמונות באיכות גבוהה יותר עם פחות סיכון לנזק לרקמות.
הגישה
מחזיק ייחודי המודפס בתלת-ממד פותח כדי לשתק גלובוסים שלמים של ex vivo להדמיית תאים חיים. מחזיק זה מונע נזק משני מקורות עיקריים: הוא מאפשר הדמיה של כדור הארץ ללא צורך לנתח את הקרנית, והוא מבטל את החשיפה לאור UV. ללא מקורות נזק אלה, התמונות שהתקבלו ייצגו בצורה מדויקת יותר את התגובה לפציעות השריטות שנעשו בניסוי. יתר על כן, המחזיק שהודפס בתלת-ממד כויל לממדים המדויקים של עין המורין. זה סיפק התאמה טובה בהרבה מאשר אימוביליזציה בפתרון PEG, מה שהוביל לתמונה באיכות גבוהה יותר ביעדים בעלי עוצמה נמוכה יותר עקב ירידה בתנועת הרקמות. פס כיסוי המחובר לחלק העליון של המחזיק מבטיח כי הגלובוס נשאר ללא תנועה לאורך כל משך הניסוי וכי אין תזוזה של הגלובוס כאשר מדיית הצמיחה מוחלת כדי לשמור על הידרציה וכדאיות. היכולת להדפיס את המחזיק למידות מדויקות מאפשרת לנו גם לייצר התאמה אופטימלית לעיניים מורין בגדלים שונים בשל הגיל או מצב המחלה. טכנולוגיה זו יכולה להיות מיושמת באופן רחב יותר כדי לפתח מחזיקים לעיניים של מינים שונים בהתבסס על מידותיהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליכים המערבים נבדקים מן החי אושרו על ידי האגודה למחקר בראייה ורפואת עיניים לשימוש בבעלי חיים בטיפול עיניים ומחקר ראייה ופרוטוקול IACUC של אוניברסיטת בוסטון (201800302).
1. עיצוב המחזיקים ופס העטיפה המודפסים בתלת מימד
- עצב את המחזיקים המודפסים בתלת-ממד ואת פס הכיסוי תוך התחשבות בקוטר הממוצע של גלובוסים של עכברים, והדפס את העיצוב בתלת-ממד (איור 1A, B).
- שמור על קוטר הדופן הפנימית של המחזיק מעט גדול יותר מהקוטר הממוצע של כדור הארץ כדי לקחת בחשבון את הגדלים השונים של עכברים בודדים. שמור על גובה המחזיק בכמחצית מקוטר הגלובוס, והבטח התאמה הדוקה של הגלובוס כאשר הוא מאובטח על-ידי פס הכיסוי המודפס בתלת-ממד.
- הגדילו את מכסה המחזיק לאורך הקוטר החיצוני של המחזיק ברוחב של 1/4 עד 1/2 מקוטר המחזיק. מוט הכיסוי הוא בגודל המאפשר גישה לגלובוס כאשר הוא מאובטח במחזיק לצורך הידרציה והסרת העין בסיום הניסוי.
- הדפס את המחזיק ואת פס הכיסוי.
2. איסוף דגימות
- עכברי המתת חסד (עכברים זכרים C57BL/6 בגילאי 9-12 שבועות ו-27 שבועות שימשו למחקר זה) תוך שימוש בפרוטוקולים מבוססים בהתאם להנחיות המוסדיות. עבור פרוטוקול זה, לבצע המתת חסד עם פחמן דו חמצני ואחריו עריפת ראש.
- הסר את ראש העכבר והנח אותו מיד על קרח כדי לשמור על הכדאיות של הרקמה. ניתן לנטרל את הגלובוסים באמצעות כלי דיסקציה תוך מניעת נזק לרקמות.
- פרופטוז את כדור הארץ באמצעות פינצטה. גזור את עצב הראייה באמצעות מספריים לנתיחה ממש מתחת למקום שבו הוא מוחזק על ידי הפינצטה.
הערה: לאמצעי זהירות נוספים, בצע את השלבים הבאים במכסה מנוע של זרימה למינרית. - לדגום את הגלובוסים ב-2 מ"ל של מדיום בצלחת תרבית תאים p35 כולל מחוון סידן ו/או כתם קרום התא במשך שעה אחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 בתנאי תאורה נמוכים. יש לוודא שהגלובוסים שקועים במדיום הכתמים לקבלת צביעה אחידה.
- עבור הניסויים שבוצעו כאן, השתמש במחוון הסידן, Fluo4-AM (1:100)2, וכתם נגדי של קרום התא, כתם קרום פלזמה אדום עמוק (1:10,000)2, עם ריכוז סופי של 1% (v/v) DMSO ו-0.1% (w/v) חומצה פלורונית ב-2 מ"ל של מדיום נטול סרום קרטינוציטים (KSFM) עם תוספי הצמיחה הבאים: 25 מיקרוגרם/מ"ל תמצית יותרת המוח של בקר, גורם גדילה אפידרמלי 0.02 ננומטר, 0.3 mM CaCl2, ופניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות/מ"ל ו-100 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה).
הערה: תנאי הדגירה וזמני הדגירה משתנים בהתאם למחוון הסידן, סוג הרקמה ונפח הדגימה. בעת שימוש בחומצה פלורונית, מומלץ להיזהר מכיוון שהיא הופכת את הרקמה לחדירה. פרוטוקול זה דורש 10% חומצה פלורונית. ריכוזים נמוכים יותר של חומצה פלורונית נקבעו בניסוי כלא יעילים, וריכוזים גבוהים יותר מסתכנים בנזק לרקמה.
- עבור הניסויים שבוצעו כאן, השתמש במחוון הסידן, Fluo4-AM (1:100)2, וכתם נגדי של קרום התא, כתם קרום פלזמה אדום עמוק (1:10,000)2, עם ריכוז סופי של 1% (v/v) DMSO ו-0.1% (w/v) חומצה פלורונית ב-2 מ"ל של מדיום נטול סרום קרטינוציטים (KSFM) עם תוספי הצמיחה הבאים: 25 מיקרוגרם/מ"ל תמצית יותרת המוח של בקר, גורם גדילה אפידרמלי 0.02 ננומטר, 0.3 mM CaCl2, ופניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות/מ"ל ו-100 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה).
3. הכנת מחזיקי המדגם
- הדביקו את המחזיקים לכיסוי תחתון זכוכית נקי עם דבק שלא נעשה בו שימוש בעבר. הדבק המשמש בפרוטוקול זה מגיע ממיכלים חד-פעמיים כדי להבטיח סטריליות ומכל חדש שלא נפתח משמש בכל פעם.
- שטפו את המחזיק ב-70% אתנול. הניחו דבק על המחזיק והדביקו את המחזיק למכסה התחתון של הזכוכית. ודא שאין דבק נמצא באזור הפנימי של המחזיק מכיוון שדבק יכול פלואורסצנטי, מה שמסבך את ההדמיה.
- המתן עד שהדבק יתמצק. ודא שהמחזיק מאובטח מפני הכיסוי.
הערה: לוחות תאים P35 עם כיסויים עם תחתית זכוכית שימשו לניסויים שהוצגו בכתב יד זה. ניתן להחליף שקופיות ו/או לוחות אחרים עם תחתית זכוכית בהתאם לצרכי הניסוי.
4. פצע של גלובוסים בעין
- הסר את הגלובוסים מתמיסת הכתם באמצעות טפטפות עיניים סטריליות, תוך הקפדה על מניעת נזק לרקמות באזור העניין. שוטפים את הגלובוסים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות מי מלח סטריליים עם אגירת פוספטים להסרת כתמים עודפים, ומניחים את הגלובוסים בתווך להובלה למיקרוסקופ.
- פצעו את הגלובוסים באמצעות מחט סטרילית של 25 גרם באזור העניין.
- באמצעות טפטפת עיניים סטרילית, הרימו והחזיקו את כדור הארץ מהחלק האחורי של העין. זה ישמור על יציבות הגלובוס, ימנע ממנו להתגלגל ויאפשר ליצור פצעים עקביים. באמצעות מערך זה, עצב הראייה יהיה בתוך פיית טפטפת העין, והקרנית תהיה פונה החוצה.
- לפצע שריטה, העבירו בעדינות מחט סטרילית של 25 גרם על פני הקרנית החשופה. לפצע ניקוב, יש ללחוץ בעדינות את המחט ישירות לתוך הקרנית המרכזית. ודא שהפצע אינו מנקב את הקרנית.
הערה: דלג על שלב זה אם אין צורך בתגובת פצע או בסביבה פצועה לצורך הניסוי. מחקרים קודמים הראו כי גם פצעי שריטה וגם פצעי ניקוב בקרניות מורין המיוצרים בשיטה זו עקביים הן בקוטר והן בעומק10. אישור מידות הפצע בין גלובוסים עצמאיים בוצע באמצעות ניתוח אזור עניין.
5. מיקום המדגם על המחזיק
- הניחו את אזור הקרנית או האזור הלימבולי על הכיסוי באזור הפנימי של המחזיק והתייצבו באמצעות הכיסוי המודפס בתלת-ממד (איור 1C-H).
- ודא כי הגלובוס ממוקם כראוי וכי אתר העניין נמצא במגע עם מכסה הזכוכית. לאחר שהגלובוס הוכנס למחזיק, אל תנסה להסיר את הגלובוס מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק לרקמות.
- הדביקו את העטיפה המודפסת בתלת-ממד למחזיק באמצעות דבק, כדי להבטיח ייצוב. ודא שפס הכיסוי נצמד למחזיק ולא לגלובוס.
הערה: האזור שיש להצטלם ממוקם למטה מכיוון שהפרוטוקול נכתב לשימוש במיקרוסקופ הפוך. ניתן להתאים את הפרוטוקול למיקרוסקופים זקופים באמצעות מחזיקים בעלי רדיוס פנימי קטן יותר והסרת מוט הכיסוי. התוצאה תהיה פחות ייצוב כדור הארץ.
6. הדמיה לדוגמה
- הפעל את המיקרוסקופ ואת התא הסביבתי וודא שהתא לח. הגדר את התא הסביבתי ל-35 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך הניסוי.
הערה: מיקרוסקופים עם תאים סביבתיים עדיפים להליך זה כדי למנוע התייבשות ולשמור על כדור הארץ בטמפרטורות אופטימליות אך אינם נדרשים. - הניחו את הכיסוי, המחזיק והגלובוס המיוצב על במת המיקרוסקופ בתוך התא הסביבתי והתמונה באמצעות טכניקות הדמיה של תאים חיים9.
- יש לטפטף מדיית צמיחה נוספת על הכיסוי כדי למנוע התייבשות ולשמור על כדאיות הרקמות. ודא שיש מספיק מדיום בבאר כדי לכסות את הגלובוס במחזיק. בהתאם למשך ההדמיה, יש להוסיף מדיום טרי בעת הצורך לאורך כל הניסוי.
- התחל בניסויים באמצעות טכניקות ופרוטוקולים של הדמיית תאים חיים. השתמש בהגדרות לייזר בהספק נמוך כדי לשמר את הרקמה ולמנוע נזק לרקמות בניסויים ממושכים. השתמש במטרות מתאימות למרחקי עבודה ארוכים. הניסויים בכתב יד זה בוצעו באמצעות מטרה של פי 20.
הערה: כוח הלייזר וההגברה, משך הניסוי, המיקום ומישור ההדמיה הם כולם משתנים בהתאם לפרמטרים הניסוייים. ניסויי הדמיה על גלובוסים שלמים שאורכם נע בין שעה ל-4 שעות בוצעו בהצלחה בפרסומים קודמים10. - הקלט ושמור נתונים בתבנית הקובץ המועדפת. התוכנה המשמשת את המיקרוסקופ מייצרת קבצי .czi להקלטת נתונים.
- יש להשליך את הגלובוסים בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים הסטנדרטיים בסוף הפרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה שימש להפקה עקבית של נתונים ותמונות באיכות פרסום10. התמונות המתקבלות מייצגות שיפור משמעותי בהשוואה לגישות קודמות (איור 2). באמצעות המחזיק המודפס בתלת-ממד, ניתן לצלם תמונות לאורך שכבות הקרנית, וניתן לצפות בגיוס סידן במישורי z שונים (איור 3). גישה זו שימשה להשוואת איתות תאי בין שכבות תאי apical ו- basal בפצע בעכברים צעירים ומבוגרים10.
היציבות המשופרת אפשרה גם הדמיה של גלובוסים למשך זמן רב משמעותית ממה שהיה אפשרי בעבר. עובדה זו אפשרה להאריך את המחקרים על נדידת התאים למיטת הפצע בכמה שעות מעבר ליכולות קודמות. עם ציר הזמן המורחב הזה, ניתן להבחין בהבדלים משמעותיים בהתנהגות התאים במהלך תגובת ריפוי הפצע בין עכברים צעירים ומבוגרים לאחר פגיעה בקרנית10. עבור פרוטוקול זה, הנתונים נאספו כל 5 דקות במשך 4 שעות. בעת השימוש במחזיק, לא נצפתה סחיפה משמעותית במישורי x, y או z במהלך הניסוי (איור 4, וידאו 1).
יתרון של פרוטוקול זה הוא שהוא מאפשר לאזורים שונים של הקרנית להיות תמונה על בסיס המיקום של כדור הארץ במחזיק. בפרסום שפורסם לאחרונה, תכונה זו נוצלה כדי לאסוף תמונות הן בקרנית המרכזית והן באזור הקרנית-לימבל (איור 5)10. נמצא כי פגיעה בקרנית המרכזית גורמת לאירועי איתות סידן בתאים הסמוכים לעצבים באזור הלימבל10. הרבגוניות של המחזיק חורגת מייצוב הגלובוס לניסויי הדמיה ושימשה למספר יישומים שונים. על ידי הצבת הקרנית עם הפנים כלפי מעלה במחזיק, בוצעו ניסויי ננו-אינדנציה כדי למדוד את הנוקשות של אפיתל הקרנית, קרום המרתף והסטרומה בעכברים צעירים ומבוגרים10,11.
איור 1: סכמות והגדרה של המחזיק המודפס בתלת-ממד. (A) עיצוב המחזיק המודפס בתלת-ממד עם מידות גובה ורוחב עם הערות. (ב) תמונת קובץ CAD מייצגת מתוכנת מדפסת התלת-ממד. (ג) תמונה מייצגת של המחזיק עם הכריכה המצורפת המכילה גלובוס מורין. (D) דבק סטרילי חד-פעמי מוחל על תחתית המחזיק המודפס בתלת-ממד. (E) המחזיק המודפס בתלת-ממד מוצמד לצלחת תרבית תאים p35 עם תחתית זכוכית. (F) גלובוס משוקע ממוקם בקרנית כלפי מטה לתוך המחזיק באמצעות טפטפת עיניים סטרילית. (G) פס הכיסוי מוצמד לחלק העליון של המחזיק המודפס בתלת-ממד כדי להבטיח אימוביליזציה של הגלובוס. (H) צלחת תחתית הזכוכית עם מחזיק דבק וגלובוס מונחת על במת המיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: שימוש במחזיקים מיוחדים המודפסים בתלת-ממד כדי לייצב את כדור הארץ ולהניב נתוני הדמיה באיכות גבוהה יותר של מבנים רב-שכבתיים . (A) ו- (B) מייצגים נתוני הדמיה חיים טיפוסיים של קרנית ex vivo פצועה המיוצבת ללא ועם מחזיק מודפס בתלת-ממד, בהתאמה. ניתן לזהות בבירור אירועי איתות סידן (ירוק) וכתם נגדי של תאים (כתם קרום פלזמה אדום עמוק) בשכבות האפיקליות, הבסיסיות והסטרומליות של הקרנית ב-(B) אך לא ב-(A). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ערימת Z של קרנית משותקת במחזיק המודפס בתלת-ממד. תמונות מייצגות של ערימת z שצולמו דרך שכבות הקרנית בפצע שריטה (מסומן בכוכבית לבנה). הדגימה מוכתמת בכתם קרום פלזמה אדום עמוק כדי לדמיין את קרומי התאים ו- Fluo4-AM (ירוק) כדי לדמיין איתות סידן. (A) ניתן לראות את שכבת התא האפי, (B) תאים אפיקליים ותאי בסיס, (C) שכבת תאי בסיס, ו-(D) סטרומה במיטת הפצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ניסוי מייצג של 4 שעות בסדרת זמן של קרנית החושף תנועה קטנה של כדור הארץ בכיווני x, y או z. התמונה היא של פציעת שריטה (המסומנת בכוכבית לבנה) בקרנית המרכזית של כדור הארץ ex vivo murine. כדור הארץ מוכתם בכתם קרום פלזמה אדום עמוק כדי לדמיין את קרומי התאים ו- Fluo4-AM (ירוק) כדי לדמיין אירועי איתות סידן. הגלובוס משותק באמצעות מחזיק מודפס בתלת-ממד. התמונות צולמו בהפרש של שעה אחת זו מזו, החל מ-5 דקות לאחר הפציעה. סחיפה קטנה בכיווני x, y או z נצפתה באמצעות מערך הדמיה זה לאורך כל הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: דיאגרמה של מיקומי הדמיה על כדור הארץ שלם. המחזיק המודפס בתלת-ממד מאפשר הדמיה של גלובוס ex vivo שלם במקומות שונים. המחזיק שימש לאיסוף תמונות הן מהאזורים המרכזיים והן מהאזורים הלימבליים של הקרנית. גלובוסים מוכתמים בכתם קרום פלזמה אדום עמוק כדי לזהות את קרומי התאים ו- Fluo4-AM (ירוק) כדי לזהות איתות סידן. (A) תמונה מייצגת של הקרנית המרכזית בפצע שריטה. (B) תמונה מייצגת של האזור הלימבלי של הקרנית לאחר פגיעה בקרנית המרכזית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
וידאו 1: סרט של גלובוס משותק במחזיק מודפס בתלת-ממד למשך 4 שעות. גלובוס היה משותק עם המחזיק שהודפס בתלת-ממד והוכתם בכתם קרום פלזמה אדום עמוק (אדום) כדי להמחיש את קרומי התאים ו-Fluo4-AM (ירוק) כדי לדמיין אירועי איתות סידן. התמונה צולמה כל 5 דקות למשך 4 שעות, החל מ-5 דקות לאחר הפציעה. סחיפה קטנה בכיווני x, y או z נצפתה באמצעות מערך הדמיה זה לאורך כל הניסוי. מהירות ההשמעה היא 30 פריימים לשנייה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה של תאים חיים המשתמשת במחזיק מודפס בתלת-ממד כדי לייצב ולשתק עיניים שלמות של בעלי חיים. הוא נועד לעקוף מספר חסרונות משמעותיים המוכרים בפרוטוקולי הדמיה קודמים של תאים חיים של רקמת קרנית ex vivo . פרוטוקול זה מציע יתרונות רבים להדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמים. הוא מפחית באופן משמעותי נזק מיותר לרקמות שעלול להפריע לתגובת ריפוי הפצע לפצעי שריטה שנגרמו בניסוי. זה כולל פגיעה בעצבים ובאפיתל כתוצאה מדיסקציה וחשיפה לאור UV. יתר על כן, פרוטוקול זה מקל על הידרציה וכדאיות של רקמות על ידי שיתוק הרקמה באופן המאפשר ליישם את מדיום הצמיחה מעת לעת ללא הפרעה לניסויים. על ידי שינוי כיוון העין במחזיק, הפרוטוקול מאפשר הדמיה של אזורים שונים על פני הגלובוס. השימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית יחד עם פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של מישורים שונים של כדור הארץ, ומאפשר תצפית על אינטראקציות בין מבני רקמות. הפרוטוקול הוא רב-תכליתי מאוד וניתן להתאים אותו לגלובוסים בגדלים שונים מעכברים וממינים אחרים. ניתן להסיר בקלות את המחזיקים והכיסויים מבארות ההדמיה, לעקר אותם ולעשות בהם שימוש חוזר. פרוטוקול ההדפסה התלת-ממדית יעיל וחסכוני בזמן, ומאפשר יצירה נוחה של מחזיקים רבים בו זמנית. ניתן לתקן את הגלובוסים בתוך המחזיקים אם יש צורך לשמור את הדגימות ולצלם אותן שוב במועד מאוחר יותר. רקמה קבועה שומרת על כתם קרום פלזמה אדום עמוק וכתמי Fluo4-AM למשך מספר שבועות לאחר הקיבוע, אשר יכולים לשמש כסמנים בעת צביעה עבור חלבון(ים) מסוים.
פרוטוקולים קודמים קראו לנתיחת העין ולשימוש הבא בג'ל PEG המופעל על ידי UV כדי לשתק את הקרנית לצורך הדמיה 7,8,9. נזק לרקמה שנגרם באמצעות טכניקות אלה עלול לבלבל את תוצאות הניסוי. חשוב במיוחד לקחת זאת בחשבון כאשר חוקרים את התהליכים התאיים והרקמות המעורבים בריפוי פצעים, שכן נזק נוסף זה מעבר לפצעים המיושמים בניסוי עשוי לשנות את תגובת ריפוי הפצע 4,12. הקלט של עצבי הקרנית התחושתיים יושפע מהפרוטוקול הקודם, שכן תהליך הדיסקציה מנתק את העצבים מגוף התא שלהם בגנגליון הטריגמינלי13. יתר על כן, כריתת הקרנית תגרום בעצמה לתגובת פציעה, שכן גורמים מסיסים המשתחררים מפציעה אחראים לתגובת ריפוי הפצע4. הליך חדש זה מטפל בחולשות אלה על ידי הדמיה של הגלובוסים ללא פגע. באמצעות מתודולוגיה זו, פגיעה בעין מוגבלת לחיתוך עצב הראייה בעת האנוקלציה ושומרת על כדאיות התאים בתוך הקרנית לפרקי זמן ממושכים. יחד, שיפורים אלה יוצרים סימולציה טובה יותר של תגובת הפצע.
אימוביליזציה היא צעד חיוני אך מאתגר בעבודה עם רקמות חיות, מכיוון שהיא חייבת להישאר בת קיימא ולחות לאורך כל הניסוי. בעוד הקרניות והגלובוסים יכולים להיות מאובטחים עם ג'ל PEG המושרה על ידי UV, ההליך דורש קרינת UV לאחר הצבת הרקמה במחזיק8. נצפה כי ההקרנה הנדרשת לפולימריזציה של ה-PEG הפחיתה את ההיענות התאית. יתר על כן, ה-PEG הפחית את הרזולוציה של התמונות, ופונקציית AiryScan נדרשה כדי לצפות באיתות הסלולרי. בפרוטוקול חדש זה, מידות המחזיק מותאמות במדויק לגלובוסים, ופס הכיסוי מספק שכבה נוספת של אימוביליזציה. המחזיק ופס הכיסוי מבטלים את הצורך להשתמש ב-PEG, המפיק תמונות באיכות גבוהה יותר וברזולוציה גבוהה יותר עם צילומים בזמן אמת של תהליך ריפוי הפצע. פתרון אחד לבעיות הנ"ל יהיה לוותר לחלוטין על הדמיית תאים חיים ולתקן את הגלובוסים בפרפורמלדהיד (4%) בזמנים קבועים מראש לאחר הפציעה. עם זאת, עם רקמה קבועה, תהליכים תאיים מתמשכים כגון איתות סידן ואת ההשפעות של תהליכים אלה על שינויים פיזיים ברקמה לא ניתן לראות. עבור קבוצות המעוניינות לרשום ולכמת אירועי תקשורת בין תאים באפיתל הקרנית, המגבלות המוטלות על ידי קיבוע רקמות הופכות טכניקה זו ללא מעשית למטרות אלה.
פרוטוקול חדש זה כולל שני שלבים מרכזיים: (1) המתת חסד וביטול מיידי של כדור הארץ, ו-(2) מיקום והתמצאות הגלובוס בתוך המחזיק. חיתוך עצב הראייה ו enucleation של כדור הארץ חייב להתבצע בזהירות על ידי proptosing העין ללא הצבת סד כדי לשמר את המבנים הפנימיים והחיצוניים. מיקום והתמצאות נחוצים להדמיה של אתרי העניין ולהבטחת שדה הראייה הגדול ביותר האפשרי במיקוד עם פירוט הולם. יש צורך במיקום נכון של הגלובוס לפני החלת מוט הכיסוי על המחזיק.
ניתן להתאים מספר משתנים של הפרוטוקול בהתאם לדרישות הפרמטרים הניסוייים. ניתן להדפיס את המחזיקים בגדלים שונים כדי להתאים לגלובוסים בכרכים שונים. הפרמטרים לגבי קוטר המחזיק וגובהו ביחס לגודל כדור הארץ נשארים זהים בכל טווחי הגודל. אם המשתמש חווה סחף במישור z, הסיבה הפוטנציאלית עשויה להיות שהרקמה אינה משותקת, ויש לייצר את המחזיק מחדש. ניתן להתאים את צביעת הגלובוסים השלמים בהתאם לפרמטרים הניסוייים, לכתמים בהם נעשה שימוש ולסביבה ולריכוזים האופטימליים לרקמה המעניינת. ניתן להתאים את משך הניסוי כל עוד נשמרת כדאיות הרקמות. ניסויים קצרי טווח הכוללים שעה אחת של הדמיה מתמדת של הרקמה וניסויים ארוכי טווח הכוללים הדמיה של הרקמה במרווחי זמן קבועים במשך 4 שעות בוצעו שניהם בהצלחה. ניסויים אלה בוצעו במיקרוסקופ הפוך, ופרוטוקול זה תוכנן לשימוש אופטימלי עם מערך הדמיה דומה. ברגע שהגלובוס מיוצב וממוקם בתוך המחזיק, הסרת הגלובוס עלולה לגרום נזק לרקמות; לפיכך, מיקום וכיוון אופטימליים של כדור הארץ לפני חיבור פס הכיסוי הם חיוניים. ניתן לתקן את הגלובוסים ב-4% פרפורמלדהיד ועדיין בתוך המחזיקים לצורך ניתוח נוסף של לוקליזציה של חלבונים. נתונים ראשוניים הראו כי כתם קרום פלזמה אדום עמוק וכתם Fluo4-AM נשמרים שניהם באמצעות תהליך הקיבוע.
למרות שלפרוטוקול זה יש יתרונות רבים על פני פרוטוקולים קודמים, ישנן כמה מגבלות לגישה ניסיונית זו. חסרון אחד הוא שקשה להסיר את כדור הארץ מהמחזיק מבלי לפגוע באפיתל הקרנית. לפיכך, יש לתקן את כדור הארץ במחזיק להדמיה מחדש באמצעות שיטות לוקליזציה של חלבונים או RNA במועד מאוחר יותר. זה יכול להגביל את מחקרי המעקב. חסרון נוסף של פרוטוקול זה במהלך פרוטוקולי הדמיה ממושכים הוא שיש לשמור על הידרציה. הצורך למרוח מחדש את המדיה באופן ידני במרווחי זמן קבועים מחייב מישהו לנטר באופן פעיל את תהליך ההדמיה להיקף הניסוי. זה עשוי להיות מאתגר מבחינה לוגיסטית עבור פרוטוקולי הדמיה מורחבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ל-NIH על תמיכת המענק הבאה: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) ו-5T32GM008541-24 (KS). ברצוננו להודות גם לקרן לחקר העיניים של אריות מסצ'וסטס ולקרן השתלות הקרנית של ניו אינגלנד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
