Summary
El presente trabajo describe un novedoso protocolo experimental que utiliza un soporte impreso en 3D para permitir imágenes de células vivas de alta resolución de globos enucleados. A través de este protocolo, la actividad de señalización de calcio celular en el epitelio corneal herido de globos ex vivo se puede observar en tiempo real.
Abstract
La cicatrización de heridas epiteliales corneales es un proceso migratorio iniciado por la activación de receptores purinérgicos expresados en las células epiteliales. Esta activación da como resultado eventos de movilización de calcio que se propagan de célula a célula, que son esenciales para iniciar la motilidad celular en el lecho de la herida, promoviendo la cicatrización eficiente de la herida. El laboratorio de Trinkaus-Randall ha desarrollado una metodología para obtener imágenes de la respuesta de cicatrización de heridas corneales en globos murinos ex vivo en tiempo real. Este enfoque implica la enucleación de un globo intacto de un ratón que ha sido sacrificado según los protocolos establecidos e inmediatamente la incubación del globo con un tinte indicador de calcio. Una contratinción que tiñe otras características de la célula se puede aplicar en esta etapa para ayudar con las imágenes y mostrar puntos de referencia celulares. El protocolo funcionó bien con varios colorantes de células vivas diferentes utilizados para la contratinción, incluida la actina SiR para teñir la actina y la tinción de la membrana plasmática de color rojo intenso para teñir la membrana celular. Para examinar la respuesta a una herida, el epitelio corneal se lesiona con una aguja de 25 G, y los globos se colocan en un soporte impreso en 3D. Las dimensiones del soporte impreso en 3D están calibradas para garantizar la inmovilización del globo durante toda la duración del experimento y se pueden modificar para adaptarse a ojos de diferentes tamaños. Las imágenes de células vivas de la respuesta de la herida se realizan continuamente a varias profundidades en todo el tejido a lo largo del tiempo utilizando microscopía confocal. Este protocolo nos permite generar imágenes de alta resolución y calidad de publicación utilizando un objetivo de aire 20x en un microscopio confocal. Otros objetivos también se pueden utilizar para este protocolo. Representa una mejora significativa en la calidad de las imágenes de células vivas en globos murinos ex vivo y permite la identificación de nervios y epitelio.
Introduction
Córnea
La córnea es una estructura transparente y avascular que cubre la superficie anterior del ojo que refracta la luz para permitir la visión y protege el interior del ojo del daño. Como la córnea está expuesta al medio ambiente, es susceptible al daño tanto por causas mecánicas (rascado) como por infección. Una lesión corneal en un paciente sano generalmente se cura dentro de 1-3 días. Sin embargo, en pacientes con afecciones subyacentes, incluida la deficiencia de células madre limbares y la diabetes tipo II, el proceso de cicatrización de la herida corneal puede prolongarse en gran medida1. Como la córnea está altamente inervada, estas úlceras corneales que no cicatrizan y las erosiones corneales recurrentes son muy dolorosas y disminuyen en gran medida la calidad de vida de los pacientes que las experimentan1.
Señalización celular
Cuando una córnea sana se lesiona, los eventos de señalización de calcio en las células adyacentes a la herida preceden y provocan la migración celular al lecho de la herida, donde cierran la lesión sin riesgo de cicatrización 2,3. Estos eventos de señalización han sido bien caracterizados en modelos de cultivo de células epiteliales corneales utilizando imágenes de células vivas2. Los experimentos preliminares demuestran significativamente más señalización de calcio después de una lesión en células no diabéticas en comparación con las células diabéticas. Sin embargo, la caracterización de los eventos de señalización celular en globos ex vivo ha demostrado ser un desafío técnico.
Imágenes de células vivas
Estudios previos han registrado con éxito eventos de señalización de calcio a partir de modelos de cultivo celular in vitro de cicatrización de heridas corneales 4,5,6. El desarrollo de una metodología para producir imágenes de alta calidad de estos eventos de señalización en tejido ex vivo es de gran interés porque permitiría el estudio de estos eventos en un sistema más complejo y real. Los enfoques anteriores han implicado la disección de la córnea seguida de la inmovilización en un gel PEG inducido por UV 7,8,9. La inmovilización es un paso esencial pero desafiante cuando se trabaja con tejido vivo, ya que debe permanecer viable e hidratado durante todo el transcurso del experimento. Además, la inmovilización no debe dañar el tejido. Mientras que la solución de PEG inmovilizó el tejido, la resolución y la calidad de las imágenes producidas no fueron consistentes. Por lo tanto, los soportes impresos en 3D se desarrollaron para inmovilizar globos intactos para producir imágenes de mayor calidad con menos riesgo de daño tisular.
El enfoque
Se desarrolló un soporte impreso en 3D único para inmovilizar globos intactos ex vivo para obtener imágenes de células vivas. Este soporte evita el daño de dos fuentes principales: permite obtener imágenes de un globo enucleado sin la necesidad de diseccionar la córnea y elimina la exposición a la luz UV. Sin estas fuentes de daño, las imágenes obtenidas representaron con mayor precisión la respuesta a las lesiones por rasguños realizadas experimentalmente. Además, el soporte impreso en 3D se calibró con las dimensiones precisas del ojo murino. Esto proporcionó un ajuste mucho mejor que la inmovilización en la solución PEG, lo que llevó a una imagen de mayor calidad en objetivos de menor potencia debido a la disminución del movimiento del tejido. Una barra de cubierta unida a la parte superior del soporte asegura que el globo permanezca inmóvil durante toda la duración del experimento y que no haya desplazamiento del globo cuando se aplica un medio de crecimiento para mantener la hidratación y la viabilidad. La capacidad de imprimir el soporte a dimensiones precisas también nos permite generar un ajuste óptimo para ojos murinos de diferentes tamaños debido a la edad o estado de la enfermedad. Esta tecnología se puede aplicar más ampliamente para desarrollar soportes para los ojos de diferentes especies en función de sus dimensiones.
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Protocol
Los procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología para el Uso de Animales en Cuidados Oftalmológicos e Investigación de la Visión y el protocolo IACUC de la Universidad de Boston (201800302).
1. Diseño de los soportes impresos en 3D y la barra de cubierta
- Diseñe los soportes impresos en 3D y la barra de cubierta que representan el diámetro promedio de los globos del ratón e imprima en 3D el diseño (Figura 1A, B).
- Mantenga el diámetro de la pared interna del soporte ligeramente más grande que el diámetro promedio del globo para tener en cuenta los diferentes tamaños de ratones individuales. Mantenga la altura del soporte en aproximadamente la mitad del diámetro del globo, asegurando un ajuste ajustado del globo cuando se asegura con la barra de cubierta impresa en 3D.
- Ajuste el tamaño de la barra de cubierta del soporte a la longitud del diámetro exterior del soporte con un ancho que sea de 1/4 a 1/2 del diámetro del soporte. La barra de cobertura está dimensionada para permitir el acceso al globo cuando se asegura en el soporte para la hidratación y la extracción del ojo al final del experimento.
- Imprima el soporte y la barra de cubierta.
2. Recogida de muestras
- Eutanasia en ratones (se utilizaron ratones machos C57BL/6 de 9-12 semanas y 27 semanas de edad para este estudio) utilizando protocolos establecidos de acuerdo con las directrices institucionales. Para este protocolo, realice la eutanasia con dióxido de carbono seguida de la decapitación.
- Retire la cabeza del ratón y colóquela inmediatamente sobre hielo para preservar la viabilidad del tejido. Nuclee los globos usando herramientas de disección mientras previene el daño tisular.
- Proptose el globo con pinzas. Recorte el nervio óptico con tijeras de disección justo debajo de donde lo sostienen las pinzas.
NOTA: Para mayor precaución, realice los siguientes pasos en una campana de flujo laminar. - Incubar los globos en 2 ml de medio en una placa de cultivo celular p35 que incluya un indicador de calcio y/o tinción de membrana celular durante 1 h en una incubadora deCO2 al 5% a 37 °C con condiciones de poca luz. Asegúrese de que los globos estén sumergidos en el medio de tinción para una tinción uniforme.
- Para los experimentos realizados aquí, utilice el indicador de calcio, Fluo4-AM (1:100)2, y la contratificación de la membrana celular, tinción de membrana plasmática de color rojo intenso (1:10.000)2, con una concentración final de 1% (v/v) de DMSO y 0,1% (p/v) de ácido plurónico en 2 mL de medio libre de suero de queratinocitos (KSFM) con los siguientes suplementos de crecimiento: 25 μg/ml de extracto hipofisario bovino, 0,02 nM factor de crecimiento epidérmico, 0,3 mM CaCl2 y penicilina-estreptomicina (100 unidades/ml y 100 μg/ml, respectivamente).
NOTA: Las condiciones y tiempos de incubación son variables dependiendo del indicador de calcio, el tipo de tejido y el volumen de la muestra. Cuando se usa ácido plurónico, se recomienda precaución ya que hace que el tejido sea permeable. Este protocolo requiere un 10% de ácido plurónico. Se ha determinado experimentalmente que las concentraciones más bajas de ácido plurónico son ineficaces, y las concentraciones más altas corren el riesgo de dañar el tejido.
- Para los experimentos realizados aquí, utilice el indicador de calcio, Fluo4-AM (1:100)2, y la contratificación de la membrana celular, tinción de membrana plasmática de color rojo intenso (1:10.000)2, con una concentración final de 1% (v/v) de DMSO y 0,1% (p/v) de ácido plurónico en 2 mL de medio libre de suero de queratinocitos (KSFM) con los siguientes suplementos de crecimiento: 25 μg/ml de extracto hipofisario bovino, 0,02 nM factor de crecimiento epidérmico, 0,3 mM CaCl2 y penicilina-estreptomicina (100 unidades/ml y 100 μg/ml, respectivamente).
3. Preparación de portamuestras
- Adhiera los soportes a un cubreobjetos limpio con fondo de vidrio con pegamento que no se haya utilizado anteriormente. El pegamento utilizado en este protocolo proviene de contenedores de un solo uso para garantizar la esterilidad y se usa un recipiente nuevo sin abrir cada vez.
- Lave el soporte en etanol al 70%. Coloque pegamento en el soporte y adhiera el soporte al cubreobjetos inferior de vidrio. Asegúrese de que no haya pegamento dentro del área interna del soporte, ya que el pegamento puede fluorescer, lo que complica las imágenes.
- Espere hasta que el pegamento se solidifique. Confirme que el soporte esté seguro contra el cubreobjetos.
NOTA: Se utilizaron placas celulares P35 con cubreobjetos con fondo de vidrio para los experimentos presentados en este manuscrito. Otras diapositivas y / o placas con fondo de vidrio pueden ser sustituidas según las necesidades del experimento.
4. Heridas en los globos oculares
- Retire los globos de la solución de tinción con goteros estériles, teniendo cuidado de evitar daños tisulares en la región de interés. Lave los globos durante 5 minutos a temperatura ambiente con solución salina estéril tamponada con fosfato para eliminar el exceso de mancha, y coloque los globos en el medio para transportarlos al microscopio.
- Enrolle los globos con una aguja estéril de 25 G en la región de interés.
- Con un gotero estéril, levante y sostenga el globo desde la parte posterior del ojo. Esto mantendrá el globo estable, evitará que ruede y permitirá que se hagan heridas consistentes. Usando esta configuración, el nervio óptico estará dentro de la boquilla del gotero y la córnea estará mirando hacia afuera.
- Para una herida por rasguño, mueva suavemente una aguja estéril de 25 G a través de la córnea expuesta. Para una herida punzante, presione suavemente la aguja directamente en la córnea central. Asegúrese de que la herida no perfore la córnea.
NOTA: Omita este paso si no se requiere una respuesta de herida o un entorno herido para el experimento. Estudios previos han demostrado que tanto las heridas por rasguños como las heridas punzantes en córneas murinas realizadas con este método son consistentes tanto en diámetro como en profundidad10. La confirmación de las dimensiones de la herida entre globos independientes se realizó mediante un análisis de región de interés.
5. Colocación de la muestra en el soporte
- Coloque la córnea o la región limbal sobre el cubreobjetos en el área interna del soporte y estabilice utilizando la cubierta impresa en 3D (Figura 1C-H).
- Confirme que el globo está colocado correctamente y que el sitio de interés está en contacto con el cubreobjetos de vidrio. Una vez que el globo se ha colocado en el soporte, no intente quitar el globo, ya que esto puede causar daño tisular.
- Adhiera la cubierta impresa en 3D al soporte con pegamento, asegurando la estabilización. Asegúrese de que la barra de cubierta se adhiera al soporte y no al globo terráqueo.
NOTA: El área que se va a fotografiar se coloca hacia abajo porque el protocolo está escrito para su uso en un microscopio invertido. El protocolo se puede adaptar para microscopios verticales utilizando soportes con un radio interior más pequeño y la eliminación de la barra de cubierta. Esto resultará en una menor estabilización del globo.
6. Imágenes de muestra
- Encienda el microscopio y la cámara ambiental y verifique que la cámara esté humidificada. Ajuste la cámara ambiental a 35 °C y 5% deCO2 durante la duración del experimento.
NOTA: Los microscopios con cámaras ambientales son preferibles para este procedimiento para prevenir la deshidratación y mantener el globo a temperaturas óptimas, pero no son necesarios. - Coloque el cubreobjetos, el soporte y el globo estabilizado en la etapa del microscopio dentro de la cámara ambiental e imagen utilizando técnicas de imágenes de células vivas9.
- Pipetear medios de crecimiento adicionales en el cubreobjetos para evitar la deshidratación y mantener la viabilidad del tejido. Asegúrese de que haya suficiente medio en el pozo para cubrir el globo en el soporte. Dependiendo de la duración de la imagen, agregue un medio fresco cuando sea necesario durante todo el experimento.
- Comience los experimentos utilizando técnicas y protocolos de imágenes de células vivas. Utilice ajustes de láser de baja potencia para preservar el tejido y prevenir el daño tisular en experimentos de larga duración. Utilice objetivos apropiados para largas distancias de trabajo. Los experimentos en este manuscrito se realizaron utilizando un objetivo 20x.
NOTA: La potencia y ganancia del láser, la duración experimental, la ubicación y el plano de imagen son variables dependiendo de los parámetros experimentales. Los experimentos de imágenes en globos intactos que van de 1 h a 4 h de duración se han realizado con éxito en publicaciones anteriores10. - Grabe y guarde los datos en el formato de archivo preferido. El software utilizado por el microscopio produce archivos .czi para el registro de datos.
- Deseche los globos según los protocolos institucionales estándar al final del protocolo.
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Representative Results
Este protocolo se ha utilizado para producir consistentemente datos e imágenes con calidad de publicación10. Las imágenes obtenidas representan una mejora significativa en comparación con los enfoques anteriores (Figura 2). Usando el soporte impreso en 3D, las imágenes se pueden capturar a través de las capas de la córnea, y se puede observar la movilización de calcio en diferentes planos z (Figura 3). Este enfoque se ha utilizado para comparar la señalización célula-célula entre las capas celulares apicales y basales en una herida en ratones jóvenes y viejos10.
La estabilidad mejorada también ha permitido obtener imágenes de globos durante mucho más tiempo de lo que antes era posible. Esto ha permitido que los estudios de migración celular en el lecho de la herida se extiendan varias horas más allá de las capacidades anteriores. Con esta línea de tiempo extendida, se pueden observar diferencias sustanciales en el comportamiento celular durante la respuesta de cicatrización de heridas entre ratones jóvenes y viejos después de una lesión corneal10. Para este protocolo, los datos fueron recolectados cada 5 min durante 4 h. Al usar el soporte, no se observó una deriva significativa en los planos x, y o z durante el curso del experimento (Figura 4, Video 1).
Una ventaja de este protocolo es que permite obtener imágenes de diferentes regiones de la córnea en función de la colocación del globo terráqueo en el soporte. En una publicación reciente, esta característica fue aprovechada para recolectar imágenes tanto en la córnea central como en la región corneal-limbal (Figura 5)10. Se encontró que una lesión en la córnea central produce eventos de señalización de calcio en células adyacentes a los nervios en la región limbal10. La versatilidad del soporte va más allá de la estabilización del globo para experimentos de imágenes y se ha utilizado para varias aplicaciones diferentes. Al colocar la córnea boca arriba en el soporte, se realizaron experimentos de nanoindentación para medir la rigidez del epitelio corneal, la membrana basal y el estroma en ratones jóvenes y viejos10,11.
Figura 1: Esquemas y configuración del soporte impreso en 3D. (A) Diseño del soporte impreso en 3D con dimensiones anotadas de altura y anchura. (B) Imagen de archivo CAD representativa del software de la impresora 3D. (C) Imagen representativa del soporte con la cubierta adjunta que contiene un globo murino. (D) Se aplica pegamento estéril de un solo uso en la parte inferior del soporte impreso en 3D. (E) El soporte impreso en 3D está adherido a una placa de cultivo celular p35 con fondo de vidrio. (F) Se coloca un globo enucleado en la córnea hacia abajo en el soporte utilizando un gotero estéril para los ojos. (G) La barra de cubierta está adherida a la parte superior del soporte impreso en 3D para garantizar la inmovilización del globo. (H) La placa con fondo de vidrio con un soporte adherido y un globo se coloca en la etapa del microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Uso de soportes impresos en 3D especializados para estabilizar el globo y producir datos de imágenes de mayor calidad de estructuras de varias capas . (A) y (B) representan datos típicos de imágenes en vivo de una córnea ex vivo herida estabilizada sin y con un soporte impreso en 3D, respectivamente. Los eventos de señalización de calcio (verde) y la contratinción celular (tinción de membrana plasmática de color rojo intenso) se pueden identificar claramente en las capas apical, basal y estromal de la córnea en (B) pero no en (A). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pila en Z de una córnea inmovilizada en el soporte impreso en 3D. Imágenes representativas de una pila z tomada a través de las capas de la córnea en una herida por rasguño (denotada con un asterisco blanco). La muestra se tiñe con tinción de membrana plasmática de color rojo intenso para visualizar las membranas celulares y Fluo4-AM (verde) para visualizar la señalización de calcio. (A) La capa celular apical, (B) las células apicales y basales, (C) la capa de células basales y (D) el estroma se pueden ver en el lecho de la herida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Experimento representativo de series temporales de 4 h de una córnea que revela poco movimiento del globo en las direcciones x, y o z. La imagen es de una herida por rasguño (denotada con un asterisco blanco) en la córnea central de un globo murino ex vivo. El globo se tiñe con tinción de membrana plasmática de color rojo intenso para visualizar las membranas celulares y Fluo4-AM (verde) para visualizar eventos de señalización de calcio. El globo se inmoviliza utilizando un soporte impreso en 3D. Las imágenes fueron tomadas con 1 h de diferencia, comenzando 5 minutos después de la lesión. Se observó poca deriva en las direcciones x, y o z utilizando esta configuración de imágenes a lo largo del transcurso del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Diagrama de ubicaciones de imágenes en un globo intacto. El soporte impreso en 3D permite obtener imágenes de un globo terráqueo ex vivo intacto en varios lugares. El soporte se utilizó para recoger imágenes de las regiones central y limbal de la córnea. Los globos se tiñen con tinción de membrana plasmática de color rojo intenso para detectar las membranas celulares y Fluo4-AM (verde) para detectar la señalización de calcio. (A) Imagen representativa de la córnea central en una herida por rasguño. (B) Imagen representativa de la región limbal de la córnea después de una lesión en la córnea central. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: Película de un globo terráqueo inmovilizado en un soporte impreso en 3D durante 4 h. Se inmovilizó un globo con el soporte impreso en 3D y se tiñó con tinción de membrana plasmática de color rojo intenso (rojo) para visualizar las membranas celulares y Fluo4-AM (verde) para visualizar eventos de señalización de calcio. Se tomó una imagen cada 5 minutos durante 4 h, comenzando 5 minutos después de la lesión. Se observó poca deriva en las direcciones x, y o z utilizando esta configuración de imágenes a lo largo del transcurso del experimento. La velocidad de reproducción es de 30 fotogramas por segundo. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Este protocolo describe una técnica de imagen de células vivas que utiliza un soporte impreso en 3D para estabilizar e inmovilizar los ojos intactos de los animales. Está diseñado para eludir varias desventajas significativas reconocidas con protocolos previos de imágenes de células vivas de tejido corneal ex vivo . Este protocolo ofrece muchas ventajas para la obtención de imágenes de células vivas de globos intactos. Reduce significativamente el daño tisular innecesario que podría interferir con la respuesta de cicatrización de heridas a heridas por rasguños inducidas experimentalmente. Esto incluye daño a los nervios y epitelio por disección y exposición a la luz UV. Además, este protocolo facilita la hidratación y viabilidad del tejido al inmovilizar el tejido de una manera que permite que el medio de crecimiento se aplique periódicamente sin interrumpir los experimentos. Al cambiar la orientación del ojo en el soporte, el protocolo permite obtener imágenes de diferentes regiones del globo. El uso de microscopía confocal junto con este protocolo permite la obtención de imágenes de diferentes planos del globo, lo que permite la observación de las interacciones entre las estructuras tisulares. El protocolo es muy versátil y se puede adaptar a globos de varios tamaños de ratones y otras especies. Los soportes y las cubiertas se pueden quitar fácilmente de los pozos de imágenes, esterilizar y reutilizar. El protocolo de impresión 3D es eficiente y efectivo en el tiempo, lo que permite la creación conveniente de muchos soportes a la vez. Los globos terráqueos pueden fijarse dentro de los soportes si las muestras deben conservarse y volver a fotografiarse en una fecha posterior. El tejido fijo retiene la tinción de la membrana plasmática de color rojo intenso y las tinciones de Fluo4-AM durante varias semanas después de la fijación, que pueden usarse como marcadores cuando se tiñen para una proteína específica.
Los protocolos anteriores requerían la disección del ojo y el uso posterior de un gel PEG activado por UV para inmovilizar la córnea para la obtención de imágenes 7,8,9. El daño al tejido incurrido a través de estas técnicas podría confundir los resultados experimentales. Esto es particularmente importante a considerar cuando se estudian los procesos celulares y tisulares involucrados en la cicatrización de heridas, ya que este daño adicional más allá de las heridas aplicadas experimentalmente puede alterar la respuesta de cicatrización de la herida 4,12. La entrada de los nervios corneales sensoriales se verá afectada por el protocolo anterior, ya que el proceso de disección separa los nervios de sus cuerpos celulares en el ganglio trigémino13. Además, la disección de la córnea causaría una respuesta a la lesión, ya que los factores solubles liberados de una lesión son responsables de la respuesta de cicatrización de la herida4. Este nuevo procedimiento aborda estas debilidades al obtener imágenes de los globos intactos. Usando esta metodología, el daño al ojo se limita al corte del nervio óptico tras la enucleación y mantiene la viabilidad celular dentro de la córnea durante largos períodos de tiempo. Juntas, estas mejoras crean una mejor simulación de la respuesta de la herida.
La inmovilización es un paso esencial pero desafiante cuando se trabaja con tejido vivo, ya que debe permanecer viable e hidratado durante todo el transcurso del experimento. Mientras que las córneas y los globos podrían ser asegurados con gel PEG inducido por UV, el procedimiento requiere irradiación UV después de colocar el tejido en el soporte8. Se observó que la irradiación requerida para polimerizar el PEG disminuyó la capacidad de respuesta celular. Además, el PEG disminuyó la resolución de las imágenes, y se requirió la función AiryScan para observar la señalización celular. En este nuevo protocolo, las dimensiones del soporte se optimizan para adaptarse con precisión a los globos, y la barra de cubierta proporciona una capa adicional de inmovilización. El soporte y la barra de cubierta eliminan la necesidad de usar PEG, que produce imágenes de mayor calidad y mayor resolución con imágenes en tiempo real del proceso de curación de heridas. Una solución a los problemas mencionados anteriormente sería renunciar por completo a las imágenes de células vivas y fijar los globos en paraformaldehído (4%) en momentos predeterminados después de la lesión. Sin embargo, con el tejido fijo, no se pueden observar procesos celulares en curso, como la señalización del calcio y los efectos de estos procesos en los cambios físicos en el tejido. Para los grupos interesados en registrar y cuantificar eventos de comunicación entre células en el epitelio corneal, los límites impuestos por la fijación tisular hacen que esta técnica no sea práctica para tales fines.
Este nuevo protocolo tiene dos pasos clave: (1) eutanasia y enucleación inmediata del globo, y (2) posicionamiento y orientación del globo dentro del soporte. El corte del nervio óptico y la enucleación del globo deben realizarse con cuidado proplanzando el ojo sin colocar un aparato ortopédico para preservar las estructuras internas y externas. El posicionamiento y la orientación son necesarios para obtener imágenes de los sitios de interés y garantizar que el mayor campo de visión posible esté enfocado con el detalle adecuado. Es necesaria la colocación correcta del globo antes de aplicar la barra de cubierta al soporte.
Varias variables del protocolo se pueden ajustar dependiendo de los requisitos de los parámetros experimentales. Los soportes se pueden imprimir en diferentes tamaños para acomodar globos de diferentes volúmenes. Los parámetros relativos al diámetro y la altura del soporte en relación con el tamaño del globo siguen siendo los mismos en todos los rangos de tamaño. Si el usuario experimenta deriva en el plano z, la razón potencial podría ser que el tejido no está inmovilizado y el soporte debe volver a fabricarse. La tinción de los globos intactos se puede ajustar dependiendo de los parámetros experimentales, las tinciones utilizadas y el entorno y las concentraciones óptimas para el tejido de interés. La duración experimental se puede ajustar siempre que se mantenga la viabilidad del tejido. Se han realizado con éxito experimentos a corto plazo que implican 1 h de imágenes constantes del tejido y experimentos a largo plazo que implican imágenes del tejido a intervalos regulares en el transcurso de 4 h. Estos experimentos se realizaron en un microscopio invertido, y este protocolo fue diseñado para un uso óptimo con una configuración de imagen similar. Una vez que el globo se estabiliza y se coloca dentro del soporte, la extracción del globo puede provocar daños en los tejidos; Por lo tanto, el posicionamiento y la orientación óptimos del globo antes de colocar la barra de cubierta son esenciales. Los globos se pueden fijar en paraformaldehído al 4% mientras aún están dentro de los soportes para un análisis adicional de la localización de proteínas. Los datos preliminares han demostrado que la tinción de membrana plasmática de color rojo intenso y la tinción de Fluo4-AM se conservan durante el proceso de fijación.
Aunque este protocolo tiene muchas ventajas sobre los protocolos anteriores, existen algunas limitaciones para este enfoque experimental. Una desventaja es que es difícil extraer el globo del soporte sin dañar el epitelio corneal. Por lo tanto, el globo debe fijarse en el soporte para volver a obtener imágenes utilizando métodos de localización de proteínas o ARN en una fecha posterior. Esto puede limitar los estudios de seguimiento. Otra desventaja de este protocolo durante los protocolos de imagen prolongados es que se debe mantener la hidratación. La necesidad de volver a aplicar manualmente los medios a intervalos regulares requiere que alguien supervise activamente el proceso de obtención de imágenes para determinar el alcance del experimento. Esto puede resultar logísticamente desafiante para los protocolos de imágenes extendidos.
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Disclosures
No tenemos conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a los NIH por el siguiente apoyo de subvención: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) y 5T32GM008541-24 (KS). También nos gustaría reconocer al Fondo de Investigación del Ojo de los Leones de Massachusetts y al Fondo de Trasplante de Córnea de Nueva Inglaterra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
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