عزل قطرات الدهون Plastoglobule من أنسجة أوراق النبات والبكتيريا الزرقاء
Summary
يتم تقديم بروتوكول سريع وفعال لعزل قطرات الدهون plastoglobule المرتبطة بالكائنات الحية الضوئية المختلفة. يعد التحضير الناجح للبلازموغلوبولات المعزولة خطوة أولى حاسمة تسبق التحقيقات الجزيئية التفصيلية مثل التحليلات البروتينية والدهون.
Abstract
قطرات الدهون Plastoglobule هي مقصورة فرعية ديناميكية من البلاستيدات الخضراء النباتية والبكتيريا الزرقاء. توجد في كل مكان بين أنواع التمثيل الضوئي ، ويعتقد أنها تلعب دورا مركزيا في تكييف وإعادة تشكيل غشاء الثايلاكويد في ظل ظروف بيئية سريعة التغير. سهلت القدرة على عزل البلاستوغلوبولات عالية النقاء دراستها إلى حد كبير من خلال منهجيات البروتين والدهون وغيرها. مع البلاستوغلوبولات ذات النقاء العالي والعائد ، من الممكن التحقيق في تكوين الدهون والبروتين ، والنشاط الأنزيمي ، وطوبولوجيا البروتين ، من بين الخصائص الجزيئية المحتملة الأخرى. تقدم هذه المقالة بروتوكولا سريعا وفعالا لعزل البلاستوغلوبولات من البلاستوبلاستيدات الخضراء لأنسجة الأوراق النباتية وتقدم اختلافات منهجية لعزل البلاستوغلوبولات وهياكل قطرات الدهون ذات الصلة من أوراق الذرة ، وأنسجة الأوراق المجففة لنبات القيامة ، Eragrostis nindensis ، والبكتيريا الزرقاء ، Synechocystis س. PCC 6803. يعتمد العزل على الكثافة المنخفضة لهذه الجسيمات الغنية بالدهون ، مما يسهل تنقيتها عن طريق تعويم كثافة السكروز. ستثبت هذه المنهجية قيمتها في دراسة البلاستوغلوبولات من الأنواع المتنوعة.
Introduction
ظهر الفهم الحالي لتكوين البلاستوغلوبول ووظيفته من خلال الدراسات التفصيلية للبروتين والدهون1،2،3،4،5. وقد ساعدت مثل هذه الدراسات بشكل كبير من خلال طريقة سريعة وفعالة للعزل تعتمد على كثافتها المنخفضة جدا للفصل الفعال باستخدام تدرجات السكروز. تم تحقيق الطرق الأولية لعزل البلاستوغلوبول من أنواع مثل شجرة الزان (Fagus sylvatica) ، مكنسة سكوتش (Sarothamnus scoparius) ، البصل (Allium cepa) ، السبانخ (Spinacia oleracea) ، بانسي (فيولا الالوان الثلاثة) ، الفلفل (الفليفلة السنوية) ، والبازلاء (Pisum sativum)6،7،8،9،10،11 ، 12،13. تم تقديم طريقة محدثة لعزل البلاستوغلوبولات البلاستوبولية الخضراء بطريقة أكثر كفاءة وأفضل إنتاجية بواسطة Ytterberg et al.3,14. بينما تم توظيفنا في البداية لدراسة البلاستوغلوبولات في البلاستيدات الخضراء لأوراق أرابيدوبسيس ثاليانا ، فقد استخدمنا بنجاح هذه الطريقة المحدثة لأنسجة الأوراق السليمة لأنواع نباتية أخرى ، أحادية الفلقة وثنائية الفلقة ، بما في ذلك الذرة (Zea mays) ، والطماطم (Solanum lycopersicum) ، وعشب الحب (Eragrostis nindensis) ، والبروم الكاذب الأرجواني (Brachypodium distachyon) ، والتبغ البري (Nicotiana benthamiana ; النتائج غير المنشورة). علاوة على ذلك ، تم تكييف طريقة العزل بنجاح مع البلاستوغلوبولات من البكتيريا الزرقاء ، بما في ذلك Synechocystis sp. PCC 6803 و Anabaena sp. PCC 712015 ، وأنسجة الأوراق المجففة لنبات القيامة ، E. nindensis.
ترتبط البلاستيدات الخضراء في أنسجة الأوراق السليمة ماديا بأغشية الثايلاكويد16. على الرغم من هذه الاستمرارية الفيزيائية ، تحافظ المقصورتان الفرعيتان للبلاستيدات الخضراء على تركيبات دهنية وبروتينية مميزة ، على الرغم من اقتراح التبادل المنظم للدهون والبروتين بين الجزأين2،4،17،18،19. في الواقع ، تم اقتراح نموذج نصف نصفي مثير للاهتمام مؤخرا لتهريب الدهون المحايدة بين البلاستيدات الخضراء والسيتوسول19. نظرا للاستمرارية الفيزيائية للبلاستوغلوبولات والثايلاكويدات ، تبدأ طريقة العزل بأنسجة الأوراق السليمة بجمع مستحضر ثايلاكويد خام محبب ، والذي يتم صوتنة لاحقا لفصل البلاستوغلوبولات عن الثايلاكويدات ، وهو ما يتناقض مع الطرق المستخدمة لعزل قطرات الدهون الخلوية20 . ثم يقوم الطرد المركزي الفائق على وسادة السكروز بتعويم البلازموبوليات منخفضة الكثافة عبر السكروز ، مما يفصلها بشكل فعال عن الثايلاكويدات والنوى وغيرها من المواد عالية الكثافة. في المقابل ، من الواضح أن البلاستوغلوبولات في البكتيريا الزرقاء ، وكذلك تلك الموجودة في أنسجة الأوراق المجففة ، موجودة في الجسم الحي في شكل عائم حر. ومن ثم ، فإن عزلتهم تنطوي على الطفو مباشرة على تدرج السكروز. توضح هذه المقالة طريقة العزل عن أنسجة الأوراق السليمة وتوضح كذلك نوعين مختلفين يمكن استخدامهما لعزل البلاستوغلوبولات من أنسجة الأوراق المجففة أو مزارع البكتيريا الزرقاء ، مما يوسع بشكل كبير الاتساع الفسيولوجي والسياق التطوري الذي يمكن فيه دراسة البلاستوغلوبولات.
يمكن لاحقا استخدام البلاستوغلوبولات المعزولة لأي عدد من التحليلات النهائية للتحقيق في الخصائص الجزيئية. لقد استخدمنا البلاستوغلوبولات المعزولة من أنسجة أوراق A. thaliana لإجراء تحليل مكثف للبروتين والدهون في ظل ظروف بيئية أو أنماط وراثية مختلفة ، مما يدل على التعديل الانتقائي لتكوين البروتين والدهون في التكيف مع الإجهاد2،4،21،22. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء فحوصات كيناز في المختبر التي تظهر نشاط الفسفرة العابرة المرتبط بالبلازموغلوبولات المعزولة 22 ، وتم التحقيق في حالات قلة القسيمات لمكونات البروتين باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي الأصلي 21 ، وتم إجراء فحوصات حلاقة البروتياز23.
الفائدة الأساسية لهذه الطريقة هي السرعة النسبية للإجراء. في تجربتنا ، يمكن إكمال البروتوكولات الموضحة أدناه بالكامل في غضون 4 ساعات تقريبا. تم وصف طريقة بديلة لعزل البلاستوغلوبولات من أنسجة الأوراق ، والتي تسمح بالعزل المتزامن للأجزاء الفرعية الأخرى من البلاستيدات الخضراء24. تقدم هذه الطريقة البديلة بعض المزايا الواضحة عندما تكون المقارنة الكمية مع الأجزاء الفرعية الأخرى للبلاستيدات الخضراء ضرورية أو مرغوبة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة البديلة هي أيضا أكثر مملة وستوفر عائدا أقل بكثير من plastoglobules المعزولة من كميات مماثلة من أنسجة الأوراق. عندما يكون الهدف هو إجراء دراسة مركزة للبلاستوغلوبولات ، فإن المنهجية الموضحة هنا هي الخيار الأمثل. ومع ذلك، يمكن جمع إجمالي حصص الأوراق والثايلاكويد الخام أثناء تحضير العينة، ويوصى بشدة بالقيام بذلك، للحصول على عينات مرجعية للمقارنة اللاحقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتقليل التغيرات الفسيولوجية / الكيميائية الحيوية في المادة وحماية بعض أصباغ الدهون الضوئية والحرارية التي تعد مكونا غنيا في البلاستوغلوبولات ، من الأهمية بمكان إجراء العزل عند 4 درجات مئوية ومحمي من الضوء. كما هو موضح أعلاه ، يتم تنفيذ الخطوات الأولية في الغرفة الباردة تحت مصباح أمان باس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم البحث في مجموعة مختبر Lundquist بمنح من NSF (MCB-2034631) ووزارة الزراعة الأمريكية (MICL08607) إلى P.K.L. يشكر المؤلفون الدكتورة كاري هيزر (جامعة ولاية ميشيغان) على دعمها في تطوير طريقة عزل البلاستوغلوبول البكتيري الأزرق.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K. Plastoglobule proteome. Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C., Jarvis, R. P. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
