Plastoglobule Lipid Droplet Isolation van plantaardig bladweefsel en cyanobacteriën
Summary
Een snel en efficiënt protocol wordt gepresenteerd voor de isolatie van plastoglobule lipidedruppels geassocieerd met verschillende fotosynthetische organismen. De succesvolle bereiding van geïsoleerde plastoglobulen is een cruciale eerste stap die voorafgaat aan gedetailleerde moleculaire onderzoeken zoals proteomische en lipidomische analyses.
Abstract
Plastoglobule lipidedruppels zijn een dynamisch subcompartiment van plantaardige chloroplasten en cyanobacteriën. Alomtegenwoordig gevonden onder fotosynthetische soorten, wordt aangenomen dat ze een centrale rol spelen bij de aanpassing en remodellering van het thylakoïde membraan onder snel veranderende omgevingsomstandigheden. Het vermogen om plastoglobulen van hoge zuiverheid te isoleren heeft hun studie aanzienlijk vergemakkelijkt door middel van proteomische, lipidomische en andere methodologieën. Met plastoglobulen van hoge zuiverheid en opbrengst is het mogelijk om hun lipide- en eiwitsamenstelling, enzymatische activiteit en eiwittopologie te onderzoeken, naast andere mogelijke moleculaire kenmerken. Dit artikel presenteert een snel en effectief protocol voor de isolatie van plastoglobulen uit chloroplasten van plantenbladweefsel en presenteert methodologische variaties voor de isolatie van plastoglobulen en gerelateerde lipidedruppelstructuren uit maïsbladeren, het uitgedroogde bladweefsel van de opstandingsplant, Eragrostis nindensis, en de cyanobacterium, Synechocystis SP. PCC 6803. Isolatie is afhankelijk van de lage dichtheid van deze lipiderijke deeltjes, wat hun zuivering door sucrosedichtheidsflotatie vergemakkelijkt. Deze methodologie zal waardevol blijken bij de studie van plastoglobulen van diverse soorten.
Introduction
Het huidige begrip van de samenstelling en functie van plastoglobule is naar voren gekomen door middel van gedetailleerde proteomische en lipidomische studies 1,2,3,4,5. Dergelijke studies zijn enorm geholpen door een snelle en effectieve isolatiemethode die afhankelijk is van hun zeer lage dichtheid voor efficiënte scheiding met behulp van sucrosegradiënten. De eerste methoden voor plastoglobule-isolatie werden bereikt van soorten zoals de beukenboom (Fagus sylvatica), schotse bezem (Sarothamnus scoparius), ui (Allium cepa), spinazie (Spinacia oleracea), viooltje (Viola tricolor), peper (Capsicum annuum) en erwt (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Een bijgewerkte methode om chloroplast plastoglobules op een efficiëntere en beter renderende manier te isoleren werd later gepresenteerd door Ytterberg et al.3,14. Hoewel we aanvankelijk werden gebruikt voor de studie van de plastoglobulen van Arabidopsis thaliana bladchloroplasten, hebben we deze bijgewerkte methode met succes gebruikt voor het gezonde bladweefsel van andere plantensoorten, zowel eenzaadlobbige als tweezaadlobbige, waaronder maïs (Zea mays), tomaat (Solanum lycopersicum), liefdesgras (Eragrostis nindensis), paars vals brome (Brachypodium distachyon) en wilde tabak (Nicotiana benthamiana ; niet-gepubliceerde resultaten). Bovendien is de isolatiemethode met succes aangepast aan de plastoglobulen van cyanobacteriën, waaronder Synechocystis sp. PCC 6803 en Anabaena sp. PCC 712015, en het uitgedroogde bladweefsel van de opstandingsplant, E. nindensis.
Chloroplast plastoglobulen van gezond bladweefsel zijn fysiek verbonden met de thylakoïde membranen16. Ondanks deze fysieke continuïteit behouden de twee chloroplast-subcompartimenten verschillende lipide- en eiwitsamenstellingen, hoewel de gereguleerde uitwisseling van lipide en eiwit tussen de twee compartimenten is voorgesteld 2,4,17,18,19. In feite is onlangs een interessant hemifusiemodel voorgesteld voor de handel in neutrale lipiden tussen chloroplasten en cytosol19. Vanwege de fysieke continuïteit van plastoglobulen en thylakoïden begint de isolatiemethode met gezond bladweefsel met het verzamelen van een gepelletiseerd ruw thylakoïdepreparaat, dat vervolgens wordt gesoniseerd om de plastoglobulen van de thylakoïden te scheiden, wat in tegenstelling is tot methoden die worden gebruikt voor het isoleren van cytosolische lipidedruppels20 . Ultracentrifugatie op een sucrosekussen drijft vervolgens de plastoglobulen met lage dichtheid omhoog door de sucrose, waardoor ze effectief worden gescheiden van de thylakoïden, kernen en ander materiaal met hoge dichtheid. Plastoglobulen in cyanobacteriën, evenals die van uitgedroogd bladweefsel, bestaan daarentegen blijkbaar in vivo in een vrij zwevende vorm. Vandaar dat hun isolatie direct op een sucrosegradiënt drijft. Dit artikel demonstreert de isolatiemethode van gezond bladweefsel en demonstreert verder twee variaties die kunnen worden gebruikt om plastoglobulen te isoleren uit uitgedroogd bladweefsel of cyanobacteriële culturen, waardoor de fysiologische breedte en evolutionaire context waarin plastoglobules kunnen worden bestudeerd, aanzienlijk wordt uitgebreid.
Geïsoleerde plastoglobulen kunnen vervolgens worden gebruikt voor een willekeurig aantal downstream-analyses om moleculaire kenmerken te onderzoeken. We hebben de geïsoleerde plastoglobulen uit A. thaliana bladweefsel gebruikt voor uitgebreide proteomische en lipidomische analyse onder verschillende omgevingsomstandigheden of genotypen, wat de selectieve modificatie van eiwit- en lipidesamenstelling in aanpassing aan stress 2,4,21,22 aantoont. Daarnaast zijn in vitro kinase-assays uitgevoerd die transfosforyleringsactiviteit geassocieerd met geïsoleerde plastoglobules aantonen22, zijn de oligomere toestanden van eiwitcomponenten onderzocht met behulp van native gel-elektroforese 21 en zijn protease-scheertests uitgevoerd23.
Het belangrijkste voordeel van deze methode is de relatieve snelheid van de procedure. Onze ervaring is dat de onderstaande protocollen binnen ongeveer 4 uur volledig kunnen worden voltooid. Er is een alternatieve methode beschreven om plastoglobulen uit bladweefsel te isoleren, waardoor de gelijktijdige isolatie van andere chloroplast-subcompartimentenmogelijk is 24. Deze alternatieve methode biedt een aantal duidelijke voordelen wanneer kwantitatieve vergelijking met de andere chloroplast subcompartimenten noodzakelijk of gewenst is. Deze alternatieve methode is echter ook vervelender en zal een aanzienlijk lagere opbrengst van geïsoleerde plastoglobulen uit vergelijkbare hoeveelheden bladweefsel opleveren. Wanneer een gerichte studie van plastoglobules het doel is, is de hier geschetste methodologie de optimale keuze. Niettemin kunnen tijdens de monstervoorbereiding totaal blad- en ruwe thylakoïde-aliquots worden verzameld, en het wordt ten zeerste aanbevolen om referentiemonsters te hebben voor latere vergelijking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om fysiologische /biochemische veranderingen in het materiaal te minimaliseren en bepaalde foto- en thermolabiele prenyllipidepigmenten te beschermen die een rijk bestanddeel van plastoglobulen vormen, is het van cruciaal belang om de isolatie uit te voeren bij 4 °C en beschermd tegen licht. Zoals hierboven aangegeven, worden de eerste stappen uitgevoerd in de koelcel onder een veiligheidslamp met behulp van een groenuitstralende gloeilamp. De volgende stappen die in het laboratorium worden uitgevoerd, zijn onder gedimd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek in de Lundquist labgroep wordt ondersteund door subsidies van de NSF (MCB-2034631) en USDA (MICL08607) aan P.K.L. De auteurs bedanken Dr. Carrie Hiser (MSU) voor de steun bij de ontwikkeling van de cyanobacteriële plastoglobule isolatiemethode.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K. Plastoglobule proteome. Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C., Jarvis, R. P. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
