Здесь представлен метод кормления клеток кровью in vitro через искусственную мембранную систему, позволяющую частично или полностью нагружать различные стадии жизни клещей.
Клещи и связанные с ними заболевания являются важной темой изучения из-за их общественного здравоохранения и ветеринарной нагрузки. Тем не менее, требования к кормлению клещей как во время изучения, так и выращивания могут ограничивать экспериментальные вопросы или способность лабораторий исследовать клещей и связанные с ними патогены. Система искусственного мембранного кормления может уменьшить эти проблемы и открыть новые направления исследований, которые, возможно, были невозможны с традиционными системами кормления животных. В этом исследовании описывается система искусственного мембранного питания, которая была усовершенствована для успешного кормления и нагружения на всех этапах жизни Ixodes scapularis . Кроме того, система искусственного мембранного питания, описанная в этом исследовании, может быть модифицирована для использования с другими видами клещей путем простого уточнения желаемой толщины мембраны. Преимущества искусственной мембранной системы кормления уравновешиваются трудоемкостью системы, дополнительными факторами окружающей среды, которые могут повлиять на успех кормления, и необходимостью совершенствования техники для каждого нового вида и стадии жизни клещей.
Клещевые заболевания сильно влияют на здоровье людей и животных во всем мире, являясь причиной более двух третей всех трансмиссивных заболеваний в США с 2004 по 2016год1. Кроме того, в последние годы растет число случаев заболевания, при этом все больше людей и домашнего скота страдают от клещей и связанных с ними заболеваний 2,3. Хотя, вероятно, существует множество причин тенденции к росту числа случаев заболевания, изменение климата является важным фактором 3,4. Прогнозируемое продолжающееся увеличение числа случаев клещевых заболеваний подчеркивает необходимость разработки новых инструментов для изучения взаимосвязей между клещами и патогенами, которые они передают.
Известно, что клещи претерпевают изменения в физиологии и экспрессии генов во время кормления и что эти изменения играют роль в передаче патогена 5,6. Может быть трудно провести исследования, изучающие влияние полного и частичного кормления на передачу и приобретение патогенов с использованием животных моделей, особенно в ситуациях, когда модели грызунов не восприимчивы к заражению конкретным патогеном. Например, штамм Anaplasma phagocytophilum Variant-1 естественным образом передается между Ixodes scapularis и оленями, но не может заражать мышей, что усложняет клещевую инфекцию в лаборатории7. Искусственные системы кормления также могут быть применены для изучения патогенов, таких как Borrelia burgdorferi, с использованием трансгенных мутантов, которые имеют делеции генов, которые ингибируют передачу или инфекцию8. Использование искусственной системы кормления помогает исследователям изолировать роль генов, позволяя инфекции или передаче происходить только на стороне клеща, тем самым изолируя любую реакцию хозяина, которая может сбить с толку такие исследования.
Аналогичным образом, некоторые этапы жизни клещей, участвующих в передаче болезней и животных, не могут быть вызваны для питания общими лабораторными модельными видами. Самки Ixodes scapularis , например, должны питаться более крупными животными, обычно кроликами9. Хотя они часто доступны для лабораторных экспериментов, административные и сельскохозяйственные требования к использованию кроликов превышают требования мелких грызунов и могут быть непомерно высокими для некоторых лабораторий. Другие виды клещей, особенно те, которые имеют ветеринарное значение, должны питаться крупным рогатым скотом или другими крупными животными, которые непрактичны для использования в большинстве лабораторий. Методы кормления in vitro и заражения, такие как искусственное мембранное вскармливание, обеспечивают альтернативы использованию крупных или экзотических животных-хозяев.
Кроме того, использование искусственной системы кормления позволяет проводить определенные анализы, которые могут быть невозможны при традиционных методах кормления животных. Одним из таких примеров является то, что, отделяя источник крови от механизма питания, становится возможным изучение роли, которую кровь разных хозяев может играть в передаче B. burgdorferi 10. Это исследование крови хозяина и роли, которую сама кровь играет в отсутствие иммунного ответа хозяина, является важным фактором в понимании циклов передачи патогенов и тем, что системы искусственного питания могут помочь ответить11. Также становится возможным количественно оценить точное количество передачи патогена во время кормления, а не просто изучать успех передачи и установление у хозяина 8,12.
Некоторые из первых искусственных кормовых мембран, предназначенных для твердых клещей, были сделаны из шкур животных или мембран животного происхождения в 1950-х и 1960-х годах13,14. Из-за биологической природы этих мембран возникли проблемы как с производством новых мембран, так и со сроком годности. В 1990-х годах были разработаны полностью искусственные мембраны, которые использовали подложку из сетки, бумаги или ткани с силиконовой пропиткой15,16. Силикон был идеальным, поскольку его физические свойства имитируют эластичность и легкую липкость кожи, а также его био-присущую природу. Основываясь на этом, Кробер и Герин, на чьей работе была основана эта техника, описали пропитанную силиконом технику подачи вискозной мембраны для искусственного кормления I. ricinus17.
Усовершенствование методов для I. scapularis, близкородственного вида, привело к заметным различиям в твердости силикона, используемого в мембранной пропитке, рецептуре производства мембраны, размерах камеры и стимуляторе прикрепления. В то время как уточнения, о которых сообщалось в этом исследовании, привели к аналогичным характеристикам мембраны, о которых сообщили Andrade et al., которые также разработали силиконовую мембрану на основе Krober и Guerin для использования в I. scapularis, существует разница в стадиях пропитки силикона, что позволяет гибко использовать этот протокол для незрелых стадий жизни I. scapularis15, 18. В этом исследовании также описываются дополнения и технические изменения, основанные на повторном использовании этого метода, лучшие практики, которые приводят к успешной подаче, и устранение неполадок, которые могут возникнуть. Этот метод использовался для питания всех активных стадий жизни, заражения клещей патогенными бактериями и воздействия на клещей нескольких доз антибиотиков19,20. В то время как показанный метод искусственного мембранного кормления предназначен для I. scapularis, этот метод легко адаптируется к другим видам клещей с незначительными изменениями толщины мембраны.
Искусственное мембранное кормление клещей является полезным инструментом для различных экспериментальных процедур, но вряд ли заменит кормление животных для всех применений. Поддержание больших колоний клещей на всех этапах жизни без кормления животных, как правило, несостоятельно….
00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
Super glue | cyanoacrylate glue | ||
Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |