Etablera en muskontusion ryggmärgsskada modell baserad på en minimalt invasiv teknik

Summary

Minimalt invasiva tekniker och en enkel laboratorieanordning förbättrar reproducerbarheten av ryggmärgsskademodellen genom att minska operativ skada på försöksdjuren och möjliggöra anatomiskt morfologiunderhåll. Metoden är värdefull eftersom de tillförlitliga resultaten och reproducerbara förfarandet underlättar undersökningar av mekanismerna för sjukdomsreparation.

Abstract

Att använda minimalt invasiva metoder för att modellera ryggmärgsskada (SCI) kan minimera beteendemässiga och histologiska skillnader mellan försöksdjur och därigenom förbättra experimentens reproducerbarhet.

Dessa metoder behöver två krav för att uppfyllas: tydlighet i den kirurgiska anatomiska vägen och enkelhet och bekvämlighet hos laboratorieanordningen. Avgörande för operatören ger en tydlig anatomisk väg minimalt invasiv exponering, vilket undviker ytterligare skador på försöksdjuret under de kirurgiska ingreppen och gör det möjligt för djuret att upprätthålla en konsekvent och stabil anatomisk morfologi under experimentet.

I denna studie undersöks användningen av en ny integrerad plattform som kallas SCI-koaxialplattformen för ryggmärgsskada hos små djur för att exponera ryggmärgen på T9-nivå på ett minimalt invasivt sätt och stabilisera och immobilisera ryggkotan hos möss med hjälp av en ryggradsstabilisator, och slutligen används en koaxial gravitationsslagare för att kontusera ryggmärgen hos möss för att närma sig olika grader av T9 ryggmärgsskada. Slutligen tillhandahålls histologiska resultat som referens för läsarna.

Introduction

Traumatisk ryggmärgsskada (SCI) predisponerar lätt individen för allvarliga konsekvenser¹; Det finns dock ingen effektiv behandling för närvarande ^1,2. Djurkontusionsmodeller är en av de viktigaste metoderna för att studera SCI ^3,4.

Från 2004 till 2014⁴ användes råttor som modellorganismer i 289 av 407 studier (71%) och möss i 69 (16,9%). Faktum är att andelen experiment med möss gradvis har ökat under åren på grund av deras fördelar jämfört med andra modeller, särskilt den stora potentialen för genregleringsstudier ^3,4,5. Därför krävs mer kompatibla verktyg för att genomföra fler studier med musen som modell på grund av den stora vikt som läggs vid modellkonsistens⁶. De vanliga enheterna som rapporterats i tidigare studier är i grunden baserade på Allens ryggmärgseffektprincip, till exempel den grundläggande viktminskningsprovkroppen ^7,8, New York University (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) impactor^1,9 och Infinite Horizon (IH) impactor^10,11 . Viktfallsprovkroppen och NYU/MASCIS-slaganordningen delar samma princip att sikta på den riktade ryggmärgen och släppa en fast vikt från olika höjder för att göra olika skadeallvarligheter. IH-slaganordningen skapar ryggmärgsskadan enligt olika krafter.

För att underlätta användningen av musmodellen i SCI-studier och för att lägga grunden för effektiva behandlingsmetoder utvecklas en integrerad plattform för ryggmärgsskada i ryggmärgen, kallad ryggmärgsskadans koaxialplattform (SCICP). Plattformen består av fyra huvudkomponenter: (1) ett djuroperationsbord utformat för en lämplig position för opererade möss, vilket är mycket kompakt och ger bekvämlighet utan positionsbegränsning; 2) en mikroupprullningsanordning på båda sidor för att hålla paravertebrala muskler under drift, 3) En kotstabilisator som håller kotan före förfarandet med gnistor av gemenskapsintresse (två ryggradsstabilisatorer finns tillgängliga för användning på större djur såsom råttor). (4) en hylsa, en slagspets, vikter och en dragstift. De tre delarna ska monteras på en avtagbar X-Y-Z-arm. För exakt inriktning placeras en provkroppsspets på ryggmärgs yta och X-Y-Z-armen sänks försiktigt till den förväntade höjden med hjälp av märket mellan provkroppens spets och hylsan. Slagstiftsspetsen är tillverkad av en 0,12 g aluminiumlegering för att undvika skador på ryggmärgen som tillskrivs stor viktkompression före proceduren. Dragstiftet är till för att hålla vikterna på toppen av hylsan för att förbereda viktfallet (figur 1).

I tidigare studier definierades slagkraftsindelning enligt IH-enhetens slagkraftsdata, som är 30 Kdyn, 50 Kdyn respektive⁷⁰ Kdyn ^6,10. Under forskningsprocessen visade sig seriella grader av SCI-modeller vara etablerade baserat på SCICP, som kan användas i olika studier. Därför, innan experimentet officiellt startades, testades slagkrafterna som genererades av olika vikter av olika massor med hjälp av en topptryckstestanordning. Som ett resultat valdes tre standardiserade representativa SCI-musmodeller som tre olika grader av skada, inklusive graderade milda, måttliga respektive svåra grupper, ^6,10, och vikterna släpptes på samma höjd, med en vikt på 1,3 g för mild, 2,0 g för måttlig och ^2,7 g för allvarlig skada.

Som ett annat sätt att garantera användbarhet och noggrannhet rapporteras ett nytt och minimalt invasivt operativt tillvägagångssätt. Genom att undersöka anatomin hos normala möss hittas en ny metod för att lokalisera det interspinösa utrymmet hos T12-T13. Metoden för att lokalisera kotan i operationsstegen är lätt att behärska och exakt, vilket säkerställer exakt lokalisering för minimalt invasiva operationer.

Förhoppningsvis kan denna teknik för kontusionsskada hjälpa forskningen och förståelsen av ryggmärgsskada, inklusive patofysiologisk förståelse, ledningsutvärdering och så vidare.

Protocol

OBS: Alla experiment godkändes av Laboratory Animal Ethical and Welfare Committee vid Shandong University Cheeloo College of Medicine (godkännandenummer: 21L60) och utfördes enligt Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicerad av National Institutes of Health (NIH Publications No. 85-23, reviderad 1996).

1. Mekanism för ryggmärgsskada koaxialplattform och mekaniska tester

1. Montera plattformen med ett kirurgiskt operationsbord, en ryggradsstabilisator och en slagstiftsspets (figur 1).
   OBS: Håll viktfallet och avgasspåren, som förhindrar att vikten stöter på luftströmmar, rena, eftersom smuts på viktfallet eller hylsan kan påverka plattformens precision.
2. Sätt spetsen, som möjliggör noggrann ryggmärgslokalisering, i ärmen.
3. Välj lämpliga massor av viktdropparna för experimentet, som är 1,3 g, 2,0 g och 2,7 g för de milda, måttliga respektive svåra grupperna.
4. Anslut dragstiftet i hålen i viktfallet.
5. Montera viktfallet på toppen av hylsan med dragstiftet monterat i spåret på X-Y-Z-armen så att, när lokaliseringen är klar, frigörs vikten för att träffa slagprovsspetsen, följaktligen kontuserar ryggmärgen och förändringar i ryggmärgen observeras under mikroskopet.
6. Justera den avtagbara X-Y-Z-precisionsarmen med 0,1 mm precision för att underlätta för föraren att ge tillräckligt med arbetsutrymme (bild 1D, E).
   OBS: För att bekräfta konsistensen av resultaten av studien, innan experimentet börjar, mäta kraften som genereras när vikten tappas inuti hylsan med hjälp av en topptrycksdetekteringsanordning. En upprepning av bekräftelsen är inte nödvändig för framtida studier.
7. Slå på enheten, placera metalltrycksreceptorn under spetsen, nollställ adaptern, släpp dragstiftet och registrera den faktiska slagkraften.

2. Lokalisering och laminektomi av den 9^{: e} bröstkotan (T9)

OBS: Kvinnliga C57BL / 6J-möss 9-10 veckor gamla köptes från Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, Kina).

1. Autoklav en serie kirurgiska instrument för experimentet och sterilisera operationsbordet med 75% alkohol före operationen.
2. Injicera buprenorfin för analgesi (0,05-2,0 mg/kg, SQ) 30 minuter före anestesi för skadeoperationer. Bedöva sedan musen med isofluran (induktion: ~ 3% -5%, underhåll: ~ 1,5% -2%). Kontrollera om djuret är helt bedövat av reflexerna i svans eller tå nypa. När anestesi är i kraft, lägg musen i ett benäget läge i en bestämd del av operationsbordet och täck hornhinnan med oftalmisk salva (applicera oftalmisk salva på hornhinnorna för att skydda ögonen från att torka under operationen).
   1. Raka håret från det kaudala till rostrala med en elektrisk rakapparat över thoracolumbar ryggraden. Sterilisera huden flera gånger i en cirkulär rörelse med jodofor i 30 s och följt av 75% alkohol. Applicera ett sterilt kirurgiskt draperi och gör ett längsgående snitt på cirka 1,5 cm på huden från cirka T6 till T13 med skalpell och blad.
      OBS: Palpera längs kustmarginalen till mittlinjen, där T12-T13 interspinous space ligger. Gör ett 1,5 cm snitt till rostralen, och snittet är ungefär i jämnhöjd med T6-T13 ryggkotor.
3. Utforska den 13: e revbenet på ena sidan från den beniga delen under operationsmikroskopet. Utforska den spinösa processen i mittlinjen genom att lätt röra vid området för costovertebralvinkeln och sedan mot rostralen för att lokalisera det interspinösa utrymmet i T12-T13. Utforska det interspinösa utrymmet i T9-T10 från T12-T13: s utrymme till rostralsidan. (Figur 2A, 3A)
4. Dissekera paraspinalmuskeln längs den spinösa processen hos T9 till de främre och bakre fasettfogarna på båda sidor med mikrosax (figur 3B). Dra tillbaka paraspinalmusklerna med mikroretraktorer och rengör mjukvävnaden på lamina och i det interspinösa utrymmet i T8-T9 och T9-T10 med mikrosax.
5. Utför T9-laminektomi, kläm fast den spinösa processen med T9 med mikrokirurgiska pincett, lyft upp den något, sätt in mikrosaxen parallellt längs den högra dorsolaterala sidan av lamina, undvik skador på ryggmärgen och skär av lamina med mikrosax. Upprepa på vänster sida och ryggmärgen kan exponeras (figur 2B, 3C).
6. Innan du fixerar ryggkotan, lossa universalarmen och kläm långsamt fast de 9: e till 10: e fasettfogarna på båda sidor av ryggkotan med mikromyggtången i ryggradsstabilisatorn. Dra åt skruvarna på mikromyggtången, och kotan stabiliseras därmed. Justera ryggmärgen till horisontalplanet, dra åt universalarmen och ryggkotan är fixerad (figur 3D).

3. T9 kontusionsskada

1. När ryggmärgen på T9-nivå har exponerats och kotan är fixerad, sikta på ryggmärgen vid spetsen inuti hylsan under operationsmikroskopet (figur 3E).
2. Kontrollera om spetsens yta är parallell med ryggmärgen från ryggmärgs bakre och laterala aspekter, eftersom det är lätt att observera förhållandet mellan ryggmärgen och spetsen under mikroskopet och att operationsbordet lätt kan vridas.
3. Kontrollera om spetsens yta är parallell med de bilaterala gränserna för den förskonade lamina innan spetsen är i kontakt med ryggmärgen efter laminektomi eftersom det är ett naturligt referensplan parallellt med ryggmärgen.
4. Efter att ha lokaliserat det interspinösa utrymmet på T12-T13, sänk hylsan tills provkroppens ände överensstämmer med märket på observationsfönstret och den angivna höjden på 22 mm uppnås. Dra ut dragstiftet för att släppa vikten (1,3 g, 2,0 g eller 2,7 g beroende på grupp, där varje grupp inkluderar 3 möss och varje grupp har en mus för varje tidpunkt).
   OBS: Ryggmärgen ska vara parallell med marken och vinkelrätt mot spetsen; flytta operationsbordet för att säkerställa det mikroskopiska synfältet, eftersom bordet är mycket kompakt.
5. Ta bort provkroppen när kontusionen är klar och observera graden av SCI under driftsmikroskopet. I den milda gruppen kan en ljusröd färgförändring ses, medan i den måttliga gruppen uppvisar skadestället mörkrött i 3-4 s, och eventuellt kan eminens observeras. I den svåra gruppen kan de mörkröda manifestationerna uppträda omedelbart, och uppenbar eminens i dura manifesteras, men dura är fortfarande i en konsekvent form (Figur 3F).
6. Suturera den ytliga fascian och huden med suturer (polypropen icke-absorberbar sutur, storlek: 6-0).
7. Efter avslutad sutur, sterilisera det kirurgiska området, placera musen på en temperaturkontrollerad kudde tills fullt medvetande är återställt och lägg sedan musen i musburarna.

4. Djurvård

1. Placera djuret på värmedynan för återhämtning och observera rörelsen hos båda bakbenen.
   OBS: Djur som har genomgått operation ska inte returneras till sällskap med andra djur förrän de är helt återställda.
2. Sätt en högvattendiet på burgolvet så att djur lätt kan nå maten. Alternativt kan du använda en bur med ett lägre matningsbord.
3. Töm mössens blåsor två gånger om dagen efter operationen eftersom det är svårt för de måttliga och svåra skadegrupperna att återställa blåsfunktionen. Injicera buprenorfin för analgesi (0,05-2,0 mg/kg, SQ) 8-12 timmar/dag i 3 dagar.

5. Transkardiell perfusion, färgning och immunfärgning

1. Den 1: a, 28: e och 56: e dagen efter skada, offra en mus i varje grupp, respektive genom perfusion.
   1. Persfuse mössen med 60 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 20 ml 4% paraformaldehyd efter överdriven anestesi (4% -6% isofluran).
   2. Samla ryggraden med mikrosax, som sträcker sig rostralt och kaudalt 1 cm från lesionscentret.
   3. Resektera överflödiga muskler, reservera intakta ryggradssegment med partiella revben för instrument att hålla i steg 5.1.4 och blötlägg det i 4% paraformaldehyd i 24 timmar.
   4. Kläm revbenen med hemostatiska pincett för fixering och definiera lesionscentret under mikroskopet enligt den resekterade lamina och färgförändringen i ryggmärgs lesionscentrum.
   5. Resect alla laminae och artikulära processer med mikrosax från caudal.
   6. Klipp av nervrötterna med mikrosax och ta ut ryggmärgen.
   7. Samla 0,5 cm av ryggmärgen som sträcker sig kaudalt respektive rostralt från lesionscentret med mikrosax.
   8. Sätt ryggmärgen i 30% sackaros vid 4 ° C i 48 timmar.
2. Skär vävnaderna i 6 μm tjocka sektioner efter frysning enligt histologisk undersökningstyp.
3. Utför hematoxylin och eosin (H&E) färgning.
   1. Värm om sektionerna till rumstemperatur och blötlägg de 6 μm tjocka sektionerna i 4% formaldehyd i cirka 15 minuter, följt av blötläggning i 1x PBS i 1 min fyra gånger för att ta bort kvarvarande OCT.
   2. Fläcka sektionerna med hematoxylin i 90 s och skölj med dubbeldestillerat vatten.
   3. Tvätta sedan sektionerna med rinnande vatten i 3 minuter.
   4. Fläcka med eosin i 4 minuter och blötlägg i 95% alkohol i 30 s två gånger för att skölja överskott av eosin.
   5. Slutligen dehydrera med gradientalkohol (95% alkohol och 50% alkohol en gång, successivt) i 30 s och blötlägg i xylen för transparens i 2 min. Försegla sedan proverna med hartsgel (koronalplansektion: Figur 4; sagittalplansektion: Figur 5).
4. Utför immunofluorescerande färgning.
   1. Värm om sektionerna till rumstemperatur och blötlägg de 6 μm tjocka sektionerna i 4% formaldehyd i cirka 2 minuter.
   2. Tvätta sektionerna i TBST i 5 min i tre gånger.
   3. Inkubera sektionerna med blockerande lösning (10% get normalt serum i PBS) och blockera i 1 h för att blockera ospecifik bindning av immunglobulin.
   4. Inkubera ryggmärgssektionerna över natten vid 4 °C med både musens anti-glia fibrillära sura protein (GFAP, en markör för reaktiva astrocyter), polyklonal antikropp (1:600) och kaninanti-NF200-antikropp (1:2000), en markör för neurofilament i 0,4 ml blockerande lösning.
   5. Skölj sektionerna med PBS och tillsätt 0,4 ml blockerande lösning med get-anti-kanin Alexa 594-konjugerad IgG (1: 1,000) och get-anti-mus Alexa 488-konjugerad IgG (1: 1,000) sekundära antikroppar i 1 h vid rumstemperatur.
   6. Ta bilder med ett fluorescerande mikroskop vid 10x genom automatisk panoramaskanning vid våglängder på 594 nm respektive 488 nm (figur 6).
      1. Slå på fluorescensmikroskopet, sätt bilden på mikroskopsteget, byt till fluorescenskanalen, använd positioneringsknappen för att placera tre till fyra punkter på vävnaden och fokusera för att slutföra fotograferingen. När du har avslutat fotograferingen sparar du bilderna från olika kanaler i önskat format och sparar sedan den sammanslagna bilden.

Representative Results

För att testa enhetens precision mättes kraften som tre olika viktmassor tillverkade av samma höjd med hjälp av en topptryckstestanordning. Tjugofyra tester utfördes med varierande viktgrupper, vilket resulterade i (medelvärde ± SD) 0,323 N ± 0,02 N för 1,3 g vikter, 0,543 N ± 0,15 N för 2,0 g vikter och 0,723 N ± 0,26 N för 2,7 g vikter (figur 7). Tidigare studier har antagit dyne (dyn) eller Kilodyne (Kdyn) som enheter för att mäta kontusionsintensiteterna. För bättre jämförelse med tidigare studier listas omvandlingarna mellan Newtons (N) och dyne/Kilodyne (1 N = 1 kg × 1 m/s 2 = 1 × 10 3 g × 1 × 100 cm/s² = 1 × 10⁵ dyn; 0,323 N = 32,3 Kdyn; 0,543 N = 54,3 Kdyn; 0,723 N = 72,3 Kdyn).

Tabell 1 och figur 4 visar data från lesionerna hos de milda, måttliga och svåra grupperna på koronala sektioner. Att döma av figur 4, den 28: e dagen efter skada, minskade kontinuiteten i de urskiljbara grå och vita substansgränserna i de milda, måttliga och svåra grupperna successivt, med området för ärrvävnad som växte sig större och en ökande andel på tvärsnittet av lesionscentret. Det fanns uppenbara morfologiska skillnader i alla experimentgrupper jämfört med den normala gruppen. Detta bevisade rationaliteten i uppdelningen av skadegrader i experimentgrupperna.

Tabell 2 och figur 5 beskriver ryggmärgsskada på 1: a och 56: e dagen efter skada på sagittala sektioner. Det kan ses att lesionsområdet gradvis ökade signifikant från de milda till svåra grupperna på 1: a dagen efter skada. Under tiden var kontinuiteten av vit substans på båda sidor av ryggmärgen bättre i den milda gruppen, med observerbara små runda vakuoler, vilka är egenskaperna hos interstitiellt ödem. I den måttliga gruppen visade den vita substansen dålig kontinuitet, och strukturen hos den ventrala vita substansen var inte beställd. I den svåra gruppen uppvisade den ventrala vita substansen allvarligare störningar, och ett stort område av kaviteten uppträdde i mitten av skadan. Dessutom visade den omgivande vävnaden uppenbar fyllning av de röda blodkropparna, och de röda blodkropparna nära den centrala kanalen samlades i remsor. Den 56: e dagen efter skada observerades ärrbildning i skadecentret för de tre grupperna, vars område ökade beroende på skadans svårighetsgrad.

Integriteten hos ryggmärgsneurofilament på den 56: e dagen efter skada kan också härledas från analysen av immunofluorescensfärgningsresultaten (figur 6). Figuren visar också att överlappande ärrbildande astrocyter var synliga i mitten av alla tre grupperna av skador, där skadeområdets längd ökade med skadans svårighetsgrad, medan ärrdiametern minskade. Detta tyder på närvaron av ärrkontraktur, vilket kan leda till en minskning av ryggmärgsdiametern.

Figur 1: En hel- och delutställning av ryggmärgsskadans koaxialplattform . (A) X-Y-Z-armen och operationsbordet kan separeras, vilket ger tillräckligt utrymme för operationsproceduren under vilken ett litet djurs ryggmärg exponeras. Manöverbordet kan flyttas fritt under drift, vilket minskar potentiella driftssvårigheter som tillskrivs positionsbegränsningar. Kroppen hos ryggradsstabilisatorn har en tre-gemensam universell arm för riktningshjälp, vilket ökar dess flexibilitet. (B) Sätt provkroppens spets i hylsan och montera den senare i X-Y-Z-armen. Sätt spetsen på dragstiftet i viktens hål för att förhindra att vikten sjunker och placera vikten i ärmen. Med delarna monterade, lokalisera det riktade skadeområdet under mikroskopet. Sänk sedan X-Y-Z-armen tills slutet av provkroppens spets överensstämmer med observationsfönstrets nedre nivå, vilket indikerar att en enhetlig kontusionshöjd har uppnåtts (höjden mellan vikten och provkroppens spets är 22 mm när fallet börjar). Dra i dragstiftet så kommer effekten att göras. (C) När skadeområdet har exponerats, använd klämmorna för att klämma fast och fixera musens ryggrad och åtdragningsbulten för att stabilisera ryggradsstabilisatorn. D) Rekommenderade funktioner för spår på manöverbordet. Försöksdjuret ska sättas i mittspåret, med huvudet mot den främre, bröstkorgsdelen i sluttningen. X-Y-Z-armen är separerad från operationsbordet. E) En visning av den monterade SCICP:n. Pilar anger delarna. Med spetsen riktad mot målkontusionsområdet, för att starta kontusionen, dra ut dragstiftet och vikten kommer att falla på slagstiftets spets för att kontusera ryggmärgen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Ett avbildningsdiagram över T13-metoden för lokalisering av kotkotor. (A) Den 13: e revbenet och T13 är relativt konstanta anatomiska strukturer. T13-costovertebralvinkeln kan lätt detekteras under mikroskopet, från vilket operatören kan sondera mot den spinösa processen och hitta T12-T13-interspinous space. Sök sedan mot rostralsidan successivt för att hitta målskadekotan (till exempel T9). (B) En minimalt invasiv 9: e thoraxlaminektomi kan bevara adekvata lamina och fasettfogar mellan intilliggande ryggradskroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Exponering och kontusion av ryggmärgen på T9-nivå hos möss . (A) Sondera T13 costovertebral vinkel. (B) Med paraspinalmuskeln indragen av mikroupprullningsdon för att göra tillräckligt med utrymme för drift, exponera T9. (C) Utför T9-laminektomi med mikrosax. (D) Stabilisera kotan med klämmorna på ryggradsstabilisatorn. (E) Sikta mot målkontusionsområdet med provkroppens spets. (F) Ödem och trängsel noteras i skadeområdet efter kontusion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Representativa sektioner den 28: e dagen efter olika grader av SCI hos möss (koronala sektioner). (A) Musens normala bröstmärg. Skalstång = 500 μm. (B) För den milda gruppen kan liten skada noteras i ryggmärgens dorsala aspekt, medan morfologin hos den skonade vita substansen och grå substansen är väsentligen bevarad. (C) För den måttliga gruppen observeras uppenbar ärrvävnad i ryggmärgen (indikeras av den röda asterisken). De differentierande egenskaperna mellan vit substans och grå substans kan knappt särskiljas. (D) Jämförelsevis har ryggmärgen hos den svåra gruppen nästan förlorat sin ursprungliga morfologi och har nästan ersatts av ärrvävnad. Den gröna streckade linjen indikerar skadans område och den svarta streckade linjen indikerar gränsen för den observerbara grå substansen. När skadans svårighetsgrad ökade uppträdde en större lesion och mindre sparad struktur i musens ryggmärg, med gränsen till grå substans knappt urskiljbar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Representativa sektioner den 1: a och 56: e dagen efter skada på ryggmärgen hos möss (sagittala sektioner). (A) Musens normala bröstmärg. (B) B1-B3 representerar ryggmärgen den 1: a dagen efter skada i de milda, måttliga och svåra grupperna. Det kan ses att när skadan ökade stördes eller strömmade ett större område i lesionscentret. Kontinuiteten av vit substans i ventral ryggmärg skilde sig på grund av olika skadeintensiteter. B1 visar att den vita substansen i ventral ryggmärg har bättre kontinuitet med lätt ödem. B2 visar sämre kontinuitet av den vita substansen i ventral ryggmärg och svårare ödem. Vävnaden i mitten av B3 SCI har förlorat nästan all kontinuitet, och det finns omfattande ödem i området utanför skadans centrum. (C) C1-C3 representerar ryggmärgen den 56: e dagen efter skadan i de milda, måttliga och svåra grupperna. Olika grader av ärrkontraktur manifesterades i skadecentret mellan olika grupper, och det fanns en signifikant skillnad i skadeområdets diameter. Skalstreck = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Representativa sektioner den 56: e dagen efter ryggmärgsskada hos möss (sagittala sektioner). (A) Representativ del av den milda gruppen. NF200 indikerar neurofilamentet, medan GFAP indikerar astrocyter. Överlappande astrocyter observeras i lesionens epicentrum, medan neurofilamentet i den ventrala delen av ryggmärgen är i god kontinuitet. (B) Representativ del av den moderata gruppen. Två ärrcentra kan observeras (indikeras av röda asterisker) förutom överlappande astrocyter, medan neurofilamentet i den ventrala aspekten har kontinuitet. (C) Representativ del av den svåra gruppen, med ett stort lesionsområde och massiva ärrbildande astrocyter. Det finns inget uppenbart ärrcenter observerat, och neurofilamentet har dålig kontinuitet. Skala bar = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7: Kraft som genereras från samma höjd men med olika vikter. Före experimentet detekterades kraften som genererades av olika viktmassor som släpptes från samma höjd med hjälp av en topptrycksdetekteringsanordning. Efter att varje grupp hade slutfört 24 detektioner erhölls mer tillförlitliga tyngdkraftsdata för referens av slagkraft. Data analyserades med hjälp av statistikprogrammet SPSS19.0. Data presenteras som medelvärde ± SD, n = 24 i varje grupp. Jämförelser mellan fler grupper baserades på en enkelriktad variansanalys (ANOVA) som användes för att testa skillnaderna; p < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

28 dpi
Grupp	GMR (%)	WMR (%)	DR (%)
Normal	35.44	64.57	0
Mild	11.59	64.88	23.53
Moderat	0	41.14	58.86
Allvarlig	0	0	100

Tabell 1: Frekvens av vit substans, grå substans och skador den 28: e dagen efter skada. Förkortningar: dpi = dagar efter skada, DA = skadat område; GMR = grå substanshastighet; WMR = vit substanshastighet; DR = skadad hastighet.

Grupp	1dpi DA (μm2)	56 dpi DA (μm2)
Normal	0	0
Mild	2391250	666091
Moderat	4383381	1263191
Allvarlig	5118833	1943962

Tabell 2: Jämförelser mellan lesionen på sagittala sektioner på 1: a och 56: e dagen efter skada.

Discussion

Genom det standardiserade förfarandet kan stabila data erhållas, särskilt i små djur in vivo-experiment , vilket kan minimera avvikelsen av resultat orsakade av individuella skillnader mellan djuren. Baserat på ovanstående förhållanden och praktiska applikationsinstrument kan standardiserade, minimalt invasiva, exakta och repeterbara SCI-modeller upprättas.

På grund av dess användbarhet och bekvämlighet användes tidigare viktdroppsprovkroppen mestadels³. Effektorn som introduceras i denna studie delar samma princip med Allens modell¹². Lyckligtvis, på grund av de exakta tillverkningsfördelarna med modern bearbetningsteknik, designade forskargruppen en viktminskningsslagare med fördelarna med att vara lätt att använda, starkt stabil och sällan felaktig. En topptrycksdetekteringsanordning användes för att mäta tyngdkraften hos olika vikter. Tidigare studier^6,10 om Infinite Horizons impactor rapporterade att ett ±5 Kdyn-kraftområde som avviker från den avsedda kraften accepteras i grupperna 30 Kdyn, 50 Kdyn och ⁷⁰ Kdyn^, vilket ger en referens för den aktuella studien när det gäller gruppindelning och val av kontusionsgrad. I den nuvarande forskningen mättes den möjliga kraften hos olika grupper i förväg och mer exakta data erhölls.

Mer kritisk än enheten i djurmodellexperiment är förståelsen och användningen av musanatomi. Att använda anatomi på ett bra sätt kan göra procedurer minimalt invasiva. Minimalt invasiv kirurgi påverkar direkt stabiliteten hos försöksdjurets funktionella tillstånd och konsistensen av efterföljande musåterhämtning. Tidigare studier har visat att den minimalinvasiva etableringen av SCI-modeller ökar stabiliteten i ryggradsstrukturen och undviker ytterligare skador orsakade av ryggradsinstabilitet under återhämtning hos råtta¹. Förutsättningen för minimalt invasiv kirurgi är den rimliga användningen av naturliga anatomiska strukturer. Därför bör den snabba och exakta lokaliseringen av ryggmärgssegment göras i enlighet med mössens anatomiska struktur. Som rapporterats användes avbildningsmetoden för att hitta kotan¹³. Även om den har hög noggrannhet, i den faktiska experimentella driftsprocessen, har avbildningsmetoden för lokalisering nackdelarna med obekväm drift, lång driftstid, komplex utrustningsförvärv och höga krav på utrustningsnoggrannhet. beskrev lokaliseringen av T7 genom de underlägsna vinklarna på scapulas¹⁴, medan möss verkar i en liggande utsprång, så de underlägsna vinklarna som nämns ska vara bakre vinklar. Dessutom är användning av de nedre scapulära spetsarna för att hitta T7 en lokaliseringsmetod för en specifik position i mänsklig anatomi¹⁵, som inte är lämplig för möss. Slutligen validerade mikro-CT-data också hypotesen att de bakre vinklarna på scapulae inte är i linje med T7 oavsett om musen är i sin naturliga eller specifika kroppsposition. McDonough et ^al.14 nämnde också att lokalisera den högsta punkten på ryggen när musen är välvd och definiera den högsta punkten som T12. Jämförelsevis, i den nuvarande forskningen, är T9 belägen med hjälp av T12-T13 interspinous space, som varken är associerad med eller påverkas av musens hållning. Dessutom, med denna metod, kan målkotan enkelt lokaliseras och drivas. Man bör sondera den 13: e ribben under mikroskopet, försiktigt röra området för den costovertebrala vinkeln, dra en linje mot den spinösa processen och sedan undersöka utrymmet mellan de spinösa processerna i T12-T13 mot huvudet. Forskargruppen använde T12-T13 interspinous space för att lokalisera T9 hos 12 möss. Slutligen hade 12 kvinnliga C57BL / 6J-möss en Micro-CT-skanning efter T9-platsen och laminektomi. Resultatet av Micro-CT-skanningen indikerade att de borttagna laminerna hos alla 12 möss var T9. Resultaten av Micro-CT visade att alla T9 var exakt placerade och noggrannheten var signifikant högre än scapula-lokaliseringsmetoden. Denna metod ger oss ett snabbt och exakt sätt att lokalisera, vilket bidrar till konsekvensen i skademodellen.

Den minimala invasiviteten i detta protokoll uttalas i huvudsak tre aspekter. För det första, efter lokalisering, dras paraspinalmusklerna på T9-nivå endast tillbaka av mikroretraktorer utan att skada musklerna vid T8- eller T10-nivåerna. Förutom, exponeringen av lamina av mikroretraktorerna stör inte det visuella fältet. För det andra är blodförlusten, som mestadels kommer från laminektomi, som kan orsaka blodutflöde från det cancellösa benet, mycket låg i operationsproceduren, nästan inte mer än volymen för att fläcka en 2 mm x 2 mm x 3 mm triangulär bit bomull. För det tredje genomfördes laminektomi begränsad till det nödvändiga området i största möjliga utsträckning, vilket upprätthöll kontinuiteten i den laterala delen av lamina och kraftigt dämpade ryggkotans instabilitet. Jämfört med tidigare protokoll^16,17 minskar det nuvarande protokollet mycket onödig skada.

För att utvärdera de olika graderna av SCI jämfördes resultaten mellan alla grupper inom histopatologi med vad tidigare studier redan har visat 9,11,18. Dessa resultat är tillräckliga för att slutföra en observationsstudie av olika grader av skada och förändringar i olika perioder. HE och immunofluorescens visade att med ökningar av svårighetsgraden av SCI uppträdde mer onormal morfologi i ryggmärgsvävnaden, och ökningen av graden av skada ledde också till en ökning av graden av strukturell störning i ryggmärgen. Ur perspektivet av vävnadsmorfologiobservation överensstämmer graden och regelbundenheten av vävnadsmorfologiska förändringar i varje experimentell grupp i denna studie mycket med tidigare studier.

Enligt de nuvarande histologiska testresultaten indikeras tydliga förändringar i olika indikatorer efter olika grader av traumatisk SCI, vilket ytterligare bekräftar tillförlitligheten hos den modell som fastställts i denna studie.

Även om tekniken är korrekt och effektiv kan det finnas potentiella begränsningar för metoderna. När det gäller laminektomi bör operatören vara skicklig med operationer under mikroskopet för att förhindra att ryggmärgen skadas av misstag. Installationen av hela plattformen är också baserad på mekaniska strukturer, vilket ställer en högre efterfrågan på operatören jämfört med automiserad utrustning. Faktum är att alla nämnda problem kan förbättras genom upprepad träning av operationen.

Det kan ses att minimalt invasiv och standardiserad modellering är fördelaktig för att göra resultaten mer enhetliga, stabila och repeterbara, utvärdera effekten av olika behandlingsplaner exakt och optimera forskningsplanen för traumatisk SCI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% fixative solution	Solarbio	P1110	4%
Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody	abcam	ab8135	Dilution ratio (1: 2000)
Eosin Staining Solution (water soluble)	biosharp	BL727B
Ethanol	Fuyu Reagent	64-17-5
Fluorescent microscope	KEYENCE	BZ-X800
Frozen Slicer	leica	CM3050 S
GFAP (GA5) Mouse mAb	Cell Signaling TECHNOLOGY	#3670	Dilution ratio (1: 600)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32723TR	Dilution ratio (1: 1000)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	ThermoFisher SCIENTIFIC	A32740	Dilution ratio (1: 1000)
Hematoxylin Staining Solution	biosharp	BL702A
Mice	Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany	C57BL/6J
Microsurgery apparatus	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	All the surgey instruments are custom-made	Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors
Normal sheep serum for blocking (working solution)	Zhong Shan Jin Qiao	ZLI-9022	working solution
O.C.T. Compound	SAKURA	4583
PBS (phosphate buffered solution)	Solarbio	P1020	pH 7.2-7.4
RWD Laboratory inhalation anesthetic station	RWD Life Science Co., Ltd	R550
Small animal in vivo microCT imaging system	PerkinElmer	Quantum GX2
Spinal cord injury coaxial platform	Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd	Custom-made(Feng's standard)	(https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1)
Surgery microscope	Zumax Medical Co., Ltd.	zumax, OMS2355
TBST (Tris Buffered Saline+Tween)	Solarbio	T1082	Dilution ratio (1: 19)
Xylene	Fuyu Reagent	1330-20-7