Summary
Det nåværende arbeidet beskriver en ny eksperimentell protokoll som bruker en 3D-trykt holder for å muliggjøre høyoppløselig levende celleavbildning av enukleerte glober. Gjennom denne protokollen kan den cellulære kalsiumsignalaktiviteten i såret hornhinneepitel fra ex vivo-globuser observeres i sanntid.
Abstract
Kornealepitelial sårheling er en migrerende prosess initiert ved aktivering av purinerge reseptorer uttrykt på epitelceller. Denne aktiveringen resulterer i kalsiummobiliseringshendelser som forplanter seg fra celle til celle, som er avgjørende for å initiere cellulær motilitet i sårsengen, og fremmer effektiv sårheling. Trinkaus-Randall-laboratoriet har utviklet en metodikk for å avbilde hornhinnens sårhelingsrespons i ex vivo murine globuser i sanntid. Denne tilnærmingen innebærer å enukleere en intakt klode fra en mus som har blitt avlivet i henhold til etablerte protokoller og umiddelbart inkubere kloden med et kalsiumindikatorfargestoff. En motbeis som flekker andre funksjoner i cellen, kan brukes på dette stadiet for å hjelpe til med avbildning og vise cellulære landemerker. Protokollen fungerte bra med flere forskjellige levende cellefarger som ble brukt til motfarging, inkludert SiR-aktin for å farge aktin og dyprød plasmamembranflekk for å farge cellemembranen. For å undersøke responsen på et sår, er hornhinneepitelet skadet ved hjelp av en 25 G nål, og globusene er plassert i en 3D-trykt holder. Dimensjonene til den 3D-printede holderen er kalibrert for å sikre immobilisering av kloden gjennom hele eksperimentets varighet og kan endres for å imøtekomme øyne av forskjellige størrelser. Levende celleavbildning av sårresponsen utføres kontinuerlig på ulike dybder i vevet over tid ved hjelp av konfokalmikroskopi. Denne protokollen lar oss generere bilder med høy oppløsning i publikasjonskvalitet ved hjelp av et 20x luftmål på et konfokalmikroskop. Andre mål kan også brukes til denne protokollen. Det representerer en betydelig forbedring i kvaliteten på levende cellebilder i ex vivo murine globuser og tillater identifisering av nerver og epitel.
Introduction
Hornhinne
Hornhinnen er en klar, avaskulær struktur som dekker øyets fremre overflate som bryter lys for å muliggjøre syn og beskytter øyets indre mot skade. Siden hornhinnen er utsatt for miljøet, er den utsatt for skade fra både mekaniske årsaker (riper) og fra infeksjon. En hornhinneskade hos en ellers sunn pasient helbreder vanligvis innen 1-3 dager. Hos pasienter med underliggende tilstander, inkludert limbal stamcellemangel og type II diabetes, kan imidlertid hornhinnens sårheling forlenges kraftig1. Siden hornhinnen er svært innervert, er disse ikke-helbredende hornhinnenesårene og tilbakevendende hornhinde erosjoner svært smertefulle og reduserer livskvaliteten til pasienter som opplever dem1.
Cell signalering
Når en ellers sunn hornhinne er skadet, går kalsiumsignalhendelser i cellene ved siden av såret foran og ber om cellulær migrasjon i sårsengen, hvor de lukker skaden uten risiko for arrdannelse 2,3. Disse signalhendelsene har blitt godt karakterisert i hornhinneepitelcellekulturmodeller ved bruk av levende celleavbildning2. Foreløpige eksperimenter viser betydelig mer kalsiumsignalering etter skade i ikke-diabetiske celler sammenlignet med diabetiske celler. Karakterisering av cellesignaleringshendelsene i ex vivo-globuser har imidlertid vist seg å være en teknisk utfordring.
Bildebehandling av levende celler
Tidligere studier har vellykket registrert kalsiumsignaleringshendelser fra in vitro cellekulturmodeller av hornhinnens sårheling 4,5,6. Å utvikle en metodikk for å produsere bilder av høy kvalitet av disse signalhendelsene i ex vivo-vev er av stor interesse fordi det ville tillate studiet av disse hendelsene i et mer komplekst og naturtro system. Tidligere tilnærminger har involvert disseksjon av hornhinnen etterfulgt av immobilisering i en UV-indusert PEG-gel 7,8,9. Immobilisering er et viktig, men utfordrende skritt når du arbeider med levende vev, da det må forbli levedyktig og hydrert i løpet av forsøket. Videre må immobilisering ikke skade vevet. Mens PEG-løsningen immobiliserte vevet, var oppløsningen og kvaliteten på de produserte bildene ikke konsistente. Derfor ble 3D-printede holdere utviklet for å immobilisere intakte globuser for å produsere bilder av høyere kvalitet med mindre risiko for vevskader.
Tilnærmingen
En unik 3D-printet holder ble utviklet for å immobilisere intakte ex vivo globuser for levende cellebilder. Denne holderen forhindrer skade fra to hovedkilder: det tillater avbildning av en enukleert klode uten behov for å dissekere hornhinnen, og det eliminerer eksponering for UV-lys. Uten disse kildene til skade representerte bildene som ble oppnådd mer nøyaktig responsen på ripeskadene som ble gjort eksperimentelt. Videre ble den 3D-printede holderen kalibrert til de nøyaktige dimensjonene til murine eye. Dette ga en mye bedre passform enn immobilisering i PEG-løsning, noe som førte til et bilde av høyere kvalitet ved lavere drevne mål på grunn av redusert vevsbevegelse. En dekselstang festet til toppen av holderen sikrer at kloden forblir immobil gjennom hele eksperimentets varighet, og at det ikke er noen forskyvning av kloden når vekstmedier påføres for å opprettholde hydrering og levedyktighet. Muligheten til å skrive ut holderen til presise dimensjoner gjør det også mulig for oss å generere en optimal passform for murine øyne i forskjellige størrelser på grunn av alder eller sykdomsstatus. Denne teknologien kan brukes bredere for å utvikle holdere for øynene til forskjellige arter basert på deres dimensjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrene som involverer dyrefag ble godkjent av Association for Research in Vision and Ophthalmology for bruk av dyr i oftalmisk omsorg og visjonsforskning og Boston University IACUC-protokollen (201800302).
1. Designe 3D-printede holdere og dekselstang
- Design 3D-printede holdere og dekselstang som står for den gjennomsnittlige diameteren på musekuler og 3D-print designet (figur 1A, B).
- Hold diameteren på holderens indre vegg litt større enn klodens gjennomsnittlige diameter for å ta hensyn til de forskjellige størrelsene på individuelle mus. Hold høyden på holderen på rundt halvparten av globusdiameteren, noe som sikrer en tett passform på kloden når den er sikret med den 3D-printede dekselstangen.
- Skaler holderens dekselstang til lengden på holderens ytre diameter med en bredde som er 1/4 til 1/2 av holderdiameteren. Dekselstangen er dimensjonert for å gi tilgang til kloden når den er festet i holderen for hydrering og fjerning av øyet ved avslutningen av forsøket.
- Skriv ut holderen og dekselstangen.
2. Eksempel på innsamling
- Avlivningsmus (mannlige C57BL / 6 mus i alderen 9-12 uker og 27 uker gamle ble brukt til denne studien) ved hjelp av etablerte protokoller i samsvar med institusjonelle retningslinjer. For denne protokollen, utfør eutanasi med karbondioksid etterfulgt av halshugging.
- Fjern musehodet og legg det umiddelbart på is for å bevare vevets levedyktighet. Enukleate globusene ved hjelp av disseksjonsverktøy samtidig som du forhindrer vevskader.
- Proptose kloden ved hjelp av pinsett. Klipp synsnerven ved hjelp av disseksjonssaks like under der den holdes av pinsetten.
MERK: For ytterligere forholdsregler, utfør følgende trinn i en laminær strømningshette. - Inkuber globusene i 2 ml medium i en p35-cellekulturskål, inkludert en kalsiumindikator og/eller cellemembranflekk i 1 time i en 37 °C, 5 % CO 2-inkubator med dårlige lysforhold. Forsikre deg om at kulene er nedsenket i fargemediet for jevn farging.
- For forsøkene som er utført her, bruk kalsiumindikatoren, Fluo4-AM (1:100)2, og cellemembrantellerfarge, dyprød plasmamembranflekk (1:10,000)2, med en endelig konsentrasjon på 1% (v/v) DMSO og 0,1% (w/v) pluronsyre i 2 ml keratinocytt serumfritt medium (KSFM) med følgende veksttilskudd: 25 μg/ml bovin hypofyseekstrakt, 0,02 nM epidermal vekstfaktor, 0,3 mM CaCl2 og penicillin-streptomycin (henholdsvis 100 enheter/ml og 100 μg/ml).
MERK: Inkubasjonsbetingelsene og -tidene varierer avhengig av kalsiumindikatoren, vevstypen og prøvevolumet. Ved bruk av pluronsyre anbefales forsiktighet, da det gjør vevet gjennomtrengelig. Denne protokollen krever 10% pluronsyre. Lavere konsentrasjoner av pluronsyre har blitt bestemt eksperimentelt for å være ineffektive, og høyere konsentrasjoner risikerer skade på vevet.
- For forsøkene som er utført her, bruk kalsiumindikatoren, Fluo4-AM (1:100)2, og cellemembrantellerfarge, dyprød plasmamembranflekk (1:10,000)2, med en endelig konsentrasjon på 1% (v/v) DMSO og 0,1% (w/v) pluronsyre i 2 ml keratinocytt serumfritt medium (KSFM) med følgende veksttilskudd: 25 μg/ml bovin hypofyseekstrakt, 0,02 nM epidermal vekstfaktor, 0,3 mM CaCl2 og penicillin-streptomycin (henholdsvis 100 enheter/ml og 100 μg/ml).
3. Forberedelse av prøveholdere
- Fest holderne til et rent deksel med glassbunn med lim som ikke har vært brukt tidligere. Limet som brukes i denne protokollen kommer fra engangsbeholdere for å sikre sterilitet, og en ny, uåpnet beholder brukes hver gang.
- Vask holderen i 70% etanol. Plasser lim på holderen og fest holderen til glassbunndekselet. Forsikre deg om at det ikke er lim i det indre området av holderen, da lim kan fluoresceres, noe som kompliserer bildebehandling.
- Vent til limet stivner. Bekreft at holderen er festet mot dekselet.
MERK: P35-celleplater med glassbunnsdeksler ble brukt til eksperimentene som ble presentert i dette manuskriptet. Andre glassbunnsbilder og / eller plater kan erstattes basert på eksperimentets behov.
4. Såring av øyekulene
- Fjern globusene fra fargeløsningen ved hjelp av sterile øyedråpere, og pass på å forhindre vevskader på interesseområdet. Vask kulene i 5 minutter ved romtemperatur ved bruk av steril fosfatbufret saltvann for å fjerne overflødig flekk, og plasser globusene i mediet for transport til mikroskopet.
- Vikle globusene med en steril 25 G nål i interesseområdet.
- Bruk en steril øyedråper, plukk opp og hold kloden fra baksiden av øyet. Dette vil holde kloden stabil, forhindre at den ruller og tillate konsekvente sår. Ved hjelp av dette oppsettet vil optisk nerve være inne i øyedråpedysen, og hornhinnen vender utover.
- For et skrapesår, flytt forsiktig en steril 25 G nål over den eksponerte hornhinnen. For et punkteringssår, trykk forsiktig nålen direkte inn i den sentrale hornhinnen. Sørg for at såret ikke punkterer hornhinnen.
MERK: Hopp over dette trinnet hvis en sårrespons eller et såret miljø ikke er nødvendig for eksperimentet. Tidligere studier har vist at både ripesår og punkteringssår til murine hornhinner laget ved hjelp av denne metoden er konsistente i både diameter og dybde10. Bekreftelse av sårdimensjonene mellom uavhengige globuser ble utført ved hjelp av en interesseområdeanalyse.
5. Prøveplassering på innehaveren
- Plasser hornhinnen eller limbalområdet på dekselet i holderens indre område og stabiliser ved hjelp av det 3D-printede dekselet (figur 1C-H).
- Bekreft at globusen er riktig plassert og at stedet av interesse er i kontakt med glassdekselet. Når globusen er plassert i holderen, må du ikke prøve å fjerne globusen, da dette kan forårsake vevskader.
- Fest det 3D-printede dekselet til holderen ved hjelp av lim, noe som sikrer stabilisering. Forsikre deg om at dekselstangen fester seg til holderen og ikke kloden.
MERK: Området som skal avbildes, plasseres ned fordi protokollen er skrevet for bruk på et omvendt mikroskop. Protokollen kan tilpasses for stående mikroskoper ved hjelp av holdere med mindre indre radius og fjerning av dekselstangen. Dette vil resultere i mindre klodestabilisering.
6. Eksempel på bildebehandling
- Slå på mikroskopet og miljøkammeret og kontroller at kammeret er fuktet. Sett miljøkammeret til 35 °C og 5 % CO2 i løpet av forsøket.
MERK: Mikroskoper med miljøkamre er å foretrekke for denne prosedyren for å forhindre dehydrering og for å holde kloden ved optimale temperaturer, men er ikke nødvendig. - Plasser dekselet, holderen og den stabiliserte globusen på mikroskopstadiet i miljøkammeret og bildet ved hjelp av levende celleavbildningsteknikker9.
- Pipetter ekstra vekstmedier på dekslet for å forhindre dehydrering og opprettholde vevets levedyktighet. Forsikre deg om at det er nok medium i brønnen til å dekke kloden i holderen. Avhengig av varigheten av bildebehandling, legg til nytt medium når det er nødvendig gjennom hele forsøket.
- Begynn eksperimenter ved hjelp av levende celleavbildningsteknikker og protokoller. Bruk laserinnstillinger med lav effekt for å bevare vevet og forhindre vevskader i langvarige eksperimenter. Bruk passende mål for lange arbeidsavstander. Eksperimentene i dette manuskriptet ble utført ved hjelp av et 20x mål.
MERK: Lasereffekten og forsterkningen, eksperimentell varighet, plassering og bildeplan er alle variabler avhengig av eksperimentelle parametere. Avbildningseksperimenter på intakte globuser fra 1 time til 4 timer i varighet har blitt utført med suksess i tidligere publikasjoner10. - Registrer og lagre data i ønsket filformat. Programvaren som brukes av mikroskopet produserer .czi filer for dataopptak.
- Kast globusene i henhold til standard institusjonelle protokoller på slutten av protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen har blitt brukt til konsekvent å produsere data og bilder av publiseringskvalitet10. Bildene som er oppnådd, representerer en betydelig forbedring sammenlignet med tidligere tilnærminger (figur 2). Ved hjelp av den 3D-printede holderen kan bilder tas gjennom lagene i hornhinnen, og kalsiummobilisering i forskjellige z-plan kan observeres (figur 3). Denne tilnærmingen har blitt brukt til å sammenligne celle-celle signalering mellom apikale og basale cellelag ved et sår hos unge og gamle mus10.
Den forbedrede stabiliteten har også gjort det mulig å avbilde globuser betydelig lenger enn tidligere mulig. Dette har gjort det mulig å forlenge studier av cellulær migrasjon i sårsengen med flere timer utover tidligere evner. Med denne utvidede tidslinjen kan betydelige forskjeller i cellulær oppførsel observeres under sårhelingsresponsen mellom unge og gamle mus etter hornhinneskade10. For denne protokollen ble data samlet inn hvert 5. minutt i 4 timer. Ved bruk av holderen ble det ikke observert signifikant drift i x-, y- eller z-planene i løpet av forsøket (figur 4, video 1).
En fordel med denne protokollen er at den gjør at forskjellige regioner i hornhinnen kan avbildes basert på klodens plassering i holderen. I en nylig publikasjon ble denne funksjonen utnyttet til å samle bilder både ved den sentrale hornhinnen og i hornhinnen-limbalområdet (figur 5)10. En skade på den sentrale hornhinnen ble funnet å produsere kalsiumsignalhendelser i celler ved siden av nerver i limbalområdet10. Allsidigheten til holderen går utover å stabilisere kloden for avbildningseksperimenter og har blitt brukt til flere forskjellige applikasjoner. Ved å plassere hornhinnen med forsiden opp i holderen, ble nanoindentasjonseksperimenter utført for å måle stivheten til hornhinneepitelet, kjellermembranen og stroma hos unge og gamle mus10,11.
Figur 1: Skjemaer og oppsett av den 3D-printede holderen. (A) Design av den 3D-printede holderen med kommenterte høyde- og breddedimensjoner. (B) Representativt CAD-filbilde fra 3D-skriverprogramvaren. (C) Representativt bilde av holderen med det vedlagte dekselet som inneholder en murinekule. (D) Sterilt engangslim påføres bunnen av den 3D-printede holderen. (E) Den 3D-printede holderen festes til en p35-cellekulturskål med glassbunn. (F) En enukleert globus plasseres hornhinnen ned i holderen ved hjelp av en steril øyedråper. (G) Dekselstangen er festet til toppen av den 3D-printede holderen for å sikre immobilisering av kloden. (H) Glassbunnplaten med en festet holder og globus er plassert på mikroskopstadiet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bruk av spesialiserte 3D-printede holdere for å stabilisere kloden og gi bildedata av høyere kvalitet av flerlagsstrukturer . (A) og (B) representerer typiske levende bildedata av en såret ex vivo hornhinne stabilisert uten og med en 3D-trykt holder, henholdsvis. Kalsiumsignaleringshendelser (grønn) og cellemotvekt (dyprød plasmamembranflekk) kan tydelig identifiseres i apikale, basale og stromale lag av hornhinnen i (B), men ikke i (A). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Z-stack av en hornhinne immobilisert i den 3D-printede holderen. Representative bilder av en z-stabel tatt gjennom lagene i hornhinnen ved et ripesår (betegnet med en hvit stjerne). Prøven er farget med dyprød plasmamembranflekk for å visualisere cellemembranene og Fluo4-AM (grønn) for å visualisere kalsiumsignalering. (A) Det apikale cellelaget, (B) apikale og basale celler, (C) basalcellelaget og (D) stroma kan ses i sårbunnen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representativt 4 timers tidsserieeksperiment av en hornhinne som avslører liten bevegelse av kloden i x-, y- eller z-retningene. Bildet er av en ripesårskade (betegnet med en hvit stjerne) ved den sentrale hornhinnen til en ex vivo murine globus. Kloden er farget med dyp rød plasmamembranflekk for å visualisere cellemembranene og Fluo4-AM (grønn) for å visualisere kalsiumsignalhendelser. Globusen er immobilisert ved hjelp av en 3D-trykt holder. Bildene ble tatt med 1 time mellomrom, og begynte 5 min etter skade. Lite drift i x-, y- eller z-retningene ble observert ved hjelp av dette bildeoppsettet i løpet av eksperimentet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Diagram over avbildningssteder på en intakt klode. Den 3D-printede holderen tillater avbildning av en intakt ex vivo-klode på forskjellige steder. Innehaveren ble brukt til å samle bilder fra både de sentrale og limbale områdene i hornhinnen. Globuser er farget med dyprød plasmamembranflekk for å oppdage cellemembranene og Fluo4-AM (grønn) for å oppdage kalsiumsignalering. (A) Representativt bilde av den sentrale hornhinnen ved et skrapesår. (B) Representativt bilde av hornhinnens limbale region etter en skade på den sentrale hornhinnen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Film av en globus immobilisert i en 3D-trykt holder i 4 timer. En globus ble immobilisert med den 3D-printede holderen og farget med dyprød plasmamembranflekk (rød) for å visualisere cellemembranene og Fluo4-AM (grønn) for å visualisere kalsiumsignaleringshendelser. Et bilde ble tatt hvert 5. minutt i 4 timer, og begynte 5 minutter etter skade. Lite drift i x-, y- eller z-retningene ble observert ved hjelp av dette bildeoppsettet i løpet av eksperimentet. Avspillingshastigheten er 30 bilder per sekund. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en levende celleavbildningsteknikk som bruker en 3D-trykt holder for å stabilisere og immobilisere intakte dyreøyne. Den er designet for å omgå flere betydelige ulemper anerkjent med tidligere levende celleavbildningsprotokoller av ex vivo hornhinnevev. Denne protokollen gir mange fordeler for levende celleavbildning av intakte globuser. Det reduserer unødvendig vevskader betydelig som kan forstyrre sårhelingsresponsen på eksperimentelt induserte ripesår. Dette inkluderer skade på nerver og epitel fra disseksjon og eksponering for UV-lys. Videre letter denne protokollen vevshydrering og levedyktighet ved å immobilisere vevet på en måte som gjør at vekstmedium kan påføres periodisk uten forstyrrelse av forsøkene. Ved å endre orienteringen av øyet i holderen, tillater protokollen avbildning av forskjellige regioner på kloden. Bruken av konfokalmikroskopi sammen med denne protokollen tillater avbildning av forskjellige plan på kloden, noe som muliggjør observasjon av interaksjoner mellom vevstrukturer. Protokollen er svært allsidig og kan tilpasses globuser av forskjellige størrelser fra mus og andre arter. Holdere og deksler kan enkelt fjernes fra avbildningsbrønnene, steriliseres og gjenbrukes. 3D-utskriftsprotokollen er effektiv og tidseffektiv, noe som gjør det mulig å lage mange innehavere på en gang. Globusene kan festes i holderne hvis prøvene må beholdes og avbildes igjen på et senere tidspunkt. Fast vev beholder dyp rød plasmamembranflekk og Fluo4-AM-flekker i flere uker etter fiksering, som kan brukes som markører ved farging for et bestemt protein (er).
Tidligere protokoller krevde disseksjon av øyet og påfølgende bruk av en UV-aktivert PEG-gel for å immobilisere hornhinnen for avbildning 7,8,9. Skader på vevet som oppstår gjennom disse teknikkene, kan forvirre eksperimentelle resultater. Dette er spesielt viktig å vurdere når man studerer de cellulære og vevsprosessene som er involvert i sårheling, da denne ekstra skaden utover de eksperimentelt påførte sårene kan endre sårhelingsresponsen 4,12. Inngangen til sensoriske hornhinnenerver vil bli påvirket av den forrige protokollen, da disseksjonsprosessen kutter nervene fra cellelegemene i trigeminal ganglion13. Videre vil disseksjonen av hornhinnen i seg selv forårsake en skaderespons, da løselige faktorer frigjort fra en skade er ansvarlige for sårhelingsresponsen4. Denne nye prosedyren adresserer disse svakhetene ved å avbilde globusene intakte. Ved hjelp av denne metoden er skade på øyet begrenset til kutting av optisk nerve ved enukleasjon og opprettholder cellens levedyktighet i hornhinnen i lengre perioder. Sammen skaper disse forbedringene en bedre simulering av sårresponsen.
Immobilisering er et viktig, men utfordrende skritt når du arbeider med levende vev, da det må forbli levedyktig og hydrert i løpet av forsøket. Mens hornhinnen og globusene kunne sikres med UV-indusert PEG-gel, krever prosedyren UV-bestråling etter plassering av vevet i holderen8. Det ble observert at bestrålingen som kreves for å polymerisere PEG, reduserte cellulær respons. Videre reduserte PEG oppløsningen på bildene, og AiryScan-funksjonen var nødvendig for å observere cellesignalering. I denne nye protokollen er dimensjonene til holderen optimalisert for å passe nøyaktig til globene, og dekselstangen gir et ekstra lag med immobilisering. Holderen og dekselstangen eliminerer behovet for å bruke PEG, som produserer bilder av høyere kvalitet med høyere oppløsning med sanntidsopptak av sårhelingsprosessen. En løsning på de ovennevnte problemene ville være å avstå fra levende celleavbildning helt og fikse globusene i paraformaldehyd (4%) på forhåndsbestemte tidspunkter etter skade. Men med fast vev kan pågående cellulære prosesser som kalsiumsignalering og effekten av disse prosessene på fysiske endringer i vevet ikke observeres. For grupper som er interessert i å registrere og kvantifisere kommunikasjonshendelser mellom celler i hornhinneepitelet, gjør grensene pålagt av vevsfiksering denne teknikken upraktisk for slike formål.
Denne nye protokollen har to viktige trinn: (1) eutanasi og umiddelbar globus-enukleasjon, og (2) posisjonering og orientering av kloden i holderen. Skjæringen av optisk nerve og enukleasjon av kloden må utføres nøye ved å proptosere øyet uten å plassere en spenne for å bevare de indre og eksterne strukturer. Posisjonering og orientering er nødvendig for avbildning av interesseområdene og for å sikre at størst mulig synsfelt er i fokus med tilstrekkelig detalj. Riktig plassering av kloden er nødvendig før du påfører dekselstangen på holderen.
Flere variabler i protokollen kan justeres avhengig av kravene til de eksperimentelle parametrene. Holderne kan skrives ut i forskjellige størrelser for å imøtekomme globuser med forskjellige volumer. Parametrene angående holderdiameter og høyde i forhold til klodens størrelse forblir de samme på tvers av størrelsesområder. Hvis brukeren opplever drift i z-planet, kan den potensielle årsaken være at vevet ikke er immobilisert, og holderen bør reproduseres. Fargingen av de intakte globusene kan justeres avhengig av eksperimentelle parametere, flekkene som brukes, og det optimale miljøet og konsentrasjonene for vevet av interesse. Den eksperimentelle varigheten kan justeres så lenge vevets levedyktighet opprettholdes. Kortsiktige eksperimenter som involverer 1 time konstant avbildning av vevet og langsiktige eksperimenter som involverer avbildning av vevet med jevne mellomrom i løpet av 4 timer, har begge blitt utført. Disse forsøkene ble utført på et omvendt mikroskop, og denne protokollen ble designet for optimal bruk med et lignende bildeoppsett. Når kloden er stabilisert og plassert i holderen, kan fjerning av kloden føre til vevskader; Dermed er optimal plassering og orientering av kloden før du fester dekselstangen avgjørende. Globusene kan festes i 4% paraformaldehyd mens de fortsatt er innenfor holderne for videre analyse av proteinlokalisering. Foreløpige data har vist at dyprød plasmamembranflekk og Fluo4-AM-farging begge beholdes gjennom fikseringsprosessen.
Selv om denne protokollen har mange fordeler i forhold til tidligere protokoller, er det noen begrensninger for denne eksperimentelle tilnærmingen. En ulempe er at det er vanskelig å fjerne kloden fra holderen uten å skade hornhinneepitelet. Dermed må kloden festes i holderen for re-imaging ved hjelp av protein- eller RNA-lokaliseringsmetoder på et senere tidspunkt. Dette kan begrense oppfølgingsstudier. En annen ulempe med denne protokollen under langvarige bildeprotokoller er at hydrering må opprettholdes. Behovet for å manuelt bruke media med jevne mellomrom krever at noen aktivt overvåker bildebehandlingsprosessen for omfanget av eksperimentet. Dette kan vise seg å være logistisk utfordrende for utvidede bildeprotokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Vi vil gjerne anerkjenne NIH for følgende tilskuddsstøtte: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) og 5T32GM008541-24 (KS). Vi vil også anerkjenne Massachusetts Lions Eye Research Fund og New England Corneal Transplant Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
