Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de inductie en analyse van in vitro neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Kwantificering van DNA, cathelicidin (LL37) en enzymactiviteit leverde gegevens op die de variabiliteit in de samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden aantonen.
Abstract
Neutrofielen functioneren als de eerste lijn van cellulaire verdediging in een aangeboren immuunrespons door gebruik te maken van verschillende mechanismen, zoals de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Deze studie analyseert de morfologische en compositorische veranderingen in NET's geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli met behulp van gestandaardiseerde in vitro methodologieën voor NET-inductie en karakterisering met menselijke cellen. De hier beschreven procedures maken de analyse van NET-morfologie (lytisch of niet-lytisch) en samenstelling (DNA-eiwitstructuren en enzymatische activiteit) en het effect van oplosbare factoren of cellulair contact op dergelijke kenmerken mogelijk. Bovendien kunnen de hier beschreven technieken worden gewijzigd om het effect van exogene oplosbare factoren of cellulair contact op de NET-samenstelling te evalueren.
De toegepaste technieken omvatten de zuivering van polymorfonucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed met behulp van een gradiënt met dubbele dichtheid (1,079-1,098 g / ml), waardoor optimale zuiverheid en levensvatbaarheid (≥ 95%) worden gegarandeerd, zoals aangetoond door Wright's kleuring, trypan blue uitsluiting en flowcytometrie, inclusief FSC versus SSC-analyse en 7AAD-kleuring. NET-vorming wordt geïnduceerd met microbiële (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus en Candida albicans) en chemische (phorbol myristate acetaat, HOCl) stimuli, en de NET's worden gekenmerkt door DNA-DAPI-kleuring, immunostaining voor het antimicrobiële peptide cathelicidin (LL37) en kwantificering van enzymatische activiteit (neutrofiel elastase, cathepsine G en myeloperoxidase). De beelden worden verkregen door fluorescentiemicroscopie en geanalyseerd met ImageJ.
Introduction
Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in de bloedbaan en spelen een essentiële rol tijdens de klaring van pathogene agentia door verschillende mechanismen, waaronder de afgifte van grote chromatinestructuren bestaande uit DNA en verschillende nucleaire, cytoplasmatische en granulaire antibacteriële eiwitten 1,2. Het directe antecedent dat deze antimicrobiële rol van neutrofielen beschrijft, werd gemaakt door Takei et al.3 in 1996. Deze auteurs rapporteerden een nieuwe vorm van overlijden die verschilt van apoptose en necroptose bij neutrofielen, vertoonden morfologische veranderingen die nucleaire breuk vertoonden, gevolgd door het morsen van het nucleoplasma in het cytoplasma en een toename van de membraanpermeabiliteit vanaf 3 uur incubatie met phorbol myristate acetaat (PMA)2,3. Het was echter pas in 2004 dat de term "neutrofiele extracellulaire vallen (NET's)" werd gebruikt4.
NET-vorming is waargenomen in verschillende omstandigheden, zoals bacteriële, schimmel5, virale6 en parasitaire infecties, voor het neutraliseren, doden en voorkomen van microbiële verspreiding7. Andere studies tonen aan dat het ook kan voorkomen in niet-pathogene omstandigheden door steriele stimuli, zoals cytokines, mononatriumurinezuur of cholesterolkristallen, auto-antilichamen, immuuncomplexen en geactiveerde bloedplaatjes7. Lipopolysaccharide (LPS), interleukine-8 (IL-8) en PMA behoorden tot de eerste in vitro stimuli beschreven als NET-inductoren, en de in vivo NET-betrokkenheid bij pathogene processen werd aangetoond in twee modellen van acute ontsteking: experimentele dysenterie en spontane menselijke appendicitis4. DNA is een essentieel NET-onderdeel. De juiste structuur en samenstelling zijn noodzakelijk voor het vastleggen en doden van micro-organismen door een hoge lokale concentratie van antimicrobiële moleculen aan de gevangen microben te leveren, zoals aangetoond door een korte deoxyribonuclease (DNase) behandeling die NET's en hun microbicide eigenschappen desintegreert4. Naast DNA bestaan NET's uit aangehechte eiwitten zoals histonen, neutrofiel elastase (NE), cathepsine G (CG), proteïnase 3, lactoferrine, gelatinase, myeloperoxidase (MPO) en antimicrobiële peptiden (AMPs) zoals het kationische pro-inflammatoire peptide cathelicidin LL-37 onder andere 8,9. Dergelijke aggregaten kunnen grotere draden vormen met diameters tot 50 nm. Deze factoren kunnen de microbiële virulentiefactoren of de integriteit van het pathogene celmembraan verstoren; bovendien kunnen de AMPs het NET-afgeleide DNA stabiliseren tegen afbraak door bacteriële nucleasen10.
De specifieke mechanismen die de netvorming reguleren, zijn nog niet volledig opgehelderd. De best gekarakteriseerde route die leidt tot NET-afgifte is via ERK-signalering, wat leidt tot NADPH-oxidaseactivering en productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), evenals verhoogd intracellulair calcium dat activering van de MPO-route veroorzaakt. Dit zet waterstofperoxide op zijn beurt om in hypochloorzuur, waardoor NE wordt geactiveerd door oxidatie11,12. NE is verantwoordelijk voor het afbreken van de actinefilamenten van het cytoskelet om fagocytose te blokkeren en ze naar de kern te transloceren voor verwerking door proteolytische splitsing en deaminering door PAD4 die de desensibilisatie van chromatinevezels aansturen, die associëren met korrel- en cytoplasmatische eiwitten, en vervolgens extracellulair worden vrijgegeven7. Deze proteasen omvatten die welke vrijkomen uit het azurosoomcomplex van de azurofielkorrels en andere proteasen zoals cathepsine G13.
Afhankelijk van de morfologische veranderingen in neutrofielen, worden NET's ingedeeld in twee typen: suïcidale of lytische NET-vorming die leidt tot celdood4, en vitale of niet-lytische NET-formatie geproduceerd door levensvatbare cellen gemedieerd door een vesiculaire afgifte van nucleair of mitochondriaal DNA, met een overblijfsel van een geanucleeerde cytoplast met fagocytisch vermogen14,15. Over het algemeen vertonen NET's die zijn samengesteld uit mitochondriaal DNA een langwerpige vezel14 morfologie, terwijl die gestructureerd van nucleair DNA een wolkachtig uiterlijk hebben3. Het is echter niet bekend hoe de neutrofiel zijn DNA-oorsprong kiest. In tegenstelling tot eerdere studies die de canonieke paden van NET's beschreven als enkele uren nodig, wordt de vitale route snel geactiveerd in slechts 5-60 minuten15.
Ondanks deze vooruitgang varieert de NET-samenstelling afhankelijk van de stimulus; verschillende mucoid en niet-mucoid stammen van P. aeruginosa induceren bijvoorbeeld de vorming van NET's met 33 gemeenschappelijke eiwitten en maximaal 50 variabele eiwitten7. Het is dus noodzakelijk om technieken te homogeniseren die het genereren van objectieve conclusies in onderzoeksgroepen mogelijk maken. Dit artikel beschrijft een protocol met verschillende technieken die vergelijking en evaluatie van de samenstelling, structuur en morfologie van NET's geïnduceerd met verschillende micro-organismen mogelijk maken: Staphylococcus aureus (grampositieve bacterie), Pseudomonas aeruginosa (gramnegatieve bacterie) en Candida albicans (schimmel), evenals chemische stimuli (PMA, HOCl) bij menselijke neutrofielen van gezonde individuen. De representatieve resultaten tonen de heterogeniteit van NET's aan, afhankelijk van hun inducerende stimulus onder vergelijkbare in vitro omstandigheden, gekenmerkt door DNA-DAPI-kleuring, immunostaining voor LL37 en kwantificering van enzymatische activiteit (NE, CG en MPO).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De bloedmonsters werden verkregen als donaties van klinisch gezonde deelnemers na geïnformeerde toestemming. Alle experimenten werden uitgevoerd met toestemming van de Human Research Ethics Committee van de Faculteit biochemische Wetenschappen, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' van Oaxaca.
OPMERKING: De inclusiecriteria in de studie waren onduidelijk geslacht en leeftijd, en klinisch gezond volgens de antwoorden van de deelnemers op een vragenlijst voorafgaand aan het nemen van een bloedmonster. Een hematologische analyse werd uitgevoerd om het celgetal te bepalen en infecties of bloedarmoede uit te sluiten, evenals de C-reactieve proteïnetest om ontstekingen bij de donor uit te sluiten.
1. Perifere bloedafname en het verkrijgen van het erytrocyten- en leukocytenpakket
- Verzamel 10 ml perifeer bloed door venapunctie in buizen met 1,8 mg / ml K2 · EDTA als antistollingsmiddel (zie materiaaltabel) van klinisch gezonde personen na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming. Voer vervolgens standaard bloedbiometrie en C-reactieve proteïnetest uit om infectie of ontsteking uit te sluiten, waardoor de kwaliteit van het monster wordt gewaarborgd.
- Centrifugeer het perifere bloedmonster bij 82 x g gedurende 15 minuten om het bloedplaatjesrijke plasma te verwijderen, gevolgd door een tweede centrifugatie bij 630 x g gedurende 5 minuten. Gooi het resterende plasma weg om het erytrocyten- en leukocytenpakket te verkrijgen.
- Verdun het in een verhouding van 1:1 (v/v) met 1x Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS).
2. Polymorfonucleaire neutrofiele (PMN) zuivering met behulp van een gradiënt met dubbele dichtheid
OPMERKING: Voer neutrofielenzuivering uit onmiddellijk nadat het bloed is verzameld, omdat ze een beperkte in vitro levensduur van ongeveer 8 uur hebben.
- Deponeer het volgende in een steriele glazen buis van 10 ml (zie materiaaltabel) in volgorde: 1 ml 1,098 g / ml dichtheidsoplossing, 1 ml 1,079 g / ml dichtheidsoplossing (zie materiaaltabel) en vervolgens 4 ml van het verdunde erytrocyten- en leukocytenpakket. Giet over de muren zonder de oppervlaktespanning tussen de lagen te breken om te voorkomen dat ze zich vermengen.
- Centrifugeer bij 320 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C, waarbij versnelling/vertraging wordt vermeden zodat de hoge krachten van de centrifuge de helling niet verstoren.
- Aspirateer de fase die overeenkomt met granulocyten (figuur 1A) door pipetteren en breng over naar een andere steriele glazen buis van 10 ml. Wassen met 4 ml 1x DPBS bij 300 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en behandel de cellen met osmotische shock om de resterende erytrocyten te verwijderen. Voeg 4 ml 0,2% zoutoplossing toe gedurende 2 minuten bij 4 °C en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. Voeg vervolgens 4 ml van de isotone oplossing (0,65% zoutoplossing) toe gedurende 5 minuten bij 4 °C om de membraanintegriteit te herstellen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: De zoutoplossing van 0,2% is een hypotoon medium, met een lagere opgeloste concentratie ten opzichte van die van het intracellulaire medium RBC. Contact met het hypotone medium zorgt ervoor dat water in de RBC kan diffunderen, wat leidt tot hun zwelling en hemolyse. Deze verwijdering van RBC uit het supernatant werd bevestigd door microscopische observatie. - Verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 4 ml 1x DPBS om cellulair afval te verwijderen en centrifugeer vervolgens bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspendeer ten slotte de celpellet in 2 ml koude Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) buffer.
3. Morfologie en levensvatbaarheid van neutrofielen (figuur 1B)
- Trypan blue exclusietest
- Verdun 5 μL van de celsuspensie in 20 μL van 0,4% trypan blauw (verhouding 1:5). Tel de cellen in een Neubauer-kamer en bepaal de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een exclusietest. Beschouw de cellen die de integriteit van hun membraan behouden zonder de kleurstof te permeabiliseren als levensvatbaar.
- Monteer 5 μL van de celsuspensie op een dia; droog en beits met Wright's vlek gedurende 15 s. Fixeer het monster onmiddellijk met fosfaatbuffer pH 6,4 gedurende 30 s. Wassen met voldoende gedestilleerd water en de morfologie observeren onder een optische microscoop (100x).
- 7AAD-kleuring en flowcytometrie analyse
- Voeg 1 x 105 cellen toe aan flowcytometriebuizen en kleur met 1 μL 7AAD in 100 μL FACS-buffer (1x DPBS, 0,1% natriumazide en 10% autoloog gedecomplementeerd plasma) gedurende 15 minuten bij 4 °C in het donker.
- Wassen met 500 μL FACS-buffer op 300 x g gedurende 10 min. Bevestig de cellen met 500 μL 2% paraformaldehyde en bewaar bij 4 °C tot hun analyse in de flowcytometer.
- Voor een dode celcontrole fixeert u 1 x 105 cellen met 200 μL 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten en wast u met 500 μL 1x PBS bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Trek het supernatant af en gooi het weg. Voeg vervolgens 200 μL van 0,1% Triton X-100 toe gedurende 1 uur bij 4 °C. Wassen met 500 μL 1x PBS en vlekken met 7AAD zoals in stap 3.2.1.
- Gebruik een flowcytometer (zie Materiaaltabel) en voer FSC versus SSC-analyse uit om de celzuiverheid te analyseren en SSC versus 7AAD-kleuring om de levensvatbaarheid van de cel te analyseren. Lees 3 x 104 gebeurtenissen in 100 μL opnamevolume bij medium flow (1.000 cellen/s) in de polymorfonucleaire instellingen (FSC, 400-490 en SSC, 300-320).
- Analyseer de vastgelegde gegevens in de flowcytometersoftware (zie Tabel van materialen) en bepaal het percentage zuiverheid en positieve cellen voor 7AAD in de polymorfonucleaire populatie, gepresenteerd door middel van dot plots en histogrammen.
4. CFSE-kleuring van micro-organismen
- Voeg 1 x 108 bacteriën of 1 x 106 schimmel pseudohyphae toe in 1,5 ml microbuisjes en kleur met 200 μL 5 μM carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) opgelost in 1x PBS. Meng gedurende enkele seconden en incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten in het donker.
- Stop de reactie door 500 μL gedecomplementeerd plasma toe te voegen en centrifugeer bij 620 x g gedurende 10 minuten voor pseudohyphae of bij 1.800 x g gedurende 10 minuten voor bacteriën.
- Gooi de supernatanten weg en was de pellets met 1 ml 1x PBS met centrifugatie zoals in stap 4.2. Ten slotte resuspendeert u de micro-organismen in 250 μL 1x PBS.
- Bereid 50 μL aliquots in microbuisjes van 1,5 ml met 2 x 107 bacteriën (MOI: 100) of 2 x 105 pseudohyphae (MOI:1) voor NET-inductie.
5. NET-inductie
- Plaats 10 mm x 10 mm steriele glazen afdekplaten in een 24-wells plaat en dek af met 10 μL van 0,001% poly-L-lysine gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Tweemaal wassen met 100 μL 1x PBS, aan de lucht drogen en gedurende 15 minuten bestralen met UV-licht.
- Vervang de HBSS-oplossing van de neutrofielenususpensie in stap 2.5 door RPMI 1640 medium aangevuld met 10% autoloog plasma. Voeg aan de 24-well plaat (stap 5.1) 350 μL van deze celsuspensie toe, voor een eindconcentratie van 2 x 105 neutrofielen/put.
- Laat de cellen zich hechten aan de bodem van de putten door gedurende 20 minuten te broeden bij 37 °C met 5% CO2.
- Voeg de stimuli toe om NET-vorming te induceren in 50 μL: microbiële stimuli-gram-positieve bacterie S. aureus (ATCC 25923), gramnegatieve bacterie P. aeruginosa (ATCC 10145) bij MOI 100 en pseudohyphae van C. albicans (ATCC 10231) bij MOI:1; biochemische stimuli-PMA (200 nM) en HOCl (4,5 mM), en controle met stimulus afwezig (50 μL HBSS).
- Verkrijg een eindvolume van 400 μL per putje. Meng op een platenschudder bij 140 tpm gedurende 30 s en incubeer gedurende 4 uur bij 37 °C en 5% CO2.
6. Visualisatie van NET's door fluorescentiemicroscopie
- DNA en LL37 immunostaining
- Verwijder na NET-inductie de supernatanten uit de putten door voorzichtig te pipetteren en fixeer de cellen gedurende 30 minuten met 300 μL 4% paraformaldehyde.
- Was de cellen met 200 μL 1x PBS zonder centrifuging en voeg gedurende 30 minuten 200 μL blokkeerbuffer (10% gedecomplementeerd plasma in 1x PBS) toe.
- Voor LL-37-kleuring, permeabiliseer de cellen met 200 μL van 0,2% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 10 minuten om het antilichaam de cellen binnen te laten komen. Was 2x voorzichtig met 1x PBS om het overtollige wasmiddel te verwijderen.
- Monteer de coverslips op glazen dia's (vier coverslips op elke dia). DNA kleurt de cellen met 2 μL DAPI (zie materiaaltabel), verzegelt de coverslips en bewaart bij -20 °C tot hun analyse door confocale fluorescentiemicroscopie.
- Acquisitie en analyse van fluorescerende beelden
- Neem NET-afbeeldingen om hun componenten te kwantificeren en gebruik de bijbehorende filters in de confocale fluorescentiemicroscoop (zie Materiaaltabel) om de beelden te verkrijgen met de software van de computer.
OPMERKING: Bedenk dat het DNA gekleurd is met DAPI (blauwe kleur), met excitatie bij 360 nm en emissie bij 460 nm. De micro-organismen zijn gekleurd met CVSE (groene kleur), die een excitatie heeft van 492 nm en een emissie van 521 nm. Het LL37-peptide is gelabeld met anti-LL37 Alexa Fluor 594-antilichaam (rode kleur), dat een excitatie van 594 nm en een emissie van 614 nm heeft. - Kalibreer de microscoop. Plaats de dia en focus met behulp van differentieel interferentiecontrast (DIC) met normaal licht ingeschakeld. Kies Live om het beeld op de monitor te projecteren.
- Doe het licht uit en selecteer het fluorochroom overeenkomstige kanaal. Selecteer bijvoorbeeld filter 365 nm/blauw voor DAPI, 43 HE DsRed voor Alexa 594 of 38 HE GFP voor CFSE.
- Pas de instellingen aan met het isotype controle antilichaam voor LL37 en niet-gekleurde cellen voor DAPI en CVSE. Stel dezelfde belichtingstijd, spanning, contrast en lensinstellingen in om alle beelden onder dezelfde omstandigheden vast te leggen.
OPMERKING: In deze studie werden de belichtingstijd, spanning en contrast ingesteld op respectievelijk 1,0 ms, 4,0 V en 0,0, met een doelstelling van 40x. Deze waarden kunnen worden aangepast om de beste beeldopname voor de monsters mogelijk te maken. - Selecteer Magnetisch om de afbeelding vast te leggen. Sla vijf beelden op (vier uitersten en het midden) per put, en van de colocalisatie (samenvoeging) van DNA/LL37/CVSE.
- Definieer de drie klassen pixels als achtergrond met de onafhankelijke afbeeldingen van elke kleur en analyseer de gemiddelde grijssignaalwaarde per gebied met de Image J-software.
- Neem NET-afbeeldingen om hun componenten te kwantificeren en gebruik de bijbehorende filters in de confocale fluorescentiemicroscoop (zie Materiaaltabel) om de beelden te verkrijgen met de software van de computer.
7. Kwantificering van enzymatische activiteit
- Voeg in een 96-well plaat 90 μL celsuspensie toe in HBSS met 1 x 105 neutrofielen voor NET-inductie en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
- Voeg onmiddellijk 10 μL van de overeenkomstige stimuli toe (concentratie zoals in stap 5.4) en incubeer gedurende 4 uur bij 37 °C met 5% CO2.
- Gooi de supernatanten weg en was de cellen met 100 μL HBSS. Behandel met 1 U/ml DNase gedurende 10 minuten bij 37 °C om de afgifte van DNA-eiwitstructuren te bevorderen en centrifugeer bij 1.800 x g gedurende 10 minuten.
- Herstel de supernatanten en evalueer de enzymactiviteit in het supernatant met behulp van colorimetrische reacties zoals eerder beschreven door White et al.17.
- Bepaal de maximale enzymactiviteit van NE, CG en MPO bij neutrofielen onder dezelfde experimentele omstandigheden zonder stimuli voor NET-inductie toe te voegen. Vries vervolgens het celmonster in bij -70 ° C en ontdooi bij 37 ° C in een waterbad, waardoor een temperatuurschok wordt gegenereerd om de afgifte van intracell-eiwitten door cellyse te bevorderen. Centrifugeer bij 1.800 x g gedurende 10 minuten en herstel de supernatanten.
- Voeg 50 μL van het supernatant toe aan elke put in 96-well platen en voeg vervolgens 50 μL van elk substraat toe zoals aangegeven in stap 7.7.
- Voeg 0,5 M N-methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroaniline toe als substraat voor NE en 1 mM N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide voor CG. Incubeer gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. Voeg voor MPO 1,6 mM van 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg na incubatie 50 μL van de stopoplossing (0,5 M H2SO4) toe voor MPO en meet de absorptie bij 405 nm voor NE en CG en 450 nm voor MPO, met behulp van een spectrofotometer.
- Vergelijk de verkregen waarden met de overeenkomstige kalibratiecurven en toon de resultaten van elke toestand ten opzichte van de maximale enzymactiviteit (100%).
8. Statistische analyse
- Analyseer de meetgegevens in drievoud voor elk onafhankelijk experiment (n = 10) en voer een ANOVA uit voor statistische analyse door groepen met een betrouwbaarheidsniveau van 95% te vergelijken.
Figuur 1: PMN-zuivering en NET-inductieprotocol. (A) Plasma werd uit het perifere bloed verwijderd om het erytrocyten- en leukocytenpakket te verkrijgen en 1:1 (v/v) verdund met 1x DPBS. Vervolgens werd 4 ml van de verdunning langs de wand toegevoegd aan de gradiëntbuis met dubbele dichtheid en gecentrifugeerd bij 320 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C, waarbij de scheiding van verschillende cellagen werd verkregen en degene die overeenkomt met PMN werd hersteld. (B) De gezuiverde cellen werden geteld en hun morfologie werd geanalyseerd door de kleuring van Wright. De levensvatbaarheid werd bepaald door trypanblauwe uitsluiting en 7AAD-kleuring met behulp van flowcytometrie. Zodra optimale neutrofiele zuiverheid en levensvatbaarheid waren geverifieerd, werd NET-vorming geïnduceerd door microben (S. aureus, P. aeruginosa en C. albicans) of chemicaliën (PMA, HOCl) toe te voegen in 24-well platen voor analyse door fluorescentiemicroscopie met DAPI-DNA, anti-LL37 Alexa Fluor 594 en micro-organismen-CVSE-kleuring. Voor enzymkwantificering werden NET's geïnduceerd in 96-well platen gedurende 3 uur en behandeld met DNase, gevolgd door de toevoeging van substraten voor elk enzym: NE, CG en MPO; kleurveranderingen werden gekwantificeerd door spectrofotometrie. DPBS = Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing; PBMC = Perifere bloed mononucleaire cellen; PMN = Polymorfonucleaire neutrofielen; NE = Neutrofiel elastase; CG = Cathepsine G; MPO = Myeloperoxidase; PMA = Phorbol myristate acetaat; HOCl = Hypochloorzuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zuiverheid en levensvatbaarheid van neutrofielen
De dynamische cellulaire fasen worden in de buis gevisualiseerd vanuit de gradiëntzuivering met dubbele dichtheid. Binnen deze lagen bevindt de laag die overeenkomt met granulocyten zich boven de dichtheidslaag van 1,079 g/ml, onderscheiden van de fasen van perifere bloedmononucleocyten (PBMC's) en erytrocyten (figuur 1A). De morfologie van de gezuiverde cellen werd geverifieerd met de kleuring van Wright door cellen te observeren met gesegmenteerde kernen verbonden met draadachtige filamenten die overeenkomen met volwassen neutrofielen (figuur 2A). Vanwege de verminderde halfwaardetijd van neutrofielen is levensvatbaarheid een cruciaal punt voor de volgende NET-inductie-experimenten. Daarom werd de levensvatbaarheid van cellen geverifieerd met trypanblauwe uitsluitingskleuring, waarbij de integriteit van het plasmamembraan werd geëvalueerd wanneer de kleurstof niet doordringt (figuur 2B). Bovendien intercaleert 7AAD in cytosine- en guaninebasen van DNA en zendt fluorescentie uit, wat de uitsluiting van dode cellen vergemakkelijkt (figuur 2C, D). Deze procedures resulteerden in een celzuiverheid van 98,9% ± 0,06% en een cel levensvatbaarheid van 95,5% ± 4,2% in 10 uitgevoerde experimenten.
Figuur 2: Morfologie en levensvatbaarheid van vers gezuiverde neutrofielen. (A) Na gradiëntzuivering werd de typische neutrofielmorfologie bevestigd door de kleuring van Wright (100x). De cellen vertoonden een meervoudige kern die kenmerkend is voor volwassen neutrofielen in de bloedbaan en (B) optimale levensvatbaarheid door trypanblauwe uitsluiting zonder membraanverstoring. (C) Analyse van SSC versus FSC door flowcytometrie bevestigt een populatie die overeenkomt met PMN, waarbij een celzuiverheid van 98,9% ± 0,06% (n = 10) wordt verkregen. (D) PMN-dotplots worden gepresenteerd (niet-gekleurde cellen, linkerpanelen versus 7AAD-gekleurde celrechtpanelen) met hun respectieve histogrammen (niet-gekleurd-blauw versus gekleurd-rood), wat wijst op een hoge levensvatbaarheid van cellen van 95,5% ± 4,2% (n = 10) in de vers geïsoleerde neutrofielen vergeleken met de controlecellen die zijn doordrongen met 0,1% Triton (onderste panelen) om de resultaten te valideren. De 7AAD-kleurstof bindt aan DNA en is uitgesloten van levensvatbare cellen, dus de voorbehandeling van wasmiddelen veroorzaakte veranderingen in het celmembraan en maakte de binnenkomst van 7AAD mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Morfologie en samenstelling van NET's geïnduceerd door chemische en microbiologische stimuli
Figuur 3 toont representatieve beelden die in vitro NET-inductie aantonen door de werking van chemische (PMA, HOCl) of microbiële (C. albicans, S. aureus en P. aeruginosa) middelen na 4 uur incubatie (figuur 3A). De NET-samenstelling werd bepaald door DNA/LL37-kleuring en de beelden werden vastgelegd voor kwantificering van gemiddelde grijswaarden in het gebied met ImageJ (figuur 3B,C). Suïcidale (lytische) of vitale (niet-lytische) NET-vorming werd beschreven op basis van hun morfologie. Ter vergelijking: niet-gestimuleerde controle-neutrofielen gekweekt in HBSS gedurende 4 uur vertoonden LL37 gelokaliseerd in het cytoplasma met gecondenseerd multilobed-gesegmenteerd chromatine (figuur 3A 1-3), kenmerkend voor deze rustende cellen.
PMA is een krachtige ROS-inductor door PKC-activering en functioneert dus als een positieve controle om suïcidale (lytische) NET-vorming te induceren. De beelden van PMA-geïnduceerde NET's tonen netwerken met overvloedige chromatinedecondensatie die wolkachtige structuren vormen die verband houden met de zelfmoordroute (figuur 3A 4-6), waarin de neutrofiel sterft als gevolg van overvloedig DNA dat wordt vrijgegeven in de extracellulaire ruimte die grote delen van het geanalyseerde gebied beslaat. Binnen deze bewolkte gebieden die het DNA bedekken, werd LL37 gecolokaliseerd, zowel intra- als extracellulair in hoge concentraties (figuur 3A 6, B-C). HOCl daarentegen is een fysiologische, biochemische verbinding die wordt gegenereerd als een product van de oxidatieve activiteit van MPO. NET's gevormd met HOCl vertoonden een kleine DNA-dispersie in de extracellulaire ruimte met filamenteuze morfologie die lijkt te zijn afgeleid van het celmembraan (figuur 3A 7-9). Dergelijke morfologische kenmerken komen overeen met de vitale NET-vorming en ze vertoonden geen colocalisatie van LL37 met de DNA-filamenten; LL37 bleef gelokaliseerd op nucleair niveau (figuur 3A 7-9,C). Deze resultaten geven aan dat deze chemische agentia onder vergelijkbare gecontroleerde omstandigheden verschillen vertonen in de samenstelling van de vrijgekomen NET's, zowel DNA als LL37.
Analyse van NET's geïnduceerd door micro-organismen toonde aan dat pseudohyphae van C. albicans netwerken induceerde met lage concentraties DNA die vrijkomen in de extracellulaire ruimte met filamenteuze structuren, wat de aanwezigheid van geanucleeerde cytoplastachtige structuren benadrukt die kenmerkend zijn voor de vitale NET-vorming (figuur 3A 10-13), die niet worden waargenomen met HOCl en S. aureus die ditzelfde pad activeren. Ondertussen colocaliseert LL37 met DNA op cellulair niveau en lage concentraties worden geassocieerd met pseudohyphae, waardoor hun voortplanting wordt afgebakend. Beide componenten vertoonden geen statistisch significante verschillen met de controle met HBSS (figuur 3B,C). S. aureus is een van de meest voorkomende pathogene bacteriën wereldwijd, met het vermogen om NET's te induceren die een vitale morfologie vertonen, zoals eerder gemeld in verschillende studies15,19. Overvloedig DNA werd vrijgegeven in statistisch significante concentraties als filamenteuze structuren die colokaliseerden met LL37 en bacteriële clusters vormden, wat aangeeft dat de steiger de eliminatie van de bacteriën zou kunnen afbakenen en bevorderen (Figuur 3A 14-17). Aan de andere kant veroorzaakte de gramnegatieve bacterie P. aeruginosa de afgifte van grote concentraties DNA met een troebele morfologie geassocieerd met de zelfmoord NET-vorming, en LL37 significant gecolokaliseerd met DNA en bacteriën (figuur 3A 18-21, B, C).
Visualisatie van NET's door fluorescentiemicroscopie toonde aan dat de NET's geïnduceerd door HOCl, S. aureus en C. albicans vitale-achtige morfologie vertonen met filamenteuze structuren. Alleen S. aureus leidde echter tot het vrijkomen van statistisch significante hoeveelheden DNA. De morfologie van de andere twee stimuli (PMA en P. aeruginosa)-geïnduceerde NET's komt overeen met het type zelfmoord NET-vorming, met statistisch significante hoeveelheden DNA en LL37 in vergelijking met niet-gestimuleerde neutrofielen. Er waren overvloedige wolkachtige DNA-structuren, significanter in NET's geïnduceerd door P. aeruginosa dan die geïnduceerd door PMA.
Figuur 3: DNA- en LL37-samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd door chemische en microbiële stimuli. (A) Menselijke van bloed afkomstige neutrofielen werden gestimuleerd met PMA (4-6), HOCl (7-9), pseudohyphae van C. albicans (10-13), S. aureus (14-17), P. aeruginosa (18-21) en een niet-gestimuleerde controle (1-3) in HBSS, gedurende 4 uur. NET's werden gevisualiseerd met BEHULP VAN DNA-DAPI (blauw), anti-LL37 Alexa Fluor 594 (rood), of isotypecontrole, en micro-organismen werden vooraf gekleurd met 5 μM CVSE (groen). Afbeeldingen tonen representatieve fluorescentiemicroscopieresultaten van 10 onafhankelijke experimenten uitgevoerd in drievoud. (B-C) Grafieken tonen gemiddelden ± SD van de gemiddelde grijswaarde van het signaal per gebied voor de aangegeven kleuren van vijf afbeeldingen (vier uitersten en het midden) per put en geanalyseerd met de ImageJ-software voor (B) DAPI-DNA en (C) Alexa Fluor 594-LL37-kleuring. ANOVA werd uitgevoerd om groepen experimentele omstandigheden te vergelijken met een betrouwbaarheidsniveau van 95%. * = p ≤ 0,05. HBSS = Hank's gebalanceerde zoutoplossing; PMA = phorbol myristate acetaat; HOCl = hypochloorzuur. Overgenomen van Sosa-Luis et al.16 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Enzymatische activiteit van NE, CG en MPO in NET's geïnduceerd door chemische en microbiologische stimuli
Een ander doel van deze studie was het kwantificeren van de activiteit van enzymen beschreven als centrale componenten in NET's, zoals NE, CG en MPO, die overvloedig aanwezig zijn met antimicrobiële activiteit afgeleid van azurofiele korrels. Daarom werden NET's geïnduceerd en werden de celnetwerken behandeld met DNase, wat de afgifte van structuur-geassocieerde eiwitten bevorderde, en enzymactiviteit werd bepaald met behulp van colorimetrische assays. De analyse toonde restactiviteit voor NE (2,3% ± 0,6%), CG (6,2% ± 2,7%) en MPO (21,4% ± 2,0%) geassocieerd met DNA-structuren afgeleid van alle NET's, vergeleken met de maximale activiteit verkregen van gelyseerde rustende neutrofielen genomen als 100% (figuur 4). NET's geïnduceerd door de meeste stimuli vertoonden lage enzymactiviteitswaarden voor NE en CG, behalve S. aureus voor NE en PMA voor CG, die statistische significantie vertoonden. Aan de andere kant nam de MPO-activiteit toe in alle stimuli zonder enig statistisch significant verschil tussen hen, maar was significant tussen de groepen chemische stimuli versus micro-organismen.
Deze resultaten tonen de haalbaarheid aan van het gepresenteerde protocol, dat informatie verschaft over de heterogeniteit in NET-samenstelling door DNA, LL37 en enzymactiviteit (NE, CG en MPO) te kwantificeren met verschillende stimuli onder dezelfde in vitro omstandigheden. De resultaten laten zien dat de neutrofielen differentieel en specifiek kunnen reageren op elke stimulus door geschikte DNA-structuren te vormen met verschillende antimicrobiële eiwitten tijdens NET-vorming.
Figuur 4: Residuele enzymatische activiteit in NET's geïnduceerd door chemische en microbiële stimuli. Colorimetrische assays werden gebruikt om de enzymatische activiteit in NET's te evalueren na het ontkoppelen van DNA-eiwitstructuren door DNase om alleen NET-gebonden eiwitten te analyseren. De grafiek toont de gemiddelde ± SD van het percentage resterende enzymatische activiteit in NET's geïnduceerd door elke chemische of microbiële stimuli in vergelijking met de maximale enzymatische activiteit (in de supernatanten van de neutrofielen gelyseerd door vries-ontdooien bij -70 °C) verkregen voor NE (3,54 ± 2,52 U/ml), CG (34,90 ± 25,85 U/ml) en MPO (0,29 ± 0,13 U/ml). Basaal toont de enzymatische activiteit in de supernatanten van de neutrofielen die in de HBSS-buffer worden bewaard. Statistische analyse werd uitgevoerd met gegevens van 10 onafhankelijke experimenten door ANOVA om groepen experimentele omstandigheden te vergelijken met een betrouwbaarheidsniveau van 95%. * en ** = p ≤ 0,05 in vergelijking met alle andere stimuli. = p ≤ 0,05 bij vergelijking van de gesignaleerde groepen stimuli. NE = neutrofiel elastase; CG = cathepsine G; MPO = myeloperoxidase; PMA = phorbol myristate acetaat; HOCl = hypochloorzuur. Overgenomen van Sosa-Luis et al.16 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een zeer zuivere populatie van levensvatbare neutrofielen moet worden verkregen om de afgifte van NET's te induceren, aangezien deze cellen een beperkte ex vivo levensduur hebben van gemiddeld 8 uur, een periode waarbinnen alle experimenten moeten worden uitgevoerd. Hiertoe is de ideale methodologie de gradiënt met dubbele dichtheid om de zuiveringstijd te optimaliseren door niet-geactiveerde cellen te isoleren die beter reageren op exogene stimulatie, in tegenstelling tot Ficoll-Histopaque gradiënt of Dextran sedimentatietechnieken17. Een ander voordeel van de gradiëntmethode met dubbele dichtheid is de relatief lage kosten in vergelijking met celverrijkingstechnieken met hoge zuiverheid, zoals fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) die afhankelijk zijn van de antigenen van het celoppervlak, zoals CD16hi in neutrofielen. Naast hoge kosten kunnen deze sorteermethoden ook onbedoelde activering van de doelcellen veroorzaken tijdens de interactie tussen antilichamen en antigeen en de ex vivo tijd van neutrofielen verhogen, omdat deze twee technieken over het algemeen worden gebruikt na dichtheidsgradiëntzuivering. Celmorfologie en levensvatbaarheid sluiten veranderingen in de gezuiverde neutrofielen uit en bevestigen dat de waargenomen veranderingen specifiek zijn als reactie op de toegevoegde stimuli versus de rustende neutrofielen onder dezelfde experimentele omstandigheden zonder stimulatie (figuur 2). Dit bevestigt de efficiëntie van het protocol als een aseptische en reproduceerbare methode voor neutrofielenisolatie zonder de levensvatbaarheid en morfologie van de cel te veranderen. Deze bijdrage van eosinofielen, die vaak worden aangetroffen in bloed met aantallen van minder dan 2%, werd uitgesloten en veranderde de statistische significantie van de resultaten niet, omdat eosinofielen niet werden waargenomen in het monster op de kleuring van Wright bij het analyseren van verschillende velden (figuur 2A). Dit kan worden bevestigd door flowcytometrie met behulp van de CD16-marker, die niet aanwezig is in eosinofielen, maar in hoge concentraties aanwezig is bij neutrofielen.
In de studie van NET's zijn er consensussen en discrepanties18; verschillende studies hebben tegenstrijdige resultaten gemeld als reactie op dezelfde stimuli, wat te wijten kan zijn aan verschillen in de neutrofielenisolatieprotocollen, de verlengde experimenteertijd die de neutrofielen spontaan activeert, de buffers en verschillende concentraties van dezelfde gebruikte stimulus. Daarom is het essentieel om de protocollen te homogeniseren met expliciete details, zodat de protocollen consistent kunnen worden gerepliceerd om vergelijkingen mogelijk te maken. De meest gebruikte methoden zijn immunocytochemie en immunohistochemie, die de identificatie mogelijk maken van structuren die extracellulair DNA colocaliseren met van korrels afgeleide eiwitten18 die meestal componenten bevatten met bacteriedodende activiteit die virulentiefactoren8 kunnen vernietigen, zoals NE, MPO, CG en LL37. Bovendien bevelen recente studies voor het monitoren van NET-vorming aan om dit proces te analyseren met behulp van real-time live-cell-methoden zoals intravitale microscopie 1,18. Weinig studies zoals deze studie verenigen de experimentele omstandigheden om de samenstelling van NET's onder verschillende stimuli (bacteriën, schimmels en chemicaliën) te vergelijken 1,9, met behulp van de techniek van fluorescentiemicroscopie om de dispersie van DNA-DAPI, LL37-Alexa 594, en de colokalisatie ervan met micro-organismen te visualiseren - CFSE. Evenzo geeft de behandeling met DNase alleen die eiwitten vrij die geassocieerd zijn met de DNA-structuur van de NET's, dus de spectrofotometrische techniek zorgt ervoor dat de enzymatische activiteit van MPO, NE en CG wordt gekwantificeerd, waarbij wordt uitgesloten dat ze afkomstig zijn van degranulatie.
NET morfologie kan worden gedefinieerd als suïcidaal of vitaal, met de mogelijkheid om ze te differentiëren op basis van de dispersie die door DNA in de extracellulaire ruimte wordt aangenomen. De suïcidale route wordt gekenmerkt door een wolkachtige structuur, terwijl de vitale route een filamenteuze vormis 15,19,20. Op basis hiervan geeft figuur 3 aan dat PMA en P. aeruginosa een suïcidaal NET-type vertegenwoordigen. Deze resultaten valideren deze techniek door onder onze omstandigheden te repliceren wat werd beschreven door Brinckman et al. met PMA, de meest gebruikte verbinding om NET's te induceren door de activering van c-Raf, MEK, Akt, ERK en eiwitkinase C (PKC) te activeren, die op hun beurt NADPH-oxidase11 activeren en een sterke toename van intracellulaire ROS veroorzaken. Bovendien sluiten de resultaten de mogelijkheid uit dat externe artefacten, incubatietijden of de korte mechanische agitatie die in deze studie werd gebruikt, de spontane in vitro afgifte van NET's met een wolkachtig uiterlijk veroorzaakten, zoals sommige auteurs hebben genoemd17, omdat rustende neutrofielen zonder stimulatie na 4 uur een multilobede kern met intact chromatine vertoonden (figuur 3A 1-3).
Evenzo, NET's geïnduceerd met HOCl, C. albicans, en S. aureus presenteerde filamenteuze morfologie, overeenkomend met de vitale NET morfologie (figuur 3A 7-17). Deze route wordt gekenmerkt door neutrofielen die op een unieke en oxidantonafhankelijke manier reageren zonder cellyse of zelfs breuk van het plasmamembraan, alleen ontluiking van blaasjes met nucleair DNA15. Dit resultaat bevestigt opnieuw het potentieel van deze techniek om zowel morfologische verschijningen van NET-productie als suïcidaal of vitaal te onderscheiden. Wat de NET-samenstelling betreft, toonden de resultaten die met behulp van deze methodologie werden verkregen statistische significantie in de differentiële vereisten van LL37 voor PMA- en P. aeruginosa-stimulatie (figuur 3C). NE (alleen voor S. aureus) en MPO-activiteit waren hoger in de micro-organismen versus de chemische groep (figuur 4). Deze informatie bewijst opnieuw de selectiviteit van neutrofielen bij het reageren op elke stimulus, zoals gerapporteerd door Kenny et al.5 bij het vergelijken van verschillende stimuli in NET-productie in vitro. Er werd beschreven dat in sommige gevallen de productie van NET ROS nodig heeft of differentiële vereisten heeft van specifieke enzymen zoals PAD4, terwijl in andere gevallen de aanwezigheid van deze moleculen irrelevant is voor hun productie5.
Een beperking van de techniek van het kwantificeren van DNA in de extracellulaire ruimte die in deze studie wordt beschreven, is dat DNA ook afkomstig kan zijn van andere vormen van celdood met een necrotisch morfotype, en het is onmogelijk voor deze techniek om onderscheid te maken tussen hen. Er is echter gemeld dat NET's van dit proces kunnen worden onderscheiden door de aanwezigheid van granulaire eiwitten te bevestigen18. Evenzo is de oorsprong van het DNA onbekend, wat kan worden bevestigd door organelspecifieke, mitochondriale of nucleaire genen te versterken met PCR19. Een andere zwakte is het onderscheiden van NET's van andere vezelige structuren zoals fibrine; een dergelijk onderscheidingsvermogen zou geavanceerde technieken vereisen, zoals scanning elektronenmicroscopie met hoge resolutie20. Concluderend maken de gepresenteerde technieken in vitro karakterisering (onder vergelijkbare omstandigheden) mogelijk van de samenstelling en morfologie van NET's geïnduceerd met verschillende stimuli, waarbij de selectiviteit van neutrofielen wordt aangetoond bij het vrijkomen van sommige van hun componenten (DNA, LL37, NE, CG, MPO) tot een specifieke stimulus. Deze technieken kunnen worden aangepast om het effect van exogene oplosbare factoren of cellulair contact op dergelijke NET-kenmerken te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een basisbeurs voor wetenschap (# 285480) van CONACyT en door de afdeling Klinisch Immunologieonderzoek van de faculteit Biochemische Wetenschappen, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L. en W.J.R.R. hebben doctoraatsbeurzen van respectievelijk CONACyT-nummers #799779, #660793 en #827788.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL - Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory - CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
- De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437 (2017).
- Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).
- Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).
- Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494 (2021).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
- Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
- White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).
