Het opzetten van een muiskneuzingsletselmodel op basis van een minimaal invasieve techniek

Summary

Minimaal invasieve technieken en een eenvoudig laboratoriumapparaat verbeteren de reproduceerbaarheid van het ruggenmergletselmodel door operatieve schade aan de proefdieren te verminderen en anatomisch morfologisch onderhoud mogelijk te maken. De methode is de moeite waard omdat de betrouwbare resultaten en reproduceerbare procedure het onderzoek naar de mechanismen van ziekteherstel vergemakkelijken.

Abstract

Het gebruik van minimaal invasieve methoden om dwarslaesie (SCI) te modelleren, kan gedrags- en histologische verschillen tussen proefdieren minimaliseren, waardoor de reproduceerbaarheid van de experimenten wordt verbeterd.

Aan deze methoden moet aan twee vereisten worden voldaan: duidelijkheid van het chirurgische anatomische pad en eenvoud en gemak van het laboratoriumapparaat. Cruciaal voor de operator is dat een duidelijke anatomische route minimaal invasieve blootstelling biedt, die extra schade aan het proefdier tijdens de chirurgische procedures voorkomt en het dier in staat stelt om tijdens het experiment een consistente en stabiele anatomische morfologie te behouden.

In deze studie wordt het gebruik van een nieuw geïntegreerd platform genaamd het SCI coaxiale platform voor ruggenmergletsel bij kleine dieren onderzocht om het ruggenmerg op T9-niveau op een minimaal invasieve manier bloot te leggen en de wervel van muizen te stabiliseren en te immobiliseren met behulp van een wervelstabilisator, en ten slotte wordt een coaxiale zwaartekracht-impactor gebruikt om het ruggenmerg van muizen te kneden om verschillende graden van T9-dwarslaesie te benaderen. Ten slotte worden histologische resultaten verstrekt als referentie voor de lezers.

Introduction

Traumatische dwarslaesie (SCI) maakt het individu gemakkelijk vatbaar voor ernstige gevolgen¹; toch is er op dit moment geen effectieve behandeling ^1,2. Dierlijke kneuzingsmodellen zijn een van de belangrijkste methoden om SCI ^3,4 te ^bestuderen.

Van 2004 tot 2014⁴ werden ratten gebruikt als modelorganismen in 289 van de 407 studies (71%) en muizen in 69 (16,9%). Inderdaad, het aandeel experimenten met muizen is in de loop der jaren geleidelijk toegenomen vanwege hun voordelen ten opzichte van andere modellen, met name het grote potentieel voor genregulatiestudies ^3,4,5. Daarom zijn er meer compatibele tools nodig om meer studies uit te voeren met de muis als model vanwege het grote belang dat wordt gehecht aan modelconsistentie⁶. De gemeenschappelijke apparaten die in eerdere studies zijn gerapporteerd, zijn in principe gebaseerd op het ruggenmergimpactprincipe van Allen, bijvoorbeeld de basisbelastingsdruppel^7,8, de Impactor ^1,9 van de New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) en de Impactor^10,11 van de Infinite Horizon (IH⁾ . De weight drop impactor en de NYU/MASCIS impactor delen hetzelfde principe van richten op het beoogde ruggenmerg en het laten vallen van een vast gewicht van verschillende hoogtes om verschillende letsel ernst te maken. De IH-impactor creëert de dwarslaesie volgens verschillende krachten.

Voor het gemak bij het gebruik van het muismodel in dwarslaesiestudies en om de basis te leggen voor effectieve behandelingsmethoden, wordt een geïntegreerd muismergslagletselplatform ontwikkeld, het coaxiale platform voor ruggenmergletsel (SCICP) genoemd. Het platform bestaat uit vier hoofdcomponenten: (1) een operatietafel voor dieren die is ontworpen voor een geschikte positie voor bediende muizen, die zeer compact is en gemak biedt zonder positiebeperking; (2) een micro-retractor aan beide zijden om de paravertebrale spieren tijdens het gebruik vast te houden; (3) een wervelstabilisator om de wervel vast te houden vóór de procedure van dwarslaesie (twee wervelstabilisatoren zijn beschikbaar voor gebruik bij grotere dieren zoals ratten); (4) een mouw, een impactor tip, gewichten en een trekpen. De drie delen moeten worden gemonteerd tot een verwijderbare X-Y-Z-arm. Voor nauwkeurige targeting wordt een impactorpunt op het oppervlak van het ruggenmerg geplaatst en wordt de X-Y-Z-arm voorzichtig afgedaald naar de verwachte hoogte met behulp van de markering tussen de impactorpunt en de mouw. De impactorpunt is gemaakt van een aluminiumlegering van 0,12 g om schade aan het ruggenmerg te voorkomen die vóór de procedure wordt toegeschreven aan grote gewichtscompressie. De trekpen is bedoeld om de gewichten aan de bovenkant van de mouw vast te houden om de gewichtsval voor te bereiden (figuur 1).

In eerdere studies werd de impactkrachtverdeling gedefinieerd op basis van de impactkrachtgegevens van het IH-apparaat, die respectievelijk 30 Kdyn, 50 Kdyn en 70 Kdyn zijn, respectievelijk ^6,10. Tijdens het onderzoeksproces werd bewezen dat seriële graden van SCI-modellen zijn vastgesteld op basis van SCICP, die in verschillende onderzoeken kunnen worden gebruikt. Daarom werden, voordat het experiment officieel werd gestart, de impactkrachten die door verschillende gewichten van verschillende massa's werden gegenereerd, getest met behulp van een piekdruktestapparaat. Als gevolg hiervan werden drie gestandaardiseerde representatieve SCI-muismodellen geselecteerd als drie verschillende graden van letsel, waaronder gradaties milde, matige en ernstige groepen, respectievelijk ^6,10, en de gewichten werden op dezelfde hoogte vrijgegeven, met een gewicht van 1,3 g voor mild, 2,0 g voor matig en 2,7 g voor ernstige schade.

Als een ander middel om de operabiliteit en nauwkeurigheid te garanderen, wordt een nieuwe en minimaal invasieve operatieve aanpak gerapporteerd. Door onderzoek te doen naar de anatomie van normale muizen, wordt een nieuwe methode gevonden om de interspineuze ruimte van T12-T13 te lokaliseren. De methode voor het lokaliseren van wervels in de operatiestappen is eenvoudig te beheersen en nauwkeurig, wat zorgt voor een nauwkeurige lokalisatie voor minimaal invasieve operaties.

Hopelijk kan deze techniek van kneuzingsletsel het onderzoek en begrip van dwarslaesie helpen, inclusief pathofysiologisch begrip, managementevaluatie, enzovoort.

Protocol

OPMERKING: Alle experimenten werden goedgekeurd door de Laboratory Animal Ethical and Welfare Committee van Shandong University Cheeloo College of Medicine (goedkeuringsnummer: 21L60) en werden uitgevoerd volgens de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals gepubliceerd door de National Institutes of Health (NIH Publications No. 85-23, herzien 1996).

1. Mechanisme van het coaxiale platform voor dwarslaesie en mechanische tests

1. Monteer het platform met een operatietafel, een wervelstabilisator en een impactorpunt (figuur 1).
   OPMERKING: Houd de gewichtsval en uitlaatsleuven, die voorkomen dat het gewicht luchtstromen tegenkomt, schoon, omdat vuil op de gewichtsval of sleeve de precisie van het platform kan beïnvloeden.
2. Plaats de punt, die een nauwkeurige lokalisatie van het ruggenmerg mogelijk maakt, in de mouw.
3. Selecteer de juiste massa's van de gewichtsdalingen voor het experiment, die respectievelijk 1,3 g, 2,0 g en 2,7 g zijn voor de milde, matige en ernstige groepen.
4. Steek de trekpen in de gaten van de gewichtsval.
5. Monteer de gewichtsval naar de bovenkant van de mouw met de trekpen in de groef op de X-Y-Z-arm, zodat, zodra de locatie is voltooid, het gewicht wordt vrijgegeven om de impactorpunt te raken, waardoor het ruggenmerg wordt gekneusd, en veranderingen in het ruggenmerg worden waargenomen onder de microscoop.
6. Stel de verwijderbare X-Y-Z-precisiearm van 0,1 mm in voor het gemak van de machinist om voldoende werkruimte te bieden (figuur 1D, E).
   OPMERKING: Om de consistentie van de resultaten van het onderzoek te bevestigen, meet u voordat het experiment begint de kracht die wordt gegenereerd wanneer het gewicht in de houder wordt gedropt met behulp van een piekdrukdetectieapparaat. Een herhaling van de bevestiging is niet nodig voor toekomstige studies.
7. Schakel het apparaat in, plaats de metalen drukreceptor onder de punt, zet de adapter op nul, laat de trekpen los en noteer de werkelijke impactkracht.

2. Lokaliseren en laminectomie van de^9e thoracale wervel (T9)

OPMERKING: Vrouwelijke C57BL / 6J-muizen van 9-10 weken oud werden gekocht bij Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, China).

1. Autoclaaf een reeks chirurgische instrumenten voor het experiment en steriliseer de operatietafel met 75% alcohol voor de operatie.
2. Injecteer buprenorfine voor analgesie (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 30 minuten vóór anesthesie voor letseloperaties. Verdoof vervolgens de muis met isofluraan (inductie: ~3%-5%, onderhoud: ~1,5%-2%). Controleer of het dier volledig verdoofd is door de reflexen van staart- of teenknijpen. Zodra de anesthesie van kracht is, legt u de muis in een buikligging in een aangewezen deel van de operatietafel en bedekt u het hoornvlies met oogheelkundige zalf (breng oogheelkundige zalf aan op de hoornvliezen om de ogen te beschermen tegen uitdroging tijdens de operatie).
   1. Scheer het haar van de caudale naar de rostral met een elektrisch scheerapparaat over de thoracolumbale wervelkolom. Steriliseer de huid meerdere keren in een cirkelvormige beweging met jodophor gedurende 30 s en gevolgd door 75% alcohol. Breng een steriel chirurgisch gordijn aan en maak een longitudinale incisie van ongeveer 1,5 cm op de huid van ongeveer T6 tot T13 met een scalpel en mes.
      OPMERKING: Palper langs de kustrand naar de middellijn, waar de T12-T13 interspineuze ruimte zich bevindt. Maak een incisie van 1,5 cm naar de rostral en de incisie is ongeveer gelijk met T6-T13-wervels.
3. Verken de 13e rib aan één kant van het benige gedeelte onder de operatiemicroscoop. Verken het spineuze proces in de middellijn door lichtjes het gebied van de costovertebrale hoek aan te raken en vervolgens naar de rostral om de interspineuze ruimte van de T12-T13 te lokaliseren. Verken de interessante ruimte van de T9-T10 van de ruimte van de T12-T13 tot de rostrale kant. (Figuur 2A, 3A)
4. Ontleed de paraspinale spier langs het spineuze proces van de T9 naar de voorste en achterste facetgewrichten van beide zijden met een microschaar (figuur 3B). Trek de paraspinale spieren in met micro-retractors en reinig het zachte weefsel op de lamina en in de interspineuze ruimte van de T8-T9 en T9-T10 met een microschaar.
5. Voer T9-laminectomie uit, klem het spineuze proces van T9 met een microchirurgische tang, til deze enigszins op, plaats de microschaar parallel langs de rechter dorsolaterale kant van de lamina, vermijd schade aan het ruggenmerg en knip de lamina af met een microschaar. Herhaal dit aan de linkerkant en het ruggenmerg kan worden blootgesteld (figuur 2B, 3C).
6. Voordat u de wervel bevestigt, maakt u de universele arm los en klemt u langzaam de 9e tot 10e facetgewrichten aan beide zijden van de wervel met de micromuggentang van de wervelstabilisator. Draai de schroeven op de micromuggentang aan en de wervel is dus gestabiliseerd. Pas het ruggenmerg aan op het horizontale vlak, span de universele arm aan en de wervel is gefixeerd (figuur 3D).

3. T9 kneuzingsletsel

1. Zodra het ruggenmerg T9-niveau is blootgesteld en de wervel is gefixeerd, richt u op het ruggenmerg door de punt in de mouw onder de operatiemicroscopische (figuur 3E).
2. Controleer of het oppervlak van de punt parallel loopt aan het ruggenmerg van de achterste en laterale aspecten van het ruggenmerg, omdat het gemakkelijk is om de relatie tussen het ruggenmerg en de punt onder de microscoop te observeren en dat de operatietafel gemakkelijk kan worden gedraaid.
3. Controleer of het oppervlak van de tip evenwijdig is aan de bilaterale randen van de gespaarde lamina voordat de tip in contact komt met het ruggenmerg na de laminectomie, omdat het een natuurlijk referentievlak is dat parallel loopt aan het ruggenmerg.
4. Nadat u de interspineuze ruimte van de T12-T13 hebt gelokaliseerd, laat u de mouw zakken totdat het uiteinde van het botslichaam consistent is met de markering op het observatievenster en de opgegeven hoogte van 22 mm is bereikt. Trek de trekpen uit om het gewicht los te laten (1,3 g, 2,0 g of 2,7 g volgens de groep, waarbij elke groep 3 muizen omvat en elke groep één muis heeft voor elk tijdstip).
   OPMERKING: Het ruggenmerg moet evenwijdig aan de grond en loodrecht op de punt staan; verplaats de operatietafel om het microscopische gezichtsveld te garanderen, omdat de tafel zeer compact is.
5. Verwijder de impactor wanneer de kneuzing is voltooid en observeer de mate van dwarslaesie onder de operatiemicroscoop. In de milde groep kan een lichtrode kleurverandering worden gezien, terwijl in de gematigde groep de verwondingsplaats donkerrood vertoont in 3-4 s, en mogelijk kan eminentie worden waargenomen. In de ernstige groep kunnen de donkerrode manifestaties onmiddellijk verschijnen en manifesteert zich duidelijke eminentie in de dura, maar de dura is nog steeds in een consistente vorm (figuur 3F).
6. Hecht de oppervlakkige fascia en huid met hechtingen (polypropyleen niet-absorbeerbare hechting, grootte: 6-0).
7. Na het voltooien van de hechting steriliseert u het chirurgische gebied, plaatst u de muis op een temperatuurgecontroleerde pad totdat het volledige bewustzijn is hersteld en plaatst u de muis vervolgens in de muizenkooien.

4. Verzorging van dieren

1. Plaats het dier op het verwarmingskussen voor herstel en observeer de beweging van beide achterpoten.
   OPMERKING: Dieren die een operatie hebben ondergaan, mogen niet worden teruggebracht naar het gezelschap van andere dieren totdat ze volledig zijn hersteld.
2. Leg een hoogwaterdieet op de vloer van de kooi, zodat dieren het voedsel gemakkelijk kunnen bereiken. U kunt ook een kooi met een lagere voedertafel gebruiken.
3. Leeg de blaas van de muizen twee keer per dag na de operatie omdat het moeilijk is voor de matige en ernstige letselgroepen om de blaasfunctie te herstellen. Injecteer buprenorfine voor analgesie (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 8-12 uur / dag gedurende 3 dagen.

5. Transcardiale perfusie, kleuring en immunostaining

1. Op de 1e, 28e en 56e dag na het letsel offert u respectievelijk één muis van elke groep door perfusie.
   1. Perfuseer de muizen met 60 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en 20 ml 4% paraformaldehyde na overmatige anesthesie (4% -6% isofluraan).
   2. Verzamel de wervelkolom met een microschaar, die zich respectievelijk rostrale en caudally 1 cm uitstrekt van het laesiecentrum.
   3. Resecteer de overtollige spieren, reserveer intacte wervelkolomsegmenten met gedeeltelijke ribben voor instrumenten om vast te houden in stap 5.1.4 en week het in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur.
   4. Klem de ribben met hemostatische tang voor fixatie en definieer het laesiecentrum onder de microscoop volgens de gereseceerde lamina en kleurverandering in het laesiecentrum van het ruggenmerg.
   5. Reseceer alle laminae en gewrichtsprocessen met een microschaar van de caudale.
   6. Knip de zenuwwortels af met een microschaar en verwijder het ruggenmerg.
   7. Verzamel 0,5 cm van het ruggenmerg dat zich respectievelijk caudaal en rostrale uitstrekt van het laesiecentrum met een microschaar.
   8. Zet het ruggenmerg in 30% sucrose op 4 °C gedurende 48 uur.
2. Snijd de weefsels in 6 μm dikke secties na het invriezen volgens het histologische onderzoekstype.
3. Voer hematoxyline en eosine (H &E) kleuring uit.
   1. Rewarm de secties opnieuw tot kamertemperatuur en week de 6 μm dikke secties in 4% formaldehyde gedurende ongeveer 15 minuten, gevolgd door weken in 1x PBS gedurende 1 minuut vier keer om resterende OCT te verwijderen.
   2. Beits de secties met hematoxyline gedurende 90 s en spoel af met dubbel gedestilleerd water.
   3. Was vervolgens de secties met stromend water gedurende 3 minuten.
   4. Beits met eosine gedurende 4 minuten en week twee keer 30 s in 95% alcohol om overtollig eosine te spoelen.
   5. Ten slotte, droog uit met gradiëntalcohol (95% alcohol en 50% alcohol eenmaal, achtereenvolgens) gedurende 30 s en week in xyleen voor transparantie gedurende 2 minuten. Verzegel vervolgens de monsters met harsgel (coronale vlaksectie: figuur 4; sagittale vlaksectie: figuur 5).
4. Voer immunofluorescente kleuring uit.
   1. Rewarm de secties terug naar kamertemperatuur en week de 6 μm dikke secties in 4% formaldehyde gedurende ongeveer 2 minuten.
   2. Was de secties in TBST gedurende 5 minuten gedurende drie keer.
   3. Incubeer de secties met blokkerende oplossing (10% geitennormaal serum in PBS) en blok gedurende 1 uur om niet-specifieke binding van immunoglobuline te blokkeren.
   4. Incubeer de secties van het ruggenmerg 's nachts bij 4 °C met zowel muis anti-glia fibrillair zuur eiwit (GFAP, een marker voor reactieve astrocyten), polyklonaal antilichaam (1:600) en konijn anti-NF200 antilichaam (1:2000), een marker voor neurofilament in 0,4 ml blokkerende oplossing.
   5. Spoel de secties af met PBS en voeg 0,4 ml blokkerende oplossing toe met Geiten anti-konijn Alexa 594-geconjugeerde IgG (1:1.000) en geiten-antimuis Alexa 488-geconjugeerde IgG (1:1.000) secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   6. Maak beelden met een fluorescerende microscoop op 10x door automatisch panoramisch te scannen op golflengten van respectievelijk 594 nm en 488 nm (figuur 6).
      1. Schakel de fluorescentiemicroscoop in, plaats de dia op het microscooppodium, schakel over naar het fluorescentiekanaal, gebruik de positioneringssleutel om drie tot vier punten op het weefsel te plaatsen en focus om de opname te voltooien. Nadat u klaar bent met fotograferen, slaat u de afbeeldingen van verschillende kanalen op in het gewenste formaat en slaat u de samengevoegde afbeelding op.

Representative Results

Om de precisie van het apparaat te testen, werd de kracht gemeten die drie verschillende massa's gewichten vanaf dezelfde hoogte maakten met behulp van een piekdruktestapparaat. Vierentwintig tests werden uitgevoerd met verschillende gewichtsgroepen, resulterend in (gemiddeld ± SD) 0,323 N ± 0,02 N voor 1,3 g gewichten, 0,543 N ± 0,15 N voor 2,0 g gewichten en 0,723 N ± 0,26 N voor 2,7 g gewichten (figuur 7). Eerdere studies gebruikten dyne (dyn) of Kilodyne (Kdyn) als eenheden om de contusie-intensiteiten te meten. Voor een betere vergelijking met eerdere studies worden de conversies tussen Newton (N) en dyne/Kilodyne vermeld (1 N = 1 kg × 1 m/s² = 1 × 10³ g × 1 × 100 cm/s² = 1 × 10⁵ dyn; 0,323 N = 32,3 Kdyn; 0,543 N = 54,3 Kdyn; 0,723 N = 72,3 Kdyn).

Tabel 1 en figuur 4 tonen gegevens over de laesies van de milde, matige en ernstige groepen op coronale secties. Afgaande op figuur 4, op de 28e dag na het letsel, nam de continuïteit van de onderscheidbare grijze en witte stofgrenzen in de milde, matige en ernstige groepen achtereenvolgens af, waarbij het gebied van littekenweefsel groter werd en een toenemend aandeel op de dwarsdoorsnede van het laesiecentrum. Er waren duidelijke morfologische verschillen in alle experimentele groepen in vergelijking met de normale groep. Dit bewees de rationaliteit van de verdeling van letselgraden in de experimentele groepen.

Tabel 2 en figuur 5 beschrijven letsel van het ruggenmerg op de 1e en 56e dag na het letsel op sagittale secties. Het is te zien dat het laesiegebied geleidelijk aanzienlijk toenam van de milde tot ernstige groepen op de 1e dag na het letsel. Ondertussen was de continuïteit van witte stof aan beide zijden van het ruggenmerg beter in de milde groep, met waarneembare kleine ronde vacuolen, die de kenmerken zijn van interstitieel oedeem. In de gematigde groep vertoonde de witte stof een slechte continuïteit en was de structuur van de ventrale witte stof niet geordend. In de ernstige groep vertoonde de ventrale witte stof ernstiger verstoring en een groot deel van de holte verscheen in het midden van de verwonding. Bovendien vertoonde het omliggende weefsel een duidelijke vulling van de rode bloedcellen en de rode bloedcellen in de buurt van het centrale kanaal verzamelden zich in stroken. Op de 56e dag na het letsel werd littekenvorming waargenomen in het letselcentrum van de drie groepen, waarvan het gebied toenam afhankelijk van de ernst van het letsel.

De integriteit van het ruggenmergneurfilament op de 56e dag na het letsel kan ook worden afgeleid uit de analyse van de immunofluorescentiekleuringsresultaten (figuur 6). De figuur laat ook zien dat overlappende littekenvormende astrocyten zichtbaar waren in het midden van alle drie de groepen verwondingen, waarbij de lengte van het letselgebied toenam met de ernst van het letsel, terwijl de littekendiameter afnam. Dit suggereert de aanwezigheid van littekencontractuur, wat kan leiden tot een afname van de diameter van het ruggenmerg.

Figuur 1: Een geheel en delen tentoonstelling van het coaxiale platform van de dwarslaesie. (A) De X-Y-Z-arm en de operatietafel kunnen worden gescheiden, waardoor voldoende ruimte overblijft voor de operatieprocedure waarbij het ruggenmerg van een klein dier wordt blootgesteld. De operatietafel kan tijdens het gebruik vrij worden verplaatst, waardoor potentiële bedrijfsmoeilijkheden als gevolg van positiebeperkingen worden verminderd. Het lichaam van de wervelstabilisator heeft een universele arm met drie gewrichten voor richtingsondersteuning, wat de flexibiliteit verhoogt. (B) Plaats de punt van het botslichaam in de mouw en monteer deze laatste in de X-Y-Z-arm. Plaats de punt van de trekpen in de gaten van het gewicht om te voorkomen dat het gewicht daalt en plaats het gewicht in de mouw. Met de onderdelen geassembleerd, lokaliseer het beoogde letselgebied onder de microscoop. Laat vervolgens de X-Y-Z-arm zakken totdat het einde van de punt van het botslichaam consistent is met het lagere niveau van het observatievenster, wat aangeeft dat een uniforme kneuzingshoogte is bereikt (de hoogte tussen het gewicht en de punt van het botslichaam is 22 mm wanneer het vallen begint). Trek aan de trekpen en de impact is klaar. (C) Nadat het verwondingsgebied is blootgesteld, gebruikt u de clips om de wervelkolom van de muis en de aanhaalbout te klemmen en te bevestigen om de wervelstabilisator te stabiliseren. (D) Aanbevolen functies voor groeven op de operatietafel. Het proefdier moet in de middelste groef worden geplaatst, met het hoofd naar het voorste, thoracale deel op de helling. De X-Y-Z arm is gescheiden van de operatietafel. (E) Een display van het geassembleerde SCICP. Pijlen geven de onderdelen aan. Met de punt gericht op het doelkneuzingsgebied, om de kneuzing te starten, trekt u de trekpen eruit en het gewicht zal op de impactorpunt vallen om het ruggenmerg te kneuzingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Een beeldgrafiek van de T13 costovertebrale wervellokalisatiemethode. (A) De 13e rib en T13 zijn relatief constante anatomische structuren. De T13 costovertebrale hoek kan eenvoudig worden gedetecteerd onder de microscoop, van waaruit de operator naar het spineuze proces kan tasten en de T12-T13 interspineuze ruimte kan vinden. Onderzoek vervolgens achtereenvolgens naar de rostrale kant om de doelletselwervel (bijvoorbeeld T9) te vinden. (B) Een minimaal invasieve 9e thoracale laminectomie kan adequate lamina- en facetgewrichten tussen aangrenzende wervellichamen behouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Blootstelling en kneuzing van het ruggenmerg op T9-niveau bij muizen. (A) Onderzoek de T13 costovertebrale hoek. (B) Met de paraspinale spier ingetrokken door micro-retractors om voldoende ruimte te maken voor gebruik, stelt u de T9 bloot. (C) Voer T9 laminectomie uit met een microschaar. (D) Stabiliseer de wervel met de clips van de wervelstabilisator. (E) Richt op het doelkneuzingsgebied met de punt van het botslichaam. (F) Oedeem en congestie worden opgemerkt in het letselgebied na kneuzing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve secties op de 28e dag na verschillende graden van dwarslaesie bij muizen (coronale secties). (A) Normaal thoracale ruggenmerg van de muis. Schaalbalk = 500 μm. (B) Voor de milde groep kan licht letsel worden opgemerkt in het dorsale aspect van het ruggenmerg, terwijl de morfologie van de gespaarde witte stof en grijze stof aanzienlijk bewaard blijft. (C) Voor de matige groep wordt duidelijk littekenweefsel waargenomen in het ruggenmerg (aangegeven met het rode sterretje). De onderscheidende eigenschappen tussen witte stof en grijze stof zijn nauwelijks te onderscheiden. (D) Relatief gezien heeft het ruggenmerg van de ernstige groep bijna zijn oorspronkelijke morfologie verloren en is het bijna vervangen door littekenweefsel. De groene stippellijn geeft het gebied van schade aan en de zwarte stippellijn geeft de grens van de waarneembare grijze stof aan. Naarmate de ernst van het letsel toenam, verscheen een grotere laesie en minder gespaarde structuur in het ruggenmerg van de muis, waarbij de rand van grijze stof nauwelijks te onderscheiden was. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatieve secties op de 1e en 56e dag na letsel aan het ruggenmerg van muizen (sagittale secties). (A) Normaal thoracale ruggenmerg van de muis. (B) B1-B3 vertegenwoordigen respectievelijk het ruggenmerg op de 1e dag na het letsel in de milde, matige en ernstige groepen. Het is te zien dat, naarmate de schade toenam, een groter gebied werd verstoord of vloeibaar werd gemaakt in het laesiecentrum. De continuïteit van witte stof in het ventrale ruggenmerg verschilde door verschillende letselintensiteiten. B1 laat zien dat de witte stof in het ventrale ruggenmerg een betere continuïteit heeft bij licht oedeem. B2 vertoont een slechtere continuïteit van de witte stof in het ventrale ruggenmerg en ernstiger oedeem. Het weefsel in het midden van de B3 SCI heeft bijna alle continuïteit verloren en er is uitgebreid oedeem in het gebied buiten het centrum van de verwonding. (C) C1-C3 vertegenwoordigen respectievelijk het ruggenmerg op de 56e dag na het letsel in de milde, matige en ernstige groepen. Verschillende gradaties van littekencontractuur manifesteerden zich in het letselcentrum tussen verschillende groepen en er was een significant verschil in de diameter van het letselgebied. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6: Representatieve secties op de 56e dag na letsel aan het ruggenmerg bij muizen (sagittale secties). (A) Representatief gedeelte van de milde groep. NF200 geeft het neurofilament aan, terwijl GFAP astrocyten aangeeft. Overlappende astrocyten worden waargenomen in het epicentrum van de laesie, terwijl het neurofilament in het ventrale deel van het ruggenmerg in goede continuïteit is. (B) Representatieve afdeling van de gematigde groep. Twee littekencentra kunnen worden waargenomen (aangegeven door rode sterretjes) naast overlappende astrocyten, terwijl het neurofilament in het ventrale aspect continuïteit heeft. (C) Representatief deel van de ernstige groep, met een groot laesiebereik en massieve littekenvormende astrocyten. Er is geen duidelijk littekencentrum waargenomen en het neurofilament heeft een slechte continuïteit. Schaalbalk= 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Kracht gegenereerd vanaf dezelfde hoogte maar met verschillende gewichten. Vóór het experiment werd de kracht gegenereerd door verschillende massa's gewichten die vrijkwamen van dezelfde hoogte gedetecteerd met behulp van een piekdrukdetectieapparaat. Nadat elke groep 24 detecties had voltooid, werden betrouwbaardere zwaartekrachtgegevens verkregen voor de referentie van slagkracht. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de statistische software SPSS19.0. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD, n = 24 in elke groep. Vergelijkingen tussen meer groepen waren gebaseerd op een eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) die werd gebruikt om de verschillen te testen; p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

28 dpi
Groep	GMR (%)	WMR (%)	DR (%)
Normaal	35.44	64.57	0
Redelijk	11.59	64.88	23.53
Gematigd	0	41.14	58.86
Ernstig	0	0	100

Tabel 1: Snelheid van witte stof, grijze stof en schade op de 28e dag na het letsel. Afkortingen: dpi = dagen na het letsel, DA = beschadigd gebied; GMR = grijze stof snelheid; WMR = witte stof snelheid; DR = beschadigde snelheid.

Groep	1dpi DA (μm2)	56dpi DA (μm2)
Normaal	0	0
Redelijk	2391250	666091
Gematigd	4383381	1263191
Ernstig	5118833	1943962

Tabel 2: Vergelijkingen tussen de laesie op sagittale secties op de 1e en 56e dag na het letsel.

Discussion

Via de gestandaardiseerde procedure kunnen stabiele gegevens worden verkregen, vooral in in vivo experimenten met kleine dieren, die de afwijking van de resultaten veroorzaakt door individuele verschillen tussen de dieren kunnen minimaliseren. Op basis van de bovenstaande omstandigheden en handige toepassingsinstrumenten kunnen gestandaardiseerde, minimaal invasieve, nauwkeurige en herhaalbare SCI-modellen worden vastgesteld.

Vanwege de uitvoerbaarheid en het gemak werd voorheen de weight drop impactor meestal^{gebruikt 3}. De impactor die in deze studie wordt geïntroduceerd, deelt hetzelfde principe met Allens model¹². Gelukkig heeft het onderzoeksteam, vanwege de nauwkeurige productievoordelen van moderne bewerkingstechnologie, een impactor ontworpen met de voordelen dat het gemakkelijk te bedienen, sterk stabiel en zelden onnauwkeurig is. Een piekdrukdetectieapparaat werd gebruikt om de zwaartekracht van verschillende gewichten te meten. Eerdere studies ^6,10 over de Infinite Horizons-impactor meldden dat een ±5 Kdyn-krachtbereik dat afwijkt van de beoogde kracht wordt geaccepteerd in de groepen 30 Kdyn, 50 Kdyn en 70 Kdyn, wat een referentie biedt voor de huidige studie in termen van groepsverdeling en contusiegraadselectie. In het huidige onderzoek werd de mogelijke kracht van verschillende groepen vooraf gemeten en werden nauwkeurigere gegevens verkregen.

Kritischer dan het apparaat in diermodelexperimenten is het begrijpen en gebruiken van de anatomie van muizen. Goed gebruik maken van anatomie kan procedures minimaal invasief maken. Minimaal invasieve chirurgie heeft direct invloed op de stabiliteit van de functionele toestand van het proefdier en de consistentie van het daaropvolgende muizenherstel. Eerdere studies hebben aangetoond dat de minimaal invasieve vestiging van SCI-modellen de stabiliteit van de wervelstructuur verhoogt en extra schade veroorzaakt door spinale instabiliteit tijdens herstel bij ratten^{voorkomt 1}. Het uitgangspunt van minimaal invasieve chirurgie is het redelijke gebruik van natuurlijke anatomische structuren. Daarom moet het snel en nauwkeurig lokaliseren van ruggenmergsegmenten worden gedaan in overeenstemming met de anatomische structuur van muizen. Zoals gemeld, werd de beeldvormingsmethode gebruikt om de wervel¹³ te vinden. Hoewel het een hoge nauwkeurigheid heeft, heeft de beeldvormingsmethode voor het lokaliseren in het eigenlijke experimentele bewerkingsproces de nadelen van ongemakkelijke werking, lange bedrijfstijd, complexe apparatuuracquisitie en hoge vereisten voor apparatuurnauwkeurigheid. McDonough et al. beschreven het lokaliseren van de T7 door de inferieure hoeken van de schouderbladen¹⁴, terwijl muizen handelen in een leugen voorovergebogen, dus de genoemde inferieure hoeken worden verondersteld posterieure hoeken te zijn. Bovendien is het gebruik van de onderste scapulaire tips om de T7 te vinden een lokalisatiemethode voor een specifieke positie in de menselijke anatomie¹⁵, die niet geschikt is voor muizen. Ten slotte valideerden Micro-CT-gegevens ook de hypothese dat de achterste hoeken van de scapulae niet gelijk zijn met T7, ongeacht of de muis zich in zijn natuurlijke of specifieke lichaamspositie bevindt. McDonough et ^al.14 noemden ook het lokaliseren van het hoogste punt van de rug wanneer de muis gebogen is en het definiëren van het hoogste punt als T12. Relatief gezien bevindt de T9 zich in het huidige onderzoek met behulp van T12-T13 interspineuze ruimte, die noch geassocieerd is met noch beïnvloed wordt door de houding van de muis. Bovendien kan met deze methode de doelwervel gemakkelijk worden gelokaliseerd en geopereerd. Men moet de 13e rib onder de microscoop onderzoeken, voorzichtig het gebied van de costovertebrale hoek aanraken, een lijn trekken naar het spineuze proces en vervolgens de ruimte tussen de processus spinosus van de T12-T13 naar het hoofd onderzoeken. Het onderzoeksteam gebruikte de T12-T13 interspineuze ruimte om de T9 van 12 muizen te lokaliseren. Ten slotte hadden 12 vrouwelijke C57BL / 6J-muizen een Micro-CT-scan na de T9-locatie en laminectomie. Het resultaat van de Micro-CT-scan gaf aan dat de verwijderde laminae bij alle 12 muizen T9 waren. De resultaten van de Micro-CT toonden aan dat alle T9 nauwkeurig gelokaliseerd waren en dat de nauwkeurigheid significant hoger was dan de scapula-lokalisatiemethode. Deze methode biedt ons een snelle en nauwkeurige manier om te lokaliseren, wat bijdraagt aan de consistentie van het blessuremodel.

De minimale invasiviteit van het huidige protocol wordt voornamelijk uitgesproken in drie aspecten. Ten eerste worden de paraspinale spieren op T9-niveau na het lokaliseren alleen ingetrokken door micro-retractors, zonder de spieren op het T8- of T10-niveau te beschadigen. Bovendien interfereert de blootstelling van de lamina door de micro-retractors niet met het gezichtsveld. Ten tweede is het bloedverlies, dat meestal afkomstig is van laminectomie, die bloeduitstroom uit het cancellous bot kan veroorzaken, erg laag in de operatieprocedure, bijna niet meer dan het volume om een driehoekig stuk katoen van 2 mm x 2 mm x 3 mm te kleuren. Ten derde werd laminectomie in de grootste mate beperkt tot het benodigde gebied, waardoor de continuïteit van het laterale deel van de lamina werd gehandhaafd en de wervelinstabiliteit sterk werd verzwakt. In vergelijking met eerdere protocollen^16,17 vermindert het huidige protocol veel onnodige schade.

Om de verschillende graden van dwarslaesie te evalueren, werden de resultaten tussen alle groepen in de histopathologie vergeleken met wat eerdere studies al^{hebben aangetoond 9,11,18}. Deze resultaten zijn voldoende om een observationele studie van verschillende gradaties van letsel en veranderingen in verschillende perioden te voltooien. HE en immunofluorescentie toonden aan dat, met toename van de ernst van dwarslaesie, meer abnormale morfologie verscheen in het ruggenmergweefsel, en de toename van de mate van schade leidde ook tot een toename van de mate van structurele aandoening van het ruggenmerg. Vanuit het perspectief van weefselmorfologieobservatie zijn de mate en regelmaat van weefselmorfologieveranderingen in elke experimentele groep in deze studie zeer consistent met eerdere studies.

Volgens de huidige histologische testresultaten worden duidelijke veranderingen in verschillende indicatoren na verschillende gradaties van traumatische dwarslaesie aangegeven, wat de betrouwbaarheid van het model dat in deze studie is vastgesteld, verder bevestigt.

Hoe nauwkeurig en effectief de techniek ook is, er kunnen potentiële beperkingen bestaan voor de methoden. Met betrekking tot laminectomie moet de operator bekwaam zijn met operaties onder de microscoop om te voorkomen dat het ruggenmerg per ongeluk wordt beschadigd. Ook is de opstelling van het hele platform gebaseerd op mechanische structuren, waardoor een hogere vraag naar de operator wordt ingesteld in vergelijking met geautomatiseerde apparatuur. Inderdaad, alle genoemde problemen kunnen worden verbeterd door herhaalde training van de operatie.

Het kan worden gezien dat minimaal invasieve en gestandaardiseerde modellering nuttig is om de resultaten uniformer, stabieler en herhaalbaarder te maken, de effectiviteit van verschillende behandelplannen nauwkeurig te evalueren en het onderzoeksplan voor traumatische dwarslaesie te optimaliseren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% fixative solution	Solarbio	P1110	4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody	abcam	ab8135	Dilution ratio (1: 2000)
Eosin Staining Solution (water soluble)	biosharp	BL727B
Ethanol	Fuyu Reagent	64-17-5
Fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X800
Frozen Slicer	leica	CM3050 S
GFAP (GA5) Mouse mAb	Cell Signaling TECHNOLOGY	#3670	Dilution ratio (1: 600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32723TR	Dilution ratio (1: 1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32740	Dilution ratio (1: 1000)
Hematoxylin Staining Solution	biosharp	BL702A
Mice	Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany	C57BL/6J
Microsurgery apparatus	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	All the surgey instruments are custom-made	Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution)	Zhong Shan Jin Qiao	ZLI-9022	working solution
O.C.T. Compound	SAKURA	4583
PBS (phosphate buffered solution)	Solarbio	P1020	pH 7.2-7.4
RWD Laboratory inhalation anesthetic station	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Small animal in vivo microCT imaging system	PerkinElmer	Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Custom-made(Feng's standard)	(https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1)
Surgery microscope	Zumax Medical Co., Ltd.	zumax, OMS2355
TBST (Tris Buffered Saline+Tween)	Solarbio	T1082	Dilution ratio (1: 19)
Xylene	Fuyu Reagent	1330-20-7