Här presenteras en metod för blodmatning av fästingar in vitro via ett artificiellt membransystem för att möjliggöra partiell eller fullständig mjölkstockning av en mängd olika fästinglivsstadier.
Fästingar och deras associerade sjukdomar är ett viktigt ämne för studier på grund av deras folkhälsa och veterinärbörda. Utfodringskraven för fästingar under både studier och uppfödning kan dock begränsa experimentella frågor eller laboratoriernas förmåga att undersöka fästingar och deras associerade patogener. Ett artificiellt membranmatningssystem kan minska dessa problem och öppna nya forskningsvägar som kanske inte har varit möjliga med traditionella djurfodersystem. Denna studie beskriver ett artificiellt membranmatningssystem som har förfinats för utfodring och mjölkstockningsframgång för alla Ixodes scapularis-livsstadier . Dessutom kan det artificiella membranmatningssystemet som beskrivs i denna studie modifieras för användning med andra fästingarter genom enkel förfining av den önskade membrantjockleken. Fördelarna med ett artificiellt membranmatningssystem uppvägs av systemets arbetsintensitet, de ytterligare miljöfaktorer som kan påverka utfodringsframgången och behovet av att förfina tekniken för varje ny art och livsstadium av fästingar.
Fästingburna sjukdomar påverkar starkt människors och djurs hälsa över hela världen och ansvarar för mer än två tredjedelar av alla vektorassocierade sjukdomar i USA från 2004 till 20161. Dessutom har antalet fall ökat de senaste åren, med fler människor och boskap som drabbats av fästingar och deras associerade sjukdomar 2,3. Även om det sannolikt finns många orsaker till den uppåtgående trenden i antalet fall, är det förändrade klimatet en viktig faktor 3,4. Den förutspådda pågående ökningen av antalet fästingburna sjukdomsfall understryker behovet av att utveckla nya verktyg för att undersöka relationerna mellan fästingar och de patogener de överför.
Det är känt att fästingar genomgår förändringar i fysiologi och genuttryck under utfodring och att dessa förändringar spelar en roll i patogenöverföring 5,6. Det kan vara svårt att utföra studier som undersöker effekterna av fullständig och partiell utfodring på överföring och förvärv av patogener med hjälp av djurmodeller, särskilt i situationer där gnagarmodeller inte är mottagliga för infektion av en viss patogen. Till exempel överförs Anaplasma phagocytophilum Variant-1-stammen naturligt mellan Ixodes scapularis och rådjur men kan inte infektera möss, vilket komplicerar fästinginfektion i labbet7. Konstgjorda matningssystem kan också användas för att studera patogener som Borrelia burgdorferi via användning av transgena mutanter som har gendeletioner som hämmar överföring eller infektion8. Att använda ett artificiellt matningssystem hjälper forskare att isolera genernas roll genom att tillåta infektion eller överföring att endast ske på fästingens sida och därigenom isolera eventuella värdsvar som kan förvirra sådana studier.
På samma sätt kan vissa livsstadier av fästingar som är involverade i sjukdom och djuröverföring inte induceras att mata på vanliga laboratoriemodellarter. Ixodes scapularis honor, till exempel, måste matas på större djur, vanligtvis kaniner9. Även om de ofta är tillgängliga för laboratorieförsök, överstiger de administrativa och djurhållningskraven för att använda kaniner de för små gnagare och kan vara oöverkomliga för vissa laboratorier. Andra fästingarter, särskilt de som är av veterinärmedicinsk betydelse, måste utfodras med nötkreatur eller andra stora djur som inte är praktiska att använda i de flesta laboratorier. In vitro-utfodrings – och infektionsmetoder, såsom artificiell membranmatning, ger alternativ till att använda stora eller exotiska värddjur.
Dessutom möjliggör användningen av ett artificiellt utfodringssystem vissa analyser som kanske inte är möjliga med traditionella djurfodermetoder. Ett sådant exempel är att genom att separera blodkällan från matningsmekanismen blir undersökning av den roll som olika värdars blod kan ha vid B. burgdorferi-överföring möjlig10. Denna undersökning av värdblod och den roll blodet själv spelar i frånvaro av värdens immunsvar är en viktig faktor för att kunna förstå patogenöverföringscykler och en som artificiella matningssystem kan hjälpa till att svarapå 11. Det blir också möjligt att kvantifiera de exakta överföringsnumren för en patogen under en matning snarare än att bara undersöka överföringsframgång och etablering i en värd 8,12.
Några av de första konstgjorda matningsmembranen gjorda för hårda fästingar gjordes av djurskinn eller membran av animaliskt ursprung på 1950- och 1960-talet13,14. På grund av dessa membrans biologiska natur fanns det problem med både produktion av nya membran och hållbarhet. På 1990-talet utvecklades helt konstgjorda membran som använde en baksida av nät, papper eller tyg med silikonimpregnering15,16. Silikon var idealiskt eftersom dess fysikaliska egenskaper efterliknar hudens stretchighet och lätt klibbighet, tillsammans med dess bioinneboende natur. Baserat på detta beskrev Krober och Guerin, vars arbete denna teknik baserades på, en silikonimpregnerad rayonmembranmatningsteknik för artificiell utfodring av I. ricinus17.
Förfining av metoderna för I. scapularis, en närbesläktad art, har lett till anmärkningsvärda skillnader i hårdheten hos silikon som används vid membranimpregnering, receptet för membranproduktion, kammarens dimensioner och fäststimulansen. Medan de förbättringar som rapporterats i denna studie har resulterat i liknande membranegenskaper som de som rapporterats av Andrade et al., som också utvecklade ett silikonbaserat membran baserat på Krober och Guerin för användning i I. scapularis, finns det en skillnad i silikonimpregneringsstegen, vilket möjliggör flexibiliteten att använda detta protokoll för omogna livsstadier av I. scapularis15, 18. Denna studie beskriver också tillägg och tekniska ändringar baserat på upprepad användning av denna metod, bästa praxis som resulterar i ett framgångsrikt flöde och felsökning av problem som kan uppstå. Denna metod har använts för att mata alla aktiva livsstadier, infektera fästingar med patogena bakterier och utsätta fästingar för flera doser antibiotika19,20. Medan den konstgjorda membranmatningsmetoden som visas är för I. scapularis, är denna metod lätt anpassningsbar till andra arter av fästingar med mindre modifieringar i membrantjocklek.
Artificiell membranmatning av fästingar ger ett användbart verktyg för en mängd olika experimentella förfaranden, men kommer sannolikt inte att ersätta djurfoder för alla applikationer. Att upprätthålla stora kolonier av fästingar i alla livsstadier utan djurfoder är i allmänhet ohållbart. I stället är det artificiella utfodringssystemet värdefullt för andra ändamål, såsom att infektera fästingar med patogener som inte stöds av modellvärdar, utvärdera effekterna av kontrollerade doser av förening…
00-10 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-10 | Trial size from Smooth-On Store |
00-50 Hardness Silicone | Smooth-On | Ecoflex 00-50 | Trial size from Smooth-On Store |
30 Hardness Silicone | Smooth-On | Mold Star 30 | Trial size from Smooth-On Store |
6-well cell culture plates | Corning Incorporated | 3516 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Millipore Sigma | A1852-1VL | Used to make an aqueous solution of 3 mM ATP that has been filter sterlized via 0.2 micometer filter |
Bovine blood | HemoStat | DBB500 | Mechanically defibrinated; 500 mL is usually sufficient for one experiment |
Clingwrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
Filter Paper | Fisherbrand | 09-790-2C | Autoclave and let cool before using. Can use Fine quality instead of medium too |
Fluon (aqueous polytetrafluoroethylene) | Bioquip | 2871 | Available from other sources such as https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml |
Glucose | Millipore Sigma | G8270-100G | |
Hexane | Millipore Sigma | 139386-100ML | |
Lens paper | Fisherbrand | 11-995 | 100% rayon |
Nystatin | Gold Biotechnology | N-750-10 | |
Parafilm | Fisherbrand | S37440 | |
Penicillin/streptomycin/fungizone | Gibco | 15240-096 | Or equivalent generic with concentration as follows (10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Amphotericin B) |
Phagostimulant | Made in House | Collected from prior tick feeds | |
Polycarbonate Pipe | McMaster-Carr | 8585K204 | Cut to 45 mm length, 1.25 inch outer diameter, 1 inch inner diameter. Cutting requires a chop saw grinding wheel. |
Rubber O-rings | McMaster-Carr | 9452K38 | 5 mm thick, 1.25 inch inner diameter |
Soft touch forceps | VWR | 470315-238 | |
Super glue | cyanoacrylate glue | ||
Unryu paper | Art supply stores | mulberry fiber 10 g/m2. Purchased at Wet Paint art supply store, St. Paul, MN, USA |