Apresentamos aqui um protocolo para usar hipertermia controlada, gerada por ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética, para desencadear a liberação de drogas de lipossomas sensíveis à temperatura em um modelo de rabdomiossarcoma em camundongos.
O ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética (MRgHIFU) é um método estabelecido para produzir hipertermia localizada. Dada a imagem em tempo real e a modulação da energia acústica, esta modalidade permite o controle preciso da temperatura dentro de uma área definida. Muitas aplicações térmicas estão sendo exploradas com essa tecnologia não invasiva e não ionizante, como a geração de hipertermia, para liberar fármacos de portadores lipossomais termossensíveis. Essas drogas podem incluir quimioterapias como a doxorrubicina, para as quais a liberação direcionada é desejada devido aos efeitos colaterais sistêmicos limitantes da dose, ou seja, cardiotoxicidade. A doxorrubicina é um pilar para o tratamento de uma variedade de tumores malignos e é comumente usada no rabdomiossarcoma (RMS) recidivante ou recorrente. RMS é o tumor extracraniano sólido de partes moles mais comum em crianças e adultos jovens. Apesar da terapia agressiva e multimodal, as taxas de sobrevida da RMS permaneceram as mesmas nos últimos 30 anos. Para explorar uma solução para atender a essa necessidade não atendida, um protocolo experimental foi desenvolvido para avaliar a liberação de doxorrubicina lipossomal termossensível (TLD) em um modelo de RMS singênico imunocompetente usando MRgHIFU como fonte de hipertermia para liberação de fármacos.
O rabdomiossarcoma (RMS) é um tumor de músculo esquelético que ocorre mais comumente em crianças e adultosjovens1. A doença localizada é frequentemente tratada com tratamento multimodal, incluindo quimioterapia, radiação ionizante e cirurgia. O uso de esquemas quimioterápicos multidrogas é mais prevalente em pacientes pediátricos, com melhores resultados em comparação com seus pares adultos2; no entanto, apesar dos esforços de pesquisa em andamento, a taxa de sobrevida em 5 anos permanece em torno de 30% na forma mais agressiva da doença 3,4. O tratamento padrão de quimioterapia é um esquema multidrogas que inclui vincristina, ciclofosfamida e actinomicina D. Em casos de doença recidivante ou recorrente, quimioterapias alternativas são usadas, incluindo doxorrubicina (FD) padrão (livre) e ifosfamida1. Embora todas essas quimioterapias tenham toxicidade sistêmica, a cardiotoxicidade da doxorrubicina impõe uma limitação de dose por toda a vida 5-7. Para aumentar a quantidade de fármaco entregue ao tumor e minimizar a toxicidade sistêmica, formulações alternativas têm sido desenvolvidas, incluindo o encapsulamento lipossomal. Podem ser doxorrubicina não termossensível, aprovada para o tratamento de câncer de mama e carcinoma hepatocelular, ou doxorrubicina termossensível, cujos ensaios clínicos estão em andamento 8,9,10,11,12,13. Métodos alternativos para a administração de drogas lipossomais encapsuladas, como lipossomas multivesiculares e lipossomas direcionados por ligantes, têm sido avaliados e se mostram promissores para o tratamento detumores9. Neste estudo, a adição de calor tem impactos multifatoriais, incluindo a liberação do fármaco14. A combinação de hipertermia (HT) gerada com ultrassom focalizado de alta intensidade guiado por ressonância magnética (MRgHIFU) e doxorrubicina lipossomal termossensível (TLD) é uma nova abordagem terapêutica multimodal para o uso dessa droga tóxica, mas eficaz no tratamento da SMR, minimizando a toxicidade limitante da dose e potencialmente aumentando a resposta imune ao tumor.
A doxorrubicina liberta-se rapidamente de TLD a temperaturas >39 °C, muito acima da temperatura média do corpo humano de 37 °C, mas não suficientemente elevada para causar danos nos tecidos ou ablação; isso começa a ocorrer a 43 °C, mas ocorre mais rapidamente quando as temperaturas se aproximam de 60 °C15. Vários métodos têm sido utilizados para gerar TH in vivo, incluindo lasers, micro-ondas, ablação por radiofrequência e ultrassom focado, muitos dos quais são métodos invasivos de aquecimento16. MRgHIFU é um método de aquecimento não invasivo e não ionizante que facilita ajustes precisos de temperatura dentro do tecido alvo in situ. A ressonância magnética (RM) fornece imagens em tempo real, onde o software de computador pode ser usado, para calcular uma medida de termometria do tecido durante o tratamento; Posteriormente, esses dados podem ser utilizados para controlar a terapia ultrassônica em tempo real para atingir e manter um set point de temperaturadesejado17. O MRgHIFU tem sido testado em vários tipos de tecidos e pode ser usado para uma ampla gama de tratamentos de temperatura, desde TH leve até ablação, bem como clinicamente para tratar com sucesso metástases ósseas dolorosas18. Além disso, foi demonstrado que a TH causa citotoxicidade tumoral, modula a expressão proteica e altera a resposta imune no microambiente tumoral 19,20,21,22. Um estudo combinou TH leve com DTL, seguido de ablação com MRgHIFU, em um modelo sinérgico de R1 emratos23, resultando em necrose no núcleo do tumor e liberação da droga para a periferia. Tradicionalmente, a radioterapia tem sido usada como terapia adjuvante para danificar as células tumorais e diminuir a recorrência local da doença. No entanto, seu uso é limitado pela dosagem ao longo da vida e danos fora do alvo1. Assim, a HT é única na medida em que pode causar alguns dos mesmos efeitos sem as mesmas toxicidades ou limitações.
Modelos animais pré-clínicos para RMS incluem modelos imunocompetentes singênicos e xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) em hospedeiros imunocomprometidos. Embora os modelos imunocomprometidos permitam o crescimento dos tumores humanos, eles não possuem o microambiente tumoral apropriado e são limitados em sua capacidade de estudar a resposta imune24. A mutação ativadora do FGFR4 é um marcador promissor de mau prognóstico e um potencial alvo terapêutico em RMS adulto e pediátrico 1,25. Nos modelos singênicos de RMS desenvolvidos no laboratório de Gladdy, os tumores são capazes de crescer em um hospedeiro imunocompetente, que desenvolve respostas imunes inatas e adaptativas aotumor26. Como a TH influencia a resposta imune, a observação da alteração na resposta imune murina é uma vantagem valiosa desse modelo tumoral. Para testar tanto a resposta tumoral ao TLD em comparação com a DF, quanto a mudança na resposta imune do tumor tanto à quimioterapia quanto à TH, um protocolo foi desenvolvido e empregado para tratar tumores RMS murinos singênicos in vivo usando MRgHIFU e TLD, que é o foco deste estudo.
O protocolo aqui desenvolvido foi utilizado para atingir tumores de membros pélvicos utilizando MRgHIFU para tratamento leve de TH e liberação de fármacos encapsulados de lipossomas in vivo. Várias etapas críticas foram encontradas nesse protocolo durante o estudo piloto, e a otimização dessas etapas críticas foi responsável pelo melhor sucesso do tratamento em relação ao estudo piloto. A primeira é a remoção completa dos pelos na área a ser sonicada. Qualquer aprisionamento de gás dentro da pel…
The authors have nothing to disclose.
Gostaríamos de reconhecer nossas fontes de financiamento para este projeto e o pessoal envolvido, incluindo: C17 Research Grant, Canada Graduate Scholarship, Ontario Student Opportunity Trust Fund e James J. Hammond Fund.
1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363204 | |
1kb plus DNA Ladder | Froggabio | DM015-R500 | |
2x HS-Red Taq (PCR mix) | Wisent | 801-200-MM | |
7 Tesla MRI BioSpec | Bruker | T184931 | 70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany |
C1000 Thermal cycler | Biorad | 1851148 | |
Clippers | Whal Peanut | 8655 | |
Compressed ultrasound gel | Aquaflex | HF54-004 | |
Convection heating device | 3M Bair Hugger | 70200791401 | |
Depiliatory cream | Nair | 61700222611 | Shopper's Drug Mart |
DMEM | Wisent | 219-065-LK | |
DNeasy extraction kit | Qiagen | 69504 | |
DPBS | Wisent | 311-420-CL | |
Drug injection system | Harvard Apparatus | PY2 70-2131 | PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump |
Eye lubricant | Optixcare | 50-218-8442 | |
F10 Media | Wisent | 318-050-CL | |
FBS | Wisent | 081-105 | |
Froggarose | FroggaBio | A87 | |
Gel Molecular Imager | BioRad | GelDocXR | |
Glutamax | Wisent | 609-065-EL | |
Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Similar to this product |
Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G) | SAI infusion | PE-20-100 | |
Isoflurane | Sigma | 792632 | |
M25FV24C Cell line | Gladdy Lab | N/A | |
Microliter Syringe | Hamilton | 01-01-7648 | |
Molecular Imager Gel Doc XR | Biorad | 170-8170 | |
Mouse holder | The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine | N/A | Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm. |
MyRun Machine | Cosmo Bio Co Ltd | CBJ-IMR-001-EX | |
Nanodrop 8000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000-GL | |
p53 primers | Eurofins | N/A | Custom Primers |
PCR tubes | Diamed | SSI3131-06 | |
Penicillin/Streptomycin | Wisent | 450-200-EL | |
Proteus software | Pichardo lab | N/A | |
Respiratory monitoring system | SAII | Model 1030 | MR-compatible monitoring and gating system for small animals |
Small Bore HIFU device, LabFUS | Image Guided Therapy | N/A | LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 – 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm |
SYBR Safe | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
TAE | Wisent | 811-540-FL | |
Tail vein catheter (27G 0.5" ) | Terumo Medical Corp | 15253 | |
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Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
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Ultrasound Gel | Aquasonic | PLI 01-08 |