Summary

Тик Искусственное мембранное кормление для Ixodes scapularis

Published: November 30, 2022
doi:

Summary

Здесь представлен метод кормления клеток кровью in vitro через искусственную мембранную систему, позволяющую частично или полностью нагружать различные стадии жизни клещей.

Abstract

Клещи и связанные с ними заболевания являются важной темой изучения из-за их общественного здравоохранения и ветеринарной нагрузки. Тем не менее, требования к кормлению клещей как во время изучения, так и выращивания могут ограничивать экспериментальные вопросы или способность лабораторий исследовать клещей и связанные с ними патогены. Система искусственного мембранного кормления может уменьшить эти проблемы и открыть новые направления исследований, которые, возможно, были невозможны с традиционными системами кормления животных. В этом исследовании описывается система искусственного мембранного питания, которая была усовершенствована для успешного кормления и нагружения на всех этапах жизни Ixodes scapularis . Кроме того, система искусственного мембранного питания, описанная в этом исследовании, может быть модифицирована для использования с другими видами клещей путем простого уточнения желаемой толщины мембраны. Преимущества искусственной мембранной системы кормления уравновешиваются трудоемкостью системы, дополнительными факторами окружающей среды, которые могут повлиять на успех кормления, и необходимостью совершенствования техники для каждого нового вида и стадии жизни клещей.

Introduction

Клещевые заболевания сильно влияют на здоровье людей и животных во всем мире, являясь причиной более двух третей всех трансмиссивных заболеваний в США с 2004 по 2016год1. Кроме того, в последние годы растет число случаев заболевания, при этом все больше людей и домашнего скота страдают от клещей и связанных с ними заболеваний 2,3. Хотя, вероятно, существует множество причин тенденции к росту числа случаев заболевания, изменение климата является важным фактором 3,4. Прогнозируемое продолжающееся увеличение числа случаев клещевых заболеваний подчеркивает необходимость разработки новых инструментов для изучения взаимосвязей между клещами и патогенами, которые они передают.

Известно, что клещи претерпевают изменения в физиологии и экспрессии генов во время кормления и что эти изменения играют роль в передаче патогена 5,6. Может быть трудно провести исследования, изучающие влияние полного и частичного кормления на передачу и приобретение патогенов с использованием животных моделей, особенно в ситуациях, когда модели грызунов не восприимчивы к заражению конкретным патогеном. Например, штамм Anaplasma phagocytophilum Variant-1 естественным образом передается между Ixodes scapularis и оленями, но не может заражать мышей, что усложняет клещевую инфекцию в лаборатории7. Искусственные системы кормления также могут быть применены для изучения патогенов, таких как Borrelia burgdorferi, с использованием трансгенных мутантов, которые имеют делеции генов, которые ингибируют передачу или инфекцию8. Использование искусственной системы кормления помогает исследователям изолировать роль генов, позволяя инфекции или передаче происходить только на стороне клеща, тем самым изолируя любую реакцию хозяина, которая может сбить с толку такие исследования.

Аналогичным образом, некоторые этапы жизни клещей, участвующих в передаче болезней и животных, не могут быть вызваны для питания общими лабораторными модельными видами. Самки Ixodes scapularis , например, должны питаться более крупными животными, обычно кроликами9. Хотя они часто доступны для лабораторных экспериментов, административные и сельскохозяйственные требования к использованию кроликов превышают требования мелких грызунов и могут быть непомерно высокими для некоторых лабораторий. Другие виды клещей, особенно те, которые имеют ветеринарное значение, должны питаться крупным рогатым скотом или другими крупными животными, которые непрактичны для использования в большинстве лабораторий. Методы кормления in vitro и заражения, такие как искусственное мембранное вскармливание, обеспечивают альтернативы использованию крупных или экзотических животных-хозяев.

Кроме того, использование искусственной системы кормления позволяет проводить определенные анализы, которые могут быть невозможны при традиционных методах кормления животных. Одним из таких примеров является то, что, отделяя источник крови от механизма питания, становится возможным изучение роли, которую кровь разных хозяев может играть в передаче B. burgdorferi 10. Это исследование крови хозяина и роли, которую сама кровь играет в отсутствие иммунного ответа хозяина, является важным фактором в понимании циклов передачи патогенов и тем, что системы искусственного питания могут помочь ответить11. Также становится возможным количественно оценить точное количество передачи патогена во время кормления, а не просто изучать успех передачи и установление у хозяина 8,12.

Некоторые из первых искусственных кормовых мембран, предназначенных для твердых клещей, были сделаны из шкур животных или мембран животного происхождения в 1950-х и 1960-х годах13,14. Из-за биологической природы этих мембран возникли проблемы как с производством новых мембран, так и со сроком годности. В 1990-х годах были разработаны полностью искусственные мембраны, которые использовали подложку из сетки, бумаги или ткани с силиконовой пропиткой15,16. Силикон был идеальным, поскольку его физические свойства имитируют эластичность и легкую липкость кожи, а также его био-присущую природу. Основываясь на этом, Кробер и Герин, на чьей работе была основана эта техника, описали пропитанную силиконом технику подачи вискозной мембраны для искусственного кормления I. ricinus17.

Усовершенствование методов для I. scapularis, близкородственного вида, привело к заметным различиям в твердости силикона, используемого в мембранной пропитке, рецептуре производства мембраны, размерах камеры и стимуляторе прикрепления. В то время как уточнения, о которых сообщалось в этом исследовании, привели к аналогичным характеристикам мембраны, о которых сообщили Andrade et al., которые также разработали силиконовую мембрану на основе Krober и Guerin для использования в I. scapularis, существует разница в стадиях пропитки силикона, что позволяет гибко использовать этот протокол для незрелых стадий жизни I. scapularis15, 18. В этом исследовании также описываются дополнения и технические изменения, основанные на повторном использовании этого метода, лучшие практики, которые приводят к успешной подаче, и устранение неполадок, которые могут возникнуть. Этот метод использовался для питания всех активных стадий жизни, заражения клещей патогенными бактериями и воздействия на клещей нескольких доз антибиотиков19,20. В то время как показанный метод искусственного мембранного кормления предназначен для I. scapularis, этот метод легко адаптируется к другим видам клещей с незначительными изменениями толщины мембраны.

Protocol

1. Подготовка камеры клещевой мембраны Подготовьте плоскую, непористую поверхность, такую как плоскость стеклянной или керамической металлической основы подставки для рук, протерев ее 70% этанолом, а затем покройте ее одним слоем полиэтиленовой пленки, убедившись, что пла…

Representative Results

Успешное кормление зависит от того, желательна ли частичная или полная нагрубание. Успешно кормят I. scapularis оттенок оружейного серого цвета для взрослых особей и отделяют самостоятельно от мембраны. Однако, если они по крайней мере размером с горошину, они могут быть отделены от мем?…

Discussion

Искусственное мембранное кормление клещей является полезным инструментом для различных экспериментальных процедур, но вряд ли заменит кормление животных для всех применений. Поддержание больших колоний клещей на всех этапах жизни без кормления животных, как правило, несостоятельно….

Materials

00-10 Hardness Silicone Smooth-On Ecoflex 00-10 Trial size from Smooth-On Store
00-50 Hardness Silicone Smooth-On Ecoflex 00-50 Trial size from Smooth-On Store
30 Hardness Silicone Smooth-On Mold Star 30 Trial size from Smooth-On Store
6-well cell culture plates Corning Incorporated 3516
Adenosine triphosphate (ATP) Millipore Sigma A1852-1VL Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter
Bovine blood HemoStat DBB500 Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment
Clingwrap Fisherbrand 22-305654 
Filter Paper Fisherbrand 09-790-2C Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) Bioquip 2871 Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
Glucose Millipore Sigma G8270-100G
Hexane Millipore Sigma 139386-100ML
Lens paper Fisherbrand 11-995 100% rayon
Nystatin   Gold Biotechnology N-750-10
Parafilm Fisherbrand S37440 
Penicillin/streptomycin/fungizone Gibco 15240-096 Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B)
Phagostimulant Made in House Collected from prior tick feeds
Polycarbonate Pipe McMaster-Carr 8585K204  Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.
Rubber O-rings McMaster-Carr 9452K38  5 mm thick, 1.25 inch inner diameter
Soft touch forceps VWR 470315-238 
Super glue cyanoacrylate glue
Unryu paper  Art supply stores mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA

References

  1. Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases – United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
  2. Busch, J. D., et al. Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer. Parasites & Vectors. 7, 188 (2014).
  3. Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases. Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).
  4. Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).
  5. Sonenshine, D. E. . Biology of Ticks. , (1991).
  6. Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).
  7. Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).
  8. Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system. Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).
  9. Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
  10. Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).
  11. Hart, T. M., et al. Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system. PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).
  12. Bernard, Q., et al. Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).
  13. Pierce, A. E., Pierce, M. H. A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg. Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).
  14. Doube, B. M., Kemp, D. H. The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices. International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).
  15. Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).
  16. Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro. International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).
  17. Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
  18. Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).
  19. Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding. Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).
  20. Oliver, J. D., et al. Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).
  21. Graham, E. E., Poland, T. M. Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time. Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).
  22. Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis. Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).
  23. Lehane, A., et al. Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019. Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).
  24. González, J., Bickerton, M., Toledo, A. Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks. Acta Tropica. 215, (2021).
  25. Król, N., et al. Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding. Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).
  26. Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. Biology of ticks. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).

Play Video

Cite This Article
Khoo, B., Cull, B., Oliver, J. D. Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis. J. Vis. Exp. (189), e64553, doi:10.3791/64553 (2022).

View Video