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Bioengineering

3 डी सेल कल्चर के लिए माइक्रोपोरस एनाल्ड पार्टिकल स्काफोल्ड्स में कण अंश को नियंत्रित करना

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64554
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Departments of Biomedical Engineering, Neurology, and Dermatology, Duke University

Summary

दानेदार मचानों के भीतर कण अंश में परिवर्तनशीलता को कम करने से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोग की सुविधा मिलती है। यह काम इन विट्रो ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए नियंत्रित कण अंशों के साथ दानेदार मचानों को उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

माइक्रोगेल माइक्रोपोरस एनाल्ड पार्टिकल (एमएपी) मचानों के निर्माण खंड हैं, जो इन विट्रो सेल कल्चर और विवो ऊतक मरम्मत दोनों के लिए एक मंच के रूप में काम करते हैं। इन दानेदार मचानों में, माइक्रोगेल के बीच शून्य स्थान द्वारा उत्पन्न जन्मजात सरंध्रता सेल घुसपैठ और प्रवास को सक्षम बनाती है। एमएपी पाड़ डिजाइन के लिए शून्य अंश और कण अंश को नियंत्रित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि छिद्र कोशिकाओं के लिए एक बायोएक्टिव क्यू है। गोलाकार माइक्रोगेल को नियंत्रित आकार और आकार के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस पर उत्पन्न किया जा सकता है और बाद में उन तरीकों का उपयोग करके फ्रीज-सुखाया जा सकता है जो बहुलक नेटवर्क के फ्रैक्चरिंग को रोकते हैं। पुनर्जलीकरण पर, लियोफिलाइज्ड माइक्रोगेल एमएपी मचानों में नियंत्रित कण अंशों का नेतृत्व करते हैं। माइक्रोगेल लियोफिलाइजेशन के लिए इन विधियों के कार्यान्वयन ने मैक्रोमोलेक्यूल प्रसार और सेल प्रसार पर कण अंश के प्रभाव को दिखाने वाले प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अध्ययनों को जन्म दिया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल एमएपी मचानों में कण अंश को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोगेल के निर्माण, लियोफिलाइजेशन और पुनर्जलीकरण को कवर करेगा, साथ ही विट्रो में 3 डी सेल संस्कृति के लिए बायो-ऑर्थोगोनल क्रॉसलिंकिंग के माध्यम से माइक्रोगेल को एनीलिंग करेगा।

Introduction

माइक्रोपोरस एनाल्ड पार्टिकल (एमएपी) मचान दानेदार सामग्री का एक उपवर्ग है जिसमें माइक्रोगेल (गेल) बिल्डिंग ब्लॉक एक थोक, छिद्रपूर्ण मचान बनाने के लिए आपस में जुड़े होते हैं। इन दानेदार मचानों के अद्वितीय माइक्रोआर्किटेक्चर के साथ, इंटरलिंक गोलाकार माइक्रोगेल के बीच शून्य स्थान द्वारा उत्पन्न जन्मजात सरंध्रता त्वरित सेल घुसपैठ और प्रवासन1 का समर्थन करती है। एमएपी मचानों के माइक्रोजेल बिल्डिंग ब्लॉक को रासायनिक संशोधनों के साथ सिंथेटिक और प्राकृतिक पॉलिमर दोनों से बनाया जा सकताहै। यहां वर्णित विधियां विशेष रूप से कार्यात्मक नॉरबोर्निन (एनबी) हैंडल के साथ संशोधित हाइलूरोनिक एसिड (एचए) रीढ़ से युक्त माइक्रोगेल के उपयोग को उजागर करती हैं। एचए बहुलक पर एनबी कार्यात्मक हैंडल माइक्रोगेल बनाने के लिए क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रियाओं का समर्थन करता है और एमएपीमचान 3,4 उत्पन्न करने के लिए उन्हें एक साथ जोड़ता है। माइक्रोगेल को एक साथ जोड़ने के लिए कई योजनाओं को नियोजित किया गया है (यानी, एनीलिंग), जैसे कि एंजाइमेटिक1, प्रकाश-आधारित 5,6, और योजक-मुक्त क्लिक रसायन विज्ञान 3,7 प्रतिक्रियाएं। एचए-एनबी माइक्रोगेल को इंटरलिंक करने के लिए टेट्राज़िन-नॉरबोर्निन व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉन मांग डाइल्स-एल्डर संयुग्मन का उपयोग करके इस काम में एडिटिव-फ्री क्लिक रसायन विज्ञान का वर्णन किया गया है।

एमएपी मचानों को बनाने के लिए, उपयोगकर्ता पहले रिवर्स इमल्शन का उपयोग करके या तो बैच सिस्टम में या माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के साथ-साथ इलेक्ट्रोहाइड्रोडायनामिक छिड़काव, लिथोग्राफी या यांत्रिक विखंडन2 के साथ माइक्रोजेल बिल्डिंग ब्लॉक उत्पन्न करते हैं। गोलाकार एचए-एनबी माइक्रोगेल के उत्पादन को अच्छी तरह से वर्णित किया गया है और पहले बैच इमल्शन2 और माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट जनरेशन तकनीक 8,9,10,11 दोनों का उपयोग करके रिपोर्ट किया गया था। इस काम में, गोलाकार एचए-एनबी माइक्रोगेल को नियंत्रित आकार और आकार के लिए प्रवाह-केंद्रित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पर उत्पन्न किया गया था, जैसा कि पहलेवर्णित 8,9,10 था। शुद्धिकरण के बाद, माइक्रोगेल एक जलीय निलंबन में मौजूद होते हैं और जाम अवस्था को प्रेरित करने के लिए केंद्रित होना चाहिए। जाम होने पर, माइक्रोगेल कतरनी-पतला गुण प्रदर्शित करते हैं, जो उन्हें इंजेक्शन योग्य, अंतरिक्ष भरने वाली सामग्री के रूप में कार्य करने की अनुमतिदेते हैं। जाम अवस्था को प्रेरित करने की एक विधि लियोफिलाइजेशन, या फ्रीज-सुखाने के माध्यम से माइक्रोगेल को सुखाना है, फिर बाद में सूखे उत्पाद को नियंत्रित मात्रा12 में पुनर्जलीकृत करना है। वैकल्पिक रूप से, अतिरिक्त बफर को माइक्रोजेल घोल से एक छन्नी पर सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से या माइक्रोगेल गोली से बफर को मैन्युअल रूप से हटाने के साथ या तो आकांक्षा द्वारा या शोषक सामग्री का उपयोग करके हटाया जा सकता है। हालांकि, माइक्रोगेल को सुखाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करते समय कण अंशों और शून्य अंशों की एक अत्यधिक परिवर्तनशील श्रेणी उत्पन्न कर सकतेहैं। लियोफिलाइज़िंग माइक्रोगेल के लिए तकनीकों को पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) माइक्रोगेल13 के लिए 70% आईपीए, जिलेटिन मेथाक्राइलोयल (गेलमा) माइक्रोगेल14 के लिए फ्लोराइडयुक्त तेलों और एचए माइक्रोगेल12 के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करके वर्णित किया गया है। यह प्रोटोकॉल सुखाने की प्रक्रिया के दौरान मूल माइक्रोजेल गुणों को बनाए रखने के लिए 70% इथेनॉल, एक मानक प्रयोगशाला अभिकर्मक का उपयोग करके गोलाकार एचए माइक्रोगेल को फ्रीज-सुखाने के तरीकों पर प्रकाश डालता है। एमएपी मचानों12 में अंतिम कण अंशों को नियंत्रित करने के लिए फ्रीज-सूखे एचए माइक्रोगेल को उपयोगकर्ता-परिभाषित वजन प्रतिशत पर तौला और पुनर्जलीकृत किया जा सकता है।

एमएपी पाड़ गठन में अंतिम चरण एक थोक, छिद्रपूर्ण पाड़1 बनाने के लिए माइक्रोगेल को एनीलिंग पर निर्भर करता है। देशी बाह्य मैट्रिक्स घटकों का उपयोग करके और बायो-ऑर्थोगोनल एनीलिंग योजनाओं को नियोजित करके, एमएपी स्काफोल्ड्स इन विट्रो सेल कल्चर और विवो ऊतक मरम्मतदोनों के लिए एक जैव संगत मंच के रूप में काम करते हैं। इन दृष्टिकोणों के माध्यम से, एमएपी मचानों को ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में उनके रोजगार के लिए उपयोगकर्ता-परिभाषित कण अंशों के साथ एचए-एनबी बिल्डिंग ब्लॉक से बनाया जा सकताहै। निम्नलिखित प्रोटोकॉल एमएपी मचानों में कण अंश को नियंत्रित करने के लिए लियोफिलाइजेशन और पुनर्जलीकरण के बाद एचए-एनबी माइक्रोगेल के माइक्रोफ्लुइडिक उत्पादन का वर्णन करता है। अंत में, माइक्रोगेल को एनीलिंग के चरणों को इन विट्रो 3 डी सेल कल्चर प्रयोगों के लिए बायो-ऑर्थोगोनल रसायन विज्ञान का उपयोग करके वर्णित किया गया है।

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Protocol

1. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस निर्माण

  1. नरम लिथोग्राफी
    नोट: यह प्रोटोकॉल डी विल्सन एट अल.9 से प्रवाह-केंद्रित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस डिज़ाइन के डिवाइस निर्माण का वर्णन करता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग एसयू -8 वेफर पर किसी भी डिवाइस डिज़ाइन के साथ किया जा सकता है। वेफर को पेट्री डिश पर टेप किया जा सकता है, और फिर वेफर सुविधाओं15 के लिए पीडीएमएस के पालन को रोकने के लिए सिलनाइज्ड करने की आवश्यकता होती है।
    1. पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) इलास्टोमेर बेस को इलाज एजेंट के साथ मिलाएं ( सामग्री की तालिका देखें) 10: 1 अनुपात में। ~ 5 मिमी पीडीएमएस के साथ वेफर को कवर करने के लिए लगभग 100 ग्राम तैयार करें। पीडीएमएस मिश्रण को वेफर और डेगैस पर लगभग 30 मिनट के लिए एक डेसिकेटर में डालें। एक बार जब सभी बुलबुले चले जाते हैं, तो पीडीएमएस को ठीक करने के लिए कम से कम 2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें।
    2. वेफर को क्रैक किए बिना डिवाइस के पैरामीटर के चारों ओर धीरे से पता लगाने के लिए चाकू का उपयोग करें; फिर, वेफर से पीडीएमएस को सावधानीपूर्वक छील लें। इनलेट और आउटलेट चैनल बनाने के लिए 1 मिमी बायोप्सी पंच ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
      नोट: माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को पंच करते समय सौम्य रहें। इनलेट या आउटलेट चैनलों के आसपास आँसू या चीरें माइक्रोजेल उत्पादन के दौरान लीक का कारण बन सकती हैं।
    3. फीचर साइड पर डिवाइस से धूल हटाने के लिए टेप का उपयोग करें। उपकरणों को रखें और नमी को हटाने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए 135 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर ग्लास स्लाइड साफ करें।
    4. एक फ्यूम हुड में, लगभग 30 सेकंड के लिए ग्लास स्लाइड और उपकरणों (फीचर साइड एक्सपोज़्ड) दोनों पर एक कोरोना प्लाज्मा गन ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें, और फिर जल्दी से उन्हें एक साथ बांध दें। डिवाइस और ग्लास स्लाइड के बीच एक अच्छी सील सुनिश्चित करने के लिए धीरे से दबाव लागू करें। बंधन को सुरक्षित करने के लिए उपकरणों को रात भर 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।

2. नॉरबोर्निन (एनबी) कार्यात्मक हैंडल के साथ हाइलूरोनिक एसिड (एचए) माइक्रोगेल का माइक्रोफ्लुइडिक उत्पादन

  1. HA-NB संश्लेषण
    नोट: एचए-नॉरबोर्निन (एचए-एनबी) संश्लेषण को डार्लिंग एट अल.3 से एचए-रिपीट इकाइयों के 1: 1.5: 2.5 के दाढ़ समकक्षों के साथ एचए-रिपीट इकाइयों के दाढ़ समकक्षों के साथ 4-(4,6-डिमेथॉक्सी-1,3,5-ट्राइजिन-2-वाईएल)-4-मेथिलमोर्फोलिनियम क्लोराइड (डीएमटीएमएम) से 5-नॉरबोर्न-2-मिथाइलमाइन (एनएमए) तक अनुकूलित किया गया था।
    1. अभिकारकों का वजन करें। एचए को 200 एमएम एमईएस बफर (पीएच ~ 6) में 20 मिलीग्राम / एमएल पर एक स्टिर प्लेट पर बीकर या फ्लास्क में हिलाकर भंग करें। एक बार घुलने के बाद, डीएमटीएमएम को एचए समाधान में जोड़ें और कमरे के तापमान पर लगभग 20 मिनट तक प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें। उदाहरण के लिए, 1 g HA + 1.09 g DMTMM + 845 μL NMA का उपयोग किया जा सकता है।
    2. डीएमटीएमएम समाधान में एनएमए ड्रॉपवाइज जोड़ें। वाष्पीकरण को कम करने और प्रतिक्रिया पोत को पन्नी से कवर करने के लिए प्रतिक्रिया पोत के उद्घाटन में पैराफिल्म जोड़ें। प्रतिक्रिया को लगभग 24 घंटे तक आगे बढ़ने की अनुमति देते हुए हिलाना जारी रखें।
    3. 24 घंटे के बाद, 200 प्रूफ इथेनॉल (प्रतिक्रिया की मात्रा लगभग 10 गुना) को ठंडा करें। एक हलचल प्लेट पर, एचए-एनबी को अवक्षेपित करने के लिए ठंडा इथेनॉल में प्रतिक्रिया ड्रॉपवाइज स्थानांतरित करें और 20 मिनट के लिए 200-300 आरपीएम पर हिलाना जारी रखें।
    4. समाधान को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और फिर 10 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। अपशिष्ट के रूप में निपटाने के लिए अतिरिक्त इथेनॉल डालें। इस बिंदु पर, एचए-एनबी उत्पाद शंक्वाकार ट्यूबों में सफेद छर्रों होना चाहिए। एचए-एनबी पर वैक्यूम को रात भर सूखने के लिए एक डेसीकेटर में खींचें।
    5. 12-14 केडीए आणविक भार कट-ऑफ सेल्यूलोज डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग करके एचए-एनबी को शुद्ध करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एचए-एनबी को 2 एम एनएसीएल समाधान में भंग करें और डायलिसिस ट्यूबिंग में स्थानांतरित करें। यदि आवश्यक हो, तो टयूबिंग को बांधें और क्लैंप के साथ सुरक्षित करें। भरे हुए डायलिसिस ट्यूबिंग को 5 लीटर अल्ट्राप्योर पानी के साथ एक बाल्टी में स्थानांतरित करें और एचए-एनबी को रात भर पानी के खिलाफ डायलाइज करें।
    6. अगले दिन, पानी निकालें और 30 मिनट के लिए 1 M NaCl घोल से बदलें। NaCl समाधान निकालें, और फिर 3 दिनों के लिए अल्ट्राप्योर पानी के खिलाफ डायलाइज करें, प्रतिदिन पानी को बदलें।
    7. 0.2 μm वैक्यूम-संचालित फ़िल्टर का उपयोग करके डायलाइज़ किए गए उत्पाद को फ़िल्टर करें, और फिर फ़िल्टर किए गए उत्पाद को 50 mL शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    8. क्रायोजेनिक कंटेनर में तरल नाइट्रोजन जोड़ें और 10 मिनट के लिए एचए-एनबी ट्यूबों को फ्लैश-फ्रीज करें। फिर, शंक्वाकार ट्यूबों को बल के साथ हटा दें और जल्दी से टोपी को हटा दें और लैब-ग्रेड ऊतक के साथ कवर करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक रबर बैंड के साथ ऊतक को सुरक्षित करें और एक लियोफिलाइजेशन कंटेनर या कक्ष में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और लियोफिलाइज़ करें। लियोफिलाइज्ड उत्पाद को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      चेतावनी: तरल नाइट्रोजन एक खतरनाक पदार्थ है। तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
    9. डी2ओ में 10 मिलीग्राम / एमएल पर एचए-एनबी को भंग करके और प्रोटॉन एनएमआर (चित्रा 1 ए) 16 के माध्यम से विश्लेषण करके नॉरबोर्निन संशोधन की मात्रा निर्धारित करें।
      1. कार्यात्मकता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पहले डी2ओ विलायक शिखर को 4.8 पीपीएम तक कैलिब्रेट करें। एचए मिथाइल प्रोटॉन (2.05) के लिए शिखर को एकीकृत करें और एकीकरण को 3.0 तक कैलिब्रेट करें। इसके बाद, पेंडेंट नॉरबोर्न समूहों के लिए चोटियों को 6.33 और 6.02 (विनाइल प्रोटॉन, एंडो) पर एकीकृत करें। संशोधन की औसत डिग्री निर्धारित करने के लिए प्रोटॉन की इसी संख्या के लिए इन चोटियों के एकीकरण को सामान्यकरें।
  2. एचए-एनबी माइक्रोजेल अग्रदूत की तैयारी
    1. 50 mM HEPES बफर (pH 7.5) तैयार करें और 0.2 μm वैक्यूम-संचालित फ़िल्टर का उपयोग करके बफर को बाँझ फ़िल्टर करें। एचईपीईएस बफर का उपयोग करके, लिथियम फिनाइल (2,4,6,-ट्राइमिथाइलबेंजोयल) फॉस्फीनेट (एलएपी) फोटो-सर्जक और ट्राइस (2-कार्बोक्सीथिल) फॉस्फीन (टीसीईपी) कम करने वाले एजेंट के संबंधित 50 एमएम स्टॉक तैयार करें। एलएपी समाधान को प्रकाश से दूर रखें।
    2. बाँझ आसुत जल में डि-थिओल लिंकर और आरजीडी पेप्टाइड के संबंधित 50 एमएम स्टॉक तैयार करके अन्य माइक्रोगेल अग्रदूत घटक तैयार करें। एचए-एनबी का वजन करें और 10 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक तैयार करने के लिए एचईपीईएस बफर में घुल जाएं।
      नोट: उपयोगकर्ता वरीयता के आधार पर माइक्रोगेल के आंतरिक क्रॉसलिंकिंग के लिए विभिन्न डि-थिओल लिंकर का उपयोग किया जा सकता है। सामग्री की तालिका में एक डिग्रेडेबल (यानी, एमएमपी-क्लीवर) और नॉन-डिग्रेडेबल (डिथियोथ्रेइटोल या डीटीटी) लिंकर दोनों को सूचीबद्ध किया गया है। एमएपी मचानों में सेल आसंजन को बढ़ावा देने के लिए आरजीडी पेप्टाइड को माइक्रोजेल फॉर्मूलेशन में शामिल किया गया है, लेकिन इस घटक को हटाया जा सकता है और एचईपीईएस बफर की समान मात्रा के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    3. वांछित अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए अतिरिक्त एचईपीईएस बफर जोड़कर 9.9 एमएम एलएपी, 0.9375 एमएम टीसीईपी (4 थिओल / टीसीईपी), 2.8 एमएम डी-थिओल लिंकर, 1 एमएम आरजीडी पेप्टाइड और 3.5 डब्ल्यूटी% (डब्ल्यू / वी) एचए-एनबी की अंतिम सांद्रता के साथ अग्रदूत घटकों को मिलाएं। एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके अग्रदूत को अच्छी तरह से मिलाएं।
    4. पी 1000 पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे पूरे मिश्रण को खींचें। टिप को 1 एमएल सिरिंज के अंत में रखें और पिपेट से टिप निकालें। मिश्रण को सिरिंज में लोड करने के लिए सिरिंज प्लंजर को खींचें, और फिर सिरिंज के अंत में 0.2 μm फ़िल्टर जोड़ें और एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में फ़िल्टर करें। फ़िल्टरिंग के दौरान उत्पादित बुलबुले को हटाने के लिए फ़िल्टर किए गए अग्रदूत समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. फिर, पी 1000 पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे फ़िल्टर किए गए अग्रदूत को बुलबुले न बनाने के लिए सावधान रखें। यदि बुलबुले हैं, तो धीरे से उन्हें हटाने और शीर्ष पर तैरने के लिए नोक पर टैप करें।
    6. टिप को 1 एमएल सिरिंज के अंत में रखें और पिपेट से टिप निकालें। सिरिंज को ऊर्ध्वाधर रखें और सिरिंज प्लंजर को धीरे-धीरे खींचें जब तक कि पूरा अग्रदूत समाधान सिरिंज में न हो। सिरिंज में एक कुंद टिप सुई जोड़ें और सुई की नोक के माध्यम से अग्रदूत को धक्का दें। प्रकाश से बाहर रखने के लिए सिरिंज को पन्नी में लपेटें।
  3. माइक्रोजेल पिंचिंग समाधान की तैयारी
    1. भारी सफेद खनिज तेल में 5% v/v Span-80 तैयार करें और अच्छी तरह मिलाएं। बुलबुले को हटाने के लिए तैयार रहें। तेल मिश्रण को कमरे के तापमान पर पन्नी में लपेटकर रखें। प्रत्येक उपयोग से पहले अच्छी तरह से मिलाएं और डिसिकेट करें।
    2. सर्फेक्टेंट मिश्रण (बुलबुले को कम करने) को खींचने के लिए 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करें जब तक कि प्लंजर और फिंगरहोल्ड के बीच की दूरी अग्रदूत सिरिंज की दूरी के बराबर न हो। सिरिंज में एक कुंद सुई जोड़ें और सुई की नोक के माध्यम से तेल को धक्का दें।
  4. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस सेटअप
    1. 1 एमएल सिरिंज में एक कुंद सुई जोड़ें और सिंथेटिक हाइड्रोफोबिक उपचार समाधान से भरें ( सामग्री की तालिका देखें)। धीरे से माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के माध्यम से समाधान प्रवाहित करें जब तक कि यह प्रत्येक इनलेट / आउटलेट पर पूल न हो जाए। समाधान को लगभग 30 मिनट के लिए बेंचटॉप पर डिवाइस में सूखने दें, और फिर अतिरिक्त समाधान को हटाने के लिए आउटलेट पर वैक्यूम खींचें। टेबलटॉप माइक्रोस्कोप पर क्लैंप के साथ डिवाइस को सुरक्षित करें।
    2. पन्नी के साथ एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब लपेटें और माइक्रोगेल संग्रह कंटेनर के रूप में सेवा करने के लिए ट्यूब रैक में रखें। संग्रह ट्यूब के उद्घाटन में यूवी प्रकाश जांच रखने के लिए क्लैंप के साथ एक रिंग स्टैंड का उपयोग करें। यूवी तीव्रता को मापने के लिए यूवी डिटेक्टर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें, जांच को 20 mW / cm2 प्राप्त होने तक स्थानांतरित करें। बाद तक यूवी लाइट बंद कर दें।
    3. ट्यूबिंग को एक लंबाई पर काटें जो माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस से संग्रह कंटेनर तक पहुंच जाएगी। टयूबिंग के एक छोर पर, 45 ° कोण काटें। धीरे से ट्यूबिंग के कोण वाले छोर को आउटलेट चैनल में डालें।
      नोट: माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में ट्यूबिंग डालते समय सौम्य रहें। इनलेट या आउटलेट चैनलों के आसपास आँसू या चीरें माइक्रोजेल उत्पादन के दौरान लीक का कारण बन सकती हैं।
    4. दोहरी सिरिंज पंप पर अग्रदूत और तेल चरण सिरिंज दोनों को सुरक्षित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक लंबाई में ट्यूबिंग के दो और टुकड़े काटें जो सिरिंज युक्तियों से माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस तक पहुंच जाएंगे। प्रत्येक ट्यूब के एक छोर पर, 45 ° कोण काटें। दोनों सिरिंज युक्तियों पर टयूबिंग (कुंद छोर) को सावधानीपूर्वक सुरक्षित करें।
    5. 1 एमएल सिरिंज के लिए पंप पर सेटिंग्स बदलें और अनुमानित अग्रदूत मात्रा शामिल करें। धीरे-धीरे पंप को आगे बढ़ाएं जब तक कि ट्यूबिंग के सिरों पर तेल और अग्रदूत दोनों को धक्का देने के लिए सिरिंज प्लंजर्स पर पर्याप्त दबाव लागू न हो, सिस्टम से किसी भी हवा को हटा दिया जाए। चरण 2.4.6 पर जाने से पहले दबाव को 5-10 मिनट बराबर होने दें।
    6. धीरे से माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के इनलेट चैनलों में ट्यूबिंग के कोण वाले छोर को फ्रंट इनलेट में माइक्रोजेल अग्रदूत समाधान और पीछे के इनलेट में पिंचिंग ऑयल के साथ डालें। पंप को छोटी वृद्धि में आगे बढ़ाएं जब तक कि डिवाइस में प्रवाह शुरू न हो जाए और प्रवाह-केंद्रित क्षेत्र में गोलाकार माइक्रोगेल बनने लगें। पंप को 0.4 μL / min फ्लोरेट के साथ शुरू करें और डिवाइस को स्थिर होने तक चलने दें। यदि आवश्यक हो, तो माइक्रोगेल उत्पादन को स्थिर करने के लिए छोटी वृद्धि में प्रवाह दर ±0.1 μL / min समायोजित करें।
    7. एक बार जब माइक्रोगेल उत्पादन स्थिर हो जाता है जैसा कि चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, तो संग्रह ट्यूब को एक नई ट्यूब के साथ बदलें, और यूवी प्रकाश चालू करें। यह सुनिश्चित करने के लिए समय-समय पर रन की जांच करें कि रन की अवधि में माइक्रोजेल उत्पादन स्थिर है।

Figure 1
चित्र 1: नॉरबोर्निन (एनबी) कार्यात्मक हैंडल के साथ हाइलूरोनिक एसिड (एचए) माइक्रोगेल का माइक्रोफ्लुइडिक उत्पादन। (ए) लगभग 31% एचए रिपीट इकाइयों को एनबी के साथ सफलतापूर्वक संशोधित किया गया था, जैसा कि ड्यूटेरियम ऑक्साइड में किए गए प्रोटॉन एनएमआर विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था। 1 कार्यात्मकता निर्धारित करने के लिए पेंडेंट नॉरबोर्निन के एच एनएमआर शिफ्ट की तुलना एचए मिथाइल समूह 2.05 पीपीएम से की गई थी। एल्सेवियर की अनुमति के साथ एंडरसन एट अल .12 से पुनर्मुद्रित। (बी) एचए-एनबी एबल्स उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रवाह-केंद्रित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का योजनाबद्ध। (सी) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी से अधिकतम तीव्रता अनुमानों का उपयोग फ्लोरोसेंटली लेबल वाले इगल्स (स्केल बार = 500 μm) की कल्पना करने के लिए किया गया था। (डी) माइक्रोफ्लुइडिक सेटअप पर स्वतंत्र रन से माइक्रोजेल व्यास की आवृत्ति वितरण उपयोग किए गए डिवाइस के आधार पर माइक्रोजेल आकार ~ 50 μm या ~ 100 μm पर नियंत्रण प्रदर्शित करता है। (ई) माइक्रोगेल व्यास को प्रत्येक स्वतंत्र रन के लिए औसत और मानक विचलन के रूप में रिपोर्ट किया गया है। विली की अनुमति के साथ विल्सन एट अल.9 से पुनर्मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. माइक्रोगेल को शुद्ध करना और सुखाना

  1. माइक्रोजेल का शुद्धिकरण
    1. माइक्रोजेल वाशिंग बफर (300 एमएम एचईपीईएस, 50 एमएम एनएसीएल, 50 एमएम सीएसीएल2) के साथ-साथ 2% (डब्ल्यू / वी) ब्लूरोनिक एफ -127 सर्फेक्टेंट समाधान को वॉशिंग बफर में तैयार करें। 0.2 μm वैक्यूम-संचालित फ़िल्टर का उपयोग करके समाधान को निष्फल करें।
    2. 5 मिनट के लिए माइक्रोजेल संग्रह ट्यूब (5,000 x g) को सेंट्रीफ्यूज करें। एक बाँझ हुड में, सुपरनैटेंट तेल चरण को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें। 2% प्लूरोनिक एफ -127 सर्फेक्टेंट समाधान और भंवर के साथ 1: 1 को अच्छी तरह से मिलाएं। सेंट्रीफ्यूज (5,000 x g) 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरने वाले धोने के घोल को एस्पिरेट करें।
    3. अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए 4x माइक्रोजेल वॉल्यूम और भंवर पर वॉशिंग बफर जोड़ें। सेंट्रीफ्यूज (5,000 x g) मिश्रण को 5 मिनट के लिए और धोने के घोल को एस्पिरेट करें। वॉशिंग बफर के साथ 4-8 वॉश पूरा करें जब तक कि सर्फेक्टेंट को सिस्टम से हटा नहीं दिया जाता है (यानी, कोई बुलबुले नहीं रहते हैं)।
  2. एचए-एनबी माइक्रोगेल की फ्लोरोसेंट लेबलिंग
    नोट: फ्लोरोसेंटली लेबल टेट्राज़िन का इन-हाउस संश्लेषण श्रृंखला में दो बेस-उत्प्रेरित थिओल-माइकल अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं पर निर्भर करता है जिन्हें अच्छी तरह से वर्णित किया गया है और पहले रिपोर्ट किया गयाथा। इस काम के लिए, एलेक्सा फ्लोर -488 को नॉरबोर्न-संशोधित एबल्स के लेबलिंग के लिए टेट्राज़िन के साथ संयुग्मित किया गया था। लियोफिलाइज्ड उत्पाद (एलेक्सा फ्लोर 488-टेट) को 1 मिलीग्राम / एमएल पर डाइमिथाइलफॉर्मामाइड में भंग कर दिया गया था और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।
    1. 3गेल्स को फ्लोरोसेंटली लेबल करने के लिए, पहले बाँझ 1x PBS में 1 mg/mL स्टॉक 1:14 को पतला करके एलेक्सा फ्लूर 488-टेट का एक कामकाजी समाधान तैयार करें। बाँझ हुड में, काम करने वाले समाधान (मात्रा द्वारा 2: 1) के साथ इगल्स को मिलाएं।
    2. विस्थापन पिपेट का उपयोग करें और अच्छी तरह मिलाएं। मिश्रण को कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. सेंट्रीफ्यूज (5,000 x g) और धुंधला घोल को एस्पिरेट करें। एलेक्सा फ्लूर 488-टेट को हटाने के लिए 1x PBS (मात्रा के अनुसार 1: 1) के साथ μgels को दो बार धोएं।
      नोट: इस बिंदु पर, फ्लोरोसेंटली लेबल वाले इगेल्स को माइक्रोजेल आकार (चित्रा 1 सी-ई)9 को मापने के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर चित्रित किया जा सकता है। माइक्रोजेल आकार को मापने के तरीकों को रूसा एट अल .17 द्वारा अच्छी तरह से वर्णित किया गया है।
  3. एचए-एनबी माइक्रोगेल को सुखाना
    1. एक सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके एक क्रायो-सुरक्षित स्क्रू-कैप ट्यूब में शुद्ध एबल्स (चित्रा 2 ए) स्थानांतरित करें। शुद्ध 50% (v/v) में 70% इथेनॉल जोड़ें और विस्थापन पिपेट के साथ अच्छी तरह मिलाएं। 5,000 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
      सावधानी: इथेनॉल एक अत्यधिक ज्वलनशील पदार्थ है।
      नोट: क्रायो-सुरक्षित स्क्रू-कैप ट्यूब को एंगेल्स जोड़ने से पहले तौला जा सकता है, और फिर एबल्स के द्रव्यमान को निर्धारित करने के लिए लियोफिलाइजेशन के बाद फिर से वजन किया जा सकता है। 1 मिलीग्राम से कम मात्रा का उपयोग करते समय त्रुटि को कम करने के लिए इसकी सिफारिश की जाती है। सुनिश्चित करें कि उपयोग से पहले पैमाने को आंतरिक रूप से समायोजित या कैलिब्रेट किया गया है।
    2. सतह पर तैरने वाले तरल को एस्पिरेट करें और 70% इथेनॉल (50% वी / वी) के साथ प्रतिस्थापित करें (चित्रा 2 बी)। विस्थापन पिपेट के साथ अच्छी तरह मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: माइक्रोगेल को लंबे समय तक भंडारण के लिए लियोफिलाइजेशन से पहले 70% इथेनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो। लियोफिलाइज्ड माइक्रोगेल को चित्रा 2 सी में दिखाया गया है। यदि क्रायोगेल गठन वांछित है तो इस चरण में अन्य लियोफिलाइजेशन मीडिया का उपयोग किया जा सकता है (चित्रा 2 डी)।
    3. संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज यह सुनिश्चित करने के लिए कि इगल्स स्क्रू-कैप ट्यूब के निचले भाग में हैं। क्रायोजेनिक कंटेनर में तरल नाइट्रोजन जोड़ें, और फिर फ्लैश-फ्रीज में इगेल्स की ट्यूब जोड़ें।
    4. 5-10 मिनट के बाद, बल के साथ इगल्स की ट्यूब को हटा दें। जल्दी से टोपी को हटा दें और लैब-ग्रेड ऊतक के साथ कवर करें। एक रबर बैंड के साथ ऊतक को सुरक्षित करें और एक लियोफिलाइजेशन कंटेनर या कक्ष में स्थानांतरित करें।
    5. निर्माता के निर्देशों के बाद लियोफिलाइज़र पर नमूना लोड करें। 0.066 टॉर और -63 डिग्री सेल्सियस पर लियोफिलाइज करें। कमरे के तापमान पर लियोफिलाइज्ड एबल्स (लियो-एबगेल्स) को कसकर सील करें।
      नोट: लियोफिलाइजेशन पूरा हो जाता है जब ट्यूब से सभी तरल हटा दिए जाते हैं और एक सूखा उत्पाद रहता है। कार्बनिक सॉल्वैंट्स आम लियोफिलाइजेशन सिस्टम पर रबर फिक्स्चर की दीर्घायु को कम कर सकते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: एचए-एनबी माइक्रोगेल को सुखाना। (ए) जलीय घोल में 3गेल का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (स्केल बार = 100 μm)। (बी) शुद्ध इगल्स को पसंद के लियोफिलाइजेशन माध्यम में मात्रा द्वारा 1: 1 से इनक्यूबेट किया जा सकता है और लियोफिलाइज्ड किया जा सकता है। (सी) सूखे लियो-इगेल्स का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (स्केल बार = 100 μm)। (डी) लियोफिलाइजेशन के बाद माइक्रोगेल को फिर से निलंबित किया जाता है। लियोफिलाइजेशन प्रक्रिया के दौरान इगल्स के मूल गुणों को बनाए रखने के लिए ईटीओएच (70%) की सिफारिश की जाती है; हालांकि, आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए), पानी और एसीटोनिट्राइल (एमसीएन) जैसे अन्य मीडिया का उपयोग क्रायोगेल गठन (स्केल बार = 100 या 50 μm) को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जा सकता है। (ई) 70% ईटीओएच में लियोफिलाइजेशन (हरे) से पहले (ग्रे) और बाद में एचए-एनबी माइक्रोगेल व्यास का माप तीन माइक्रोगेल आबादी के लिए आवृत्ति वितरण के रूप में दिखाया गया है। एल्सेवियर की अनुमति के साथ एंडरसन एट अल .12 से पुनर्मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. एमएपी मचान निर्माण

  1. टेट्राज़िन लिंकर संश्लेषण
    नोट: टेट्राज़िन लिंकर का उपयोग मुक्त नॉरबोर्न समूहों वाले इगल्स को इंटरलिंक करने के लिए किया जा सकता है (चित्रा 3 ए)। एचए-टेट्राज़िन (एचए-टेट) संश्लेषण प्रक्रिया को झांग एट अल.18 से एचए-रिपीट इकाइयों के 1: 1: 0.25 के दाढ़ समकक्षों के साथ 79 केडीए सोडियम एचए का उपयोग करके डीएमटीएमएम से टेट्राज़िन-अमाइन (चित्रा 3 बी)12 तक अनुकूलित किया गया था।
    1. अभिकारकों का वजन करें। एचए को 200 एमएम एमईएस बफर (पीएच ~ 6) में 20 मिलीग्राम / एमएल पर एक स्टिर प्लेट पर बीकर या फ्लास्क में हिलाकर भंग करें। एक बार घुलने के बाद, डीएमटीएमएम को एचए समाधान में जोड़ें और कमरे के तापमान पर लगभग 20 मिनट तक प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें। उदाहरण के लिए, 100 मिलीग्राम एचए + 72.8 मिलीग्राम डीएमटीएमएम + 14.14 मिलीग्राम टेट्राज़िन-अमाइन का उपयोग किया जा सकता है।
    2. टेट्राज़िन-अमाइन को 200 एमएम एमईएस बफर में 15 मिलीग्राम / एमएल पर घोलें और एचए / डीएमटीएमएम समाधान में ड्रॉपवाइज जोड़ें। HA-Tet प्रतिक्रिया सेटअप के लिए चित्रा 3C देखें।
    3. वाष्पीकरण को कम करने और प्रतिक्रिया पोत को पन्नी से कवर करने के लिए प्रतिक्रिया पोत के उद्घाटन में पैराफिल्म जोड़ें। प्रतिक्रिया को लगभग 24 घंटे तक आगे बढ़ने की अनुमति देते हुए हिलाना जारी रखें।
    4. 24 घंटे के बाद, 200 प्रूफ इथेनॉल (प्रतिक्रिया की मात्रा लगभग 10 गुना) को ठंडा करें। एक हलचल प्लेट पर, एचए-टेट (चित्रा 3 डी) को अवक्षेपित करने के लिए ठंडा इथेनॉल में प्रतिक्रिया को ड्रॉपवाइज स्थानांतरित करें और 20 मिनट तक हिलाना जारी रखें।
    5. समाधान को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और फिर 10 मिनट के लिए 5,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। अपशिष्ट के रूप में निपटाने के लिए अतिरिक्त इथेनॉल डालें। एचए-टेट पर वैक्यूम को रात भर सूखने के लिए एक डेसीकेटर में खींचें। प्रोटोकॉल में इस चरण में सूखे उत्पाद का एक उदाहरण चित्रा 3 ई में पाया जा सकता है।
    6. डायलिसिस का उपयोग करके एचए-टेट को शुद्ध करें। एचए-टेट को 2 एम एनएसीएल समाधान में भंग करें और 12-14 केडीए आणविक भार कट-ऑफ के साथ सेल्यूलोज डायलिसिस ट्यूबिंग में स्थानांतरित करें। भरे हुए डायलिसिस ट्यूबिंग को 5 एल अल्ट्राप्योर पानी के साथ एक बाल्टी में स्थानांतरित करें, और रात भर पानी के खिलाफ एचए-टेट को डायलाइज करें।
    7. अगले दिन, पानी निकालें और 30 मिनट के लिए 1 M NaCl घोल से बदलें। NaCl समाधान निकालें, और फिर 3 दिनों के लिए अल्ट्राप्योर पानी के खिलाफ डायलाइज करें, प्रतिदिन पानी को बदलें।
    8. 0.2 μm वैक्यूम-संचालित फ़िल्टर का उपयोग करके डायलाइज़ किए गए उत्पाद को फ़िल्टर करें, और फिर फ़िल्टर किए गए HA-टेट उत्पाद को 50 mL शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    9. शंक्वाकार ट्यूबों को तरल नाइट्रोजन में 10 मिनट के लिए फ्लैश-फ्रीज करें, और फिर शंक्वाकार ट्यूबों को बल के साथ हटा दें। जल्दी से टोपी को हटा दें और लैब-ग्रेड ऊतक के साथ कवर करें। एक रबर बैंड के साथ ऊतक को सुरक्षित करें और एक लियोफिलाइजेशन कंटेनर या कक्ष में स्थानांतरित करें और लियोफिलाइज़ करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर लियोफिलाइज्ड उत्पाद (चित्रा 3 एफ) स्टोर करें।
    10. डी2ओ में 10 मिलीग्राम / एमएल पर एचए-टेट को भंग करके टेट्राज़िन संशोधन की मात्रा निर्धारित करें और प्रोटॉन एनएमआर (चित्रा 3 जी) 16 के माध्यम से विश्लेषण करें।
      1. कार्यात्मकता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, पहले डी2ओ विलायक शिखर को 4.8 पीपीएम तक कैलिब्रेट करें। एचए मिथाइल प्रोटॉन (2.05) के लिए शिखर को एकीकृत करें और एकीकरण को 3.0 तक कैलिब्रेट करें। इसके बाद, पेंडेंट टेट्राज़िन समूहों के लिए चोटियों को 8.5 (2एच) और 7.7 (2एच) (सुगंधित प्रोटॉन) पर एकीकृत करें। संशोधन12 की औसत डिग्री निर्धारित करने के लिए प्रोटॉन की इसी संख्या के लिए इन चोटियों के एकीकरण को सामान्य करें।
  2. लक्षण वर्णन के लिए एमएपी मचानों का निर्माण करने के लिए लियो-μgels को आपस में जोड़ना
    1. एमएपी पाड़ घटकों को तैयार करें (यानी, एबल्स, एचए-टेट, पुनर्जलीकरण मात्रा)। लियो-गेल्स (चित्रा 4 ए) का वजन करें और 1x PBS के अंतिम MAP वॉल्यूम के 84% में पुनर्गठन करें। माइक्रोगेल को लगभग 20 मिनट तक सूजन करने दें (चित्रा 4 बी, सी)। पुनर्जलीकरण के लिए उपयोग किए जाने वाले डब्ल्यूटी% एमएपी को अंतिम कण अंश के लिए उपयोगकर्ता की प्राथमिकता के आधार पर चुना जा सकता है ( चित्रा 4 डी, ई देखें)।
    2. चुनी हुई एकाग्रता पर 1x PBS में HA-Tet को भंग करें (नीचे नोट देखें)।
      नोट: पैकिंग अंश (डब्ल्यूटी% एमएपी के माध्यम से ) के साथ-साथ एचए-टेट की एकाग्रता दोनों को बदलने से थोक पाड़ यांत्रिक गुण बदल जाएंगे। उदाहरण के लिए, 0.02 मिलीग्राम/एमएल एचए-टेट (2.6 मोल टेट: मोल एचए-एनबी का एनीलिंग अनुपात) के साथ क्रॉसलिंक किया गया 3.4 डब्ल्यूटी% एमएपी पाड़ लगभग 700 पीए कतरनी भंडारण मापांक12 के साथ एमएपी मचान उत्पन्न करता है।
    3. HA-Tet और lyo-μgels को संयोजित करने के लिए विस्थापन पिपेट का उपयोग करें और अच्छी तरह से मिलाएं। इस बिंदु पर, मिश्रण को विस्थापन पिपेट के माध्यम से ग्लास स्लाइड, वेल प्लेटों या उपयोगकर्ता के चयन के कंटेनर पर स्थानांतरित किया जा सकता है। 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेप्ट्यूला का उपयोग करें, और फिर एमएपी मचानों को 1x पीबीएस से भरी अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित करने के लिए स्पैटुला का उपयोग करें। एमएपी मचानों को लक्षण वर्णन के लिए तैयार होने तक 1x PBS में रखें।
  3. एमएपी पाड़ कण अंश की गणना
    1. बेहतर छवि गुणवत्ता के लिए, एक स्पैटुला का उपयोग करके एक ग्लास कवरस्लिप में एमएपी मचान स्थानांतरित करें। एफआईटीसी उत्तेजना और उत्सर्जन के लिए लेजर का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर एमएपी मचानों की छवि। छवि एमएपी स्काफोल्ड्स 20x उद्देश्य पर हैं और 2.5 μm के चरण आकार के साथ Z-दिशा में 250-300 μm को पार करने वाला Z-स्टैक प्राप्त करते हैं। छवि के μm /पिक्सेल अंशांकन पर ध्यान दें।
    2. विश्लेषण सॉफ्टवेयर में जेड-स्टैक छवि आयात करें ( सामग्री की तालिका देखें)। नई सतह जोड़ें बटन का चयन करें. बॉक्स को केवल रुचि का क्षेत्र सेगमेंट करने के लिए चेक करें, और उसके बाद नीले तीर बटन का चयन करें अगला: रुचि का क्षेत्र।
    3. विश्लेषण किए जा रहे वॉल्यूम के एक्स-, वाई-और जेड-आयामों का ट्रैक रखते हुए रुचि के क्षेत्र को परिभाषित करें। नीले तीर बटन का चयन करें अगला: स्रोत चैनल।
      नोट: एक्स- और वाई-आयाम पिक्सेल की इकाइयों में हैं जबकि जेड-आयाम चरणों की संख्या है। रुचि के क्षेत्र के लिए अनुशंसित जेड-ऊंचाई में कम से कम दो सेप्टेल शामिल होने चाहिए।
    4. FITC चैनल का चयन करने के लिए स्रोत चैनल ड्रॉप-डाउन सूची का उपयोग करें। चिकनी के बगल में बॉक्स की जांच करें और 2.50 μm का सतह विवरण इनपुट करें। थ्रेसहोल्डिंग के अंतर्गत, निरपेक्ष तीव्रता का चयन करें, और तब नीले तीर बटन अगला : दहलीज का चयन करें।
    5. FITC चैनल के लिए सुझाए गए थ्रेशोल्डिंग मान का उपयोग करें। रेंडरिंग गुणवत्ता का आकलन करने और आवश्यकतानुसार समायोजित करने के लिए 3 डी प्रक्षेपण को घुमाएं। अगला चयन करें : सतहों को वर्गीकृत करें।
      नोट: बैक बटन का उपयोग प्रक्रिया में पिछले चरणों को संपादित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि जेड-आयाम, आवश्यकतानुसार।
    6. जाँचें कि Voxels की संख्या 10.0 है या नहीं, और फिर हरे डबल तीर बटन फिनिश का चयन करें : सभी निर्माण चरणों को निष्पादित करें और विज़ार्ड को समाप्त करें।
      नोट: वॉल्यूम रेंडरिंग पैरामीटर को बैच विश्लेषण के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ताकि सभी मचानों का विश्लेषण करने के लिए समान सेटिंग्स लागू हों।
    7. डेटा निर्यात करने के लिए, सांख्यिकी टैब का चयन करें, और उसके बाद विस्तृत टैब. चर वॉल्यूम का चयन करने के लिए दूसरे ड्रॉप-डाउन बॉक्स का उपयोग करें। फ़्लॉपी डिस्क बटन का चयन करें टैब प्रदर्शन पर आंकड़े फ़ाइल में निर्यात करें और संकेत दिए जाने पर स्प्रेडशीट फ़ाइल (.xls) के रूप में सहेजें.
    8. फ़ाइल खोलें और रुचि के क्षेत्र में μgels के कुल आयतन (μm3) को निर्धारित करने के लिए कॉलम A वॉल्यूम पर SUM फ़ंक्शन का उपयोग करें।
    9. रुचि के क्षेत्र के आयामों को परिवर्तित करें जिसका विश्लेषण पिक्सेल से μm तक किया गया था। X- और Y-आयामों को परिवर्तित करने के लिए चरण 4.3.1 से छवि के μm/पिक्सेल अंशांकन का उपयोग करें। Z-आयाम (चरणों की संख्या) को छवि के चरण आकार से गुणा करें ताकि Z-आयाम को μm में परिवर्तित किया जा सके। X-, Y-, और Z-आयामों को गुणा करके ब्याज के क्षेत्र (μm3) की मात्रा की गणना करें।
    10. मचान के कण अंश को निर्धारित करने के लिए, ब्याज के क्षेत्र (चरण 4.3.8 में पाया गया) में इगेल्स की कुल मात्रा को ब्याज के क्षेत्र (चरण 4.3.9 में पाया गया) की मात्रा से विभाजित करें।

Figure 3
चित्रा 3: माइक्रोपोरस एनाल्ड कण (एमएपी) मचानों के निर्माण के लिए टेट्राज़िन लिंकर का संश्लेषण। (ए) एमएपी मचानों को बनाने के लिए टेट्राज़िन लिंकर के साथ एचए-एनबी इगल्स को जोड़ने की योजनाबद्ध। (बी) एचए-टेट संश्लेषण के लिए प्रतिक्रिया योजना। (ग) एचए-टेट प्रतिक्रिया स्थापित की गई थी और इथेनॉल में एचए-टेट की वर्षा के बाद रात भर प्रतिक्रिया करने की अनुमति दी गई थी। (E) एक बार शुद्ध और सूखने के बाद, HA-Tet को पुन: हाइड्रेट किया गया और लियोफिलाइज़ किया गया ताकि (F) एक सूखे, हल्के गुलाबी उत्पाद का उत्पादन किया जा सके। (जी) प्रोटॉन एनएमआर विश्लेषण एचए रिपीट इकाइयों के 11% के सफल संशोधन को दर्शाता है। एल्सेवियर की अनुमति के साथ एंडरसन एट अल .12 से पुनर्मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एमएपी पाड़ निर्माण के लिए लियोफिलाइज्ड माइक्रोगेल का पुनर्जलीकरण। (ए) सूखे लियो-गेल्स का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (स्केल बार = 100 μm)। (बी) फ्रीज-सुखाने के बाद, लियो-इगेल्स के पुनर्जलीकरण को लगभग 20 मिनट (स्केल बार = 100 μm) लगता है। (सी) लियो-इगेल्स को अलग-अलग डब्ल्यूटी% एमएपी पर फिर से हाइड्रेट किया जा सकता है ताकि जाम किए गए सिडगेल (स्केल बार = 100 μm) का उत्पादन किया जा सके। (घ) लियो-इगेल्स को पुनर्जलीकृत करते समय डब्ल्यूटी% एमएपी को बढ़ाने से एमएपी मचानों में कण अंश बदल जाता है, जैसा कि एमएपी मचानों और आयतन अनुमानों के एकल जेड-स्लाइस (स्केल बार = 100 μm) द्वारा दिखाया गया है। (ई) इन उपयोगकर्ता-परिभाषित डब्ल्यूटी% एमएपी मचानों का उपयोग करके, अद्वितीय कण अंशों को प्राप्त किया जा सकता है (एनएल = गैर-लियोफिलाइज्ड एबल्स)। टुकी एचएसडी के साथ एक तरफ़ा एनोवा नमूनों (एन = 3) पर किया गया था, जिसका महत्व पी < 0.05 (*), पी < 0.01 (**), पी < 0.005 (**)) और पी < 0.001 (**** था)। एल्सेवियर की अनुमति के साथ एंडरसन एट अल .12 से पुनर्मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5.3D मानचित्र मचानों में सेल संस्कृति

  1. सेल संस्कृति उपकरण तैयार करें
    1. इन प्रयोगों (चित्रा 5A-C) के लिए कस्टम सेल संस्कृति डिवाइस बनाने के लिए, पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 में पाई गई CAD फ़ाइल का उपयोग करके एक नकारात्मक मोल्ड मुद्रित करने के लिए 3D प्रिंटर का उपयोग करें।
      नोट: सेल कल्चर डिवाइस के आयाम निम्नानुसार हैं: 94.9 मिमी x 94.9 मिमी x 4.8 मिमी 2.6 मिमी कुल अच्छी ऊंचाई के साथ। आंतरिक कुओं और बाहरी कुओं का व्यास क्रमशः 4 मिमी और 6 मिमी है।
    2. द्रव्यमान द्वारा 10: 1 अनुपात पर इलाज एजेंट के साथ पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) इलास्टोमेर बेस मिलाएं। पीडीएमएस मिश्रण को एक बड़े प्लास्टिक पेट्री डिश में डालें और लगभग 30 मिनट के लिए एक डेसिकेटर में डेगैस करें या जब तक कि सभी बुलबुले गायब न हो जाएं।
    3. एक बार जब सभी बुलबुले गायब हो जाते हैं, तो नए बुलबुले के गठन को कम करने के लिए पीडीएमएस में 3 डी मुद्रित मोल्ड को सावधानीपूर्वक रखें। पीडीएमएस को ठीक करने के लिए कम से कम 2 घंटे के लिए ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. संस्कृति डिवाइस के पैरामीटर के चारों ओर धीरे से पता लगाने के लिए चाकू या रेजर ब्लेड का उपयोग करें, और फिर मोल्ड को सावधानीपूर्वक हटा दें। कुओं के नीचे से किसी भी पीडीएमएस को हटाने के लिए 4 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करें। ग्लास कवरस्लिप पर फिट होने के लिए उपकरणों को काटें।
      नोट: सेल कल्चर उपकरणों को ग्लास स्लाइड से भी जोड़ा जा सकता है, लेकिन ग्लास कवरलिप नमूना इमेजिंग में सुधार करते हैं।
    5. संस्कृति उपकरणों के नीचे की ओर से धूल को हटाने के लिए टेप का उपयोग करें। नमी को हटाने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए 135 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर साफ ग्लास कवरलिप्स और कल्चर डिवाइस (नीचे की तरफ ऊपर) रखें।
    6. फ्यूम हुड में, ग्लास कवरस्लिप और डिवाइस के निचले हिस्से दोनों पर 30 सेकंड के लिए एक कोरोना प्लाज्मा गन का उपयोग करें, और फिर जल्दी से इलाज की गई सतहों को एक साथ बांध दें। संस्कृति डिवाइस और ग्लास कवरस्लिप के बीच एक अच्छी सील सुनिश्चित करने के लिए धीरे से दबाव लागू करें।
    7. सभी उपकरणों के लिए चरण 5.1.6 दोहराएं, और फिर बंधन को सुरक्षित करने के लिए रात भर 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें। विट्रो में उपयोग करने से पहले उपकरणों को निष्फल करने के लिए ऑटोक्लेव करें।
  2. एमएपी मचानों में सेल संस्कृति
    1. वांछित कण अंश के आधार पर एमएपी पाड़ घटकों (यानी, एबल्स, एचए-टेट, मीडिया वॉल्यूम) तैयार करें (चित्रा 4 डी-ई देखें)। एक बाँझ हुड में लियो-इगल्स का वजन करें और चुने हुए डब्ल्यूटी% एमएपी के आधार पर सेल मीडिया के अंतिम एमएपी वॉल्यूम के 84% में पुनर्गठन करें। लगभग 20 मिनट के लिए इगल्स को फूलने दें।
      नोट: इन विधियों के लिए उपयोगकर्ता को पुनर्जलीकरण के लिए लियो-माइक्रोजेल उत्पाद का वजन करने की आवश्यकता होती है। छोटे द्रव्यमान (1 मिलीग्राम या उससे कम) के लिए, पहले सेप्टेल्स को जोड़ने और लियोफिलाइज़ करने से पहले क्रायोट्यूब का वजन करने का सुझाव दिया जाता है, और फिर त्रुटि को कम करने के लिए उत्पाद के द्रव्यमान को निर्धारित करने के लिए लियोफिलाइजेशन के बाद ट्यूब को फिर से तैयार करें।
    2. अंतिम एमएपी वॉल्यूम के 16% में सेल मीडिया में एचए-टेट को भंग करें।
      नोट: एमएपी मचानों में बीज बोने के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए निम्नलिखित चरणों को उपयोग किए जा रहे सेल प्रकार के आधार पर बदला जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, डी 1 माउस मेसेनकाइमल कोशिकाओं को डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) में 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन-स्ट्रेप) और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। इन कोशिकाओं के लिए मानक अनुयायी सेल कल्चर प्रोटोकॉल का पालन किया जाना चाहिए, जिसमें ऊतक संस्कृति-उपचारित संस्कृति वाहिकाओं में संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर बनाए रखा जाना चाहिए।
    3. एक बार जब डी 1 माउस मेसेनकाइमल कोशिकाएं 70% -80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाती हैं, तो मीडिया को उत्तेजित करें और कोशिकाओं को 1x PBS के साथ धोएं। ऊतक संवर्धन पोत की सतह को कवर करने के लिए 1% ट्रिप्सिन-ईडीटीए की पर्याप्त मात्रा जोड़कर कोशिकाओं को उठाएं। 1-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और फिर ट्रिप्सिन-ईडीटीए की मात्रा में 2 गुना पर 1% पेन-स्ट्रेप और 10% एफबीएस के साथ पूरक डीएमईएम मीडिया जोड़कर ट्रिप्सिनाइजेशन को बुझाएं।
    4. कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 100 x g पर सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट मीडिया को एस्पिरेट करें और 1% पेन-स्ट्रेप और 10% एफबीएस के साथ पूरक 1 एमएल डीएमईएम मीडिया में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    5. सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन अच्छी तरह से मिश्रित है, और फिर एक नई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 20 μL स्थानांतरित करें। २० १ एल ट्राइपैन ब्लू घोल डालें और अच्छी तरह मिलाएँ। हेमोसाइटोमीटर या सेल गिनती कक्ष स्लाइड के साथ एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करने के लिए इस मिश्रण के 20 μL का उपयोग करें।
    6. 10,000 कोशिकाओं /μL MAP को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सीडिंग के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को छर्रों से छर्रों के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 100 x g पर सेंट्रीफ्यूज। कोशिकाओं को उत्तेजित किए बिना सेल पेलेट से सुपरनैटेंट मीडिया को सावधानीपूर्वक एस्पिरेट करें।
    7. विस्थापन पिपेट के साथ सेल पेलेट में इगल्स और क्रॉसलिंकर जोड़ें। विस्थापन पिपेट के साथ अच्छी तरह मिलाएं, और फिर प्रति अच्छी तरह से मिश्रण के 10 μL बीज लें। चढ़ाते समय, मिश्रण को कुएं में समान रूप से वितरित करने के लिए एक गोलाकार गति में पिपेट करें।
    8. कुओं को भरने के लिए सेल मीडिया जोड़ने से पहले 25 मिनट के लिए सेल इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस पर नष्ट करने की अनुमति दें (~ 50 μL प्रति कुएं मीडिया)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 डी संस्कृतियों को बनाए रखें और आवश्यकतानुसार मीडिया बदलें। मीडिया बदलते समय मचान को उत्तेजित करने से बचने के लिए, ऊपरी कुएं के रिज के साथ पिपेट टिप को स्थिर करें।
      नोट: कल्चर कुओं से तरल जोड़ते या हटाते समय, कुएं से मचान को बाधित करने या स्पिरेट करने की संभावना को कम करने के लिए एमएपी मचान के ऊपर किनारे पर पिपेट टिप के अंत को आराम दें।
    9. वांछित समय बिंदुओं पर, मीडिया को हटाकर नमूने को ठीक करें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रति कुएं 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 50 μL जोड़ें। नमूने को 1x PBS या पसंदीदा बफर के 50 μL के साथ 3x धोएं। प्रोटोकॉल में इस बिंदु पर, इम्यूनोफ्लोरेसेंस या फ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए मानक तरीकों का पालन किया जा सकता है, प्रति 50 μL प्रति अच्छी तरह से काम की मात्रा का उपयोग करके।
      नोट: निर्धारण और सेल धुंधला करने के लिए ये विधियां विशेष रूप से फ्लोरोसेंट दाग के उपयोग का वर्णन करती हैं; हालांकि, प्राथमिक और / या द्वितीयक एंटीबॉडी संयुग्मन के साथ इम्यूनोस्टेनिंग इन मचानों में किया जा सकता है और साथ ही निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए 50 μL को प्रति अच्छी तरह से काम करने की मात्रा के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
    10. एमएपी स्काफोल्ड्स में छवि कोशिकाएं 20x उद्देश्य का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर होती हैं और 2.5 μm के चरण आकार के साथ Z-दिशा में 200-250 μm को पार करने वाला Z-स्टैक प्राप्त करती हैं। DAPI के साथ फ्लोरेसेंस धुंधलापन का एक उदाहरण (1x PBS में 0.15% Triton-X में 1:1000 पतला परमाणु दाग) और फेलोइडिन -647 (1x PBS में 0.15% Triton-X में 1:40 पतला F-एक्टिन दाग) चित्र 5E, F में दिखाया गया है, जिसमें 3 दिनों के लिए एमएपी मचानों में सुसंस्कृत निश्चित D1 कोशिकाएं हैं।
      नोट: ग्लास सतहों के प्लाज्मा उपचार के परिणामस्वरूप हाइड्रोफिलिसिटी में वृद्धि होती है, जिसे सेल आसंजन को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है। कोशिकाओं को सेल कल्चर कुओं के तल के साथ फैलते हुए देखा जाएगा, लेकिन एमएपी मचानों में सेल प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए सेल गणना या सेल वॉल्यूम परिमाणीकरण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए।

Figure 5
चित्रा 5: एमएपी मचानों में सेल संस्कृति। (ए) सेल कल्चर कुओं को बनाने के लिए मोल्ड को पीडीएमएस के साथ 3 डी मुद्रित और कास्ट किया जा सकता है। पूरे मोल्ड का व्यास 95 मिमी है, बड़े कुओं का व्यास 6 मिमी है, और छोटे आंतरिक कुएं व्यास में 4 मिमी हैं। (बी) पीडीएमएस के साथ कास्ट होने के बाद, सेल कल्चर डिवाइस बेहतर माइक्रोस्कोपी क्षमताओं के लिए कवरलिप से जुड़े प्लाज्मा होते हैं। (सी) सेल कल्चर के क्रॉस सेक्शन में सेल मीडिया (~ 50 μL) के लिए जलाशय और कोशिकाओं के साथ एमएपी पाड़ को बोने के लिए एक छोटा जलाशय (~ 10 μL) को अच्छी तरह से दर्शाया गया है। (डी) एमएपी मचानों में कोशिकाओं को सीड करने की प्रक्रिया पहले उपयोगकर्ता के वांछित डब्ल्यूटी% पर लियो-एबल्स के पुनर्जलीकरण पर निर्भर करती है, इसके बाद कोशिकाओं और क्रॉसलिंकर के साथ मिश्रण करके 3गेल को आपस में जोड़ती है। (ई) कोशिकाओं को एमएपी मचानों (हरे) में विभिन्न डब्ल्यूटी% एमएपी के साथ समझाया जा सकता है। प्रतिनिधि छवियां एमएपी मचानों में डी 1 सेल संस्कृति के दिन 5 से हैं (स्केल बार = 100 μm)। (च) एकल जेड-स्लाइस विभिन्न डब्ल्यूटी% एमएपी (स्केल बार = 50 μm) वाले मचानों में सेल वृद्धि में अंतर दिखाते हैं। एल्सेवियर की अनुमति के साथ एंडरसन एट अल .12 से पुनर्मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बायो-ऑर्थोगोनल क्रॉसलिंकिंग स्कीम के साथ-साथ 3 डी सेल कल्चर के लिए नियंत्रित कण अंशों के साथ माइक्रोपोरस एनाल्ड पार्टिकल (एमएपी) मचानों की तैयारी का प्रदर्शन करना है। सबसे पहले, एचए को नॉरबोर्नीन पेंडेंट समूहों के साथ संशोधित किया गया था ताकि एमएपी मचानों को बनाने के लिए माइक्रोगेल गठन और इंटरलिंकिंग दोनों में उपयोग किया जा सके। इन विधियों का उपयोग करते हुए, लगभग 31% एचए रिपीट इकाइयों को नॉरबोर्निन कार्यात्मक हैंडल (चित्रा 1 ए) के साथ सफलतापूर्वक संशोधित किया गया था। प्रवाह-केंद्रित क्षेत्र (चित्रा 1 बी) के साथ माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को ~ 50 μm या ~ 100 μm व्यास (चित्रा 1C, D) के HA-NB μgels का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया था। इस काम के बाकी हिस्सों में उपयोग किए जाने वाले 3गेल का औसत व्यास 92 μm (Q1 = 79 μm, Q3 = 103 μm) था (चित्र 1E)।

कण अंश को नियंत्रित करने के लिए, एक उत्पाद का उत्पादन करने के लिए लियोफिलाइजेशन (चित्रा 2 ए-सी) के माध्यम से एबल्स को सुखाया गया था जिसे उपयोगकर्ता द्वारा तौला जा सकता था और सूजे हुए सिसेल्स को प्राप्त करने के लिए पुनर्जलीकृत किया जा सकता था। 70% इथेनॉल का उपयोग करके क्रायोगेल गठन (यानी, आंतरिक दोषों) को रोकने के लिए इगेल्स को लियोफिलाइज़ करने के लिए माध्यम को अनुकूलित किया गया था, लेकिन यह भी प्रदर्शित किया गया है कि क्रायोगेल को लियोफिलाइजेशन के लिए अन्य मीडिया का उपयोग करके प्राप्त किया गया था यदि क्रायोगेल उपयोगकर्ता द्वारा वांछित हैं (चित्रा 2 डी)। माइक्रोजेल क्रायोगेल गठन के लिए विभिन्न लियोफिलाइजेशन मीडिया का एक व्यापक अध्ययन एंडरसन एट अल.12 द्वारा काम में पाया जा सकता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए, एचए-एनबी माइक्रोगेल व्यास को 70% इथेनॉल (चित्रा 2 ई) के साथ लियोफिलाइजेशन से पहले और बाद में निर्धारित किया गया था, जिसने इस सुखाने की प्रक्रिया के साथ माइक्रोगेल आकार में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं दिखाया।

एचए-एनबी एबल्स के बायो-ऑर्थोगोनल इंटरलिंकिंग की सुविधा के लिए, एक रैखिक एचए-टेट क्रॉसलिंकर को संश्लेषित किया गया था (चित्रा 3)। प्रोटॉन एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी ने इस काम में विस्तृत चरणों का उपयोग करके टेट्राज़िन पेंडेंट समूह के साथ एचए रिपीट इकाइयों के 11% का सफल संशोधन दिखाया (चित्रा 3 जी), और प्रतिक्रिया उपज 95% थी। एचए-टेट लिंकर का उपयोग करते हुए, सूखे लियो-माइक्रोजेल उत्पाद (चित्रा 4 ए) को सेल संस्कृति प्रयोगों और सामग्री लक्षण वर्णन के लिए आकार में क्रमशः 10 μL (4 मिमी व्यास) से 50 μL (8 मिमी व्यास) तक के एमएपी मचानों में μgels (चित्रा 4B, C) के विभिन्न wt% (w /v) योगों को प्राप्त करने के लिए निर्दिष्ट मात्रा के साथ पुन: हाइड्रेट किया गया था। एमएपी मचानों में ये उपयोगकर्ता-परिभाषित डब्ल्यूटी% स्कॉल्ड्स में अद्वितीय कण अंशों से मेल खाते हैं (चित्रा 4 डी, ई)।

इस प्रोटोकॉल ने बायो-ऑर्थोगोनल एनीलिंग योजनाओं का उपयोग करके 3 डी कल्चर (चित्रा 5 डी) के लिए एमएपी स्काफोल्ड्स में कोशिकाओं को सीड करने की प्रक्रिया को भी विस्तृत किया। लियो-इगेल्स को सेल मीडिया में वांछित डब्ल्यूटी% पर पुनर्जलीकृत किया गया था, और फिर सेल पेलेट और एचए-टेट के साथ मिलाया गया था ताकि इगल्स को आपस में जोड़ा जा सके। इस मिश्रण को तब सेल कल्चर उपकरणों (चित्रा 5 ए-सी) में चढ़ाया गया था ताकि एमएपी मचानों में इगेल्स के बीच शून्य स्थान में कोशिकाओं को समझाया जा सके। एमएपी मचानों में 3 डी संस्कृति में कोशिकाओं को 5 वें दिन तय किया गया था, दाग दिया गया था, और चित्र 5 ई में दिखाए गए अनुसार एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर चित्रित किया गया था। विभिन्न डब्ल्यूटी% योगों के लिए एमएपी मचानों के शून्य स्थान में कोशिकाओं का एक उदाहरण चित्र 5 एफ में दिखाया गया है।

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: सीएडी फ़ाइल सेल संस्कृति उपकरणों के लिए मोल्ड को 3 डी प्रिंट करने के लिए उपयोग की जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एचए-एनबी माइक्रोगेल के माइक्रोफ्लुइडिक उत्पादन को इमल्शन बैच उत्पादन 3,9 की तुलना में आकार वितरण की संकीर्ण सीमा के साथ माइक्रोगेल उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित माइक्रोगेल को सामग्री क्षरण का समर्थन करने के लिए एक एमएमपी-क्लीवर क्रॉसलिंकर (एसी-जीसीआरडीजीपीक्यूजीआईडब्ल्यूजीक्यूडीआरसीजी-एनएच2) का उपयोग करके तैयार किया गया था। हालांकि, एचए-एनबी माइक्रोगेल को एक वैकल्पिक डी-थिओल लिंकर जैसे कि डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) का उपयोग करके क्रॉसलिंक भी किया जा सकता है, जो गैर-डिग्रेडेबल है। इसी तरह, अन्य फोटो-आरंभकर्ता, जैसे कि इरगाक्योर 2959 2-हाइड्रॉक्सी-4-(2-हाइड्रॉक्सीथोक्सी)-2-मेथिलप्रोपियोफेनोन, का उपयोग एलएपी के बजाय एचए-एनबी अग्रदूत में किया जा सकता है ताकि थिओल-एन क्रॉसलिंकिंग10 की सुविधा मिल सके। ये माइक्रोगेल पिछले काम के आधार पर 3.5 डब्ल्यूटी% एचए से बने थे, जिसने प्रदर्शित किया कि माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म6 पर बूंदों में चुटकी लेने के लिए 3.5 डब्ल्यूटी% अग्रदूत समाधान की चिपचिपाहट अनुकूल थी। दूसरों ने कम डब्ल्यूटी% फॉर्मूलेशन (3 डब्ल्यूटी% एचए-एनबी) के साथ-साथ 8,10,11 का उपयोग करकेप्रवाह-केंद्रित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों पर एचए-एनबी माइक्रोगेल निर्माण का वर्णन किया है। हालांकि यह विधि कम पॉलीस्प्रेसिटी के साथ माइक्रोगेल आबादी के उत्पादन के लिए फायदेमंद है, यह बैच इमल्शन तकनीकों की तुलना में अधिक समय और श्रम-गहन है जिसका उपयोग एचए-एनबी माइक्रोगेल उत्पादन के लिए भी किया जा सकताहै।

माइक्रोजेल लियोफिलाइजेशन प्रक्रिया क्रॉसलिंक्ड बहुलक नेटवर्क को फ्रीज करने पर निर्भर करती है। दोष ठंड के दौरान हो सकते हैं जब लियोफिलाइजेशन माध्यम में क्रिस्टल संरचनाएं बनती हैं और पोरोजेन के रूप में कार्य करती हैं, और परिणामस्वरूप क्रायोगेल मूल सामग्री19,20 की तुलना में बढ़ी हुई छिद्रता और विभिन्न यांत्रिक गुणों का प्रदर्शन करते हैं। आज तक, फ्रीज-सुखाने वाले माइक्रोगेल के लिए वर्णित तरीके हैं जो लियोफिलाइजेशन के लिए विभिन्न माध्यमों का उपयोग करके पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल (पीईजी) 13, गेलमा14 और एचए फॉर्मूलेशन12 के लिए क्रायोगेल गठन को रोकते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, यदि क्रायोगेल वांछित हैं तो उपयोगकर्ता अपने चयन के एक अन्य लियोफिलाइजेशन माध्यम के साथ 70% इथेनॉल को इंटरचेंज कर सकता है। जबकि क्रायोगेल कुछ अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद हो सकते हैं, इस प्रोटोकॉल में 70% इथेनॉल को लियोफिलाइजेशन माध्यम के रूप मेंहाइलाइट किया गया था क्योंकि यह एक आम प्रयोगशाला अभिकर्मक है, यह एमएपी निर्माण की प्रक्रिया में नसबंदी के लाभ को शामिल करता है, और यह एचए माइक्रोगेल को अपने मूल आकार, आकार और कठोरता को बनाए रखने की अनुमति देता है, जबकि एक बार पुनर्जलीकृत होने के बाद आंतरिक दोषों को भी कम करता है। . माइक्रोगेल विशेषताओं के इन आकलनों के अलावा, पर्यावरण स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) को लियोफिलाइजेशन से पहले और बाद में माइक्रोगेल आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए एक संभावित उपकरण के रूप में लागू किया जा सकता है।

एचए-एनबी माइक्रोगेल को सुखाने के लिए इस काम में वर्णित विधियों को कण अंश में परिवर्तनशीलता को दरकिनार करने और उपयोगकर्ता-परिभाषित डब्ल्यूटी% फॉर्मूलेशन के साथ सुसंगत एमएपी मचानों का उत्पादन करने के लिए पेश किया गया था। विभिन्न डब्ल्यूटी% पुनर्जलीकरण पर नियंत्रित कण अंश का अध्ययन गोलाकार माइक्रोगेल के अध्ययन तक सीमित था। अन्य माइक्रोगेल आकृतियों, जैसे छड़ 8,21 या अनियमित आकार10,22, डब्ल्यूटी% एमएपी और कण अंश के बीच संबंधों का आकलन करने के लिए जांच नहीं की गई है। कण अंश का मूल्यांकन एमएपी मचानों में पिछले अध्ययन के आधार पर पुनर्जलीकृत लियो-माइक्रोगेल (84%) और एचए-टेट क्रॉसलिंकर (16%) के सुसंगत अनुपात का उपयोग करके किया गयाहै; हालांकि, इन अंशों को उपयोगकर्ता के विवेक पर बदला जा सकता है जब तक कि एचए-टेट वॉल्यूम वांछित क्रॉसलिंकिंग अनुपात पर एचए-टेट को भंग करने के लिए पर्याप्त है। नॉरबोर्निन-टेट्राज़िन क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया द्वि-कार्यात्मक23, मल्टी-आर्म 3, साथ ही इन विधियों में वर्णित रैखिक12 टेट्राज़िन लिंकर का उपयोग करके एमएपीमचानों को बनाने के लिए माइक्रोगेल को एनीलिंग करने में प्रभावी रही है। यदि वांछित हो, तो टेट: एचए-एनबी के दाढ़ अनुपात को थोक एमएपीमचानों 12 की विभिन्न कठोरताओं को प्राप्त करने के लिए भिन्न किया जा सकता है। पुनर्जलीकृत लियो-माइक्रोगेल के लिए इन तकनीकों का मूल्यांकन अभी तक टेट्राज़िन-नॉरबोर्निन के अलावा अन्य एनीलिंग रसायनज्ञों के लिए नहीं किया गया है।

एमएपी मचानों में 3 डी सेल कल्चर को पहले कई सेल प्रकारों के साथ वर्णित किया गया है, जैसे एंडोथेलियल सेल8, फाइब्रोब्लास्ट 1,3,4,24, तंत्रिका पूर्वज कोशिकाएं9, और मेसेनकाइमल स्टेम सेल25,26। एचए-एनबी माइक्रोगेल को 70% इथेनॉल में लियोफिलाइज्ड करने के बाद प्रोटॉन एनएमआर के माध्यम से अवशिष्ट इथेनॉल देखा गया था; हालांकि, यह भी पुष्टि की गई थी कि इथेनॉल की ट्रेस मात्रा ने सेल व्यवहार्यता12 को प्रभावित नहीं किया था। लियो-माइक्रोगेल वाले एमएपी मचानों में संस्कृति को अब तक केवल माउस मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं12 के साथ प्रदर्शित किया गया है; हालांकि, लियो-माइक्रोगेल के साथ एमएपी मचानों में कोशिकाओं को सीडिंग करने के लिए इस प्रोटोकॉल को अन्य सेल प्रकारों और उनके संबंधित सेल मीडिया के साथ बदल दिया जा सकता है। डी 1 सेल संस्कृति के लिए, एफ-एक्टिन तीव्रता और कुल सेल वॉल्यूम को कम दिखाया गया है क्योंकि डब्ल्यूटी% एमएपी12 बढ़ता है। यह भी दिखाया गया है कि डब्ल्यूटी% एमएपी में वृद्धि थोक पाड़ कठोरता (स्थानीय माइक्रोगेल कठोरता नहीं) में वृद्धि से मेल खाती है क्योंकि माइक्रोगेल के बीच शून्य स्थान छोटा हो जाता है, जिससे उच्च डब्ल्यूटी% एमएपीमचानों में कम सेल प्रसार होता है।

इस काम ने माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म पर एचए-एनबी माइक्रोगेल के उत्पादन के तरीकों का वर्णन किया, जिसके बाद मूल माइक्रोगेल गुणों को बनाए रखने या क्रायोगेल का उत्पादन करने के लिए माइक्रोगेल को फ्रीज-सुखाने का प्रावधान किया गया। इस प्रोटोकॉल ने एक टेट्राज़िन लिंकर के संश्लेषण को रेखांकित किया जिसका उपयोग लियो-माइक्रोगेल को इंटरलिंक करने के लिए किया जाता है, जब उन्हें नियंत्रित कण अंशों के साथ एमएपी मचान बनाने के लिए उपयोगकर्ता-परिभाषित वजन प्रतिशत पर पुनर्जलीकृत किया जाता है। अंत में, इस काम ने उपयोगकर्ता-परिभाषित माइक्रोआर्किटेक्चर के साथ इन एमएपी मचानों के भीतर कोशिकाओं की खेती के लिए चरणों का विवरण दिया। लगातार कण अंशों के साथ दानेदार मचानों का निर्माण एमएपी उपयोगकर्ताओं के लिए प्रयोगात्मक परिणामों की प्रजनन क्षमता में सुधार करता है, जो बड़े पैमाने पर परिवहन और यांत्रिक गुणों के लिए सेल प्रतिक्रियाओं से परे विस्तारित होताहै। इन तकनीकों का उपयोग करके उत्पन्न एमएपी मचानों का उपयोग विवो अनुप्रयोगों में आगे बढ़ने के लिए किया जा सकता है। दानेदार मचान निर्माण के लिए एक लियोफिलाइज्ड उत्पाद का उपयोग सामग्री शेल्फ-लाइफ में सुधार के लिए फायदेमंद है और एमएपी मचानों के नैदानिक सेटिंग में भविष्य के अनुवाद के लिए भी फायदेमंद होगा।

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Disclosures

एआरए और टीएस ने इस तकनीक पर एक अनंतिम पेटेंट दायर किया है।

Acknowledgments

लेखक नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (1आर01एनएस112940, 1आर01एनएस079691, आर01एनएस094599), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी एंड इंफेक्शियस डिजीज (1आर01एआई152568) को धन्यवाद देना चाहते हैं। यह काम ड्यूक यूनिवर्सिटी शेयर्ड मैटेरियल्स इंस्ट्रूमेंटेशन फैसिलिटी (एसएमआईएफ) में किया गया था, जो उत्तरी कैरोलिना रिसर्च ट्रायंगल नैनो टेक्नोलॉजी नेटवर्क (आरटीएनएन) का एक सदस्य है, जिसे राष्ट्रीय नैनो टेक्नोलॉजी समन्वित बुनियादी ढांचे (एनएनसीआई) के हिस्से के रूप में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (पुरस्कार संख्या ईसीसीएस -2025064) द्वारा समर्थित किया गया है। लुकास शिमर के साथ-साथ एथन निकलो को सेल कल्चर प्रयोगों के लिए 3 डी मुद्रित डिवाइस बनाने में उनकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309628
5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimide Invitrogen A10254 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287 For staining cell culture samples
Aluminum foil VWR 89107-726
Biopsy punch with plunger, 1.0 mm Integra Miltex 69031-01
Biopsy punch, 4 mm Integra Miltex 33-34
Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped SAI Infusion Technologies B23-50
Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm Corning CLS430521
Calcium chloride VWR 1B1110 For microgel washing buffer
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume Rainin 17008609
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume Rainin 17008605
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume Rainin 17008608
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Centrifuge tube, 15 mL CELLTREAT 667015B
Centrifuge tube, 50 mL CELLTREAT 229421
Chloroform, ACS grade, Glass Bottle Stellar Scientific CP-C7304 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator ETP 11011
CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap Nunc 368632
D1 mouse mesenchymal cells ATCC CRL-12424 Example cell line for culture in MAP gels
DAPI Sigma-Aldrich D9542 For staining cell culture samples
Deuterium oxide, 99.9 atom% D Sigma-Aldrich 151882 For NMR spectroscopy
Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off Spectra/Por 132703 For purifying HA-NB and HA-Tet
Diethyl ether VWR BDH1121-4LPC For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Dimethylformamide Sigma-Aldrich 277056 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)  TCI-Chemicals D2919 For modifying HA
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861 Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich D6429-500ML For D1 cell culture
EMS Paraformaldehyde, Granular VWR 100504-162 For making 4% PFA
Ethanol absolute (200 proof) KOPTEC 89234-850
Fetal bovine serum (FBS) ATCC 30-2020 For D1 cell culture
Heating Plate Kopf Instruments HP-4M
Hemacytometer with coverglass Daigger Scientific EF16034F
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg Contipro N/A 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights.
IMARIS Essentials software package Oxford Instruments N/A Microscopy image analysis software
Infusion pump, dual syringe Chemyx N/A
Kimwipe Kimberly-Clark 34120
Laboratory stand with support lab clamp Geyer 212100
Liquid nitrogen Airgas NI 180LT22
Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate TCI-Chemicals L0290
Lyophilizer Labconco N/A Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol.
Methyltetrazine-PEG4-maleimide Kerafast FCC210 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) Fisher Scientific BP300-100 For modifying HA
Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 VWR 48393-106
Microfluidic device SU8 master wafer FlowJem Custom design made either in-house in clean room or outsourced
Mineral oil, heavy Sigma-Aldrich 330760
MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) GenScript N/A
5-Norbornene-2-methylamine TCI-Chemicals 95-10-3 For HA-NB synthesis
Packing tape Scotch 3M 1426
Parafilm Bemis PM996
PEG(thiol)2 JenKem Technology USA A4001-1 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL Thermo Fisher Scientific 15140122 For D1 cell culture
Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm Corning 351058
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 For washing HMPs
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010023
RainX water repellent glass treatment Grainger 465D20 Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment
RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) GenScript N/A
Rubber bands Staples 112417
Sodium chloride Chem-Impex 30070 For dialysis
Span 80 for synthesis Sigma-Aldrich 1338-43-8
Sylgard 184 Silicone Elastomer Electron Microscopy Science 4019862 polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices
Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter Cytvia 09-928-066
Tetraview LCD digital microscope Celestron 44347
Tetrazine-amine HCl salt Chem-Impex 35098 For HA-Tet synthesis
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Millipore Sigma 51805-45-9
Triton X-100 VWR 97063-864
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red Fisher Scientific 25-200-056 For lifting adherent cells to seed in MAP gels
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in Thomas Scientific 1204G82
UV curing system controller, LX500 LED  OmniCure 010-00369R
UV curing head, LED spot UV OmniCure N/A
UV light meter, Traceable VWR 61161-386
Vacuum dessicator Bel-Art 08-594-15C
X-Acto Z Series Precision Utility Knife Elmer's XZ3601W

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 188
3 डी सेल कल्चर के लिए माइक्रोपोरस एनाल्ड पार्टिकल स्काफोल्ड्स में कण अंश को नियंत्रित करना
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Anderson, A. R., Segura, T.… More

Anderson, A. R., Segura, T. Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (188), e64554, doi:10.3791/64554 (2022).

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