Summary
最大限度地减少颗粒支架内颗粒组分的变异性有助于可重复的实验。这项工作描述了为 体外 组织工程应用生成具有受控颗粒组分的颗粒支架的方法。
Abstract
微凝胶是微孔退火颗粒（MAP）支架的组成部分，可作为 体外 细胞培养和 体内 组织修复的平台。在这些颗粒支架中，微凝胶之间的空隙产生的先天孔隙率使细胞浸润和迁移成为可能。控制空隙分数和颗粒分数对于MAP支架设计至关重要，因为孔隙率是细胞的生物活性线索。球形微凝胶可以在微流体装置上生成，以控制尺寸和形状，然后使用防止聚合物网络破裂的方法冷冻干燥。再水化后，冻干微凝胶导致MAP支架中的受控颗粒组分。这些微凝胶冻干方法的实施导致了可重复的研究，显示了颗粒组分对大分子扩散和细胞扩散的影响。以下协议将涵盖微凝胶的制造、冻干和再水化，用于控制MAP支架中的颗粒部分，以及通过生物正交交联对微凝胶进行退火，用于 体外3D细胞培养。
Introduction
微孔退火颗粒（MAP）支架是颗粒材料的子类，其中微凝胶（μgel）构建块相互连接以形成块状多孔支架。凭借这些颗粒支架的独特微结构，由相互连接的球形微凝胶之间的空隙产生的先天孔隙率支持加速细胞浸润和迁移1。MAP支架的微凝胶构建块可以由合成和天然聚合物制成，并具有化学改性2。这里描述的方法特别强调了由透明质酸（HA）骨架组成的微凝胶的使用，该骨架改性了功能性降冰片烯（NB）手柄。HA聚合物上的NB功能手柄支持点击化学反应，用于形成微凝胶并将它们连接在一起以生成MAP支架3，4。已经采用了许多方案将微凝胶连接在一起（即退火），例如酶1，光基5，6和无添加剂点击化学3，7反应。这项工作描述了无添加剂点击化学，使用四嗪-降冰片烯逆电子需求Diels-Alder偶联来互连HA-NB微凝胶。
为了制造MAP支架，用户首先在批处理系统或微流体装置中使用反向乳液以及电流体动力喷涂，光刻或机械破碎2生成微凝胶构建块。球形HA-NB微凝胶的生产已经得到了很好的描述，并且以前使用批量乳液2和微流体液滴生成技术8，9，10，11进行了报道。在这项工作中，在流动聚焦微流体平台上生成球形HA-NB微凝胶，用于控制尺寸和形状，如前所述8，9，10。纯化后，微凝胶存在于水悬浮液中，必须浓缩以诱导卡住状态。当被卡住时，微凝胶表现出剪切稀化特性，这使得它们能够作为可注射的空间填充材料1。诱导卡住状态的一种方法是通过冻干或冷冻干燥干燥微凝胶，然后以受控体积12对干燥产物进行再水化。或者，可以通过在过滤器上离心或通过抽吸或使用吸收材料从微凝胶沉淀中手动去除缓冲液来从微凝胶浆液中除去多余的缓冲液。然而，在制作颗粒支架时，使用离心干燥微凝胶可以产生高度可变的颗粒分数和空隙分数范围12。已经描述了使用70%IPA用于聚乙二醇（PEG）微凝胶13，氟化油用于明胶甲基丙烯酰（GelMa）微凝胶14和70%乙醇用于HA微凝胶12的冻干微凝胶技术。该协议重点介绍了使用70%乙醇（标准实验室试剂）冷冻干燥球形HA微凝胶的方法，以在干燥过程中保持原始微凝胶特性。冻干的HA微凝胶可以按用户定义的重量百分比称重和再水化，以控制MAP支架12中的最终颗粒组分。
MAP支架形成的最后一步依赖于对微凝胶进行退火以创建块状多孔支架1。通过利用天然细胞外基质成分并采用生物正交退火方案，MAP支架可作为体外细胞培养和体内组织修复的生物相容性平台3。通过这些方法，MAP支架可以由HA-NB构建块制成，具有用户定义的颗粒组分，用于组织工程应用12。以下协议描述了HA-NB微凝胶的微流体生产，然后进行冻干和再水化以控制MAP支架中的颗粒部分。最后，使用生物正交化学描述了用于体外3D细胞培养实验的微凝胶退火步骤。
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Protocol
1. 微流控器件制造
- 软光刻
注意：该协议描述了de Wilson等人9的流聚焦微流体设备设计的器件制造。但是，该协议可用于SU-8晶圆上的任何器件设计。晶片可以粘在培养皿上，然后需要硅烷化以防止PDMS粘附在晶片特征15上。- 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体基料与固化剂（见 材料表）以10：1的比例混合。准备大约 100 g 以用 ~5 mm PDMS 覆盖晶圆。将PDMS混合物倒在晶圆上，并在干燥器中脱气约30分钟。一旦所有的气泡消失，放在60°C的烤箱中至少2小时以固化PDMS。
- 用刀轻轻描摹器件参数周围，不要使晶圆破裂;然后，小心地将PDMS从晶圆上剥下来。使用1毫米活检打孔器（见 材料表）创建入口和出口通道。
注意：冲压微流体装置时要轻柔。在微凝胶生产过程中，入口或出口通道周围的撕裂或撕裂会导致泄漏。 - 使用胶带清除功能侧设备上的灰尘。将设备和干净的载玻片放在135°C的热板上至少15分钟以除去水分。
- 在通风橱中，在载玻片和设备（特征面暴露）上高处使用电晕等离子枪（见 材料表）约30秒，然后快速将它们粘合在一起。轻轻施加压力，以确保设备和载玻片之间的良好密封。将设备放入60°C烤箱中过夜以固定粘合。
2. 具有降冰片烯（NB）功能手柄的透明质酸（HA）微凝胶的微流体生产
- HA-NB合成
注意：HA-降冰片烯（HA-NB）合成改编自Darling等人3，使用79 kDa钠HA，摩尔当量为1：1.5：2.5的HA重复单元到4-（4，6-二甲氧基-1，3， 5-三嗪-2-基）-4-甲基吗啉氯化物（DMTMM）到5-降冰片烯-2-甲胺（NMA）。- 称量反应物。通过在搅拌板上的烧杯或烧瓶中搅拌，将 HA 以 20 mg/mL 溶解在 200 mM MES 缓冲液 （pH ~6） 中。溶解后，将DMTMM加入HA溶液中，并在室温下反应约20分钟。例如，可以使用 1 g HA + 1.09 g DMTMM + 845 μL NMA。
- 将 NMA 滴加到 HA/DMTMM 解决方案中。在反应容器的开口处添加封口膜以尽量减少蒸发，并用箔纸覆盖反应容器。继续搅拌，同时让反应进行约24小时。
- 24小时后，冷却200证明乙醇（约反应体积的10倍）。在搅拌板上，将反应液滴转移到冷却的乙醇中以沉淀HA-NB，并继续以200-300rpm搅拌20分钟。
- 将溶液转移到50mL锥形管中，然后以5，000× g 离心10分钟。倒掉多余的乙醇作为废物处理。此时，HA-NB产品应该是锥形管中的白色颗粒。将 HA-NB 上的真空拉入干燥器中干燥过夜。
- 使用12-14 kDa分子量截止纤维素透析管纯化HA-NB（参见 材料表）。将HA-NB溶解在2M NaCl溶液中并转移到透析管中。如果需要，请绑好管子并用夹子固定。将填充的透析管转移到装有 5 L 超纯水的桶中，并将 HA-NB 隔夜。
- 第二天，除去水并用1M NaCl溶液代替30分钟。取出NaCl溶液，然后用超纯水透析3天，每天更换水。
- 使用0.2 μm真空驱动过滤器过滤透析产物，然后将过滤产物转移到50 mL锥形管中。
- 将液氮加入低温容器中，并将HA-NB管快速冷冻10分钟。然后，用镊子取出锥形管，并用实验室级纸巾快速取下盖子和盖子（见 材料表）。用橡皮筋固定组织并转移到冻干容器或腔室（见 材料表）并冻干。将冻干产物储存在-20°C。
注意：液氮是一种有害物质。使用液氮时穿戴适当的个人防护设备。 - 通过将 HA-NB 以 10 mg/mL 溶解在 D2O 中并通过质子 NMR 进行分析来量化降冰片烯修饰（图 1A）16。
- 要确定功能化量，首先将D2O溶剂峰校准至4.8 PPM。积分HA甲基质子的峰（δ2.05）并将积分校准至3.0。接下来，积分δ6.33和δ6.02（乙烯基质子，内切）的侧降冰片烯基团的峰。将这些峰的积分归一化为相应的质子数，以确定平均修饰程度3。
- HA-NB微凝胶前驱体的制备
- 制备50 mM HEPES缓冲液（pH 7.5），并使用0.2μm真空驱动过滤器无菌过滤缓冲液。使用HEPES缓冲液，制备苯基（2，4，6，-三甲基苯甲酰基）次膦酸锂（LAP）光引发剂和三（2-羧乙基）膦（TCEP）还原剂的50 mM储备液。使 LAP 解决方案远离光线。
- 通过在无菌蒸馏水中制备各自的50 mM二硫醇接头和RGD肽储备来制备其他微凝胶前体组分。称出HA-NB并溶解在HEPES缓冲液中，制备10 mg / mL储备液。
注意：根据用户偏好，可以使用不同的二硫醇接头进行微凝胶的内部交联。可降解（即MMP可裂解）和不可降解（二硫苏糖醇或DTT）接头均已列入 材料表。RGD肽包含在微凝胶制剂中以促进MAP支架中的细胞粘附，但该组分可以去除并用等体积的HEPES缓冲液代替。 - 通过添加额外的HEPES缓冲液，将母离子组分与终浓度为9.9 mM LAP、0.9375 mM TCEP（4 硫醇/TCEP）、2.8 mM 二硫醇接头、1 mM RGD 肽和 3.5 wt% （w/v） HA-NB 混合，以达到所需的最终体积。使用外置活塞式移液器充分混合前驱体。
- 使用 P1000 移液器，慢慢拉起整个混合物。将吸头放在 1 mL 注射器的末端，然后将吸头从移液器中弹出。拉动注射器柱塞将混合物装入注射器中，然后在注射器末端添加0.2μm过滤器，并过滤到新的1.5 mL微量离心管中。离心过滤的前体溶液以去除过滤过程中产生的气泡。
- 同样，使用 P1000 移液器，慢慢拉起过滤的前驱体，小心不要产生气泡。如果有气泡，请轻轻敲击尖端，使其移开并漂浮到顶部。
- 将吸头放在 1 mL 注射器的末端，然后将吸头从移液器中弹出。保持注射器垂直并缓慢拉动注射器柱塞，直到整个前驱体溶液都在注射器中。将钝尖针头添加到注射器中，并将前体推过针尖。用箔纸包裹注射器以防止光线照射。
- 微凝胶捏合液的制备
- 在重白矿物油中准备 5% v/v Span-80 并充分混合。干燥以去除气泡。将表面活性剂/油混合物在室温下用箔纸包裹。每次使用前充分混合并干燥。
- 使用5 mL注射器吸取油/表面活性剂混合物（尽量减少气泡），直到柱塞和手指之间的距离大约等于前驱体注射器的距离。在注射器中加入一根钝针，然后将油推过针尖。
- 微流控装置设置
- 将钝针加入1 mL注射器中，并填充合成疏水处理溶液（见 材料表）。轻轻地将溶液流过微流体装置，直到它在每个入口/出口处积聚。让溶液在台面上的设备中干燥约30分钟，然后在出口处拉真空以除去多余的溶液。用台式显微镜上的夹子固定设备。
- 用箔纸包裹 15 mL 锥形管，并放入管架中作为微凝胶收集容器。使用带夹子的环形支架将紫外光探针放入收集管的开口中。使用紫外检测器（见 材料表）测量紫外强度，移动探头直到达到20 mW/cm2 。关闭紫外线灯，直到以后。
- 切割从微流体装置到收集容器的长度的管道。在管子的一端，切成 45° 角。轻轻地将管道的倾斜端插入出口通道。
注意：将管子插入微流体装置时要轻柔。在微凝胶生产过程中，入口或出口通道周围的撕裂或撕裂会导致泄漏。 - 将母离子和油相注射器固定在双注射泵上（见 材料表）。再切割两根管子，长度将从注射器尖端到达微流体装置。在每个管子的一端，切成 45° 角。小心地将管子（钝端）固定在两个注射器尖端上。
- 更改 1 mL 注射器泵上的设置，并包括大致的前体体积。缓慢地向前推动泵，直到对注射器柱塞施加足够的压力，将油和前驱体推到管道的末端，从系统中去除任何空气。让压力平衡5-10分钟，然后再继续步骤2.4.6。
- 轻轻地将管子的倾斜端插入微流体装置的入口通道中，微凝胶前驱体溶液在前入口处，夹紧油在后入口处。以小增量向前移动泵，直到在设备中开始流动，并且在流动聚焦区域开始形成球形微凝胶。以 0.4 μL/min 的流速启动泵，让设备运行直至稳定。如果需要，以小增量将流速调整±0.1 μL/min，以稳定微凝胶生产。
- 一旦微凝胶生产稳定如图 1B所示，用新管更换收集管，并打开紫外光。定期检查电泳，以确保微凝胶生产在电泳期间稳定。
图 1：具有降冰片烯 （NB） 功能手柄的透明 质酸 （HA） 微凝胶的微流体生产。 （A）大约31%的HA重复单元用NB成功修饰，这是通过在氧化氘中进行的质子NMR分析确定的。 1将侧降冰片烯在δ6.33和δ6.02（乙烯基质子，内切）以及δ6.26和δ6.23 ppm（乙烯基质子，exo）处的H NMR位移与HA甲基δ2.05 ppm进行比较以确定功能化。经爱思唯尔许可转载自Anderson等人12 。（B）用于生成HA-NB微凝胶的流动聚焦微流体装置示意图。（C）共聚焦显微镜的最大强度投影用于可视化荧光标记的μgel（比例尺= 500μm）。（D）在微流体装置上独立运行的微凝胶直径的频率分布表明，根据所使用的设备，对微凝胶尺寸~50μm或~100μm的控制。（E）微凝胶直径报告为每次独立运行的平均值和标准偏差。经Wiley许可转载自Wilson et al.9 。 请点击此处查看此图的大图。
3. 微凝胶的纯化和干燥
- 微凝胶的纯化
- 在洗涤缓冲液中制备微凝胶洗涤缓冲液（300 mM HEPES，50 mM NaCl，50 mM CaCl2）以及2%（w / v）Pluronic F-127表面活性剂溶液。使用0.2μm真空驱动过滤器对溶液进行灭菌。
- 将微凝胶收集管（5，000× g）离心5分钟。在无菌罩中，小心地吸出上清油相。将微凝胶 1：1 与 2% Pluronic F-127 表面活性剂溶液混合并涡旋混合均匀。离心（5，000× g）5分钟，吸出上清液洗涤液。
- 加入4倍微凝胶体积的洗涤缓冲液并涡旋混合均匀。将混合物离心（5，000× g）5分钟并吸出洗涤溶液。用洗涤缓冲液完成4-8次洗涤，直到表面活性剂从系统中除去（即，没有气泡残留）。
- HA-NB微凝胶的荧光标记
注意：荧光标记的四嗪的内部合成依赖于两个碱催化的巯基 - 迈克尔加成反应串联，这些反应已经很好地描述和先前报道过3。在这项工作中，Alexa Fluor-488与四嗪偶联以标记降冰片烯修饰的微凝胶。将冻干产物（Alexa面粉488-Tet）溶解在二甲基甲酰胺中，浓度为1mg / mL，并储存在-20°C。- 要荧光标记微凝胶，首先通过在无菌 1x PBS 中以 1：14 稀释 1 mg/mL 储备液来制备 Alexa Fluor 488-Tet 的工作溶液。在无菌罩中，将微凝胶与工作溶液（体积比2：1）混合。
- 使用置换式移液器并充分混合。将混合物在室温下孵育1小时或在4°C下孵育过夜。
- 离心（5，000 x g）并吸出染色溶液。用 1x PBS（体积比 1：1）洗涤微凝胶两次，以去除未反应的 Alexa Fluor 488-Tet。
注意：此时，荧光标记的微凝胶可以在共聚焦显微镜上成像以量化微凝胶尺寸（图1C-E）9。Roosa等人已经彻底描述了测量微凝胶尺寸的方法17。
- 干燥HA-NB微凝胶
- 使用外置活塞式移液器将纯化的微凝胶（图2A）转移到冷冻安全的螺旋盖管中。向纯化的微凝胶中加入70%乙醇50%（v / v），并与置换移液管充分混合。以5，000× g离心5分钟。
注意：乙醇是一种高度易燃的物质。
注意：冷冻安全的螺旋盖管可以在加入微凝胶之前称重，然后在冻干后再次称量以确定微凝胶的质量。建议这样做是为了在使用少于1毫克的量时尽量减少误差。确保在使用前对秤进行内部调整或校准。 - 吸出上清液并用70%乙醇（50%v / v）代替（图2B）。用置换式移液器充分混合。在4°C孵育过夜。
注意：如果需要，微凝胶可以在冻干前在4°C的70%乙醇中储存，以便长期储存。冻干微凝胶如图 2C所示。如果需要形成冷冻凝胶，则可以在此步骤中使用其他冻干培养基（图2D）。 - 短暂离心以确保微凝胶位于螺旋盖管的底部。将液氮加入低温容器中，然后加入微凝胶管进行快速冷冻。
- 5-10分钟后，用镊子取出微凝胶管。快速取下盖子并用实验室级纸巾盖住。用橡皮筋固定组织并转移到冻干容器或腔室中。
- 按照制造商的说明将样品加载到冻干机上。在0.066托和-63°C下冻干。 将冻干的微凝胶（冻干微凝胶）在室温下密封。
注意：当从试管中取出所有液体并保留干燥产品时，冻干完成。有机溶剂会缩短普通冻干系统上橡胶夹具的使用寿命。
- 使用外置活塞式移液器将纯化的微凝胶（图2A）转移到冷冻安全的螺旋盖管中。向纯化的微凝胶中加入70%乙醇50%（v / v），并与置换移液管充分混合。以5，000× g离心5分钟。
图2：干燥HA-NB微凝胶。 （A）微凝胶在水溶液中的最大强度投影（比例尺= 100μm）。（B）纯化的微凝胶可以在所选的冻干培养基中按体积1：1孵育并冻干。（C）干燥的冻干微凝胶的最大强度投影（比例尺= 100μm）。（D）微凝胶冻干后重悬。建议使用EtOH（70%）在整个冻干过程中保持微凝胶的原始特性;然而，其他介质，如异丙醇（IPA），水和乙腈（MeCN）可以互换使用，以促进冷冻凝胶的形成（比例尺= 100或50μm，如前所述）。（E）在70%EtOH中冻干之前（灰色）和冻干后（绿色）的HA-NB微凝胶直径的测量，显示为三个微凝胶群的频率分布。经爱思唯尔许可转载自Anderson等人12 。 请点击此处查看此图的大图。
4. MAP脚手架制作
- 四嗪接头合成
注意：四嗪接头可用于互连带有游离降冰片烯基团的微凝胶（图3A）。HA-四嗪（HA-Tet）合成程序改编自Zhang等人18 ，使用79 kDa钠HA，摩尔当量为1：1：0.25的HA重复单元到DMTMM到四嗪胺（图3B）12。- 称量反应物。通过在搅拌板上的烧杯或烧瓶中搅拌，将 HA 以 20 mg/mL 溶解在 200 mM MES 缓冲液 （pH ~6） 中。溶解后，将DMTMM加入HA溶液中，并在室温下反应约20分钟。例如，可以使用100mg HA + 72.8mg DMTMM + 14.14mg四嗪胺。
- 将四嗪胺以 15 mg/mL 溶解在 200 mM MES 缓冲液中，并滴加到 HA/DMTMM 溶液中。有关HA-Tet反应设置，请参阅 图3C 。
- 在反应容器的开口处添加封口膜以尽量减少蒸发，并用箔纸覆盖反应容器。继续搅拌，同时让反应进行约24小时。
- 24小时后，冷却200证明乙醇（约反应体积的10倍）。在搅拌板上，将反应液滴转移到冷却的乙醇中以沉淀HA-Tet（图3D）并继续搅拌20分钟。
- 将溶液转移到50mL锥形管中，然后以5，000× g 离心10分钟。倒掉多余的乙醇作为废物处理。在干燥器中拉动 HA-Tet 上的真空吸尘器干燥过夜。在方案中此步骤中干燥产物的示例可以在 图3E中找到。
- 使用透析纯化HA-Tet。将 HA-Tet 溶解在 2 M NaCl 溶液中，并以 12-14 kDa 截止分子量转移到纤维素透析管中。将填充的透析管转移到装有 5 L 超纯水的桶中，并将 HA-Tet 透析过夜。
- 第二天，除去水并用1M NaCl溶液代替30分钟。取出NaCl溶液，然后用超纯水透析3天，每天更换水。
- 使用0.2μm真空驱动过滤器过滤透析产物，然后将过滤后的HA-Tet产物转移到50 mL锥形管中。
- 将锥形管在液氮中快速冷冻10分钟，然后用镊子取出锥形管。快速取下盖子并用实验室级纸巾盖住。用橡皮筋固定组织并转移到冻干容器或腔室中并冻干。将冻干产物（图3F）储存在-20°C。
- 通过将 HA-Tet 以 10 mg/mL 溶解在 D2O 中并通过质子 NMR 进行分析 来量化四嗪修饰（图 3G）16。
- 要确定功能化量，首先将D2O溶剂峰校准至4.8 PPM。积分HA甲基质子的峰（δ2.05）并将积分校准至3.0。接下来，积分δ8.5（2H）和δ7.7（2H）（芳香质子）处侧四嗪基团的峰。将这些峰的积分归一化为相应的质子数，以确定平均修饰程度12。
- 将溶液-微凝胶相互连接以形成用于表征的MAP支架
- 准备MAP支架组件（即微凝胶，HA-Tet，补液体积）。称量冻液微凝胶（图4A）并在1x PBS的最终MAP体积的84%中复溶。让微凝胶膨胀约20分钟（图4B，C）。用于再水化的wt%MAP可以根据用户对最终颗粒组分的偏好进行选择（参见 图4D，E）。
- 将HA-Tet以所选浓度溶解在1x PBS中（见下面的注释）。
注意：改变填料分数（通过 wt%MAP）以及HA-Tet的浓度将改变散装支架的机械性能。例如，3.4 wt% 的 MAP 支架与 0.02 mg/mL HA-Tet（退火比为 2.6 mol Tet：mol HA-NB）交联，产生具有大约 700 Pa 剪切存储模量12 的 MAP 支架。 - 使用置换式移液器将HA-Tet和冻干微凝胶混合均匀。此时，混合物可以通过置换式移液器 转移到 载玻片、孔板或用户选择的容器上。让微凝胶在37°C下退火25分钟，然后使用刮刀将MAP支架转移到装有1x PBS的孔板中。将MAP支架保存在1x PBS中，直到准备好进行表征。
- 计算MAP支架颗粒分数
- 为了提高图像质量，请使用刮刀将MAP支架转移到玻璃盖玻片上。使用激光进行FITC激发和发射的共聚焦显微镜上的MAP支架图像。在20倍物镜上对MAP支架进行成像，并获得在Z方向上以2.5μm的步长遍历250-300μm的Z堆栈。记下图像的μm/像素校准。
- 将Z-stack图像导入分析软件（参见 材料表）。选择“ 添加新曲面 ”按钮。选中“ 仅细分感兴趣区域”框，然后选择蓝色箭头按钮“ 下一步：感兴趣区域”。
- 定义感兴趣区域，跟踪正在分析体积的 X、Y 和 Z 维度。选择蓝色箭头按钮 下一步：源通道。
注意：X 和 Y 尺寸以像素为单位，而 Z 尺寸是步数。感兴趣区域的推荐Z高度应至少包括两个μgel。 - 使用 “源通道 ”下拉列表选择 FITC 通道。选中 平滑 旁边的框，然后输入 2.50 μm 的表面细节。在“阈值”下，选择“ 绝对强度”，然后选择蓝色箭头按钮“ 下一步： 阈值”。
- 对 FITC 通道使用建议的阈值。旋转 3D 投影以评估渲染质量并根据需要进行调整。选择 下一步：分类曲面。
注意：根据需要，“ 后退 ”按钮可用于编辑流程中的先前步骤，例如 Z 维度。 - 检查 体素数 是否为 10.0，然后选择绿色双箭头按钮 完成：执行所有创建步骤并终止向导。
注意：可以存储体积渲染参数以进行批量分析，以便应用相同的设置来分析所有基架。 - 若要导出数据，请选择“ 统计信息 ”选项卡，然后选择“ 详细 ”选项卡。使用第二个下拉框选择可变 音量。选择软盘按钮 将 选项卡上的统计信息导出到文件 ，并在出现提示时另存为电子表格文件 （.xls）。
- 打开文件并使用A柱体积上的SUM函数来确定感兴趣区域中μgel的总 体积 （μm3）。
- 将分析的感兴趣区域的尺寸从像素转换为μm。使用步骤4.3.1中图像的μm/像素校准来转换X和Y尺寸。将 Z 维度（步数）乘以图像的步长，将 Z 维度转换为 μm。通过将 X、Y 和 Z 维度相乘来计算感兴趣区域的体积 （μm3）。
- 要确定支架的颗粒分数，请将感兴趣区域（在步骤4.3.8中找到）中微凝胶的总体积除以感兴趣区域（在步骤4.3.9中找到）的体积。
图 3：用于制造微孔退火颗粒 （MAP） 支架的四嗪接头的合成。 （A）HA-NB微凝胶与四嗪接头相互连接以形成MAP支架的示意图。（B）HA-Tet合成的反应方案。（C）设置HA-Tet反应并使其反应过夜，然后（D）HA-Tet在乙醇中沉淀。（E）纯化并干燥后，将HA-Tet再水化并冻干以产生（F）干燥的浅粉红色产品。（G）质子核磁共振分析显示成功修饰了11%的HA重复单元。经爱思唯尔许可转载自Anderson等人12 。 请点击此处查看此图的大图。
图4：用于MAP支架制造的冻干微凝胶的再水化。 （A）干燥的冻干微凝胶的最大强度投影（比例尺= 100μm）。（B）冷冻干燥后，冻干微凝胶的再水化显示大约需要20分钟（比例尺= 100μm）。（C）莱微凝胶可以在不同的wt%MAP下再水化以产生卡住的微凝胶（比例尺= 100μm）。（D）当冻干微凝胶再水化时，增加wt%MAP会改变MAP支架中的颗粒分数，如MAP支架的单个Z切片和体积投影（比例尺= 100μm）所示。（E）使用这些用户定义的wt%MAP支架，可以实现独特的颗粒级分（NL =非冻干微凝胶）。对样品（n = 3）进行了带有Tukey HSD的单因素方差分析，显著性报告为p < 0.05 （*）、p < 0.01 （**）、p < 0.005 （***） 和 p < 0.001 （****）。经爱思唯尔许可转载自Anderson等人12 。 请点击此处查看此图的大图。
5.3D 图谱支架中的细胞培养
- 准备细胞培养设备
- 要为这些实验创建自定义细胞培养设备（图5A-C），请使用3D打印机使用补充编码文件1中的CAD文件打印负模。
注意：细胞培养装置的尺寸如下：94.9 mm x 94.9 mm x 4.8 mm，总孔高为2.6 mm。内孔和外孔的直径分别为4毫米和6毫米。 - 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体基料与固化剂以10：1的质量比混合。将PDMS混合物倒入大型塑料培养皿中，并在干燥器中脱气约30分钟或直到所有气泡消失。
- 一旦所有的气泡都消失了，小心地将3D打印的模具放入PDMS中，以尽量减少新气泡的形成。在60°C的烘箱中放置至少2小时以固化PDMS。
- 用刀或剃须刀片在培养装置的参数周围轻轻描摹，然后小心地取下模具。使用 4 mm 活检打孔器从孔底部去除任何 PDMS。切割设备以适合玻璃盖玻片。
注意：细胞培养设备也可以粘合到载玻片上，但玻璃盖玻片可改善样品成像。 - 使用胶带清除培养设备底部的灰尘。将干净的玻璃盖玻片和培养装置（底部朝上）放在135°C的热板上至少15分钟以除去水分。
- 在通风橱中，在玻璃盖玻片和设备底部的高处使用电晕等离子枪 30 秒，然后快速将处理过的表面粘合在一起。轻轻施加压力，以确保培养装置和玻璃盖玻片之间的良好密封。
- 对所有设备重复步骤5.1.6，然后放入60°C烘箱中过夜以固定粘合。在 体外使用前对设备进行高压灭菌。
- 要为这些实验创建自定义细胞培养设备（图5A-C），请使用3D打印机使用补充编码文件1中的CAD文件打印负模。
- MAP支架中的细胞培养
- 根据所需的颗粒级分制备MAP支架组件（即微凝胶，HA-Tet，培养基体积）（参见图4D-E）。称量无菌罩中的冻干微凝胶，并根据所选的wt%MAP在细胞培养基的最终MAP体积的84%中复溶。让微凝胶膨胀约20分钟。
注意：这些方法要求用户称量冻干微凝胶产品以进行补液。对于小质量（1mg或更少），建议在添加和冻干微凝胶之前首先称量冷冻管，然后在冻干后重新称量管以确定产品的质量，以尽量减少误差。 - 将HA-Tet溶解在细胞培养基中，占最终MAP体积的16%。
注意：根据所使用的细胞类型，可以更改以下准备用于接种在MAP支架中的细胞的步骤。在该协议中，D1小鼠间充质细胞在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中生长，补充有1%青霉素 - 链霉素（笔链球菌）和10%胎牛血清（FBS）（参见 材料表）。这些细胞应遵循标准的贴壁细胞培养方案，将培养物保持在37°C和组织培养处理的培养容器中的5%CO2 。 - 一旦D1小鼠间充质细胞达到70%-80%汇合，吸出培养基并用1x PBS洗涤细胞。通过添加足够体积的 1% 胰蛋白酶-EDTA 来提升细胞以覆盖到组织培养容器的表面。在37°C孵育1-3分钟，然后通过加入补充有1%笔链球菌和10%FBS的DMEM培养基以2倍的胰蛋白酶-EDTA体积淬灭胰蛋白酶消化。
- 在室温下以100× g 离心细胞悬液5分钟以沉淀细胞。吸出上清液培养基并将细胞重悬于补充有 1% 笔链球菌和 10% FBS 的 1 mL DMEM 培养基中。
- 确保细胞悬液充分混合，然后将 20 μL 转移到新的微量离心管中。加入 20 μL 台盼蓝溶液并充分混合。使用20 μL该混合物使用血细胞计数器或带有细胞计数室载玻片的自动细胞计数器对细胞进行计数。
- 将接种 10，000 个细胞/μL MAP 所需的细胞数转移到新的微量离心管中。在室温下以100× g 离心5分钟以沉淀细胞。小心地从细胞沉淀中吸出上清液培养基，而不吸出细胞。
- 用置换移液管将微凝胶和交联剂添加到细胞沉淀中。用置换式移液器充分混合，然后每孔接种 10 μL 混合物。电镀时，以圆周运动移液，使混合物均匀分布在孔中。
- 让微凝胶在细胞培养箱中在37°C退火25分钟，然后加入细胞培养基以填充孔（每孔~50μL培养基）。将3D培养物保持在37°C，并根据需要更换培养基。为避免在更换介质时吸出支架，请沿上孔的脊稳定移液器尖端。
注意：从培养孔中添加或取出液体时，请将移液器尖端的末端放在MAP支架上方的壁架上，以最大程度地减少从孔中破坏或吸出支架的机会。 - 在所需的时间点，通过去除培养基并在室温下每孔加入 50 μL 4% 多聚甲醛 30 分钟来固定样品。用 50 μL 1x PBS 或首选缓冲液洗涤样品 3 次。在协议的这一点上，可以遵循免疫荧光或荧光染色的标准方法，每孔使用50μL以及工作体积。
注意：这些固定和细胞染色方法专门描述了荧光染料的使用;然而，可以使用一抗和/或二抗偶联物在这些支架中进行免疫染色，也可以按照制造商的说明使用50 μL作为每孔的工作体积进行。 - 使用20倍物镜在共聚焦显微镜上的MAP支架上对细胞进行成像，并获得在Z方向上以2.5μm的步长在Z方向上横跨200-250μm的Z堆栈。用DAPI（在1x PBS中的0.15%Triton-X中稀释1：1000的核染色）和鬼笔环肽-647（F-肌动蛋白染色剂在1x PBS中的0.15%Triton-X中稀释1：40）进行荧光染色的示例如图5E，F所示，固定的D1细胞在MAP支架中培养3天。
注意：玻璃表面的等离子处理可提高亲水性，这已被证明可以增强细胞粘附。可能会观察到细胞沿着细胞培养孔底部扩散，但不应包括在细胞计数或细胞体积定量中，以评估MAP支架中的细胞反应。
- 根据所需的颗粒级分制备MAP支架组件（即微凝胶，HA-Tet，培养基体积）（参见图4D-E）。称量无菌罩中的冻干微凝胶，并根据所选的wt%MAP在细胞培养基的最终MAP体积的84%中复溶。让微凝胶膨胀约20分钟。
图5：MAP支架中的细胞培养。 （A）用于创建细胞培养孔的模具可以3D打印并用PDMS浇铸。整个模具直径95毫米，大孔直径6毫米，小内孔直径4毫米。（B）一旦用PDMS浇注，细胞培养设备就被等离子粘合到盖玻片上，以提高显微镜能力。（C） 细胞培养孔的横截面描绘了细胞培养基的储液库 （~50 μL） 和用于用细胞接种 MAP 支架的较小储液槽 （~10 μL）。（D）在MAP支架中接种细胞的过程首先依赖于冻干-μgel以用户所需的重量再水化，然后与细胞和交联剂混合以互连μgel。（E）细胞可以封装在具有不同wt%MAP的MAP支架（绿色）中。代表性图像来自MAP支架中D1细胞培养的第5天（比例尺= 100μm）。（F）单个Z切片显示包含不同wt%MAP的支架中细胞生长的差异（比例尺= 50μm）。经爱思唯尔许可转载自Anderson等人12 。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
该协议的目的是演示使用生物正交交联方案以及用于3D细胞培养的受控颗粒组分制备微孔退火颗粒（MAP）支架。首先，用降冰片烯侧基修饰HA，用于微凝胶形成和互连以形成MAP支架。使用这些方法，大约31%的HA重复单元用降冰片烯功能手柄成功修饰（图1A）。具有流动聚焦区域的微流体装置（图1B）显示可产生直径~50μm或~100μm的HA-NB微凝胶（图1C，D）。在这项工作的其余部分中使用的微凝胶的平均直径为92μm（Q1 = 79μm，Q3 = 103μm）（图1E）。
为了控制颗粒分数，通过冻干干燥微凝胶（图2A-C），以产生可由用户称量并再水化以获得溶胀微凝胶的产品。通过使用70%乙醇优化用于冻干μgel的培养基以防止冷冻凝胶形成（即内部缺陷），但也已经证明，如果用户需要冷冻凝胶，则使用其他培养基进行冻干可以实现冷冻凝胶（图2D）。在Anderson等人的工作中可以找到对用于微凝胶冷冻凝胶形成的不同冻干介质的全面研究12。使用共聚焦显微镜，用70%乙醇冻干前后定量HA-NB微凝胶直径（图2E），这表明该干燥过程的微凝胶尺寸没有显着变化。
为了促进HA-NB微凝胶的生物正交互连，合成了一种线性HA-Tet交联剂（图3）。质子核磁共振波谱显示，使用这项工作中详述的步骤（图3G）用四嗪侧基团成功修饰了11%的HA重复单元，反应产率为95%。使用HA-Tet接头，将干燥的冻干微凝胶产物（图4A）用指定体积再水化，以在MAP支架中分别获得尺寸为10μL（直径4毫米）至50μL（直径8毫米）的微凝胶的不同wt%（w/v）配方，用于细胞培养实验和材料表征。MAP支架中这些用户定义的wt%微凝胶对应于支架中独特的颗粒组分（图4D，E）。
该协议还详细介绍了使用生物正交退火方案在MAP支架中进行3D培养的细胞接种过程（图5D）。将冻干-微凝胶在细胞培养基中以所需的wt%再水化，然后与细胞沉淀和HA-Tet混合以将微凝胶连接起来。然后将该混合物接种在细胞培养装置中（图5A-C），以产生封装在MAP支架中微凝胶之间的空隙中的细胞。MAP支架中3D培养的细胞在第5天固定，染色并在共聚焦显微镜上成像，如图5E所示。图5F显示了不同wt%配方的MAP支架空隙空间中的细胞示例。
补充编码文件1：用于3D打印细胞培养设备模具的CAD文件。请点击此处下载此文件。
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Discussion
HA-NB微凝胶的微流控生产已被证明可以产生比乳液批量生产3，9具有更窄的粒径分布范围的微凝胶。本协议中描述的微凝胶使用MMP可裂解交联剂（Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2）配制以支持材料降解。然而，HA-NB微凝胶也可以使用替代的二硫醇接头进行交联，例如二硫苏糖醇（DTT），它是不可降解的。类似地，其它光引发剂，如Irgacure 2959 2-羟基-4-（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮，可用于HA-NB前体中代替LAP以促进硫醇-烯交联10。这些微凝胶由3.5wt%HA组成，基于先前的工作，该工作证明3.5wt%前体溶液的粘度适合在微流体平台上捏成液滴6。其他人已经描述了使用较低wt%配方（3wt%HA-NB）以及8，10，11在流动聚焦微流体装置上进行HA-NB微凝胶制造。虽然该方法有利于生产具有低多分散性的微凝胶群，但它比可用于HA-NB微凝胶生产的批量乳液技术更费时和劳动强度3。
微凝胶冻干过程依赖于冷冻交联聚合物网络。当冻干介质中的晶体结构形成并充当致孔剂时，在冷冻过程中可能会出现缺陷，并且与原始材料相比，所得冷冻凝胶表现出增强的孔隙率和不同的机械性能19，20。迄今为止，已经描述了使用不同培养基进行冻干的冷冻干燥微凝胶的方法，这些方法可以防止聚乙二醇（PEG）13，GelMa14和HA制剂12 的冷冻凝胶形成。对于该协议，如果需要冷冻凝胶，用户可以将70%乙醇与他们选择的另一种冻干培养基互换。虽然冷冻凝胶在某些应用中可能是有利的，但该方案中强调了70%乙醇作为冻干培养基，因为它是一种常见的实验室试剂，它在MAP制造过程中结合了灭菌的好处，它允许HA微凝胶保持其原始尺寸，形状和刚度，同时在再水化后最大限度地减少内部缺陷12.除了这些微凝胶特性的评估外，环境扫描电子显微镜（SEM）还可以作为评估冻干前后微凝胶形态的潜在工具。
本工作中描述的用于干燥HA-NB微凝胶的方法被引入，以规避颗粒分数的变化，并生产具有用户定义的wt%配方的一致MAP支架。不同wt%再水化下受控颗粒级分的研究仅限于球形微凝胶的研究。其他微凝胶形状，例如棒8，21或不规则形状10，22，尚未研究以评估wt%MAP与颗粒分数之间的关系。根据先前的研究，已在MAP支架中使用一致比例的再水化冻干微凝胶（84%）和HA-Tet交联剂（16%）评估颗粒分数2;然而，只要HA-Tet体积足以以所需的交联比例溶解HA-Tet，这些部分就可以由用户自行决定改变。降冰片烯-四嗪点击化学反应已有效地退火微凝胶以使用双官能团23，多臂3以及这些方法中描述的线性12四嗪接头形成MAP支架。如果需要，可以改变Tet：HA-NB的摩尔比以实现块状MAP支架12的不同刚度。这些用于再水化冻干微凝胶的技术尚未用于除四嗪-降冰片烯以外的其他退火化学品。
MAP支架中的3D细胞培养之前已经描述了多种细胞类型，例如内皮细胞8，成纤维细胞1，3，4，24，神经祖细胞9和间充质干细胞25，26。在70%乙醇中冻干HA-NB微凝胶后，通过质子NMR观察到残留乙醇;然而，也证实痕量的乙醇不会影响细胞活力12。迄今为止，在包含冻干微凝胶的MAP支架中的培养物仅用小鼠间充质干细胞证明12;然而，这种用冻干-微凝胶在MAP支架中接种细胞的方案可以与其他细胞类型及其相应的细胞培养基互换。对于D1细胞培养，F-肌动蛋白强度和总细胞体积已显示随着wt%MAP的增加而降低12。还表明，随着微凝胶之间的空隙变小，增加wt%MAP对应于块支架刚度（不是局部微凝胶刚度）的增加，导致高wt%MAP支架中的细胞增殖减少12。
这项工作描述了在微流体平台上生产HA-NB微凝胶的方法，然后冷冻干燥微凝胶以保持原始微凝胶特性或生产冷冻凝胶。该协议概述了四嗪接头的合成，用于在以用户定义的重量百分比再水化以创建具有受控颗粒级分的MAP支架后互连冻微凝胶。最后，这项工作详细介绍了在这些具有用户定义的微架构的MAP支架内培养细胞的步骤。创建具有一致颗粒组分的颗粒支架提高了MAP用户实验结果的可重复性，超越了细胞对质量传递和机械性能的反应12。使用这些技术生成的MAP支架可用于 体内 应用。使用冻干产品进行颗粒支架制造有利于提高材料的保质期，也有利于将来将MAP支架转化为临床环境。
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Disclosures
ARA和TS已经为这项技术申请了临时专利。
Acknowledgments
作者要感谢美国国立卫生研究院，美国国立神经系统疾病和中风研究所（1R01NS112940，1R01NS079691，R01NS094599）和国家过敏和传染病研究所（1R01AI152568）。这项工作部分是在杜克大学共享材料仪器设施（SMIF）进行的，该设施是北卡罗来纳州研究三角纳米技术网络（RTNN）的成员，该网络由美国国家科学基金会（奖励号ECCS-2025064）支持，作为国家纳米技术协调基础设施（NNCI）的一部分。作者要感谢实验室的前博士后Lucas Schirmer博士以及Ethan Nicklow在生成用于细胞培养实验的3D打印设备方面的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309628 | |
| 5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate | BD | 309646 | |
| Alexa Fluor 488 C5 maleimide | Invitrogen | A10254 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | For staining cell culture samples |
| Aluminum foil | VWR | 89107-726 | |
| Biopsy punch with plunger, 1.0 mm | Integra Miltex | 69031-01 | |
| Biopsy punch, 4 mm | Integra Miltex | 33-34 | |
| Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped | SAI Infusion Technologies | B23-50 | |
| Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm | Corning | CLS430521 | |
| Calcium chloride | VWR | 1B1110 | For microgel washing buffer |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume | Rainin | 17008609 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume | Rainin | 17008605 | |
| Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume | Rainin | 17008608 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | CELLTREAT | 667015B | |
| Centrifuge tube, 50 mL | CELLTREAT | 229421 | |
| Chloroform, ACS grade, Glass Bottle | Stellar Scientific | CP-C7304 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator | ETP | 11011 | |
| CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap | Nunc | 368632 | |
| D1 mouse mesenchymal cells | ATCC | CRL-12424 | Example cell line for culture in MAP gels |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | For staining cell culture samples |
| Deuterium oxide, 99.9 atom% D | Sigma-Aldrich | 151882 | For NMR spectroscopy |
| Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off | Spectra/Por | 132703 | For purifying HA-NB and HA-Tet |
| Diethyl ether | VWR | BDH1121-4LPC | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 277056 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM) | TCI-Chemicals | D2919 | For modifying HA |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide) |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | D6429-500ML | For D1 cell culture |
| EMS Paraformaldehyde, Granular | VWR | 100504-162 | For making 4% PFA |
| Ethanol absolute (200 proof) | KOPTEC | 89234-850 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | For D1 cell culture |
| Heating Plate | Kopf Instruments | HP-4M | |
| Hemacytometer with coverglass | Daigger Scientific | EF16034F | |
| 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg | Contipro | N/A | 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights. |
| IMARIS Essentials software package | Oxford Instruments | N/A | Microscopy image analysis software |
| Infusion pump, dual syringe | Chemyx | N/A | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Laboratory stand with support lab clamp | Geyer | 212100 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI 180LT22 | |
| Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate | TCI-Chemicals | L0290 | |
| Lyophilizer | Labconco | N/A | Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol. |
| Methyltetrazine-PEG4-maleimide | Kerafast | FCC210 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| 2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) | Fisher Scientific | BP300-100 | For modifying HA |
| Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 | VWR | 48393-106 | |
| Microfluidic device SU8 master wafer | FlowJem | Custom design made either in-house in clean room or outsourced | |
| Mineral oil, heavy | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| 5-Norbornene-2-methylamine | TCI-Chemicals | 95-10-3 | For HA-NB synthesis |
| Packing tape | Scotch | 3M 1426 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| PEG(thiol)2 | JenKem Technology USA | A4001-1 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For D1 cell culture |
| Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm | Corning | 351058 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | For washing HMPs |
| Phosphate buffered saline (PBS) 1x | Gibco | 10010023 | |
| RainX water repellent glass treatment | Grainger | 465D20 | Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment |
| RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) | GenScript | N/A | |
| Rubber bands | Staples | 112417 | |
| Sodium chloride | Chem-Impex | 30070 | For dialysis |
| Span 80 for synthesis | Sigma-Aldrich | 1338-43-8 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Electron Microscopy Science | 4019862 | polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices |
| Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter | Cytvia | 09-928-066 | |
| Tetraview LCD digital microscope | Celestron | 44347 | |
| Tetrazine-amine HCl salt | Chem-Impex | 35098 | For HA-Tet synthesis |
| Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Millipore Sigma | 51805-45-9 | |
| Triton X-100 | VWR | 97063-864 | |
| Trypan blue solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red | Fisher Scientific | 25-200-056 | For lifting adherent cells to seed in MAP gels |
| Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in | Thomas Scientific | 1204G82 | |
| UV curing system controller, LX500 LED | OmniCure | 010-00369R | |
| UV curing head, LED spot UV | OmniCure | N/A | |
| UV light meter, Traceable | VWR | 61161-386 | |
| Vacuum dessicator | Bel-Art | 08-594-15C | |
| X-Acto Z Series Precision Utility Knife | Elmer's | XZ3601W |
References
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