Isolamento di goccioline lipidiche plastoglobule dal tessuto fogliare vegetale e cianobatteri
Summary
Viene presentato un protocollo rapido ed efficiente per l’isolamento delle goccioline lipidiche di plastoglobulo associate a vari organismi fotosintetici. Il successo della preparazione di plastoglobuli isolati è un primo passo cruciale che precede indagini molecolari dettagliate come analisi proteomiche e lipidomiche.
Abstract
Le goccioline lipidiche dei plastoglobuli sono un sottocompartimento dinamico dei cloroplasti vegetali e dei cianobatteri. Trovati ovunque tra le specie fotosintetiche, si ritiene che svolgano un ruolo centrale nell’adattamento e nel rimodellamento della membrana tilacoide in condizioni ambientali in rapida evoluzione. La capacità di isolare plastoglobuli di elevata purezza ha notevolmente facilitato il loro studio attraverso metodologie proteomiche, lipidomiche e di altro tipo. Con plastoglobuli di elevata purezza e resa, è possibile studiare la loro composizione lipidica e proteica, l’attività enzimatica e la topologia proteica, tra le altre possibili caratteristiche molecolari. Questo articolo presenta un protocollo rapido ed efficace per l’isolamento dei plastoglobuli dai cloroplasti del tessuto fogliare delle piante e presenta variazioni metodologiche per l’isolamento dei plastoglobuli e delle relative strutture di goccioline lipidiche dalle foglie di mais, dal tessuto fogliare essiccato della pianta della resurrezione, Eragrostis nindensis, e dal cianobatterio, Synechocystis PCC 6803. L’isolamento si basa sulla bassa densità di queste particelle ricche di lipidi, che facilita la loro purificazione mediante flottazione della densità del saccarosio. Questa metodologia si rivelerà preziosa nello studio dei plastoglobuli di diverse specie.
Introduction
L’attuale comprensione della composizione e della funzione dei plastoglobuli è emersa attraverso studi proteomici e lipidomici dettagliati 1,2,3,4,5. Tali studi sono stati notevolmente aiutati da un metodo rapido ed efficace di isolamento che si basa sulla loro bassissima densità per una separazione efficiente utilizzando gradienti di saccarosio. I metodi iniziali di isolamento dei plastoglobuli sono stati ottenuti da specie come il faggio (Fagus sylvatica), la ginestra scozzese (Sarothamnus scoparius), la cipolla (Allium cepa), gli spinaci (Spinacia oleracea), la viola del pensiero (Viola tricolor), il pepe (Capsicum annuum) e il pisello (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Un metodo aggiornato per isolare i plastoglobuli cloroplasti in modo più efficiente e con un rendimento migliore è stato successivamente presentato da Ytterberg et al.3,14. Mentre inizialmente impiegato per lo studio dei plastoglobuli dei cloroplasti fogliari di Arabidopsis thaliana, abbiamo impiegato con successo questo metodo aggiornato per il tessuto fogliare sano di altre specie vegetali, sia monocotiledoni che dicotiledoni, tra cui mais (Zea mays), pomodoro (Solanum lycopersicum), erba d’amore (Eragrostis nindensis), falso bromo viola (Brachypodium distachyon) e tabacco selvatico (Nicotiana benthamiana) ; risultati non pubblicati). Inoltre, il metodo di isolamento è stato adattato con successo ai plastoglobuli dei cianobatteri, tra cui Synechocystis sp. PCC 6803 e Anabaena sp. PCC 712015, e al tessuto fogliare essiccato della pianta di resurrezione, E. nindensis.
I plastoglobuli cloroplasti del tessuto fogliare sano sono fisicamente collegati alle membrane tilacoidi16. Nonostante questa continuità fisica, i due sottocompartimenti cloroplasti mantengono composizioni lipidiche e proteiche distinte, sebbene sia stato proposto lo scambio regolato di lipidi e proteine tra i due compartimenti 2,4,17,18,19. Infatti, è stato recentemente proposto un interessante modello di emifusione per il traffico di lipidi neutri tra cloroplasti e citosol19. A causa della continuità fisica dei plastoglobuli e dei tilacoidi, il metodo di isolamento con tessuto fogliare sano inizia con la raccolta di un preparato di tilacoidi grezzi pellettati, che viene successivamente sonicato per separare i plastoglobuli dai tilacoidi, che è in contrasto con i metodi utilizzati per isolare le goccioline lipidiche citosoliche20 . L’ultracentrifugazione su un cuscino di saccarosio fa quindi galleggiare i plastoglobuli a bassa densità attraverso il saccarosio, separandoli efficacemente dai tilacoidi, dai nuclei e da altro materiale ad alta densità. Al contrario, i plastoglobuli nei cianobatteri, così come quelli del tessuto fogliare essiccato, esistono evidentemente in vivo in una forma fluttuante. Quindi, il loro isolamento comporta direttamente il galleggiamento su un gradiente di saccarosio. Questo articolo dimostra il metodo di isolamento dal tessuto fogliare sano e dimostra ulteriormente due varianti che possono essere utilizzate per isolare plastoglobuli da tessuto fogliare essiccato o colture cianobatteriche, espandendo notevolmente l’ampiezza fisiologica e il contesto evolutivo in cui i plastoglobuli possono essere studiati.
I plastoglobuli isolati possono successivamente essere utilizzati per qualsiasi numero di analisi a valle per studiare le caratteristiche molecolari. Abbiamo utilizzato i plastoglobuli isolati dal tessuto fogliare di A. thaliana per estese analisi proteomiche e lipidomiche in diverse condizioni ambientali o genotipi, dimostrando la modificazione selettiva della composizione proteica e lipidica in adattamento allo stress 2,4,21,22. Inoltre, sono stati eseguiti saggi chinasici in vitro che dimostrano attività di trans-fosforilazione associata a plastoglobuli isolati 22, gli stati oligomerici dei componenti proteici sono stati studiati utilizzando l’elettroforesi su gel nativa 21 e sono stati eseguiti saggi di rasatura della proteasi23.
Il vantaggio principale di questo metodo è la velocità relativa della procedura. Nella nostra esperienza, i protocolli descritti di seguito possono essere completati completamente entro circa 4 ore. È stato descritto un metodo alternativo per isolare i plastoglobuli dal tessuto fogliare, che consente l’isolamento simultaneo di altri sottocompartimenti del cloroplasto24. Questo metodo alternativo offre alcuni chiari vantaggi quando è necessario o desiderato un confronto quantitativo con gli altri sottocompartimenti del cloroplasto. Tuttavia, questo metodo alternativo è anche più noioso e fornirà una resa significativamente inferiore di plastoglobuli isolati da quantità comparabili di tessuto fogliare. Quando l’obiettivo è uno studio mirato dei plastoglobuli, la metodologia qui delineata è la scelta ottimale. Tuttavia, durante la preparazione del campione è possibile raccogliere aliquote totali di foglie e tilacoidi grezzi ed è altamente raccomandato di farlo, per avere campioni di riferimento per il successivo confronto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per ridurre al minimo le alterazioni fisiologiche/biochimiche del materiale e proteggere alcuni pigmenti foto- e termo-labili-lipidici che sono un ricco componente dei plastoglobuli, è fondamentale eseguire l’isolamento a 4 °C e al riparo dalla luce. Come indicato sopra, i passaggi iniziali vengono eseguiti nella cella frigorifera sotto una lampada di sicurezza utilizzando una lampadina a emissione verde. Le fasi successive eseguite in laboratorio sono sotto luci soffuse e utilizzano ghiaccio o centrifugazione refriger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca nel gruppo di laboratorio di Lundquist è supportata da sovvenzioni NSF (MCB-2034631) e USDA (MICL08607) a P.K.L. Gli autori ringraziano la dott.ssa Carrie Hiser (MSU) per il supporto nello sviluppo del metodo di isolamento dei plastoglobuli cianobatterici.
Materials
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
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