Établissement d’un modèle de lésion médullaire par contusion chez la souris basé sur une technique mini-invasive

Summary

Des techniques mini-invasives et un dispositif de laboratoire simple améliorent la reproductibilité du modèle de lésion de la moelle épinière en réduisant les dommages opératoires chez les animaux de laboratoire et en permettant le maintien de la morphologie anatomique. La méthode est intéressante car les résultats fiables et la procédure reproductible facilitent les recherches sur les mécanismes de réparation des maladies.

Abstract

L’utilisation de méthodes mini-invasives pour modéliser les lésions de la moelle épinière (LME) peut minimiser les différences comportementales et histologiques entre les animaux de laboratoire, améliorant ainsi la reproductibilité des expériences.

Ces méthodes nécessitent deux exigences pour être remplies: la clarté du parcours anatomique chirurgical et la simplicité et la commodité du dispositif de laboratoire. Fondamentalement pour l’opérateur, une voie anatomique claire fournit une exposition peu invasive, ce qui évite des dommages supplémentaires à l’animal de laboratoire pendant les procédures chirurgicales et permet à l’animal de maintenir une morphologie anatomique cohérente et stable pendant l’expérience.

Dans cette étude, l’utilisation d’une nouvelle plateforme intégrée appelée plateforme coaxiale SCI pour les lésions de la moelle épinière chez les petits animaux afin d’exposer la moelle épinière de niveau T9 de manière peu invasive et de stabiliser et immobiliser la vertèbre de souris à l’aide d’un stabilisateur vertébral est étudiée et, enfin, un impacteur de gravité coaxial est utilisé pour contuse la moelle épinière de souris à approcher différents degrés de lésion de la moelle épinière T9. Enfin, les résultats histologiques sont fournis à titre de référence pour les lecteurs.

Introduction

Les lésions traumatiques de la moelle épinière (LME) prédisposent facilement l’individu à des conséquences graves¹; Néanmoins, il n’existe actuellement aucun traitement efficace ^1,2. Les modèles de contusion animale sont l’une des principales méthodes d’étude des lésions médullaires ^3,4.

De 2004 à 2014⁴, des rats ont été utilisés comme organismes modèles dans 289 des 407 études (71 %) et des souris dans 69 (16,9 %). En effet, la proportion d’expériences sur des souris a progressivement augmenté au fil des ans en raison de leurs avantages par rapport à d’autres modèles, en particulier le grand potentiel des études de régulation génique ^3,4,5. Par conséquent, des outils plus compatibles sont nécessaires pour mener davantage d’études en utilisant la souris comme modèle en raison de la grande importance accordée à la cohérence du modèle⁶. Les dispositifs courants rapportés dans les études précédentes sont essentiellement basés sur le principe d’impact de la moelle épinière d’Allen, par exemple, l’impacteur de base de perte de poids^7,8, l’impacteur ^1,9 de l’Université de New York (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) et l’impacteur Infinite Horizon (IH)^10,11 . L’impacteur de perte de poids et l’impacteur NYU / MASCIS partagent le même principe de viser la moelle épinière ciblée et de laisser tomber un poids fixe de différentes hauteurs pour faire différentes sévérités de blessure. L’impacteur IH crée la lésion de la moelle épinière en fonction de différentes forces.

Pour faciliter l’utilisation du modèle murin dans les études sur les lésions médullaires et pour établir la base de méthodes de traitement efficaces, une plateforme intégrée de lésions de la moelle épinière de souris, appelée plateforme coaxiale pour lésions de la moelle épinière (SCICP), est développée. La plate-forme se compose de quatre composants principaux: (1) une table d’opération pour animaux conçue pour une position appropriée pour les souris opérées, qui est très compacte et offre une commodité sans restriction de position; 2° un micro-rétracteur des deux côtés pour maintenir les muscles paravertébraux pendant l’opération; (3) un stabilisateur vertébral pour maintenir la vertèbre avant l’intervention de SCI (deux stabilisateurs vertébraux sont disponibles pour le fonctionnement sur les animaux plus gros tels que les rats); (4) un manchon, une pointe d’impacteur, des poids et une goupille de traction. Les trois parties doivent être assemblées dans un bras X-Y-Z amovible. Pour un ciblage précis, une pointe d’impacteur est placée à la surface de la moelle épinière et le bras X-Y-Z est doucement descendu à la hauteur prévue à l’aide de la marque entre la pointe de l’impacteur et le manchon. L’embout de l’impacteur est fait d’un alliage d’aluminium de 0,12 g pour éviter les dommages à la moelle épinière attribués à une compression de poids importante avant la procédure. La goupille de traction sert à maintenir les poids sur le dessus du manchon pour préparer la perte de poids (Figure 1).

Dans les études précédentes, la division de la force d’impact a été définie en fonction des données de force d’impact du dispositif IH, qui sont respectivement de 30 Kdyn, 50 Kdyn et 70 Kdyn, ^6,10. Au cours du processus de recherche, il a été prouvé que les degrés en série des modèles de LM étaient établis sur la base du SCICP, qui peut être utilisé dans diverses études. Par conséquent, avant de commencer officiellement l’expérience, les forces d’impact générées par divers poids de masses différentes ont été testées à l’aide d’un dispositif d’essai de pression de crête. En conséquence, trois modèles de souris représentatives normalisées de LM ont été sélectionnés comme trois degrés de blessure différents, y compris les groupes gradués légers, modérés et graves, respectivement ^6,10, et les poids ont été libérés à la même hauteur, avec un poids de 1,3 g pour les dommages légers, 2,0 g pour les dommages modérés et ^2,7 g pour les dommages graves.

Comme autre moyen de garantir l’opérabilité et la précision, une approche opératoire nouvelle et peu invasive est rapportée. En faisant des recherches sur l’anatomie de souris normales, une nouvelle méthode pour localiser l’espace interépineux de T12-T13 est trouvée. La méthode de localisation des vertèbres dans les étapes de l’opération est facile à maîtriser et précise, ce qui garantit une localisation précise pour les opérations mini-invasives.

Espérons que cette technique de lésion de contusion peut aider à la recherche et à la compréhension des lésions de la moelle épinière, y compris la compréhension de la physiopathologie, l’évaluation de la gestion, etc.

Protocol

NOTE: Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité d’éthique et de bien-être des animaux de laboratoire du Collège de médecine Cheeloo de l’Université du Shandong (numéro d’approbation: 21L60) et ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publié par les National Institutes of Health (NIH Publications n ° 85-23, révisé en 1996).

1. Mécanisme de la plate-forme coaxiale de lésion de la moelle épinière et tests mécaniques

1. Assemblez la plate-forme à l’aide d’une table d’opération chirurgicale, d’un stabilisateur vertébral et d’une pointe d’impacteur (Figure 1).
   REMARQUE: Gardez les fentes de perte de poids et d’échappement, qui empêchent le poids de rencontrer les courants d’air, propres, car toute saleté sur la chute de poids ou le manchon pourrait affecter la précision de la plate-forme.
2. Placez l’embout, qui permet une localisation précise de la moelle épinière, dans la manche.
3. Sélectionnez les masses appropriées des gouttes de poids pour l’expérience, qui sont de 1,3 g, 2,0 g et 2,7 g pour les groupes légers, modérés et sévères, respectivement.
4. Branchez la goupille de traction dans les trous de la perte de poids.
5. Assemblez la perte de poids jusqu’au sommet du manchon avec la goupille de traction insérée dans la rainure du bras X-Y-Z de sorte que, une fois la localisation terminée, le poids soit libéré pour frapper l’extrémité de l’élément de frappe, confondant ainsi la moelle épinière, et que des changements dans la moelle épinière soient observés au microscope.
6. Réglez le bras amovible X-Y-Z de précision de 0,1 mm pour que l’opérateur puisse disposer d’un espace de travail adéquat (Figure 1D, E).
   NOTE: Pour confirmer la cohérence des résultats de l’étude, avant le début de l’expérience, mesurer la force générée lorsque le poids est laissé tomber à l’intérieur du manchon à l’aide d’un dispositif de détection de pression de pointe. Une répétition de la confirmation n’est pas nécessaire pour les études futures.
7. Allumez l’appareil, placez le récepteur de pression métallique sous l’extrémité, mettez l’adaptateur à zéro, relâchez la goupille de traction et enregistrez la force d’impact réelle.

2. Localisation et laminectomie de la 9e vertèbre^thoracique (T9)

NOTE: Les souris femelles C57BL / 6J âgées de 9 à 10 semaines ont été achetées auprès de Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, Chine).

1. Autoclaver une série d’instruments chirurgicaux pour l’expérience et stériliser la table d’opération avec 75% d’alcool avant la chirurgie.
2. Injecter de la buprénorphine pour l’analgésie (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 30 minutes avant l’anesthésie pour les opérations de blessure. Ensuite, anesthésiez la souris avec de l’isoflurane (induction : ~3%-5%, entretien : ~1,5%-2%). Vérifiez si l’animal est complètement anesthésié par les réflexes de pincement de la queue ou des orteils. Une fois l’anesthésie en vigueur, posez la souris en position couchée dans une partie désignée de la table d’opération et enduisez la cornée d’une pommade ophtalmique (appliquez une pommade ophtalmique sur les cornées pour protéger les yeux du dessèchement pendant la chirurgie).
   1. Rasez les cheveux de la caudale au rostral avec un rasoir électrique sur la colonne thoraco-lombaire. Stériliser la peau plusieurs fois dans un mouvement circulaire avec de l’iodophor pendant 30 s et suivi d’alcool à 75%. Appliquez un champ chirurgical stérile et faites une incision longitudinale d’environ 1,5 cm sur la peau d’environ T6 à T13 avec un scalpel et une lame.
      REMARQUE: Palper le long de la marge costale jusqu’à la ligne médiane, où se trouve l’espace interépineux T12-T13. Faites une incision de 1,5 cm au rostral, et l’incision est approximativement affleurante avec des vertèbres T6-T13.
3. Explorez la 13e côte d’un côté de la partie osseuse sous le microscope opératoire. Explorez le processus épineux dans la ligne médiane en touchant légèrement la zone de l’angle costo-tébral, puis vers le rostral pour localiser l’espace interépineux du T12-T13. Explorez l’espace interépineux du T9-T10 de l’espace du T12-T13 au côté rostral. (Figure 2A, 3A)
4. Disséquer le muscle paraspinal le long de l’apophyse épineuse du T9 jusqu’aux facettes antérieures et postérieures des deux côtés à l’aide de micro-ciseaux (Figure 3B). Rétractez les muscles paraspinaux avec des micro-rétracteurs et nettoyez les tissus mous sur la lame et dans l’espace interépineux des T8-T9 et T9-T10 avec des micro-ciseaux.
5. Effectuez une laminectomie T9, serrez l’apophyse épineuse de T9 avec une pince microchirurgicale, soulevez-la légèrement, insérez les micro-ciseaux parallèlement le long du côté dorsolatéral droit de la lame, en évitant d’endommager la moelle épinière, et coupez la lame avec des micro-ciseaux. Répétez l’opération sur le côté gauche et la moelle épinière peut être exposée (Figure 2B, 3C).
6. Avant de fixer la vertèbre, desserrez le bras universel et serrez lentement les articulations des facettes 9e à 10e des deux côtés de la vertèbre avec la micro-pince anti-moustiques du stabilisateur vertébral. Serrez les vis sur les micro pinces anti-moustiques, et la vertèbre est ainsi stabilisée. Ajustez la moelle épinière au plan horizontal, serrez le bras universel et la vertèbre est fixée (Figure 3D).

3. Lésion de contusion T9

1. Une fois que la moelle épinière de niveau T9 est exposée et que la vertèbre est fixée, visez la moelle épinière par l’extrémité à l’intérieur du manchon sous le microscopique opératoire (Figure 3E).
2. Vérifiez si la surface de la pointe est parallèle à la moelle épinière des aspects postérieurs et latéraux de la moelle épinière, car il est facile d’observer la relation entre la moelle épinière et la pointe au microscope et que la table d’opération peut être tournée facilement.
3. Vérifiez si la surface de la pointe est parallèle aux bords bilatéraux de la lame épargnée avant que la pointe ne soit en contact avec la moelle épinière après la laminectomie, car il s’agit d’un plan de référence naturel parallèle à la moelle épinière.
4. Après avoir localisé l’espace interépineux du T12-T13, abaisser le manchon jusqu’à ce que l’extrémité de l’élément de frappe soit conforme à la marque sur la fenêtre d’observation et que la hauteur spécifiée de 22 mm soit atteinte. Retirez la goupille de traction pour libérer le poids (1,3 g, 2,0 g ou 2,7 g selon le groupe, chaque groupe comprenant 3 souris et chaque groupe ayant une souris pour chaque point temporel).
   NOTE: La moelle épinière doit être parallèle au sol et perpendiculaire à la pointe; Déplacez la table d’opération pour assurer le champ visuel microscopique, car la table est très compacte.
5. Retirez l’élément de frappe lorsque la contusion est terminée et observez le degré de LME au microscope opératoire. Dans le groupe léger, une altération de la couleur rouge clair peut être observée, tandis que dans le groupe modéré, le site de la blessure présente un rouge foncé en 3-4 s et, éventuellement, une éminence peut être observée. Dans le groupe sévère, les manifestations rouge foncé peuvent apparaître immédiatement, et une éminence évidente dans la dure-mère se manifeste, mais la dure-mère est toujours dans une forme cohérente (Figure 3F).
6. Suturer le fascia superficiel et la peau avec des sutures (suture non résorbable en polypropylène, taille: 6-0).
7. Après avoir terminé la suture, stérilisez la zone chirurgicale, placez la souris sur un tampon à température contrôlée jusqu’à ce que la pleine conscience soit rétablie, puis mettez la souris dans les cages à souris.

4. Soins aux animaux

1. Placez l’animal sur le coussin chauffant pour la récupération et observez le mouvement des deux membres postérieurs.
   REMARQUE : Les animaux qui ont subi une intervention chirurgicale ne doivent pas être retournés en compagnie d’autres animaux avant d’être complètement rétablis.
2. Mettez un régime riche en eau sur le sol de la cage afin que les animaux puissent facilement atteindre la nourriture. Vous pouvez également utiliser une cage avec une table d’alimentation plus basse.
3. Videz la vessie des souris deux fois par jour après l’opération, car il est difficile pour les groupes de blessures modérées et graves de récupérer la fonction de la vessie. Injecter de la buprénorphine pour l’analgésie (0,05-2,0 mg / kg, SQ) 8-12 h / jour pendant 3 jours.

5. Perfusion transcardique, coloration et immunomarquage

1. Les 1er, 28e et 56e jours après la blessure, sacrifiez une souris de chaque groupe, respectivement, par perfusion.
   1. Perfuser les souris avec 60 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 20 mL de paraformaldéhyde à 4 % après une anesthésie excessive (4 % à 6 % d’isoflurane).
   2. Recueillir la colonne vertébrale avec des micro-ciseaux, s’étendant rostralement et caudalement 1 cm, respectivement, du centre de la lésion.
   3. Réséquer l’excès musculaire, réserver les segments intacts de la colonne vertébrale avec des côtes partielles pour que les instruments tiennent à l’étape 5.1.4 et le tremper dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 24 h.
   4. Serrez les côtes avec une pince hémostatique pour la fixation et définissez le centre de la lésion au microscope en fonction de la lame réséquée et de l’altération de la couleur dans le centre de la lésion de la moelle épinière.
   5. Réséquer toutes les lames et les processus articulaires avec des micro-ciseaux du caudale.
   6. Coupez les racines nerveuses avec des micro-ciseaux et retirez la moelle épinière.
   7. Recueillir 0,5 cm de la moelle épinière s’étendant caudalement et rostrallement, respectivement, du centre de la lésion avec des micro-ciseaux.
   8. Mettre la moelle épinière dans du saccharose à 30% à 4 °C pendant 48 h.
2. Couper les tissus en sections de 6 μm d’épaisseur après congélation selon le type d’examen histologique.
3. Effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E).
   1. Réchauffer les sections à température ambiante et faire tremper les sections de 6 μm d’épaisseur dans du formaldéhyde à 4 % pendant environ 15 min, puis les tremper dans 1x PBS pendant 1 min quatre fois pour éliminer les OCT résiduels.
   2. Teindre les sections avec de l’hématoxyline pendant 90 s et rincer à l’eau bidistillée.
   3. Ensuite, lavez les sections à l’eau courante pendant 3 min.
   4. Colorer avec de l’éosine pendant 4 min et tremper dans de l’alcool à 95% pendant 30 s deux fois pour rincer l’excès d’éosine.
   5. Enfin, déshydrater avec de l’alcool gradient (95% d’alcool et 50% d’alcool une fois, successivement) pendant 30 s et tremper dans du xylène pour plus de transparence pendant 2 min. Ensuite, scellez les échantillons avec du gel de résine (section plan coronal : figure 4 ; section plan sagittal : figure 5).
4. Effectuer une coloration immunofluorescente.
   1. Réchauffer les sections à température ambiante et faire tremper les sections de 6 μm d’épaisseur dans du formaldéhyde à 4 % pendant environ 2 min.
   2. Laver les sections dans TBST pendant 5 minutes pendant trois fois.
   3. Incuber les coupes avec une solution bloquante (10% de sérum normal de chèvre dans du PBS) et bloquer pendant 1 h pour bloquer la liaison non spécifique de l’immunoglobuline.
   4. Incuber les sections de la moelle épinière pendant la nuit à 4 °C avec la protéine acide fibrillaire anti-glie de souris (GFAP, un marqueur des astrocytes réactifs), l’anticorps polyclonal (1:600) et l’anticorps anti-NF200 de lapin (1:2000), un marqueur du neurofilament dans 0,4 mL de solution bloquante.
   5. Rincer les sections avec du PBS et ajouter 0,4 mL de solution bloquante avec des IgG conjugués Alexa 594 anti-lapin de chèvre (1:1 000) et des anticorps secondaires IgG conjugués Alexa 488 (1:1 000) anti-souris de chèvre pendant 1 h à température ambiante.
   6. Prenez des images avec un microscope fluorescent à 10x par balayage panoramique automatique à des longueurs d’onde de 594 nm et 488 nm, respectivement (Figure 6).
      1. Allumez le microscope à fluorescence, placez la lame sur la scène du microscope, passez au canal de fluorescence, utilisez la touche de positionnement pour positionner trois à quatre points sur le tissu et effectuez la mise au point pour terminer la prise de vue. Une fois la prise de vue terminée, enregistrez les images des différentes chaînes dans le format souhaité, puis enregistrez l’image fusionnée.

Representative Results

Pour tester la précision de l’appareil, la force exercée par trois masses différentes de poids à partir de la même hauteur a été mesurée à l’aide d’un dispositif d’essai de pression de crête. Vingt-quatre essais ont été effectués avec différents groupes de poids, ce qui a donné (moyenne ± écart-type) 0,323 N ± 0,02 N pour des poids de 1,3 g, 0,543 N ± 0,15 N pour des poids de 2,0 g et 0,723 N ± 0,26 N pour des poids de 2,7 g (Figure 7). Des études antérieures ont adopté dyne (dyn) ou Kilodyne (Kdyn) comme unités pour mesurer les intensités de contusion. Pour une meilleure comparaison avec les études précédentes, les conversions entre Newtons (N) et dyne/Kilodyne sont indiquées (1 N = 1 kg × 1 m/s 2 = 1 × 10 3 g × 1 × 100 cm/s² = 1 × 10⁵ dyn; 0,323 N = 32,3 Kdyn; 0,543 N = 54,3 Kdyn; 0,723 N = 72,3 Kdyn).

Le tableau 1 et la figure 4 montrent les données sur les lésions des groupes légers, modérés et sévères sur les sections coronales. À en juger par la figure 4, le 28e jour après la blessure, la continuité des limites distinctes de la substance grise et blanche dans les groupes légers, modérés et sévères a diminué successivement, la zone de tissu cicatriciel s’agrandissant et une proportion croissante sur la section transversale du centre de la lésion. Il y avait des différences morphologiques évidentes dans tous les groupes expérimentaux par rapport au groupe normal. Cela a prouvé la rationalité de la division des degrés de blessure dans les groupes expérimentaux.

Le tableau 2 et la figure 5 décrivent les lésions de la moelle épinière les 1er et 56e jours suivant la lésion sur les sections sagittales. On peut voir que la zone de lésion a progressivement augmenté de manière significative des groupes légers à sévères le 1er jour après la blessure. Pendant ce temps, la continuité de la substance blanche des deux côtés de la moelle épinière était meilleure dans le groupe léger, avec de petites vacuoles rondes observables, qui sont les caractéristiques de l’œdème interstitiel. Dans le groupe modéré, la substance blanche affichait une faible continuité et la structure de la substance blanche ventrale n’était pas ordonnée. Dans le groupe sévère, la substance blanche ventrale présentait une perturbation plus grave et une grande partie de la cavité est apparue au centre de la blessure. De plus, les tissus environnants présentaient un remplissage évident des globules rouges et les globules rouges près du canal central se rassemblaient en bandes. Le 56e jour après la blessure, la formation de cicatrices a été observée dans le centre de la blessure des trois groupes, dont la superficie a augmenté en fonction de la gravité de la blessure.

L’intégrité du neurofilament de la moelle épinière le 56e jour suivant la lésion peut également être déduite de l’analyse des résultats de la coloration par immunofluorescence (Figure 6). La figure montre également que des astrocytes formant des cicatrices qui se chevauchent étaient visibles au centre des trois groupes de blessures, la longueur de la zone de la blessure augmentant avec la gravité de la blessure, tandis que le diamètre de la cicatrice diminuait. Cela suggère la présence d’une contracture cicatricielle, ce qui peut entraîner une diminution du diamètre de la moelle épinière.

Figure 1 : Exposition complète et partielle de la plate-forme coaxiale de la lésion de la moelle épinière. (A) Le bras X-Y-Z et la table d’opération peuvent être séparés, ce qui laisse suffisamment de place pour la procédure opératoire au cours de laquelle la moelle épinière d’un petit animal est exposée. La table d’opération peut être déplacée librement pendant le fonctionnement, ce qui réduit les difficultés de fonctionnement potentielles attribuées aux limitations de position. Le corps du stabilisateur vertébral dispose d’un bras universel à trois articulations pour l’aide à la direction, ce qui augmente sa flexibilité. (B) Placez l’embout de l’élément de frappe dans le manchon et assemblez ce dernier dans le bras X-Y-Z. Placez la pointe de la goupille de traction dans les trous du poids pour empêcher le poids de tomber et placez le poids dans le manchon. Une fois les pièces assemblées, localisez la zone de blessure ciblée au microscope. Ensuite, abaissez le bras X-Y-Z jusqu’à ce que l’extrémité de l’élément de frappe soit compatible avec le niveau inférieur de la fenêtre d’observation, ce qui indique qu’une hauteur de contusion unifiée a été atteinte (la hauteur entre le poids et l’extrémité de l’impacteur est de 22 mm lorsque la chute commence). Tirez sur la goupille de traction et l’impact sera fait. (C) Une fois la zone de blessure exposée, utilisez les clips pour serrer et fixer la colonne vertébrale de la souris et le boulon de serrage pour stabiliser le stabilisateur vertébral. (D) Fonctions recommandées pour les rainures sur la table d’opération. L’animal expérimental est censé être placé dans la rainure médiane, avec la tête vers la partie antérieure thoracique sur la pente. Le bras X-Y-Z est séparé de la table d’opération. (E) Un affichage du SCICP assemblé. Des flèches indiquent les pièces. Avec la pointe visant la zone de contusion cible, pour commencer la contusion, retirez la goupille de traction et le poids tombera sur l’extrémité de l’impacteur pour contuse la moelle épinière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Graphique d’imagerie de la méthode de localisation costo-vertébrale T13. (A) La 13e côte et T13 sont des structures anatomiques relativement constantes. L’angle costovertébral T13 peut être facilement détecté au microscope, à partir duquel l’opérateur peut sonder vers le processus épineux et trouver l’espace interépineux T12-T13. Ensuite, sondez successivement vers le côté rostral pour trouver la vertèbre cible (par exemple, T9). (B) Une 9e laminectomie thoracique mini-invasive peut préserver des articulations de lamina et de facettes adéquates entre les corps vertébraux adjacents. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Exposition et contusion de la moelle épinière de niveau T9 chez la souris. (A) Sonder l’angle costover-tébral T13. (B) Avec le muscle paraspinal rétracté par des micro-rétracteurs pour faire suffisamment d’espace pour le fonctionnement, exposer le T9. (C) Effectuer une laminectomie T9 avec des micro-ciseaux. (D) Stabiliser la vertèbre avec les clips du stabilisateur vertébral. E) Viser la zone de contusion cible avec l’extrémité de l’élément de frappe. (F) Un œdème et une congestion sont notés dans la zone de blessure après la contusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Coupes représentatives au 28e jour après différents degrés de LME chez la souris (coupes coronales). (A) Moelle épinière thoracique normale de la souris. Barre d’échelle = 500 μm. (B) Pour le groupe léger, une légère blessure peut être notée dans la face dorsale de la moelle épinière, tandis que la morphologie de la substance blanche épargnée et de la matière grise est substantiellement préservée. (C) Pour le groupe modéré, un tissu cicatriciel évident est observé dans la moelle épinière (indiqué par l’astérisque rouge). Les caractéristiques différentielles entre la substance blanche et la matière grise peuvent à peine être distinguées. (D) Comparativement, la moelle épinière du groupe sévère a presque perdu sa morphologie d’origine et a presque été remplacée par du tissu cicatriciel. La ligne pointillée verte indique la zone endommagée et la ligne pointillée noire indique la limite de la matière grise observable. Au fur et à mesure que la gravité de la blessure augmentait, une lésion plus grande et une structure moins épargnée sont apparues dans la moelle épinière de la souris, avec la bordure de la matière grise à peine distinguable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Coupes représentatives les 1er et 56e jours après la lésion de la moelle épinière de souris (coupes sagittales). (A) Moelle épinière thoracique normale de la souris. (B) B1-B3 représentent, respectivement, la moelle épinière le 1er jour après la blessure dans les groupes léger, modéré et grave. On peut voir que, à mesure que les dommages augmentaient, une plus grande zone était perturbée ou liquéfiée dans le centre de la lésion. La continuité de la substance blanche dans la moelle épinière ventrale différait en raison de l’intensité différente des blessures. B1 montre que la substance blanche dans la moelle épinière ventrale a une meilleure continuité avec un léger œdème. B2 montre une moins bonne continuité de la substance blanche dans la moelle épinière ventrale et un œdème plus sévère. Le tissu au centre de la lésion médullaire B3 a perdu presque toute continuité, et il y a un œdème étendu dans la zone en dehors du centre de la blessure. (C1-C3 représentent, respectivement, la moelle épinière le 56e jour après la blessure dans les groupes léger, modéré et grave. Différents degrés de contracture cicatricielle se manifestaient dans le centre de la blessure entre différents groupes, et il y avait une différence significative dans le diamètre de la zone de la blessure. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Coupes représentatives au 56e jour après la lésion de la moelle épinière chez la souris (coupes sagittales). (A) Section représentative du groupe bénin. NF200 indique le neurofilament, tandis que GFAP indique les astrocytes. Des astrocytes qui se chevauchent sont observés dans l’épicentre de la lésion, tandis que le neurofilament dans la partie ventrale de la moelle épinière est en bonne continuité. (B) Section représentative du groupe modéré. Deux centres cicatriciels peuvent être observés (indiqués par des astérisques rouges) en plus des astrocytes qui se chevauchent, tandis que le neurofilament dans la face ventrale a une continuité. (C) Section représentative du groupe sévère, avec une large gamme de lésions et des astrocytes cicatriciels massifs. Il n’y a pas de centre cicatriciel évident observé, et le neurofilament a une mauvaise continuité. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Force générée à partir de la même hauteur mais avec des poids différents. Avant l’expérience, la force générée par différentes masses de poids libérées de la même hauteur était détectée à l’aide d’un dispositif de détection de pression de crête. Après que chaque groupe ait effectué 24 détections, des données gravimétriques plus fiables ont été obtenues pour la référence de la force de frappe. Les données ont été analysées à l’aide du logiciel statistique SPSS19.0. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type, n = 24 dans chaque groupe. Les comparaisons entre un plus grand nombre de groupes étaient fondées sur une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) utilisée pour tester les différences; p < 0,05 a été jugé statistiquement significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

28 dpi
Groupe	RMS (%)	TMS (%)	DR (%)
Normal	35.44	64.57	0
Douleur légère	11.59	64.88	23.53
Modéré	0	41.14	58.86
Forte douleur	0	0	100

Tableau 1 : Taux de substance blanche, de matière grise et de dommages au 28e jour suivant la blessure. Abréviations : dpi = jours après la blessure, DA = zone endommagée; GMR = taux de matière grise; WMR = taux de matière blanche; DR = taux de dommages.

Groupe	1dpi DA (μm2)	56dpi DA (μm2)
Normal	0	0
Douleur légère	2391250	666091
Modéré	4383381	1263191
Forte douleur	5118833	1943962

Tableau 2 : Comparaisons entre la lésion sur les coupes sagittales au 1er et au 56e jour après la blessure.

Discussion

Grâce à la procédure normalisée, des données stables peuvent être obtenues, en particulier dans les expériences in vivo sur de petits animaux, ce qui peut minimiser l’écart des résultats causé par les différences individuelles entre les animaux. Sur la base des conditions ci-dessus et des instruments d’application pratiques, des modèles de LME normalisés, peu invasifs, précis et reproductibles peuvent être établis.

En raison de sa praticabilité et de sa commodité, auparavant, l’impacteur de perte de poids était principalement utilisé³. L’impacteur introduit dans cette étude partage le même principe avec le modèle¹² d’Allen. Heureusement, en raison des avantages de fabrication précis de la technologie d’usinage moderne, l’équipe de recherche a conçu un impacteur de perte de poids avec l’avantage d’être facile à utiliser, fortement stable et rarement imprécis. Un dispositif de détection de pression de crête a été utilisé pour mesurer la gravité de différents poids. Des études antérieures^6,10 sur l’impacteur Infinite Horizons ont rapporté qu’une plage de force de ±5 Kdyn s’écartant de la force prévue est acceptée dans les groupes 30 Kdyn, 50 Kdyn et ⁷⁰ Kdyn^, ce qui fournit une référence pour la présente étude en termes de division de groupe et de sélection du degré de contusion. Dans la présente recherche, la force possible des différents groupes a été mesurée à l’avance et des données plus précises ont été obtenues.

Plus critique que le dispositif dans les expériences sur modèles animaux est la compréhension et l’utilisation de l’anatomie de la souris. Faire bon usage de l’anatomie peut rendre les procédures peu invasives. La chirurgie mini-invasive affecte directement la stabilité de l’état fonctionnel de l’animal de laboratoire et la cohérence de la récupération ultérieure de la souris. Des études antérieures ont montré que la mise en place mini-invasive de modèles de LM augmente la stabilité de la structure vertébrale et évite les dommages supplémentaires causés par l’instabilité de la colonne vertébrale pendant la récupération chez le rat¹. La prémisse de la chirurgie mini-invasive est l’utilisation raisonnable de structures anatomiques naturelles. Par conséquent, la localisation rapide et précise des segments de la moelle épinière doit être effectuée conformément à la structure anatomique des souris. Comme indiqué, la méthode d’imagerie a été utilisée pour trouver la vertèbre¹³. Bien qu’elle ait une grande précision, dans le processus d’opération expérimental réel, la méthode d’imagerie pour la localisation présente les inconvénients d’un fonctionnement peu pratique, d’un long temps de fonctionnement, d’une acquisition d’équipement complexe et d’exigences élevées en matière de précision de l’équipement. McDonough et al. ont décrit la localisation du T7 à travers les angles inférieurs des omoplates¹⁴, alors que les souris agissent dans un mensonge prostrés, de sorte que les angles inférieurs mentionnés sont supposés être des angles postérieurs. De plus, l’utilisation des extrémités scapulaires inférieures pour trouver le T7 est une méthode de localisation pour une position spécifique dans l’anatomie humaine¹⁵, qui ne convient pas aux souris. Enfin, les données Micro-CT ont également validé l’hypothèse selon laquelle les angles postérieurs des omoplates ne sont pas affleurants de T7, que la souris soit dans sa position naturelle ou spécifique du corps. McDonough et ^al.14 ont également mentionné la localisation du point le plus élevé du dos lorsque la souris est arquée et la définition du point le plus élevé comme T12. Comparativement, dans la présente recherche, le T9 est localisé à l’aide de l’espace interépineux T12-T13, qui n’est ni associé ni affecté par la posture de la souris. En outre, avec cette méthode, la vertèbre cible peut être facilement localisée et opérée. Il faut sonder la 13ème côte au microscope, toucher doucement la zone de l’angle costo-tébral, tracer une ligne vers le processus épineux, puis sonder l’espace entre les apophyses épineuses du T12-T13 vers la tête. L’équipe de recherche a utilisé l’espace épineux T12-T13 pour localiser le T9 de 12 souris. Enfin, 12 souris femelles C57BL/6J ont subi une micro-tomodensitométrie après la localisation T9 et une laminectomie. Le résultat de la micro-tomodensitométrie a indiqué que les lames enlevées chez les 12 souris étaient T9. Les résultats de la micro-tomodensitométrie ont montré que tous les T9 étaient localisés avec précision et que la précision était significativement supérieure à celle de la méthode de localisation de l’omoplate. Cette méthode nous fournit un moyen rapide et précis de localiser, ce qui contribue à la cohérence du modèle de blessure.

Le caractère peu invasif du présent protocole se manifeste principalement sous trois aspects. Tout d’abord, après localisation, les muscles paraspinaux au niveau T9 ne sont rétractés que par des micro-rétracteurs, sans endommager les muscles aux niveaux T8 ou T10. De plus, l’exposition de la lame par les micro-rétracteurs n’interfère pas avec le champ visuel. Deuxièmement, la perte de sang, qui provient principalement de la laminectomie, qui peut provoquer un écoulement sanguin de l’os spongieux, est très faible dans la procédure opératoire, presque pas plus que le volume pour tacher un morceau de coton triangulaire de 2 mm x 2 mm x 3 mm. Troisièmement, la laminectomie a été réalisée limitée à la zone nécessaire dans la plus grande mesure, en maintenant la continuité de la partie latérale de la lame et en atténuant considérablement l’instabilité vertébrale. Par rapport aux protocoles précédents^16,17, le protocole actuel réduit beaucoup de dommages inutiles.

Pour évaluer les différents degrés de LME, les résultats entre tous les groupes en histopathologie ont été comparés à ce que les études précédentes ont déjà montré 9,11,18. Ces résultats sont suffisants pour compléter une étude observationnelle de différents degrés de blessures et de changements à différentes périodes. L’EH et l’immunofluorescence ont montré que, avec l’augmentation de la gravité des lésions médullaires, une morphologie plus anormale est apparue dans le tissu de la moelle épinière, et l’augmentation du degré de lésion a également entraîné une augmentation du degré de désordre structurel de la moelle épinière. Du point de vue de l’observation de la morphologie tissulaire, le degré et la régularité des changements de morphologie tissulaire dans chaque groupe expérimental de cette étude sont très cohérents avec les études précédentes.

Selon les résultats actuels des tests histologiques, des changements clairs dans divers indicateurs après différents degrés de lésion médullaire traumatique sont indiqués, ce qui confirme la fiabilité du modèle établi dans cette étude.

Aussi précise et efficace que soit la technique, il pourrait exister des limites potentielles pour les méthodes. En ce qui concerne la laminectomie, l’opérateur doit être habile avec les opérations au microscope pour éviter que la moelle épinière ne soit endommagée par erreur. En outre, la configuration de l’ensemble de la plate-forme est basée sur des structures mécaniques, ce qui crée une demande plus élevée pour l’opérateur par rapport aux équipements automatisés. En effet, tous les problèmes évoqués peuvent être améliorés par une formation répétée de l’opération.

On peut voir que la modélisation mini-invasive et standardisée est bénéfique pour rendre les résultats plus uniformes, stables et reproductibles, évaluer avec précision l’efficacité de divers plans de traitement et optimiser le plan de recherche pour les lésions médullaires traumatiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% fixative solution	Solarbio	P1110	4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody	abcam	ab8135	Dilution ratio (1: 2000)
Eosin Staining Solution (water soluble)	biosharp	BL727B
Ethanol	Fuyu Reagent	64-17-5
Fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X800
Frozen Slicer	leica	CM3050 S
GFAP (GA5) Mouse mAb	Cell Signaling TECHNOLOGY	#3670	Dilution ratio (1: 600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32723TR	Dilution ratio (1: 1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32740	Dilution ratio (1: 1000)
Hematoxylin Staining Solution	biosharp	BL702A
Mice	Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany	C57BL/6J
Microsurgery apparatus	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	All the surgey instruments are custom-made	Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution)	Zhong Shan Jin Qiao	ZLI-9022	working solution
O.C.T. Compound	SAKURA	4583
PBS (phosphate buffered solution)	Solarbio	P1020	pH 7.2-7.4
RWD Laboratory inhalation anesthetic station	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Small animal in vivo microCT imaging system	PerkinElmer	Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Custom-made(Feng's standard)	(https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1)
Surgery microscope	Zumax Medical Co., Ltd.	zumax, OMS2355
TBST (Tris Buffered Saline+Tween)	Solarbio	T1082	Dilution ratio (1: 19)
Xylene	Fuyu Reagent	1330-20-7