בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה
Summary
פרוטוקול מהיר ויעיל מוצג לבידוד של טיפות שומנים plastoglobule הקשורים אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים. הכנה מוצלחת של פלסטוגלובולים מבודדים היא צעד ראשון מכריע שקדם למחקרים מולקולריים מפורטים כגון ניתוחים פרוטאומיים וליפידומיים.
Abstract
טיפות שומנים פלסטוגלובול הן תת-תא דינמי של כלורופלסטים צמחיים וציאנובקטריה. הם נמצאים בכל מקום בקרב מינים פוטוסינתטיים, ומאמינים שהם ממלאים תפקיד מרכזי בהסתגלות ובשיפוץ של קרום התילקואיד בתנאי סביבה המשתנים במהירות. היכולת לבודד פלסטוגלובולים בעלי טוהר גבוה הקלה מאוד על מחקרם באמצעות מתודולוגיות פרוטאומיות, ליפידומיות ואחרות. עם plastoglobules של טוהר גבוה ותשואה, ניתן לחקור את הרכב השומנים והחלבונים שלהם, פעילות אנזימטית, טופולוגיה חלבון, בין מאפיינים מולקולריים אפשריים אחרים. מאמר זה מציג פרוטוקול מהיר ויעיל לבידוד פלסטוגלובולים מכלורופלסטים של רקמת עלה צמחי ומציג וריאציות מתודולוגיות לבידוד של פלסטוגלובולים ומבני טיפות שומנים קשורים מעלי תירס, רקמת העלה המיובשת של צמח התחייה, Eragrostis nindensis, והציאנובקטריום, סינכוציסטיס sp. PCC 6803. הבידוד מסתמך על הצפיפות הנמוכה של חלקיקים עשירים בשומנים אלה, מה שמקל על טיהורם על ידי ציפה בצפיפות סוכרוז. מתודולוגיה זו תוכיח את עצמה כבעלת ערך בחקר פלסטוגלובולים ממינים מגוונים.
Introduction
ההבנה הנוכחית של הרכב ותפקוד הפלסטוגלובול התפתחה באמצעות מחקרים פרוטאומיים וליפידומיים מפורטים 1,2,3,4,5. מחקרים כאלה נעזרו רבות בשיטת בידוד מהירה ויעילה המסתמכת על צפיפותם הנמוכה מאוד להפרדה יעילה באמצעות שיפועים של סוכרוז. שיטות ראשוניות לבידוד פלסטוגלובול הושגו ממינים כגון עץ האשור (Fagus sylvatica), מטאטא סקוטי (Sarothamnus scoparius), בצל (Allium cepa), תרד (Spinacia oleracea), פאנסי (ויולה טריקולור), פלפל (Capsicum annuum) ואפונה (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. שיטה מעודכנת לבידוד פלסטוגלובולים של כלורופלסט בצורה יעילה יותר ומניבה טוב יותר הוצגה מאוחר יותר על ידי Ytterberg et al.3,14. בעוד שבתחילה נעשה שימוש במחקר של פלסטוגלובולים של כלורופלסטים מעלי אראבידופסיס טליאנה, השתמשנו בהצלחה בשיטה מעודכנת זו לרקמת העלים הבריאה של מיני צמחים אחרים, הן מונוקוט והן דיקוט, כולל תירס (Zea mays), עגבנייה (Solanum lycopersicum), עשב אהבה (Eragrostis nindensis)), ברום מזויף סגול (Brachypodium distachyon) וטבק בר (Nicotiana benthamiana) ; תוצאות שלא פורסמו). יתר על כן, שיטת הבידוד הותאמה בהצלחה לפלסטוגלובולים של ציאנובקטריה, כולל Synechocystis sp. PCC 6803 ו– Anabaena sp. PCC 712015, ורקמת העלה המיובשת של צמח התחייה, E. nindensis.
פלסטוגלובולים של כלורופלסט של רקמת עלים בריאה מחוברים פיזית לקרום התילקואיד16. למרות ההמשכיות הפיזיקלית הזו, שני תתי-התאים של כלורופלסט שומרים על הרכבי שומנים וחלבונים נפרדים, אם כי חילופי השומנים והחלבון המוסדרים בין שני התאים הוצעו 2,4,17,18,19. למעשה, מודל hemifusion מעניין הוצע לאחרונה לסחר של שומנים ניטרליים בין chloroplasts ו cytosol19. בשל ההמשכיות הפיזית של פלסטוגלובולים ותילאקואידים, שיטת הבידוד עם רקמת עלה בריאה מתחילה באיסוף של הכנת thylakoid גולמית כדורית, אשר לאחר מכן sonicated כדי להפריד את plastoglobules מן thylakoids, אשר בניגוד לשיטות המשמשות לבידוד טיפות שומנים ציטוזוליים20 . לאחר מכן, האולטרה-צנטריפוגציה על כרית סוכרוז מרחפת את הפלסטוגלובולים בעלי הצפיפות הנמוכה כלפי מעלה דרך הסורוז, ומפרידה אותם למעשה מהתילקואידים, הגרעינים וחומרים אחרים בעלי צפיפות גבוהה. לעומת זאת, פלסטוגלובולים בציאנובקטריה, כמו גם אלה של רקמת עלים מיובשים, קיימים ככל הנראה in vivo בצורה צפה חופשית. לפיכך, הבידוד שלהם כרוך בציפה ישירה על שיפוע סוכרוז. מאמר זה מדגים את שיטת הבידוד מרקמת עלה בריאה ומדגים עוד יותר שתי וריאציות שניתן להשתמש בהן כדי לבודד פלסטוגלובולים מרקמת עלים מיובשים או מתרביות ציאנובקטריאליות, ומרחיב מאוד את הרוחב הפיזיולוגי ואת ההקשר האבולוציוני שבו ניתן לחקור פלסטוגלובולים.
לאחר מכן ניתן להשתמש בפלסטוגלובולים מבודדים לכל מספר של ניתוחים במורד הזרם כדי לחקור מאפיינים מולקולריים. השתמשנו בפלסטוגלובולים המבודדים מרקמת עלי A. thaliana לניתוח פרוטאומי וליפידומי נרחב בתנאי סביבה או גנוטיפים שונים, המדגימים את השינוי הסלקטיבי של הרכב החלבון והשומנים בהתאמה ללחץ 2,4,21,22. בנוסף, בוצעו מבחני קינאז במבחנה המדגימים פעילות טרנס-זרחון הקשורה לפלסטוגלובולים מבודדים 22, המצבים האוליגומריים של רכיבי חלבון נחקרו באמצעות אלקטרופורזה מקומית בג’ל 21, ומבחני גילוח פרוטאז בוצעו23.
היתרון העיקרי של שיטה זו הוא המהירות היחסית של ההליך. מניסיוננו, ניתן להשלים את הפרוטוקולים המפורטים להלן במלואם תוך כ-4 שעות. תוארה שיטה חלופית לבידוד פלסטוגלובולים מרקמת העלה, המאפשרת בידוד סימולטני של תת-תאים אחרים של כלורופלסט24. שיטה חלופית זו מציעה כמה יתרונות ברורים כאשר יש צורך או רצוי בהשוואה כמותית לשאר תתי-תאי הכלורופלסט. עם זאת, שיטה חלופית זו היא גם מייגעת יותר ותספק תשואה נמוכה משמעותית של פלסטוגלובולים מבודדים מכמויות דומות של רקמת עלה. כאשר מחקר ממוקד של פלסטוגלובולים הוא המטרה, המתודולוגיה המתוארת כאן היא הבחירה האופטימלית. עם זאת, ניתן לאסוף את סך כל העלים ואת האליקוטים הגולמיים של thylakoid במהלך הכנת הדגימה, ומומלץ מאוד לעשות זאת, כדי לקבל דגימות ייחוס להשוואה הבאה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי למזער את השינויים הפיזיולוגיים/ביוכימיים בחומר ולהגן על פיגמנטים מסוימים של פרניל ליפידים פוטו-לביליים ותרמו-לביליים שהם מרכיב עשיר של פלסטוגלובולים, חיוני לבצע את הבידוד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור. כפי שצוין לעיל, הצעדים הראשונים מבוצעים בחדר הקירור תחת מנורת בטיחות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר בקבוצת המעבדה של לונדקוויסט נתמך על ידי מענקים מה-NSF (MCB-2034631) ו-USDA (MICL08607) ל-P.K.L. המחברים מודים לד”ר קארי הייזר (MSU) על התמיכה בפיתוח שיטת הבידוד של פלסטוגלובול ציאנובקטריאלי.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K. Plastoglobule proteome. Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C., Jarvis, R. P. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. , 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P., Pazour, G. J., King, S. M. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. 92, 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
