Summary

Markera konstgjord membranmatning för Ixodes scapularis

Published: November 30, 2022
doi:

Summary

Här presenteras en metod för blodmatning av fästingar in vitro via ett artificiellt membransystem för att möjliggöra partiell eller fullständig mjölkstockning av en mängd olika fästinglivsstadier.

Abstract

Fästingar och deras associerade sjukdomar är ett viktigt ämne för studier på grund av deras folkhälsa och veterinärbörda. Utfodringskraven för fästingar under både studier och uppfödning kan dock begränsa experimentella frågor eller laboratoriernas förmåga att undersöka fästingar och deras associerade patogener. Ett artificiellt membranmatningssystem kan minska dessa problem och öppna nya forskningsvägar som kanske inte har varit möjliga med traditionella djurfodersystem. Denna studie beskriver ett artificiellt membranmatningssystem som har förfinats för utfodring och mjölkstockningsframgång för alla Ixodes scapularis-livsstadier . Dessutom kan det artificiella membranmatningssystemet som beskrivs i denna studie modifieras för användning med andra fästingarter genom enkel förfining av den önskade membrantjockleken. Fördelarna med ett artificiellt membranmatningssystem uppvägs av systemets arbetsintensitet, de ytterligare miljöfaktorer som kan påverka utfodringsframgången och behovet av att förfina tekniken för varje ny art och livsstadium av fästingar.

Introduction

Fästingburna sjukdomar påverkar starkt människors och djurs hälsa över hela världen och ansvarar för mer än två tredjedelar av alla vektorassocierade sjukdomar i USA från 2004 till 20161. Dessutom har antalet fall ökat de senaste åren, med fler människor och boskap som drabbats av fästingar och deras associerade sjukdomar 2,3. Även om det sannolikt finns många orsaker till den uppåtgående trenden i antalet fall, är det förändrade klimatet en viktig faktor 3,4. Den förutspådda pågående ökningen av antalet fästingburna sjukdomsfall understryker behovet av att utveckla nya verktyg för att undersöka relationerna mellan fästingar och de patogener de överför.

Det är känt att fästingar genomgår förändringar i fysiologi och genuttryck under utfodring och att dessa förändringar spelar en roll i patogenöverföring 5,6. Det kan vara svårt att utföra studier som undersöker effekterna av fullständig och partiell utfodring på överföring och förvärv av patogener med hjälp av djurmodeller, särskilt i situationer där gnagarmodeller inte är mottagliga för infektion av en viss patogen. Till exempel överförs Anaplasma phagocytophilum Variant-1-stammen naturligt mellan Ixodes scapularis och rådjur men kan inte infektera möss, vilket komplicerar fästinginfektion i labbet7. Konstgjorda matningssystem kan också användas för att studera patogener som Borrelia burgdorferi via användning av transgena mutanter som har gendeletioner som hämmar överföring eller infektion8. Att använda ett artificiellt matningssystem hjälper forskare att isolera genernas roll genom att tillåta infektion eller överföring att endast ske på fästingens sida och därigenom isolera eventuella värdsvar som kan förvirra sådana studier.

På samma sätt kan vissa livsstadier av fästingar som är involverade i sjukdom och djuröverföring inte induceras att mata på vanliga laboratoriemodellarter. Ixodes scapularis honor, till exempel, måste matas på större djur, vanligtvis kaniner9. Även om de ofta är tillgängliga för laboratorieförsök, överstiger de administrativa och djurhållningskraven för att använda kaniner de för små gnagare och kan vara oöverkomliga för vissa laboratorier. Andra fästingarter, särskilt de som är av veterinärmedicinsk betydelse, måste utfodras med nötkreatur eller andra stora djur som inte är praktiska att använda i de flesta laboratorier. In vitro-utfodrings – och infektionsmetoder, såsom artificiell membranmatning, ger alternativ till att använda stora eller exotiska värddjur.

Dessutom möjliggör användningen av ett artificiellt utfodringssystem vissa analyser som kanske inte är möjliga med traditionella djurfodermetoder. Ett sådant exempel är att genom att separera blodkällan från matningsmekanismen blir undersökning av den roll som olika värdars blod kan ha vid B. burgdorferi-överföring möjlig10. Denna undersökning av värdblod och den roll blodet själv spelar i frånvaro av värdens immunsvar är en viktig faktor för att kunna förstå patogenöverföringscykler och en som artificiella matningssystem kan hjälpa till att svarapå 11. Det blir också möjligt att kvantifiera de exakta överföringsnumren för en patogen under en matning snarare än att bara undersöka överföringsframgång och etablering i en värd 8,12.

Några av de första konstgjorda matningsmembranen gjorda för hårda fästingar gjordes av djurskinn eller membran av animaliskt ursprung på 1950- och 1960-talet13,14. På grund av dessa membrans biologiska natur fanns det problem med både produktion av nya membran och hållbarhet. På 1990-talet utvecklades helt konstgjorda membran som använde en baksida av nät, papper eller tyg med silikonimpregnering15,16. Silikon var idealiskt eftersom dess fysikaliska egenskaper efterliknar hudens stretchighet och lätt klibbighet, tillsammans med dess bioinneboende natur. Baserat på detta beskrev Krober och Guerin, vars arbete denna teknik baserades på, en silikonimpregnerad rayonmembranmatningsteknik för artificiell utfodring av I. ricinus17.

Förfining av metoderna för I. scapularis, en närbesläktad art, har lett till anmärkningsvärda skillnader i hårdheten hos silikon som används vid membranimpregnering, receptet för membranproduktion, kammarens dimensioner och fäststimulansen. Medan de förbättringar som rapporterats i denna studie har resulterat i liknande membranegenskaper som de som rapporterats av Andrade et al., som också utvecklade ett silikonbaserat membran baserat på Krober och Guerin för användning i I. scapularis, finns det en skillnad i silikonimpregneringsstegen, vilket möjliggör flexibiliteten att använda detta protokoll för omogna livsstadier av I. scapularis15, 18. Denna studie beskriver också tillägg och tekniska ändringar baserat på upprepad användning av denna metod, bästa praxis som resulterar i ett framgångsrikt flöde och felsökning av problem som kan uppstå. Denna metod har använts för att mata alla aktiva livsstadier, infektera fästingar med patogena bakterier och utsätta fästingar för flera doser antibiotika19,20. Medan den konstgjorda membranmatningsmetoden som visas är för I. scapularis, är denna metod lätt anpassningsbar till andra arter av fästingar med mindre modifieringar i membrantjocklek.

Protocol

1. Förbereda fästmembrankammaren Förbered en plan, icke-porös yta, t.ex. ett plan av glas eller en keramiskt belagd metallbas på ett armstativ genom att torka av det med 70% etanol och täck det sedan med ett enda lager plastfolie, se till att plastfolien är platt och utan bubblor eller rynkor (se figur 1A). Tejpa fast 100 % av rengöringspapperet för rayonlinser på den förberedda ytan. Se till att den är platt och något spänd med tejp över a…

Representative Results

En lyckad utfodring beror på om en partiell eller fullständig engorgement önskas. Framgångsrikt matad I. scapularis blir en nyans av gunmetal grå för vuxna och lossnar på egen hand från membranet. Men om de är minst ärtstorlek kan de lossna från membranet när utfodringen avslutas. För omogna stadier av I. scapularis varierar storleken för helt engorged fästingar, och eftersom de, till skillnad från vuxna, inte uppvisar en färgförändring, är lossning det bästa sättet att avgöra om …

Discussion

Artificiell membranmatning av fästingar ger ett användbart verktyg för en mängd olika experimentella förfaranden, men kommer sannolikt inte att ersätta djurfoder för alla applikationer. Att upprätthålla stora kolonier av fästingar i alla livsstadier utan djurfoder är i allmänhet ohållbart. I stället är det artificiella utfodringssystemet värdefullt för andra ändamål, såsom att infektera fästingar med patogener som inte stöds av modellvärdar, utvärdera effekterna av kontrollerade doser av förening…

Materials

00-10 Hardness Silicone Smooth-On Ecoflex 00-10 Trial size from Smooth-On Store
00-50 Hardness Silicone Smooth-On Ecoflex 00-50 Trial size from Smooth-On Store
30 Hardness Silicone Smooth-On Mold Star 30 Trial size from Smooth-On Store
6-well cell culture plates Corning Incorporated 3516
Adenosine triphosphate (ATP) Millipore Sigma A1852-1VL Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter
Bovine blood HemoStat DBB500 Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment
Clingwrap Fisherbrand 22-305654 
Filter Paper Fisherbrand 09-790-2C Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) Bioquip 2871 Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml
Glucose Millipore Sigma G8270-100G
Hexane Millipore Sigma 139386-100ML
Lens paper Fisherbrand 11-995 100% rayon
Nystatin   Gold Biotechnology N-750-10
Parafilm Fisherbrand S37440 
Penicillin/streptomycin/fungizone Gibco 15240-096 Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B)
Phagostimulant Made in House Collected from prior tick feeds
Polycarbonate Pipe McMaster-Carr 8585K204  Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel.
Rubber O-rings McMaster-Carr 9452K38  5 mm thick, 1.25 inch inner diameter
Soft touch forceps VWR 470315-238 
Super glue cyanoacrylate glue
Unryu paper  Art supply stores mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA

References

  1. Rosenberg, R., et al. Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases – United States and territories, 2004-2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).
  2. Busch, J. D., et al. Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer. Parasites & Vectors. 7, 188 (2014).
  3. Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases. Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).
  4. Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232 (2009).
  5. Sonenshine, D. E. . Biology of Ticks. , (1991).
  6. Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).
  7. Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice. The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).
  8. Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system. Scientific Reports. 8 (1), 1910 (2018).
  9. Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
  10. Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers. Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).
  11. Hart, T. M., et al. Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system. PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).
  12. Bernard, Q., et al. Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).
  13. Pierce, A. E., Pierce, M. H. A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg. Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).
  14. Doube, B. M., Kemp, D. H. The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices. International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).
  15. Kröber, T., Guerin, P. M. An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks. Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).
  16. Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro. International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).
  17. Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
  18. Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).
  19. Oliver, J. D., et al. Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding. Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).
  20. Oliver, J. D., et al. Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).
  21. Graham, E. E., Poland, T. M. Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time. Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).
  22. Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis. Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).
  23. Lehane, A., et al. Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019. Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).
  24. González, J., Bickerton, M., Toledo, A. Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks. Acta Tropica. 215, (2021).
  25. Król, N., et al. Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding. Microorganisms. 9 (5), 901 (2021).
  26. Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. Biology of ticks. Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).

Play Video

Cite This Article
Khoo, B., Cull, B., Oliver, J. D. Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis. J. Vis. Exp. (189), e64553, doi:10.3791/64553 (2022).

View Video