Summary
Den nuværende protokol beskriver etablering af et murine colonic organoid system til at studere aktiviteten og funktionen af kolon stamceller i en claudin-7 knockout model.
Abstract
Tarmepitelet regenererer hver 5-7 dage og styres af tarmepitelstamcellepopulationen (IESC) placeret i bunden af kryptområdet. IESC'er omfatter aktive stamceller, som selvfornyer og differentierer sig til forskellige epitelcelletyper, og hvilende stamceller, der tjener som reservestamceller i tilfælde af skade. Regenerering af tarmepitelet styres af disse aktive IESC'ers selvfornyende og differentierende egenskaber. Derudover er balancen i kryptstamcellepopulationen og vedligeholdelsen af stamcellenichen afgørende for tarmregenerering. Organoidkultur er en vigtig og attraktiv tilgang til at studere proteiner, signalmolekyler og miljømæssige signaler, der regulerer stamcelleoverlevelse og funktioner. Denne model er billigere, mindre tidskrævende og mere manipulerbar end dyremodeller. Organoider efterligner også vævsmikromiljøet, hvilket giver in vivo relevans. Den nuværende protokol beskriver isoleringen af kolonkrypter, indlejring af disse isolerede kryptceller i et tredimensionelt gelmatrixsystem og dyrkning af kryptceller til dannelse af kolonorganiske oider, der er i stand til selvorganisering, spredning, selvfornyelse og differentiering. Denne model gør det muligt at manipulere miljøet - slå specifikke proteiner ud som claudin-7, aktivere / deaktivere signalveje osv. - for at studere, hvordan disse effekter påvirker funktionen af kolonstamceller. Specifikt blev rollen som tæt krydsprotein claudin-7 i kolon stamcellefunktion undersøgt. Claudin-7 er afgørende for at opretholde tarmhomeostase og barrierefunktion og integritet. Knockout af claudin-7 hos mus inducerer en inflammatorisk tarmsygdom-lignende fænotype, der udviser tarmbetændelse, epitelhyperplasi, vægttab, slimhindesårdannelser, epitelcellesloughing og adenomer. Tidligere blev det rapporteret, at claudin-7 er nødvendig for intestinal epitel stamcellefunktioner i tyndtarmen. I denne protokol etableres et kolonorganoidkultursystem for at studere claudin-7's rolle i tyktarmen.
Introduction
Intestinal organoidkultur er et tredimensionelt (3D) ex vivo-system, hvor stamceller isoleres fra tarmkrypterne i primært væv og belægges til en gelmatrix 1,2. Disse stamceller er i stand til selvfornyelse, selvorganisering og organfunktionalitet2. Organoider efterligner vævsmikromiljøet og ligner mere in vivo-modeller end todimensionelle (2D) in vitro-cellekulturmodeller, selvom de er mindre manipulerbare end celler 3,4. Denne model eliminerer forhindringer, der opstår i 2D-modeller, såsom mangel på korrekt celle-celle-adhæsioner, celle-matrix-interaktioner og homogene populationer, og reducerer også begrænsningerne ved dyremodeller, herunder høje omkostninger og lange perioder5. Intestinale organoider - også kaldet colonoider for dem, der dyrkes af kolonkryptafledte stamceller - er i det væsentlige mini-organer, der indeholder et epitel, herunder alle celletyper, der ville være til stede in vivo, samt et lumen. Denne model tillader manipulation af systemet til at studere mange aspekter af tarmen, såsom stamcelleniche, tarmfysiologi, patofysiologi og tarmmorfogenese 3,5,6. Det giver også en god model til lægemiddelopdagelse, studerer menneskelige tarmlidelser såsom inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og kolorektal cancer, patientspecifik personlig behandlingsudvikling og studerer vævsregenerering 4,7,8,9. Derudover kan organoidsystemet også bruges til at studere cellulær kommunikation, lægemiddelmetabolisme, levedygtighed, spredning og respons på stimuli 7,8. Mens dyremodeller kan bruges til at teste potentielle terapeutiske midler til tarmpatologiske tilstande, er de ret begrænsede, da det er en udfordring at studere flere lægemidler på én gang. Der er flere forvirrende variabler in vivo, og tilhørende omkostninger og tid er henholdsvis høje og lange. På den anden side giver organoidkultursystemet mulighed for screening af mange terapier på én gang i en kortere periode og giver også mulighed for personlig behandling ved brug af patientafledt organoidkultur 4,8. Colonic organoids evne til at efterligne vævsorganisation, mikromiljø og funktionalitet gør dem også til en fremragende model til at studere regenerering og vævsreparation9. Vores laboratorium har etableret et tyndtarmsorganoidkultursystem for at studere effekten af claudin-7 på tyndtarmens stamcellefunktioner10. I denne undersøgelse etableres et stort tarmorganoidkultursystem for at studere stamcellers evne eller manglende evne til selvfornyelse, differentiering og spredning i en betinget claudin-7 knockout (cKO) model.
Claudin-7 er et meget vigtigt TJ-protein (tight junction), der udtrykkes meget i tarmen og er afgørende for at opretholde TJ-funktion og integritet11. cKO-mus lider af en IBD-lignende fænotype, der udviser alvorlig betændelse, sårdannelser, epitelcellesloughing, adenomer og øgede cytokinniveauer11,12. Mens det er almindeligt accepteret, at claudiner er afgørende for epitelbarrierefunktion, opstår der nye roller for claudiner; de er involveret i spredning, migration, kræftprogression og stamcellefunktion 10,12,13,14,15,16,17. Det er på nuværende tidspunkt uvist, hvordan claudin-7 påvirker stamcellenichen og funktionen af kolonstamceller. Da tarmen hurtigt fornyer sig selv ca. hver 5-7 dag, er vedligeholdelse af stamcelleniche og korrekt funktion af de aktive stamceller afgørende18. Her etableres et system til at undersøge de potentielle regulatoriske virkninger af claudin-7 på den koloniske stamcelleniche.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg og procedurer blev godkendt af East Carolina University (ECU) Animal Care and Use Committee (IACUC) og udført i overensstemmelse med retningslinjer fra National Institutes of Health og ECU om laboratoriedyrpleje og -brug. Uinducerbare, tarmspecifikke claudin-7 knockout-mus blev genereret ved at krydse C57BL6 claudin-7-flox transgene mus med Villin-CreERT2 mus19. Han- og hunmus i alderen 3 måneder blev anvendt i denne undersøgelse.
1. Forberedelse af reagens/udstyr
- Følgende reagenser/udstyr afkøles, inden de påbegynder deres tilknyttede eksperimenter: fosfatbufferet saltvand (PBS) til vask af tyktarmsvæv under kryptisolering; en vippe/rotator (anbragt i et 4 °C køleskab) til inkubation med epiteldissociationsmedier.
- Gelmatrixen (se Materialetabel) fjernes fra -20 °C, og der optøes på is inden plettering.
- Forkøl centrifugen til 4 °C, inden krypterne spindes ned til plettering.
- Afkøles 0,1% natriumcitratbuffer (se Materialetabel) og opbevares på is inden in situ-celledødsdetektion .
- Varm følgende reagenser op, inden de starter deres tilknyttede eksperimenter: en 96-brønds kulturplade i 24 timer før plettering; L-WRN-medier (se Materialetabel), før de tilføjes til belagte krypter og før hver medieændring.
- Vandbadet opvarmes til 94 °C inden farvning.
2. Murine colonic krypt isolering
- Forbered de nødvendige medier ved at følge nedenstående trin.
BEMÆRK: Mediemængderne beregnes her for to mus' tyktarmsvæv.- Forberede epiteldissociationsmedier: 30 ml 1x PBS + 400 μL 0,5 M EDTA + 50 μL 10 mM Y-27632 dihydrochlorid (se materialetabel). Opbevares på is indtil brug.
- Forbered kryptdissociationsmedier: 10 ml 1x PBS + 10 μL 10 mM Y-27632 dihydrochlorid. Opbevares på is indtil brug.
- Supplement L-WRN-medier: 50 ml L-WRN-medier + 47,5 ml DMEM-høj glucose med L-glutamin + 500 μL L-glutamin + 500 μL pennicilin / streptomycin + 1.000 μL B-27-supplement (50x) + 500 μL N2-supplement (100x) + 50 μL HEPES (1 M) bufferopløsning (se Materialetabel).
- Det komplette (supplerede) L-WRN-medie og aliquot filtreres til opbevaring ved -20 °C i op til 3 måneder.
BEMÆRK: Optøet medie er stabilt ved 4 °C i op til 2 uger.
- Udfør kryptisoleringen.
- For generel anæstesi tilsættes 1 ml isofluran til bomuld og placeres i en plastkassette inden for et 0,09 kubikfod anæstesikammer (se Materialetabel). Placer musen i anæstesikammeret, indtil vejrtrækningen stopper (ca. 3-5 minutter), og udfør derefter cervikal dislokation20.
- Lav et ca. 2 i snit ned ad musens midterlinje, fastgør baghuden for at udsætte maven. Isoler tyktarmen ved at skære lige under cecum fra den proksimale side og over endetarmen fra den distale side21.
- Brug tang til at fjerne fedtvævet, der er fastgjort til tyktarmen. Skub forsigtigt afføring ud ved hjælp af den flade ende af tangen og skær vævet åbent i længderetningen.
- Vask vævet 10-15 gange med kold 1x PBS ved hjælp af tang til at "hvirvle" vævet rundt i PBS mellem vaske.
- Brug ren, skarp saks til at skære vævet i små stykker, ca. 3-5 mm i størrelse.
- Gentag processen for den anden mus, og vævsstykkerne kombineres i et 50 ml rør indeholdende koldt epiteldissociationsmedium (trin 2.1.1).
- Inkuber tyktarmsvævsstykkerne i epiteldissociationsmedier i 90 minutter ved 4 °C med blid gyngen.
- Lad vævsfragmenterne synke til bunden af røret, og kassér derefter forsigtigt epiteldissociationsmediet uden at forstyrre vævet. Gentag denne proces, når du vasker vævet 10-15 gange med koldt 1x PBS. Kassér så meget PBS som muligt under den sidste vask.
- Tilsæt kryptdissociationsmedier (trin 2.1.2) til 50 ml røret, der indeholder tyktarmsvævsstykker, og ryst kontinuerligt i 5-10 minutter i hånden.
BEMÆRK: Medierne skal blive uklare fra de dissocierede krypter. - Under cellekulturhætten filtreres væv og medier med en 70 μm nyloncellesi (se materialetabel) i et frisk 50 ml rør.
- Centrifuge ved 200 x g i 10 minutter ved stuetemperatur og kassér supernatanten uden at forstyrre den kryptholdige pellet.
BEMÆRK: Afhængigt af udstyret kan man overføre det anstrengte medie til et 15 ml rør til centrifugering. - Resuspend pellet i ~ 3-4 ml kold 1x PBS.
- Pipette 10 μL af de isolerede krypter i en linje på et mikroskopglas. Under mikroskopet tælles antallet af fulde, lange krypter for at estimere kryptkoncentrationen pr. 10 μL.
- Beregn det passende volumen af krypter, der skal drejes ned for at plade 10 krypter / μL i en 96-brøndplade.
3. Krypt plettering
- Der centrifugeres et passende volumen isolerede krypter i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved 200 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af en 1.000 μL pipette uden at forstyrre de pelleterede krypter.
- Tilsæt 100 μL gelmatrix (nok til ni brønde) til de pelleterede krypter og pipetter omhyggeligt for at undgå at indføre luftbobler.
BEMÆRK: Se diskussionsafsnittet for en detaljeret beskrivelse af, hvordan man blander gelmatrixen og krypterne. Typisk er 100 μL tilstrækkeligt til ni brønde. - Lad gelmatrixen størkne delvist (~ 1-2 min).
- Plade 10 μL af gelmatrixen blandet med krypterne i hver brønd i en forvarmet 96-brønds kulturplade for at danne en kuppelform.
BEMÆRK: Placer kuplen i midten af brønden. Pas på ikke at lade gelmatrixen sprede sig til siderne af brønden. Se diskussionsafsnittet for en detaljeret beskrivelse af størkning og plettering. - Gelmatrixen indstilles helt i 10-20 minutter i en inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Forbered den endelige arbejdsløsning af L-WRN-medier.
- Der tilsættes 100 μL pennicilin/streptomycin til en 10 ml aliquot af L-WRN-medier (se trin 2.1.3) (stabil i 2 uger ved 4 °C).
- Der tilsættes tilskud til 900 μL L-WRN-medier med pennicilin/streptomycin: 0,9 μL 1 mg/ml EGF + 0,9 μL 10 mM Y-27632 dihydrochlorid.
BEMÆRK: Mængderne er baseret på ni brønde. Y-27632 dihydrochlorid tilsættes kun på dag 0 (på pletteringstidspunktet).
- Tilsæt 100 μL medier til hver brønd. Pas på ikke at forstyrre kuplen.
- Inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 24 timer.
4. Oprettelse af claudin-7 knockout i kultur
- Lad krypterne vokse normalt i kultur i 24 timer efter plettering.
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør tilsættes 2,7 μL 1 mmol/L 4-hydroxytamoxifen (4OH-Tamoxifen) til 900 μL L-WRN-medier (endelig koncentration på 3 μmol/L) + 0,9 μL 1 mg/ml EGF.
BEMÆRK: Stamopløsningen af 4OH-Tamoxifen fremstilles ved at blande pulveriseret 4OH-Tamoxifen (se Materialetabel) med 1x PBS til en koncentration på 1 mmol / L. - Fjern gamle medier fra brøndene via vakuumsugning.
- Tilsæt 100 μL 4OH-Tamoxifen-holdige medier til hver brønd og mærk dem som claudin-7 cKO/4OH-TAM.
BEMÆRK: DMSO skal tilføjes til kontrolbrøndene. Friske 4OH-Tamoxifen-holdige medier skal tilsættes hver 2. dag. - Inkuberes ved 37 °C indtil næste medieskift (~2-3 dage).
5. Vedligeholdelse af kolonorganoid
BEMÆRK: Medier skal skiftes hver 2-3 dage. Kultur op til 12 dage.
- Forbered en frisk endelig arbejdsløsning af L-WRN-medier: 900 μL L-WRN-medier + 0,9 μL 1 mg / ml EGF.
- Fjern gamle medier fra brøndene via vakuumsugning. Tilføj friske medier til brøndene.
BEMÆRK: Pas på ikke at forstyrre kuplen. - Inkuberes ved 37 °C indtil næste medieskift.
BEMÆRK: Kulturer kan opretholdes og passeres i den ønskede varighed for eksperimentet. Kulturerne for denne undersøgelse blev typisk opretholdt i mellem 9-12 dage, men man kan ønske at fortsætte yderligere i 15 eller 20 dage.
6. Høst og indlejring af kolonorganiske oider
- Fjern gamle medier fra brøndene via vakuumsugning.
- Fix organoiderne med 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 time ved stuetemperatur.
OBS: PFA er et giftigt materiale. Tag forholdsregler, når du bruger dette reagens. - 4% PFA fjernes fra brøndene via vakuumsugning, og der tilsættes 30% saccharose i 24 timer ved 4 °C.
- Mærk en plastform, og fyld den til 90% med optimal skæretemperatur (OCT) -forbindelse (se Materialetabel).
- Fjern 30% saccharose fra brøndene via vakuumsugning. Tilsæt 10 μL 1x PBS til hvert hul.
- Med en pipettespids skal du forsigtigt ridse bunden af brønden for at adskille kuplen, der indeholder organoider.
- Med en pipette fjernes PBS, der indeholder de dissocierede organoider, og væsken lægges i formen indeholdende OCT.
BEMÆRK: Undgå at indføre bobler i OCT-forbindelsen. - Fortsæt denne proces, indtil alle organoider er fjernet fra alle brønde.
- I en Dewar-kolbe i rustfrit stål tilsættes tørispiller og 2-methylbutan (nok til at dække tørispillerne) (se Materialetabel).
- Hold støt den organoidholdige OCT-blok over 2-methylbutan for at blinke frysning.
- Opbevar den organoidholdige OCT-blok ved -80 °C, indtil den er klar til sektion (kan opbevares i op til 1 år).
7. Immunfluorescens
- Afsnit den organoidholdige OCT-blok ved en tykkelse på 5 μm ved hjælp af en kryostat (se Materialetabel) ved -20 °C.
- For hvert afsnit skal du kontrollere under mikroskopet for at sikre, at en organoid blev fanget. Når sektioneringen er færdig, opbevares diasene ved -80 °C, indtil de er klar til plettering (kan opbevares i op til 6 måneder).
- Rutsjebanerne opvarmes i 10 mM natriumcitratbuffer i 10 min ved 94 °C.
BEMÆRK: Bufferen fremstilles ved at opløse natriumcitrat i deioniseret vand. Juster pH til 6 med saltsyre. - Lad rutsjebanerne køle af på bordpladen i 20 min. Skyl med destilleret vand i 5 min.
- Saml rutsjebanerne i et farvningsstativ (se Materialetabel) med 0,2% Triton X-100 og inkuber med 100 mM glycin i 15 min.
- Skyl tre gange med 1x PBS i 5 minutter hver. Bloker med 5% bovin serumalbumin (BSA) i 45 minutter ved stuetemperatur.
- Inkuberes med claudin-7 anti-murine kanin primært antistof22 (fortyndet i 1% BSA) natten over ved 4 °C. Skyl tre gange med 1x PBS i 10 minutter hver.
- Inkuberes med Cy3 anti-kanin sekundært antistof23 (fortyndet i 1% BSA) i 1 time ved stuetemperatur. Skyl tre gange med 1x PBS i 10 minutter hver.
- Monter diasene med et passende monteringsmedium (se Materialetabel) med DAPI, og tilføj en dæksel.
8. Registrering af celledød
- Fastgør organoiderne inde i brøndene med 4% paraformaldehyd i 1 time ved stuetemperatur. Skyl med 1x PBS i 5 min.
- Inkuber kulturpladen på is med 0,1% Triton X-100 i kold 0,1% natriumcitratbuffer i 2 min. Skyl to gange med 1x PBS i 5 minutter hver.
- Forbered TUNEL-reaktion24,25 ved hjælp af TMR Red, et in situ-celledødsdetekteringssæt(se materialetabel). Der tilsættes 50 μL TUNEL-reaktionsreagenser til hvert hul.
- Inkuberes i befugtet atmosfære i 1 time ved 37 °C i mørke.
BEMÆRK: Alle de resterende trin skal udføres i mørke. - Skyl tre gange med 1x PBS i 5 minutter hver. Inkuberes med 1:2.500 Hoechst (fortyndet i 1x PBS, se Materialetabel) i 3 min.
- Skyl tre gange med 1x PBS i 5 minutter hver. Brug TRITC-filteret til at visualisere billeder på et fluorescerende mikroskop (se Materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at undersøge de regulatoriske virkninger af claudin-7 på tyktarmsstamceller blev kolonkrypter isoleret fra murin tyktarmsvæv som beskrevet ovenfor og vist i figur 1A. Når krypterne var isoleret fra det primære væv, blev de belagt i en 3D-matrix i en 96-brøndplade for at vokse i 11 dage (figur 1). Normale sunde krypter lukker lumen og bliver sfæroider på dag 2 og begynder til sidst at spire og danne de forskellige epitelcelletyper på cirka dag 5 (figur 1B). Kolonoider fik lov til at vokse indtil dag 11, hvor de derefter blev høstet til yderligere eksperimenter (figur 1B). For at knockoute claudin-7 i kultur fik krypterne lov til at vokse normalt i 24 timer. Efter 24 timer blev krypterne behandlet med 3 μmol/L 4OH-Tamoxifen (TAM) og dyrket i yderligere 10 dage. Kulturmediet indeholdende frisk 4OH-TAM blev skiftet hver 2. dag. DMSO blev brugt som et køretøj i kontrolbrønde. Claudin-7 mangelfulde krypter (claudin-7 KO) kunne ikke danne ordentlige sfæroider og begyndte hurtigt at dø efter 1 dag med 4OH-TAM-behandling (figur 1B).
Figur 2A fremhæver den vellykkede vækst af kolonoider fra normale krypter indeholdende claudin-7 (kontrol), når de skrider frem i løbet af de 9 kulturdage. Disse krypter begyndte at danne sfæroider på dag 2, begyndte at spire på dag 5 og fortsatte med at vokse og spire, indtil de blev høstet på dag 9 (figur 2A). I modsætning hertil forværredes krypter, der manglede claudin-7 (claudin-7 KO) meget hurtigt (figur 2B). Ca. 2-3 dage efter behandling med 4OH-TAM havde claudin-7 KO-krypter ikke dannet sunde sfæroider og optrådte kun som cirkulære klumper af celler (figur 2B). Krypter isoleret fra vildtypemus blev behandlet med 4OH-TAM for at bekræfte, at der ikke er nogen toksisk virkning på grund af Tamoxifen-behandling; Disse krypter var i stand til at overleve og vokse normalt. For at undersøge claudin-7 deletion og overlevelsestilstanden af claudin-7 KO colonoider blev der anvendt en immunostaining metode og et in situ celle dødsdetektionssæt (figur 3). Immunofluorescerende farvning for claudin-7 i høstet kontrol og cKO-organoider bekræftede vellykket knockout af claudin-7 i kultur (figur 3A). Dag 9 kontrolkolonoider udviste meget lidt apoptotisk signal (figur 3B); claudin-7 KO colonoids viste imidlertid høj apoptose (figur 3B). Uden claudin-7 kunne stamcellerne ikke overleve, selvforny eller differentiere sig til dannelse af kolonoider.
Figur 1: Skematisk repræsentation, der viser kryptisolering og kolonoidvækst . (A) Grafisk afbildning af kryptisoleringsprocessen, plettering i 3D-matrixen og vækst indtil høst. (B) Tidslinje for eksperimenter og kolonoid vækst i kontrol og claudin-7 KO-afledte krypter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Claudin-7 mangelfulde kolonoider er ude af stand til at overleve og vokse . (A) Repræsentative billeder af kontrol/DMSO-organoider på dag 3 og dag 9. (B) Repræsentative billeder af 4OH-TAM/cKO organoider på dag 3 og dag 9, n = 10. Skalabjælker = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Claudin-7 mangelfulde kolonoider gennemgår hurtigt apoptose. (A) Claudin-7 farvning i dag 9 kontrol / DMSO og claudin-7 cKO / 4OH-TAM organoider, n = 3. Skalastænger = 250 μm. (B) Apoptotisk farvning i dag 9 kontrol og claudin-7 cKO / 4OH-TAM colonoider, n = 3. Skalabjælker = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organoidkultur er en fremragende model til undersøgelse af stamcellefunktion, tarmfysiologi, lægemiddelopdagelse, menneskelige tarmsygdomme og vævsregenerering og reparation 7,8,9,10,11,26. Selvom det har mange fordele, kan det være udfordrende at etablere. Der skal udvises forsigtighed i alle trin i hele protokollen, men vigtigst af alt under pletteringsfasen. Når du blander de isolerede krypter med en gelmatrix, skal du sørge for grundigt at pipettere op og ned for at bryde kryptpillen dannet efter centrifugering og fordele krypterne jævnt i hele matrixen. Undgå samtidig at indføre luftbobler i matrixen, mens du pipetterer. For at gøre dette skal pipettering udføres langsomt med pipettespidsen mod bunden af 1,5 ml røret.
Derudover må gelmatrixen ikke størknes fuldstændigt under hele denne proces. For at forhindre for tidlig størkning blandes ved omhyggelig pipettering, placeres røret derefter på is og gentages denne proces. Når de isolerede krypter og gelmatrixen er tilstrækkeligt blandet, skal gelmatrixen størkne delvist. Denne proces kan tage 1-5 minutter, afhængigt af typen / mærket af gelmatrix, der anvendes. Det skal ligne en gel, der bevæger sig lidt, hvis røret er tippet, men bør ikke være for løbende, at det ville spildes ud, hvis det blev omvendt. På dette tidspunkt kan man begynde at platte 10 μL ind i midten af hver brønd. Gelmatrixen skal danne en 3D-kuppel og bør ikke røre ved siderne af brønden. Hvis gelmatrixen spredes og rammer brøndens væg, størkner den ikke nok; vent, indtil den er tilstrækkeligt størknet til at danne en kuppel, da krypterne ikke vil overleve og vokse, hvis kuplen ikke dannes. Når plettering er afsluttet korrekt, og krypter er tilstrækkeligt suppleret, som forklaret ovenfor, forventes organoiderne at vokse uden problemer.
Denne protokol etablerer et kolonorganoidsystem med eller uden claudin-7 for at observere dets virkninger på kolonstamcelleoverlevelse. Mens kolonorganoidkultur er et innovativt og fordelagtigt system, har modellen stadig begrænsninger. Afhængigt af typen af undersøgelse kan manglen på immunceller og mikrobiota i tarmorganoider være en fordel eller ulempe26. I dette studie er det en fordel at undersøge claudin-7's regulatoriske rolle på stamcellefunktioner uden immunkomponenten. Det blev konkluderet, at en vis effekt specifikt skyldes claudin-7, snarere end andre potentielle variabler såsom immunresponset, der ville være til stede i in vivo dyremodeller. Omvendt kan denne faktor være en begrænsning for andre typer undersøgelser. Etablering af kolonorganoidkultur kan også være dyrere og tidskrævende end traditionelle 2D-cellelinjer. De kan dog efterligne det cellulære mikromiljø af væv, der giver in vivo-relevans, er meget mere repræsentative for væv end 2D-cellekultur og er stadig billigere end dyremodeller 4,7. I betragtning af tarmorganoidkulturens enorme anvendelse og enorme potentiale vil dette system sandsynligvis blive den ideelle model inden for laboratorieforskning over hele verden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev finansieret af NIH DK103166.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
