Minimalt invasiva tekniker och en enkel laboratorieanordning förbättrar reproducerbarheten av ryggmärgsskademodellen genom att minska operativ skada på försöksdjuren och möjliggöra anatomiskt morfologiunderhåll. Metoden är värdefull eftersom de tillförlitliga resultaten och reproducerbara förfarandet underlättar undersökningar av mekanismerna för sjukdomsreparation.
Att använda minimalt invasiva metoder för att modellera ryggmärgsskada (SCI) kan minimera beteendemässiga och histologiska skillnader mellan försöksdjur och därigenom förbättra experimentens reproducerbarhet.
Dessa metoder behöver två krav för att uppfyllas: tydlighet i den kirurgiska anatomiska vägen och enkelhet och bekvämlighet hos laboratorieanordningen. Avgörande för operatören ger en tydlig anatomisk väg minimalt invasiv exponering, vilket undviker ytterligare skador på försöksdjuret under de kirurgiska ingreppen och gör det möjligt för djuret att upprätthålla en konsekvent och stabil anatomisk morfologi under experimentet.
I denna studie undersöks användningen av en ny integrerad plattform som kallas SCI-koaxialplattformen för ryggmärgsskada hos små djur för att exponera ryggmärgen på T9-nivå på ett minimalt invasivt sätt och stabilisera och immobilisera ryggkotan hos möss med hjälp av en ryggradsstabilisator, och slutligen används en koaxial gravitationsslagare för att kontusera ryggmärgen hos möss för att närma sig olika grader av T9 ryggmärgsskada. Slutligen tillhandahålls histologiska resultat som referens för läsarna.
Traumatisk ryggmärgsskada (SCI) predisponerar lätt individen för allvarliga konsekvenser1; Det finns dock ingen effektiv behandling för närvarande 1,2. Djurkontusionsmodeller är en av de viktigaste metoderna för att studera SCI 3,4.
Från 2004 till 20144 användes råttor som modellorganismer i 289 av 407 studier (71%) och möss i 69 (16,9%). Faktum är att andelen experiment med möss gradvis har ökat under åren på grund av deras fördelar jämfört med andra modeller, särskilt den stora potentialen för genregleringsstudier 3,4,5. Därför krävs mer kompatibla verktyg för att genomföra fler studier med musen som modell på grund av den stora vikt som läggs vid modellkonsistens6. De vanliga enheterna som rapporterats i tidigare studier är i grunden baserade på Allens ryggmärgseffektprincip, till exempel den grundläggande viktminskningsprovkroppen 7,8, New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) impactor1,9 och Infinite Horizon (IH) impactor10,11 . Viktfallsprovkroppen och NYU/MASCIS-slaganordningen delar samma princip att sikta på den riktade ryggmärgen och släppa en fast vikt från olika höjder för att göra olika skadeallvarligheter. IH-slaganordningen skapar ryggmärgsskadan enligt olika krafter.
För att underlätta användningen av musmodellen i SCI-studier och för att lägga grunden för effektiva behandlingsmetoder utvecklas en integrerad plattform för ryggmärgsskada i ryggmärgen, kallad ryggmärgsskadans koaxialplattform (SCICP). Plattformen består av fyra huvudkomponenter: (1) ett djuroperationsbord utformat för en lämplig position för opererade möss, vilket är mycket kompakt och ger bekvämlighet utan positionsbegränsning; 2) en mikroupprullningsanordning på båda sidor för att hålla paravertebrala muskler under drift, 3) En kotstabilisator som håller kotan före förfarandet med gnistor av gemenskapsintresse (två ryggradsstabilisatorer finns tillgängliga för användning på större djur såsom råttor). (4) en hylsa, en slagspets, vikter och en dragstift. De tre delarna ska monteras på en avtagbar X-Y-Z-arm. För exakt inriktning placeras en provkroppsspets på ryggmärgs yta och X-Y-Z-armen sänks försiktigt till den förväntade höjden med hjälp av märket mellan provkroppens spets och hylsan. Slagstiftsspetsen är tillverkad av en 0,12 g aluminiumlegering för att undvika skador på ryggmärgen som tillskrivs stor viktkompression före proceduren. Dragstiftet är till för att hålla vikterna på toppen av hylsan för att förbereda viktfallet (figur 1).
I tidigare studier definierades slagkraftsindelning enligt IH-enhetens slagkraftsdata, som är 30 Kdyn, 50 Kdyn respektive70 Kdyn 6,10. Under forskningsprocessen visade sig seriella grader av SCI-modeller vara etablerade baserat på SCICP, som kan användas i olika studier. Därför, innan experimentet officiellt startades, testades slagkrafterna som genererades av olika vikter av olika massor med hjälp av en topptryckstestanordning. Som ett resultat valdes tre standardiserade representativa SCI-musmodeller som tre olika grader av skada, inklusive graderade milda, måttliga respektive svåra grupper, 6,10, och vikterna släpptes på samma höjd, med en vikt på 1,3 g för mild, 2,0 g för måttlig och 2,7 g för allvarlig skada.
Som ett annat sätt att garantera användbarhet och noggrannhet rapporteras ett nytt och minimalt invasivt operativt tillvägagångssätt. Genom att undersöka anatomin hos normala möss hittas en ny metod för att lokalisera det interspinösa utrymmet hos T12-T13. Metoden för att lokalisera kotan i operationsstegen är lätt att behärska och exakt, vilket säkerställer exakt lokalisering för minimalt invasiva operationer.
Förhoppningsvis kan denna teknik för kontusionsskada hjälpa forskningen och förståelsen av ryggmärgsskada, inklusive patofysiologisk förståelse, ledningsutvärdering och så vidare.
Genom det standardiserade förfarandet kan stabila data erhållas, särskilt i små djur in vivo-experiment , vilket kan minimera avvikelsen av resultat orsakade av individuella skillnader mellan djuren. Baserat på ovanstående förhållanden och praktiska applikationsinstrument kan standardiserade, minimalt invasiva, exakta och repeterbara SCI-modeller upprättas.
På grund av dess användbarhet och bekvämlighet användes tidigare viktdroppsprovkroppen mestadels3. Effektorn som introduceras i denna studie delar samma princip med Allens modell12. Lyckligtvis, på grund av de exakta tillverkningsfördelarna med modern bearbetningsteknik, designade forskargruppen en viktminskningsslagare med fördelarna med att vara lätt att använda, starkt stabil och sällan felaktig. En topptrycksdetekteringsanordning användes för att mäta tyngdkraften hos olika vikter. Tidigare studier6,10 om Infinite Horizons impactor rapporterade att ett ±5 Kdyn-kraftområde som avviker från den avsedda kraften accepteras i grupperna 30 Kdyn, 50 Kdyn och 70 Kdyn, vilket ger en referens för den aktuella studien när det gäller gruppindelning och val av kontusionsgrad. I den nuvarande forskningen mättes den möjliga kraften hos olika grupper i förväg och mer exakta data erhölls.
Mer kritisk än enheten i djurmodellexperiment är förståelsen och användningen av musanatomi. Att använda anatomi på ett bra sätt kan göra procedurer minimalt invasiva. Minimalt invasiv kirurgi påverkar direkt stabiliteten hos försöksdjurets funktionella tillstånd och konsistensen av efterföljande musåterhämtning. Tidigare studier har visat att den minimalinvasiva etableringen av SCI-modeller ökar stabiliteten i ryggradsstrukturen och undviker ytterligare skador orsakade av ryggradsinstabilitet under återhämtning hos råtta1. Förutsättningen för minimalt invasiv kirurgi är den rimliga användningen av naturliga anatomiska strukturer. Därför bör den snabba och exakta lokaliseringen av ryggmärgssegment göras i enlighet med mössens anatomiska struktur. Som rapporterats användes avbildningsmetoden för att hitta kotan13. Även om den har hög noggrannhet, i den faktiska experimentella driftsprocessen, har avbildningsmetoden för lokalisering nackdelarna med obekväm drift, lång driftstid, komplex utrustningsförvärv och höga krav på utrustningsnoggrannhet. beskrev lokaliseringen av T7 genom de underlägsna vinklarna på scapulas14, medan möss verkar i en liggande utsprång, så de underlägsna vinklarna som nämns ska vara bakre vinklar. Dessutom är användning av de nedre scapulära spetsarna för att hitta T7 en lokaliseringsmetod för en specifik position i mänsklig anatomi15, som inte är lämplig för möss. Slutligen validerade mikro-CT-data också hypotesen att de bakre vinklarna på scapulae inte är i linje med T7 oavsett om musen är i sin naturliga eller specifika kroppsposition. McDonough et al.14 nämnde också att lokalisera den högsta punkten på ryggen när musen är välvd och definiera den högsta punkten som T12. Jämförelsevis, i den nuvarande forskningen, är T9 belägen med hjälp av T12-T13 interspinous space, som varken är associerad med eller påverkas av musens hållning. Dessutom, med denna metod, kan målkotan enkelt lokaliseras och drivas. Man bör sondera den 13: e ribben under mikroskopet, försiktigt röra området för den costovertebrala vinkeln, dra en linje mot den spinösa processen och sedan undersöka utrymmet mellan de spinösa processerna i T12-T13 mot huvudet. Forskargruppen använde T12-T13 interspinous space för att lokalisera T9 hos 12 möss. Slutligen hade 12 kvinnliga C57BL / 6J-möss en Micro-CT-skanning efter T9-platsen och laminektomi. Resultatet av Micro-CT-skanningen indikerade att de borttagna laminerna hos alla 12 möss var T9. Resultaten av Micro-CT visade att alla T9 var exakt placerade och noggrannheten var signifikant högre än scapula-lokaliseringsmetoden. Denna metod ger oss ett snabbt och exakt sätt att lokalisera, vilket bidrar till konsekvensen i skademodellen.
Den minimala invasiviteten i detta protokoll uttalas i huvudsak tre aspekter. För det första, efter lokalisering, dras paraspinalmusklerna på T9-nivå endast tillbaka av mikroretraktorer utan att skada musklerna vid T8- eller T10-nivåerna. Förutom, exponeringen av lamina av mikroretraktorerna stör inte det visuella fältet. För det andra är blodförlusten, som mestadels kommer från laminektomi, som kan orsaka blodutflöde från det cancellösa benet, mycket låg i operationsproceduren, nästan inte mer än volymen för att fläcka en 2 mm x 2 mm x 3 mm triangulär bit bomull. För det tredje genomfördes laminektomi begränsad till det nödvändiga området i största möjliga utsträckning, vilket upprätthöll kontinuiteten i den laterala delen av lamina och kraftigt dämpade ryggkotans instabilitet. Jämfört med tidigare protokoll16,17 minskar det nuvarande protokollet mycket onödig skada.
För att utvärdera de olika graderna av SCI jämfördes resultaten mellan alla grupper inom histopatologi med vad tidigare studier redan har visat 9,11,18. Dessa resultat är tillräckliga för att slutföra en observationsstudie av olika grader av skada och förändringar i olika perioder. HE och immunofluorescens visade att med ökningar av svårighetsgraden av SCI uppträdde mer onormal morfologi i ryggmärgsvävnaden, och ökningen av graden av skada ledde också till en ökning av graden av strukturell störning i ryggmärgen. Ur perspektivet av vävnadsmorfologiobservation överensstämmer graden och regelbundenheten av vävnadsmorfologiska förändringar i varje experimentell grupp i denna studie mycket med tidigare studier.
Enligt de nuvarande histologiska testresultaten indikeras tydliga förändringar i olika indikatorer efter olika grader av traumatisk SCI, vilket ytterligare bekräftar tillförlitligheten hos den modell som fastställts i denna studie.
Även om tekniken är korrekt och effektiv kan det finnas potentiella begränsningar för metoderna. När det gäller laminektomi bör operatören vara skicklig med operationer under mikroskopet för att förhindra att ryggmärgen skadas av misstag. Installationen av hela plattformen är också baserad på mekaniska strukturer, vilket ställer en högre efterfrågan på operatören jämfört med automiserad utrustning. Faktum är att alla nämnda problem kan förbättras genom upprepad träning av operationen.
Det kan ses att minimalt invasiv och standardiserad modellering är fördelaktig för att göra resultaten mer enhetliga, stabila och repeterbara, utvärdera effekten av olika behandlingsplaner exakt och optimera forskningsplanen för traumatisk SCI.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av State Key Program of National Natural Science of China (81930070).
4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | abcam | ab8135 | Dilution ratio (1: 2000) |
Eosin Staining Solution (water soluble) | biosharp | BL727B | |
Ethanol | Fuyu Reagent | 64-17-5 | |
Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
Frozen Slicer | leica | CM3050 S | |
GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1: 600) |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1: 1000) |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1: 1000) |
Hematoxylin Staining Solution | biosharp | BL702A | |
Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
PBS (phosphate buffered solution) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1) |
Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1: 19) |
Xylene | Fuyu Reagent | 1330-20-7 |