Summary
Um protocolo rápido e eficiente é apresentado para o isolamento de gotículas lipídicas de plastoglobule associadas a vários organismos fotossintéticos. A preparação bem-sucedida de plastoglóbulos isolados é um primeiro passo crucial que precede investigações moleculares detalhadas, como análises proteômicas e lipidômicas.
Abstract
As gotículas lipídicas de platoglobulos são um subcompartimento dinâmico de cloroplastos vegetais e cianobactérias. Encontrados de forma onipresente entre as espécies fotossintéticas, acredita-se que eles sirvam a um papel central na adaptação e remodelação da membrana tilacóide sob condições ambientais em rápida mudança. A capacidade de isolar plastoglóbulos de alta pureza facilitou muito seu estudo através de metodologias proteômicas, lipidômicas e outras. Com plastoglóbulos de alta pureza e rendimento, é possível investigar sua composição lipídica e proteica, atividade enzimática e topologia proteica, entre outras possíveis características moleculares. Este artigo apresenta um protocolo rápido e eficaz para o isolamento de plastoglóbulos de cloroplastos de tecido foliar vegetal e apresenta variações metodológicas para o isolamento de plastoglóbulos e estruturas de gotículas lipídicas relacionadas de folhas de milho, do tecido foliar desidratado da planta da ressurreição, Eragrostis nindensis, e da cianobactéria, Synechocystis PCC 6803. O isolamento depende da baixa densidade dessas partículas ricas em lipídios, o que facilita sua purificação pela flotação da densidade de sacarose. Esta metodologia será valiosa no estudo de plastoglobules de diversas espécies.
Introduction
A compreensão atual da composição e função dos plastoglóbulos emergiu por meio de estudos proteômicos e lipidômicos detalhados 1,2,3,4,5. Tais estudos têm sido grandemente auxiliados por um método rápido e eficaz de isolamento que se baseia em sua densidade muito baixa para uma separação eficiente usando gradientes de sacarose. Os métodos iniciais de isolamento de plastoglobulos foram obtidos a partir de espécies como faia (Fagus sylvatica), vassoura-escocesa (Sarothamnus scoparius), cebola (Allium cepa), espinafre (Spinacia oleracea), pansy (Viola tricolor), pimenta (Capsicum annuum) e ervilha (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. Um método atualizado para isolar plastoglóbulos de cloroplasto de forma mais eficiente e melhor produtiva foi posteriormente apresentado por Ytterberg et al.3,14. Embora inicialmente empregado para o estudo dos plastoglóbulos dos cloroplastos foliares de Arabidopsis thaliana, empregamos com sucesso este método atualizado para o tecido foliar saudável de outras espécies vegetais, tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas, incluindo milho (Zea mays), tomate (Solanum lycopersicum), capim-do-amor (Eragrostis nindensis), bromo falso roxo (Brachypodium distachyon) e tabaco selvagem (Nicotiana benthamiana) ; resultados não publicados). Além disso, o método de isolamento foi adaptado com sucesso aos plastoglóbulos de cianobactérias, incluindo Synechocystis sp. PCC 6803 e Anabaena sp. PCC 712015, e o tecido foliar dessecado da planta da ressurreição, E. nindensis.
Os plastoglóbulos de cloroplasto do tecido foliar saudável estão fisicamente conectados às membranas tilacóides16. Apesar dessa continuidade física, os dois subcompartimentos do cloroplasto mantêm composições lipídicas e proteicas distintas, embora a troca regulada de lipídios e proteínas entre os dois compartimentos tenha sido proposta 2,4,17,18,19. De fato, um interessante modelo de hemifusão foi recentemente proposto para o tráfico de lipídios neutros entre cloroplastos e citosol19. Devido à continuidade física de plastoglobules e tilacóides, o método de isolamento com tecido foliar saudável inicia-se com a coleta de uma preparação tilacóide bruta peletizada, que é posteriormente sonicada para separar os plastoglóbulos dos tilacóides, o que contrasta com os métodos utilizados para isolar gotículas lipídicas citosólicas20 . A ultracentrifugação em uma almofada de sacarose então flutua os plastoglóbulos de baixa densidade através da sacarose, separando-os efetivamente dos tilacóides, núcleos e outros materiais de alta densidade. Em contraste, plastoglóbulos em cianobactérias, bem como os de tecido foliar dessecado, evidentemente existem in vivo em uma forma flutuante. Assim, seu isolamento envolve flutuar diretamente em um gradiente de sacarose. Este artigo demonstra o método de isolamento do tecido foliar saudável e demonstra ainda duas variações que podem ser usadas para isolar plastoglóbulos de tecidos foliares desidratados ou culturas de cianobactérias, expandindo grandemente a amplitude fisiológica e o contexto evolutivo em que os plastoglóbulos podem ser estudados.
Plastoglobules isolados podem posteriormente ser usados para qualquer número de análises a jusante para investigar características moleculares. Utilizamos os plastoglóbulos isolados do tecido foliar de A. thaliana para extensa análise proteômica e lipidômica sob diferentes condições ambientais ou genótipos, demonstrando a modificação seletiva da composição proteica e lipídica em adaptação ao estresse 2,4,21,22. Além disso, ensaios de quinase in vitro que demonstram atividade de transfosforilação associada a plastoglóbulos isolados foram realizados22, os estados oligoméricos de componentes proteicos foram investigados usando eletroforese em gel nativa 21 e ensaios de barbear de protease foram realizados23.
O principal benefício deste método é a velocidade relativa do procedimento. Em nossa experiência, os protocolos descritos abaixo podem ser totalmente concluídos em aproximadamente 4 h. Um método alternativo para isolar plastoglóbulos do tecido foliar tem sido descrito, o que permite o isolamento simultâneo de outros subcompartimentos de cloroplasto24. Este método alternativo oferece algumas vantagens claras quando a comparação quantitativa com os outros subcompartimentos de cloroplasto é necessária ou desejada. No entanto, este método alternativo também é mais tedioso e proporcionará um rendimento significativamente menor de plastoglóbulos isolados de quantidades comparáveis de tecido foliar. Quando um estudo focado de plastoglobules é o objetivo, a metodologia descrita aqui é a escolha ideal. No entanto, as alíquotas totais foliares e tilacóides brutas podem ser coletadas durante a preparação da amostra, e é altamente recomendável fazê-lo, para ter amostras de referência para posterior comparação.
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Protocol
1. Isolamento bruto de plastoglobule
- Extração bruta de plastoglobulos de tecido foliar de milho não estressado
- Adquira seis mudas de milho saudáveis com aproximadamente 3 semanas de idade e quase no estágio de crescimento V5, pesando aproximadamente 120 g.
- Corte todas as folhas na base do caule, mergulhe-as rapidamente em um banho de gelo e transporte para a câmara fria.
- Trabalhando sob uma lâmpada de segurança verde, remova as folhas de milho do banho de gelo e corte-as em pedaços menores (cerca de 5 cm x 5 cm) usando uma tesoura.
- Moer suavemente, mas completamente, metade do tecido foliar cortado em liquidificador comercial em 350 mL de tampão de moagem (Tabela 1). Start-stop do liquidificador 5x-6x para garantir que todas as folhas sejam cortadas. Não use mais do que o nível 7 no liquidificador.
- Filtrar o homogeneizado através de uma camada de pano de nylon de 25 μm num funil grande em quatro frascos de centrífuga de 250 ml. Em seguida, repita o passo 1.1.4 com a segunda metade do tecido foliar cortado.
- Dividir uniformemente o filtrado entre os quatro frascos e centrifugar durante 6 minutos a 1.840 x g a 4 °C. Retirar uma alíquota do filtrado foliar e retirá-la antes da centrifugação para ser armazenada como uma amostra foliar total representativa.
- Despeje o sobrenadante resultante e ressuscite suavemente o pellet em 12 mL de meio R 0,2 contendo 0,2 M de sacarose (Tabela 1), girando e ressuspendendo com movimentos suaves da escova. Depois de ressuspender cada pellet, carregue a suspensão para o frasco seguinte e repita a ressuspensão. Junte as suspensões em uma garrafa.
- Distribuir a suspensão agrupada entre seis tubos ultracentrífugos de 3 mL, atingindo um volume máximo de 2,5 mL em cada tubo.
- Sonicate cada tubo 4x, por 10 s de cada vez, usando um sonicator de ponta a uma amplitude de 100%. Tenha cuidado para manter o chifre do sonicator submerso e longe da superfície líquida para evitar a formação de espuma.
- Mova lentamente a buzina do sonicator para cima e para baixo dentro da suspensão durante cada rodada. Alterne entre os quatro tubos, devolvendo cada tubo a um balde de gelo após cada sonicação para permitir que a amostra esfrie.
- Centrifugar a suspensão tilacóide bruta sonicated a 150.000 x g durante 30 min a 4 °C. Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos brutos da superfície da almofada de sacarose (prontamente vista como uma almofada amarela e oleosa) usando uma seringa e uma agulha 22 G, roçando a superfície da almofada com a abertura da agulha, recuperando aproximadamente 500 μL de cada tubo. Deposite em um tubo de 2,0 mL.
- Coletar alíquotas do tilacoide bruto antes e após a sonicação e liberação de plastoglobules. Continue para a etapa 2.1. Alternativamente, armazene os plastoglóbulos brutos a -80 °C e purifique mais tarde.
- Extração bruta de plastoglobulos de tecido foliar desidratado de E. nindensis
- Adquira um vaso (composto por três plantas individuais por vaso) de E. nindensis totalmente desidratada, de 8 a 9 semanas de idade (quase 40 g de tecido).
- Retire todo o tecido foliar da base da planta, logo acima do solo, usando uma tesoura e mergulhe imediatamente o tecido em um banho de gelo. Transporte o tecido para a câmara fria.
- Trabalhando sob uma lâmpada de segurança verde, corte o E. nindensis sai em pedaços menores (em torno de 5 cm x 5 cm) usando tesoura.
- Moer suavemente, mas bem, as folhas com 100 mL de tampão de moagem (Tabela 1) em um liquidificador comercial. Ligue o liquidificador várias vezes para garantir que todas as folhas estão sendo cortadas. Não use mais do que o nível 7 no liquidificador.
- Filtrar o homogeneizado através de uma camada de pano de nylon de 25 μm num funil grande para um balão cónico de 250 ml. Retirar uma alíquota do filtrado foliar e retirá-la antes da centrifugação para ser armazenada como uma amostra foliar total representativa.
- Adicionar a quantidade adequada de sacarose para levar a uma concentração final de 0,5 M e distribuir a solução em tubos de centrífuga de 250 ml.
NOTA: Uma maior concentração de sacarose em comparação com a preparação de Z. mays é usada para garantir a flutuação das gotículas lipídicas citosólicas antes da subsequente sonicação/liberação dos plastoglóbulos ligados ao tilacóide. - Centrifugar os tubos a 45.000 x g durante 30 min a 4 °C. Uma mistura de plastoglóbulos e gotículas lipídicas citosólicas será prontamente vista como uma almofada amarela e oleosa sobre ou perto da superfície da almofada de sacarose (Figura 1B). Recolha o material flutuante utilizando uma seringa com uma agulha de 22 G, roçando a superfície da almofada com a abertura da agulha e deposite num tubo.
- Rejeitar o sobrenadante restante após a recolha da mistura de plastoglobule/gotículas lipídicas flutuantes.
- Para isolar os plastoglóbulos conectados ao tilacóide residual, ressussuscite o pellet em 12 mL de R 0,2 médio rodopiando e ressuspendendo com movimentos suaves da escova. Junte as suspensões em uma garrafa. Continue para a etapa 1.1.8.
- Extração bruta de plastoglobulos a partir de cianobactérias
- Cultivar uma cultura de 50 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 para a fase estacionária (cerca de 7-10 dias) e ajustar a densidade celular para uma OD750 de 2,0 usando um espectrofotômetro. Para condições de cultura, use meios BG-11 e cresça em uma incubadora a uma intensidade de luz de 150 μmol de fótons/m 2/s, 2% de CO2, 32 °C e com agitação contínua a 150 rpm.
- Para remover os polissacarídeos, lavar as células centrifugando a cultura de 50 mL a 6.000 x g por 45 min a 4 °C e, posteriormente, removendo o sobrenadante. Continue lavando as células duas vezes em 50 mL de tampão A (Tabela 1). Remover uma alíquota do homogeneizado celular e retirá-la antes da centrifugação para ser armazenada como uma amostra de célula total representativa
- Ressuspeite o pellet lavado em 25 mL de tampão A e quebre as células usando uma célula de pressão francesa a 1.100 psi, repetindo o processo 3x (coloque a amostra no gelo entre cada ciclo para evitar a desnaturação da proteína) até que a cor lisada mude de verde para vermelho-azul-verde sob luz branca. Use uma célula pré-resfriada e execute esta etapa na câmara fria.
- Distribuir o homogeneizado resultante entre oito tubos ultracentrífugos de 3 mL preenchidos até um máximo de 2,5 mL em cada tubo e, em seguida, sobrepor cuidadosamente com 400 μL de R médio, produzindo um gradiente de degraus.
NOTA: Consulte Yang, et al. e Kelekar, et al. para descrições detalhadas da preparação do gradiente de sacarose25,26. - Equilibre cuidadosamente os tubos adicionando o meio R adicional, conforme necessário, e centrifugar durante 30 minutos a 150.000 x g a 4 °C. O tilacóide e outras organelas mais pesadas (incluindo quaisquer corpos de polihidroxialcanoato) serão pellets, enquanto os plastoglóbulos serão prontamente vistos como uma almofada amarela e oleosa sobre ou perto do topo do gradiente de sacarose (Figura 1C).
- Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos brutos com uma seringa e agulha 22G e deposite em um tubo de 2 mL. Raspe os plastoglóbulos do lado da parede do tubo de ultracentrífuga com a ponta da agulha, se necessário.
- Continue para a etapa 2.2. Em alternativa, conservar os plastoglóbulos brutos a -80 °C e purificar mais tarde.
2. Colheita de plastoglóbulos puros
- Processamento de tecidos vegetais
- Produzir gradientes de sacarose em tubos ultracentrífugos de 2,5 mL por primeira camada com 500 μL de plastoglóbulos brutos da etapa 1.1 ou etapa 1.2 misturada com 500 μL do meio R 0.7, para levar a um volume total de 1 mL, em seguida, sobrepor com 400 μL de R médio 0.2, seguido de sobreposição com 400 μL de R médio.
NOTA: Consulte Yang et al. e Kelekar et al. para descrições detalhadas da preparação do gradiente de sacarose25,26. - Equilibre cuidadosamente os tubos adicionando o excesso de R médio à camada superior, conforme necessário. Em seguida, centrifugar a 150.000 x g por 1,5 h a 4 °C.
- Colha a almofada flutuante resultante de plastoglóbulos puros (Figura 1A) com seringa e agulha 22G e deposite em um tubo de 2 mL. Raspe os plastoglóbulos da parte superior da parede do tubo de centrífuga com a ponta da agulha, se necessário.
- Aliquot os plastoglóbulos puros e congelamento flash em nitrogênio líquido. Conservar directamente a -80 °C ou liofilizar até ao pó seco.
- Produzir gradientes de sacarose em tubos ultracentrífugos de 2,5 mL por primeira camada com 500 μL de plastoglóbulos brutos da etapa 1.1 ou etapa 1.2 misturada com 500 μL do meio R 0.7, para levar a um volume total de 1 mL, em seguida, sobrepor com 400 μL de R médio 0.2, seguido de sobreposição com 400 μL de R médio.
- Processamento de cianobactérias
- Produzir um gradiente de sacarose em quatro tubos ultracentrífugos de 2,5 mL em camadas primeiro com 500 μL dos plastoglóbulos brutos da etapa 1.3 misturados com 750 μL do meio R 0,7, depois sobrepor com 750 μL do meio R 0,2.
NOTA: Consulte Yang et al. e Kelekar et al. para descrições detalhadas da preparação do gradiente de sacarose25,26. - Centrifugar o gradiente de sacarose a 150.000 x g durante 90 min a 4 °C. Coletar os plastoglóbulos puros (Figura 1C) com seringa e agulha 22 G da fase superior do gradiente de sacarose e transferir para um tubo de 1,5 mL.
- Aliquot os plastoglóbulos puros e congelamento instantâneo em nitrogênio líquido. Conservar diretamente a -80 °C ou liofilizar para um pó seco.
- Produzir um gradiente de sacarose em quatro tubos ultracentrífugos de 2,5 mL em camadas primeiro com 500 μL dos plastoglóbulos brutos da etapa 1.3 misturados com 750 μL do meio R 0,7, depois sobrepor com 750 μL do meio R 0,2.
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Representative Results
Após a conclusão da etapa 1 do protocolo, deve-se ser capaz de ver prontamente uma quantidade considerável de material de plastoglobule/gotícula lipídica flutuando sobre (ou perto) da camada superior da almofada de sacarose (Figura 1B-C). Outras frações também poderiam ser coletadas nesta fase. Por exemplo, os tilacóides serão peletizados e podem ser ressuspensos com o meio R 0,2 para análises subsequentes. Após a centrifugação subsequente, os plastoglóbulos purificados serão obtidos na superfície ou perto da superfície do gradiente de sacarose, como mostra a Figura 1A,C. Foi observado em certas circunstâncias (por exemplo, linhas genotípicas específicas ou condições ambientais) que os plastoglobules se isolarão como duas subpopulações distintas que se separam em diferentes camadas no gradiente: uma fração de baixa densidade na superfície do gradiente e uma segunda fração mais densa que se instala na interface entre as duas camadas superiores do gradiente. Embora uma análise comparativa cuidadosa das frações de separação não tenha sido realizada anteriormente, parece provável que essas subpopulações representem plastoglóbulos de tamanhos diferentes, nos quais aqueles com menor diâmetro (e, portanto, maior área de superfície para proporção de volume e relação proteína-lipídio) se estabelecerão mais abaixo no gradiente.
Em uma tentativa malsucedida, ver-se-á pouco ou nenhum plastoglobul visível na superfície da almofada de sacarose após a primeira rodada de centrifugação. A falha em isolar com sucesso plastoglóbulos suficientes pode depender de vários fatores que podem precisar ser otimizados. Em particular, a técnica de sonicação (ao usar tecido foliar saudável) pode ter um impacto significativo no sucesso. Além disso, a quantidade necessária de material vegetal/cianobacteriano dependerá da espécie específica e de sua condição de estresse.
Após o isolamento bem-sucedido dos plastoglobules, é possível validar a pureza dos plastoglobules isolados usando imunoblotting das proteínas marcadores para plastoglobules e tilacóides (o compartimento primário de contaminação). Na Figura 1D, imunoblots representativos são observados usando anticorpos levantados contra A. thaliana FBN1a, como marcador para plastoglobules2, e contra A. thaliana photosystem II subunidade D1, como marcador de tilacóides27. Os homólogos FBN em Synechocystis sp. PCC 6803 associam-se principalmente com tilacóides em vez de plastoglobules.
Deve-se também considerar cuidadosamente a maneira de armazenamento, que pode depender dos estudos a jusante pretendidos. Especialmente para análises a jusante de lipídios pigmentares prenillipídicos, é crucial minimizar a exposição das amostras à luz direta para evitar danos aos compostos fotolábeis. Plastoglobules purificados podem ser usados para experimentos a jusante, como experimentos baseados em lipidômica ou proteômica. Os platólogos são caracterizados por uma relação proteína/lipídios muito baixa, que se manifesta em sua baixa densidade e capacidade de flutuar na sacarose; assim, uma baixa concentração de proteína das amostras de plastoglobule é normal. Por esta razão, é aconselhável remover os lipídios antes da separação de proteínas por SDS-PAGE usando precipitação de proteína de acetona ou extração de clorofórmio/metanol.
Figura 1: Isolamento e immunoblotting de plastoglobules e tilacóides . (A) Uma amostra representativa de plastoglobule purificada de Z. mays antes da extração do gradiente de sacarose. (B) Uma amostra representativa de plastoglobule bruto de E. nindensis desidratada antes da extração da almofada de sacarose. (C) Uma amostra representativa de plastoglobule bruto (esquerdo) e puro (direita) de Synechocystis sp. PCC 6803, mostrando antes e depois da ultracentrifugação da almofada de sacarose carregada e gradiente, respectivamente. (D) O anticorpo antifibrilina1a (α-FBN1a) foi utilizado para monitorar o acúmulo de fibrilina, uma proteína marcadora de plastoglobules em plantas superiores. O ortolog de fibrilina se acumula predominantemente nos tilacóides isolados de cianobactérias (Synecho, Syenchocystis sp. PCC 6803). A subunidade D1 do antifotossistema II (α-PsbA) foi utilizada para validar a depleção de tilacóides a partir de isolamentos de plastoglobulos. Em cada pista, foram carregados 5 μg de tilacóides e 10 μg de proteína plastoglobule. Abreviaturas: PG = plastoglobules; Teu = tilacóides. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Composições de buffer a | |
| Buffer de moagem | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 100 mM de sorbitol | |
| 5 mM de ácido ascórbico b | |
| Cisteína b reduzida de 5 mM | |
| 0,05 % (p/v) BSA b | |
| R médio | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| Médio R 0,2 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,2 M de sacarose | |
| Médio R 0,7 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8,0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0,7 M de sacarose | |
| Buffer A | 25 mM HEPES-KOH (pH 7,8) |
| Sacarose 250 mM | |
| são fornecidas concentrações finais de cada componente tampão. | |
| b Deve ser adicionado fresco no dia do isolamento. Embora os tampões possam ser preparados no dia anterior ao isolamento, esses certos ingredientes devem ser adicionados frescos no dia do isolamento, bem como quaisquer inibidores da fosfatase e protease. | |
Tabela 1: Receitas tampão para isolamento de plastoglobulos do tecido foliar da planta ou cianobactérias.
| Coquetel b Inibidor de Fosfatase | |
| Inibidor | Conc. final (mM) |
| Na-Flúor | 50 |
| β-Glicerofosfato⋅2Na⋅5H2O | 25 |
| Na-OrthoVanadate | 1 |
| Na-pirofosfato⋅10H2O | 10 |
| b Os inibidores da fosfatase devem ser adicionados frescos no dia do isolamento. | |
Tabela 2: Coquetel inibidor da fosfatase.
| Coquetel inibidor de protease a | ||||
| Inibidor | Estoque (mg/mL) | Meio de estoque | Fator de diluição | Conc. final (mg/mL) |
| Antipain⋅2HCl | 20 | Água | 400x | 50 |
| Bestatina | 1 | 0.15 M NaCl | 25x | 40 |
| Quimostatina | 20 | DMSO | 2000x | 10 |
| E-64 | 20 | Água | 2000x | 10 |
| Leupeptina (hemissulfato) | 20 | Água | 4000x | 5 |
| P-ramidon⋅2Na | 20 | Água | 2000x | 10 |
| AEBSF | 50 | Água | 1000x | 50 |
| Aprotinina | 10 | Água | 5000x | 2 |
| a As soluções-mãe de protease devem ser armazenadas a -20 °C em pequenas alíquotas para armazenagem a longo prazo. Descongele e adicione fresco ao tampão apropriado imediatamente antes do isolamento. | ||||
Tabela 3: Coquetel de inibidores de protease.
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Discussion
Para minimizar as alterações fisiológicas/bioquímicas do material e proteger certos pigmentos pré-lábeis foto-lábeis e termolábeis que são um componente rico dos plastoglobules, é fundamental realizar o isolamento a 4 °C e protegido da luz. Como indicado acima, as etapas iniciais são realizadas na câmara fria sob uma lâmpada de segurança usando uma lâmpada emissora de verde. As etapas subsequentes realizadas no laboratório são sob luzes esmaecidas e usam gelo ou centrifugação refrigerada. Por razões semelhantes, a inclusão de inibidores de protease fresca (e inibidores da fosfatase se houver interesse em estudar a fosfo-regulação de proteínas) é crítica (Tabela 2 e Tabela 3).
Enquanto outros métodos (por exemplo, um homogeneizador Dounce, ciclos de congelamento-descongelamento) poderiam, em princípio, ser empregados para liberar plastoglóbulos de tilacóides em cloroplastos vegetais mais altos, a sonicação foi encontrada para ser muito superior em fornecer o melhor rendimento e pureza (resultados não publicados). Sonication pode criar vesículas artificiais de lamelas tilacóides ou retículo endoplasmático; no entanto, essas vesículas seriam muito ricas em proteínas e, portanto, densas, impedindo sua flutuação no gradiente de sacarose.
Ao extrair a almofada flutuante de plastoglóbulos puros do gradiente de sacarose, é benéfico extraí-los na menor quantidade de R médio possível. A aquisição de plastoglóbulos concentrados dessa maneira facilita os estudos a jusante, minimizando os volumes necessários de amostra. O uso de seringa e agulha 22 G é a estratégia mais eficaz para extrair os plastoglobules. Devido à sua natureza hidrofóbica e rica em lipídios, eles são extremamente pegajosos, e o uso de pontas de pipeta ou espátula deve ser evitado a todo custo. Verificou-se que a perda de plastoglóbulos devido à aderência é melhor minimizada com uma seringa e agulha, embora não pareça possível evitar completamente alguma perda durante a extração.
Se uma camada de plastoglóbulos amarelo-cremosos facilmente visível não for vista flutuando sobre ou perto da superfície do gradiente de sacarose, material vegetal/cianobacteriano insuficiente pode ter sido usado para o isolamento. Verificou-se que as monocotiledôneas dão maiores rendimentos de plastoglóbulos do que as dicotiledôneas de quantidades comparáveis de tecido vegetal (resultados não publicados). Embora quantidades adequadas de material biológico de partida sejam indicadas para os isolamentos específicos exemplificado neste artigo, as quantidades necessárias de tecido para uma extração eficiente devem ser determinadas empiricamente com base na espécie, no tecido e nas condições ambientais do organismo. Em geral, o tecido foliar estressado (mas não necrótico) ou as culturas de cianobactérias darão maiores rendimentos de plastoglobules. Ao utilizar o tecido foliar de A. thaliana, dois planos de plantas de A. thaliana (cerca de 140 plantas individuais) do estágio de crescimento vegetativo médio são tipicamente suficientes para o isolamento de plastoglobules, especialmente quando o material vegetal é levemente estressado, por exemplo, por um tratamento de estresse leve 2,4. Como uma explicação alternativa para os baixos rendimentos, a homogeneização inicial do tecido foliar com o liquidificador pode ter sido muito vigorosa e separado os plastoglóbulos dos tilacóides prematuramente, ou a sonicação do material tilacóide bruto pode ter sido insuficientemente vigorosa para liberar efetivamente os plastoglóbulos antes da flotação (esses pontos não são um problema ao extrair de cianobactérias, que são flutuantes no local).
É importante ter em mente que o isolamento de plastoglobules representará a maior parte da população de plastoglobules de uma amostra de tecido. Assim, qualquer possível heterogeneidade em lipídios, proteínas ou funções não seria discernível a partir de estudos subsequentes. Devido a essa limitação, não foi possível avaliar quanta heterogeneidade pode existir entre gotículas lipídicas de plastoglobule individuais. No entanto, micrografias eletrônicas de transmissão de tecido foliar vegetal de múltiplos organismos revelam padrões diferenciais de coloração entre plastoglobules, mesmo dentro do mesmo cloroplasto 28,29,30,31. Isso sugere fortemente heterogeneidade no conteúdo lipídico, embora a natureza ou o propósito disso permaneçam obscuros. Significativamente, micrografias eletrônicas de plastoglóbulos isolados de A. thaliana demonstram que esse método de isolamento não é tendencioso para o isolamento de plastoglóbulos maiores ou menores2.
O isolamento de plastoglóbulos puros representa o passo inicial para a sua caracterização molecular detalhada. Numerosas aplicações a jusante podem ser realizadas posteriormente, dependendo dos interesses específicos e da finalidade do investigador. Por exemplo, para investigar a composição lipídica ou proteica, a amostra isolada é prontamente passível de estudos proteômicos ou lipidômicos. A abordagem de digestão em gel é favorecida para estudos proteômicos de baixo para cima de amostras de plastoglobules. No entanto, como os lipídios estão em grande excesso em relação à proteína, o lipídio pode interferir na separação SDS-PAGE. A precipitação inicial de proteína utilizando acetona, com subsequente ressuspensão em tampão de solubilização de Laemmli, elimina a maioria dos lipídios, permitindo assim uma separação eficiente da proteína no gel de separação SDS-PAGE. A ressuspensão inicial do pellet de proteína em tampão tris-HCl de 100 mM e SDS de 2% permite a determinação precisa do teor de proteína pelo método do ácido bicinchonínico antes da adição de redutor, corante e glicerol. Da mesma forma, a purificação lipídica por meio de métodos de separação de fase líquido-líquido, como o método de Bligh e Tyer, é adequada para análises lipidômicas a jusante32.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
A pesquisa no grupo de laboratório Lundquist é apoiada por doações da NSF (MCB-2034631) e USDA (MICL08607) para a P.K.L. Os autores agradecem à Dra. Carrie Hiser (MSU) pelo apoio no desenvolvimento do método de isolamento de plastoglobule cianobacteriano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinin | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbate | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Bovine Serum Albumin | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| French Pressure cell (model FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron shaking incubator | Infors HT | N/A | |
| Phospho-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Potassium Hydroxide | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Reduced Cysteine | MP Biochemicals | 101444 | |
| Sodium Fluoride | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Sodium Ortho-vanadate | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Sodium Pyrophosphate · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitol | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Commercial blender |
| Zea mays | N/A | N/A |
References
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029 (2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis. Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).
- Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes. Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).
- Lundquist, P. K., et al. Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway. The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).
- Vidi, P. A., et al. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles. Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and the fine structure of plastids. Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).
- Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L. Planta. 72 (1), 1-13 (1966).
- Lichtenthaler, H. K. Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung. Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).
- Lichtenthaler, H. K. Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill. Planta. 87 (4), 304-310 (1969).
- Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).
- Hansmann, P., Sitte, P. Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor. Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).
- Steinmuller, D., Tevini, M. Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts. Planta. 163 (2), 201-207 (1985).
- Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts. Planta. 208 (1), 107-113 (1999).
- Grennan, A. K. Plastoglobule proteome. Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).
- Peramuna, A., Summers, M. L. Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme. Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).
- Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes. The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).
- Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).
- Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle. Frontiers in Plant Science. 5, 298 (2014).
- Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage. Progress in Lipid Research. 80, 101069 (2020).
- Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves. Bio-Protocols. 10 (24), 3867 (2020).
- Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress. Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).
- Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth. Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762 (2022).
- Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2. Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213 (2021).
- Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. Chloroplast Research in Arabidopsis. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).
- Yang, H., Murphy, A. Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings. Bio-Protocols. 3 (24), 1014 (2022).
- Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).
- Chen, J. H., et al. Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield. Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).
- Liu, L. Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves. Micron. 80, 135-144 (2016).
- Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content. PLoS One. 7 (10), 47547 (2012).
- Singh, D. K., et al. FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis. Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).
- Zheng, X., et al. Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues. Plant Biotechnology Journal. , (2022).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
