Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kontrol af partikelfraktion i mikroporøse udglødede partikelstilladser til 3D-cellekultur

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64554
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Departments of Biomedical Engineering, Neurology, and Dermatology, Duke University

Summary

Minimering af variabiliteten i partikelfraktionen inden for granulære stilladser letter reproducerbare eksperimenter. Dette arbejde beskriver metoder til generering af granulære stilladser med kontrollerede partikelfraktioner til in vitro-vævstekniske applikationer.

Abstract

Microgels er byggestenene i mikroporøse udglødede partikel (MAP) stilladser, der tjener som en platform for både in vitro cellekultur og in vivo væv reparation. I disse granulære stilladser muliggør den medfødte porøsitet, der genereres af tomrummet mellem mikrogeler, celleinfiltration og migration. Styring af tomrumsfraktionen og partikelfraktionen er afgørende for MAP-stilladsdesign, da porøsitet er et bioaktivt signal til celler. Sfæriske mikrogeler kan genereres på en mikrofluidisk enhed til kontrolleret størrelse og form og efterfølgende frysetørres ved hjælp af metoder, der forhindrer brud på polymernetværket. Ved rehydrering fører de frysetørrede mikrogeler til kontrollerede partikelfraktioner i MAP-stilladser. Implementeringen af disse metoder til mikrogellyofilisering har ført til reproducerbare undersøgelser, der viser effekten af partikelfraktion på makromolekylediffusion og cellespredning. Følgende protokol vil dække fremstilling, lyofilisering og rehydrering af mikrogeler til kontrol af partikelfraktion i MAP-stilladser samt udglødning af mikrogelerne gennem bioortogonal tværbinding til 3D-cellekultur in vitro.

Introduction

Mikroporøse udglødede partikel (MAP) stilladser er en underklasse af granulære materialer, hvor mikrogel (μgel) byggestenene er indbyrdes forbundet for at danne et stort, porøst stillads. Med den unikke mikroarkitektur af disse granulære stilladser understøtter den medfødte porøsitet, der genereres af tomrummet mellem sammenkoblet sfærisk mikrogel, accelereret celleinfiltration og migration1. Microgel-byggestenene i MAP-stilladser kan fremstilles af både syntetiske og naturlige polymerer med kemiske modifikationer2. De her beskrevne metoder fremhæver specifikt brugen af mikrogeler bestående af en hyaluronsyre (HA) rygrad modificeret med funktionelle norbornen (NB) håndtag. NB's funktionelle håndtag på HA-polymeren understøtter klikkemireaktioner til dannelse af mikrogeler og sammenkædning af dem for at generere MAP-stilladser 3,4. Talrige ordninger er blevet anvendt til at forbinde mikrogelerne sammen (dvs. udglødning), såsom enzymatisk1, lysbaseret 5,6 og additivfri klikkemi 3,7 reaktioner. Additivfri klikkemi er beskrevet i dette arbejde ved hjælp af tetrazin-norbornen invers elektronefterspørgsel Diels-Alder-konjugation til sammenkobling af HA-NB-mikrogelerne.

For at fremstille MAP-stilladser genererer brugerne først mikrogelbyggestenene ved hjælp af omvendte emulsioner enten i batchsystemer eller i mikrofluidiske enheder samt med elektrohydrodynamisk sprøjtning, litografi eller mekanisk fragmentering2. Produktionen af sfæriske HA-NB-mikrogeler er velbeskrevet og tidligere rapporteret ved anvendelse af både batchemulsion2 og mikrofluidiske dråbegenereringsteknikker 8,9,10,11. I dette arbejde blev sfæriske HA-NB-mikrogeler genereret på en flowfokuseret mikrofluidisk platform til kontrolleret størrelse og form, som tidligere beskrevet 8,9,10. Efter oprensning findes mikrogelerne i en vandig suspension og skal koncentreres for at inducere en fastklemt tilstand. Når de sidder fast, udviser mikrogeler forskydningsfortyndende egenskaber, som gør det muligt for dem at fungere som injicerbare, rumfyldende materialer1. En metode til at fremkalde en fastklemt tilstand er at tørre mikrogelerne via frysetørring eller frysetørring og derefter rehydrere det tørrede produkt i et kontrolleret volumen12. Alternativt kan overskydende buffer fjernes fra mikrogelopslæmningen via centrifugering over en sil eller med manuel fjernelse af bufferen fra mikrogelpelleten enten ved aspiration eller ved hjælp af et absorberende materiale. Brug af centrifugering til tørring af mikrogelerne kan imidlertid generere et meget variabelt interval af partikelfraktioner og tomme fraktioner, når man laver granulære stilladser12. Teknikker til frysende mikrogeler er blevet beskrevet ved hjælp af 70% IPA for polyethylenglycol (PEG) mikrogeler13, fluorerede olier til gelatine methacryloyl (GelMa) mikrogeler14 og 70% ethanol til HA-mikrogeler12. Denne protokol fremhæver metoder til frysetørring af sfæriske HA-mikrogeler ved hjælp af 70% ethanol, et standard laboratoriereagens, for at bevare de oprindelige mikrogelegenskaber under tørringsprocessen. De frysetørrede HA-mikrogeler kan vejes og rehydreres med brugerdefinerede vægtprocenter for at kontrollere de endelige partikelfraktioner i MAP-stilladser12.

Det sidste trin i MAP-stilladsdannelsen er afhængig af udglødning af mikrogelerne for at skabe et stort, porøst stillads1. Ved at anvende native ekstracellulære matrixkomponenter og anvende bioortogonale udglødningsordninger fungerer MAP-stilladser som en biokompatibel platform til både in vitro-cellekultur og in vivo-vævsreparation 3. Gennem disse tilgange kan MAP-stilladser fremstilles af HA-NB-byggesten med brugerdefinerede partikelfraktioner til deres anvendelse i vævstekniske applikationer12. Følgende protokol beskriver den mikrofluidiske produktion af HA-NB-mikrogeler efterfulgt af frysefilisering og rehydrering til kontrol af partikelfraktion i MAP-stilladser. Endelig beskrives trin til udglødning af mikrogelerne ved hjælp af bioortogonal kemi til in vitro 3D-cellekultureksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af mikrofluidisk enhed

  1. Blødt litografi
    BEMÆRK: Denne protokol beskriver enhedsfremstilling af et flowfokuserende mikrofluidisk enhedsdesign fra de Wilson et al.9. Denne protokol kan dog bruges med ethvert enhedsdesign på en SU-8-wafer. Waferen kan tapes til en petriskål og skal derefter silaniseres for at forhindre overholdelse af PDMS til waferfunktionerne15.
    1. Polydimethylsiloxan (PDMS) elastomerbasen blandes med hærdningsmidlet (se Materialetabel) i forholdet 10:1. Forbered ca. 100 g til at dække waferen med ~ 5 mm PDMS. Hæld PDMS-blandingen på skiven og afgass i en ekssikkator i ca. 30 min. Når alle boblerne er væk, skal du placere dem i en ovn ved 60 °C i mindst 2 timer for at hærde PDMS.
    2. Brug en kniv til forsigtigt at spore rundt om enhedens parameter uden at knække waferen; Skræl derefter forsigtigt PDMS af waferen. Brug en 1 mm biopsistans (se Materialetabel) til at skabe indløbs- og udløbskanalerne.
      BEMÆRK: Vær forsigtig, når du stanser den mikrofluidiske enhed. Tårer eller revner omkring indløbs- eller udløbskanalerne kan forårsage lækager under mikrogelproduktion.
    3. Brug tape til at fjerne støv fra enheden på funktionssiden. Anbring enhederne, og rengør glasglas på en kogeplade ved 135 °C i mindst 15 minutter for at fjerne fugt.
    4. I en røghætte skal du bruge en koronaplasmapistol (se Materialetabel) højt på både glasrutschebaner og enheder (funktionsside udsat) i ca. 30 s, og derefter hurtigt binde dem sammen. Påfør forsigtigt tryk for at sikre en god tætning mellem enheden og glasbeholderen. Anbring enhederne i en 60 °C ovn natten over for at sikre bindingen.

2. Mikrofluid produktion af hyaluronsyre (HA) mikrogeler med norbornen (NB) funktionelle håndtag

  1. HA-NB syntese
    BEMÆRK: HA-norbornen (HA-NB) syntese blev tilpasset fra Darling et al.3 ved anvendelse af 79 kDa natrium HA med molære ækvivalenter på 1: 1.5: 2.5 HA-gentagelsesenheder til 4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholiniumchlorid (DMTMM) til 5-norbornen-2-methylamin (NMA).
    1. Vej reaktanterne. HA opløses ved 20 mg/ml i 200 mM MES-buffer (pH ~6) under omrøring i et bægerglas eller en kolbe på en omrøringsplade. Når DMTMM er opløst, tilsættes den til HA-opløsningen, og der reageres i ca. 20 minutter ved stuetemperatur. For eksempel kan 1 g HA + 1,09 g DMTMM + 845 μL NMA bruges.
    2. Føj NMA dropwise til HA/DMTMM-løsningen. Tilsæt parafilm til åbningen af reaktionsbeholderen for at minimere fordampningen, og dæk reaktionsbeholderen med folie. Fortsæt omrøringen, mens reaktionen tillades i ca. 24 timer.
    3. Efter 24 timer afkøles 200 bevis ethanol (ca. 10x reaktionsvolumen). På en omrøringsplade overføres reaktionen dråbevis til den afkølede ethanol for at udfælde HA-NB og fortsætte omrøringen ved 200-300 o / min i 20 minutter.
    4. Opløsningen overføres til 50 ml koniske rør, og centrifugeres derefter ved 5.000 x g i 10 min. Hæld overskydende ethanol af for at bortskaffe som affald. På dette tidspunkt skal HA-NB-produktet være hvide pellets i de koniske rør. Træk vakuum på HA-NB i en dessicator for at tørre natten over.
    5. Rens HA-NB ved hjælp af 12-14 kDa molekylvægt afskåret cellulosedialyserør (se Materialetabel). HA-NB opløses i 2 M NaCl-opløsning, og der overføres til dialyseslangen. Bind slangen og fastgør den med klemmer, hvis det er nødvendigt. Overfør den fyldte dialyseslange til en spand med 5 liter ultrarent vand og dialysér HA-NB mod vand natten over.
    6. Den næste dag fjernes vandet og udskiftes med 1 M NaCl-opløsning i 30 min. Fjern NaCl-opløsningen, og dialysér derefter mod ultrarent vand i 3 dage, og udskift vandet dagligt.
    7. Filtrer det dialyserede produkt ved hjælp af 0,2 μm vakuumdrevet filter, og overfør derefter det filtrerede produkt til 50 ml koniske rør.
    8. Tilsæt flydende nitrogen til en kryogen beholder og frys HA-NB-rørene i 10 minutter. Fjern derefter de koniske rør med tang, og fjern hurtigt hætten og dæksel med et væv af laboratoriekvalitet (se Materialetabel). Fastgør vævet med et gummibånd og overfør til en frysebeholder eller et kammer (se Materialetabel) og lyofiliser. Opbevar det frysetørrede produkt ved -20 °C.
      FORSIGTIG: Flydende nitrogen er et farligt stof. Brug det passende personlige beskyttelsesudstyr, når du arbejder med flydende nitrogen.
    9. Norbornenmodifikation opgøres ved at opløse HA-NB ved 10 mg/ml iD2O og analysere via proton NMR (figur 1A)16.
      1. For at bestemme mængden af funktionalisering skal du først kalibrere D2O-opløsningsmiddeltoppen til 4,8 PPM. Integrer toppen for HA-methylprotonerne (δ2.05), og kalibrer integrationen til 3.0. Integrer derefter toppe for vedhængsnorbornengrupperne ved δ6.33 og δ6.02 (vinylprotoner, endo). Normaliser integrationen af disse toppe til det tilsvarende antal protoner for at bestemme den gennemsnitlige grad af modifikation3.
  2. Fremstilling af HA-NB mikrogelprækursor
    1. Der forberedes 50 mM HEPES-buffer (pH 7,5), og bufferen filtreres sterilt ved hjælp af et 0,2 μm vakuumdrevet filter. Ved hjælp af HEPES-bufferen fremstilles respektive 50 mM lagre af lithiumphenyl(2,4,6,-trimethylbenzoyl)phosphinat (LAP) fotoinitiator og tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) reduktionsmiddel. Hold LAP-opløsningen væk fra lys.
    2. De øvrige mikrogelprækursorkomponenter fremstilles ved at forberede respektive 50 mM lagre af di-thiollinker og RGD-peptid i sterilt destilleret vand. HA-NB vejes af, og der opløses i HEPES-buffer for at forberede en bestand på 10 mg/ml.
      BEMÆRK: Forskellige di-thiol-linkere kan bruges til den interne tværbinding af mikrogelerne baseret på brugerpræferencer. Både en nedbrydelig (dvs. MMP-spaltet) og ikke-nedbrydelig (dithiothreitol eller DTT) linker er opført i materialetabellen. RGD-peptidet er inkluderet i mikrogelformuleringen for at fremme celleadhæsion i MAP-stilladser, men denne komponent kan fjernes og erstattes med samme volumen HEPES-buffer.
    3. Kombiner forløberkomponenterne med slutkoncentrationer på 9,9 mM LAP, 0,9375 mM TCEP (4 thiol/TCEP), 2,8 mM di-thiol linker, 1 mM RGD-peptid og 3,5 vægt% (w/v) HA-NB ved at tilføje ekstra HEPES-buffer for at nå det ønskede endelige volumen. Bland forløberen godt ved hjælp af en positiv forskydningspipette.
    4. Brug en P1000-pipette til langsomt at trække hele blandingen op. Sæt spidsen på enden af en 1 ml sprøjte, og skub spidsen ud af pipetten. Træk i sprøjtestemplet for at fylde blandingen i sprøjten, og tilsæt derefter et 0,2 μm filter på enden af sprøjten, og filtrer det ind i et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør. Den filtrerede prækursoropløsning centrifugeres centrifugeres for at fjerne de bobler, der produceres under filtreringen.
    5. Igen, ved hjælp af en P1000-pipette, skal du langsomt trække den filtrerede forløber op og være forsigtig med ikke at skabe bobler. Hvis der er bobler, skal du forsigtigt trykke på spidsen, så de kan løsne sig og flyde til toppen.
    6. Placer spidsen på enden af en 1 ml sprøjte, og skub spidsen ud af pipetten. Hold sprøjten lodret, og træk langsomt i sprøjtestemplet, indtil hele forløberopløsningen er i sprøjten. Tilsæt en stump spidsnål til sprøjten, og skub forløberen gennem nålens spids. Pak sprøjten ind i folie for at holde den ude af lyset.
  3. Fremstilling af mikrogel klemningsopløsning
    1. Forbered 5% v / v Span-80 i tung hvid mineralolie og bland godt. Udtørring for at fjerne bobler. Opbevar blandingen af overfladeaktivt stof og olie ved stuetemperatur indpakket i folie. Bland godt og udtørring inden hver brug.
    2. Brug en 5 ml sprøjte til at trække blandingen af olie/overfladeaktive stoffer op (minimer bobler), indtil afstanden mellem stemplet og fingergrebet er omtrent lig med afstanden til forløbersprøjten. Tilsæt en stump nål til sprøjten og skub olien gennem spidsen af nålen.
  4. Opsætning af mikrofluidisk enhed
    1. Tilsæt en stump nål til en 1 ml sprøjte og fyld med syntetisk hydrofob behandlingsopløsning (se Materialetabel). Flydende forsigtigt opløsningen gennem den mikrofluidiske enhed, indtil den samler sig ved hvert indløb / udløb. Lad opløsningen tørre i enheden på bordpladen i ca. 30 minutter, og træk derefter vakuum på stikkontakten for at fjerne overskydende opløsning. Fastgør enheden med klemmer på et bordmikroskop.
    2. Pak et 15 ml konisk rør med folie og læg det i et rørstativ for at tjene som mikrogelopsamlingsbeholder. Brug et ringstativ med en klemme til at placere UV-lyssonden i åbningen af opsamlingsrøret. Brug en UV-detektor (se Materialetabel) til at måle UV-intensiteten, og flyt sonden til 20 mW/cm2 er opnået. Sluk for UV-lyset til senere.
    3. Skær slanger i en længde, der når fra den mikrofluidiske enhed til opsamlingsbeholderen. I den ene ende af slangen skæres en vinkel på 45°. Indsæt forsigtigt den vinklede ende af slangen i udløbskanalen.
      BEMÆRK: Vær forsigtig, når du indsætter slangen i den mikrofluidiske enhed. Tårer eller revner omkring indløbs- eller udløbskanalerne kan forårsage lækager under mikrogelproduktion.
    4. Fastgør både forløber- og oliefasesprøjter på en pumpe med dobbelt sprøjte (se Materialetabel). Skær yderligere to stykker slanger i en længde, der når fra sprøjtespidserne til den mikrofluidiske enhed. I den ene ende af hvert rør skæres en vinkel på 45°. Fastgør forsigtigt slangen (stump ende) på begge sprøjtespidser.
    5. Skift indstillingerne på pumpen for 1 ml sprøjten, og inkluder det omtrentlige forløbervolumen. Skub langsomt pumpen fremad, indtil der påføres tilstrækkeligt tryk på sprøjtestemplet til at skubbe både olien og forløberen til enderne af slangen og fjerne luft fra systemet. Lad trykket udligne 5-10 min inden du går videre til trin 2.4.6.
    6. Indsæt forsigtigt den vinklede ende af slangen i indløbskanalerne på den mikrofluidiske enhed med mikrogelprecursoropløsningen i det forreste indløb og klemolien i bagindløbet. Flyt pumpen fremad i små trin, indtil strømmen begynder i enheden, og sfæriske mikrogeler begynder at danne sig ved strømningsfokuseringsområdet. Start pumpen med en flowhastighed på 0,4 μL/min., og lad enheden køre, indtil den stabiliserer sig. Hvis det er nødvendigt, justeres strømningshastigheden ±0,1 μL/min i små trin for at stabilisere mikrogelproduktionen.
    7. Når mikrogelproduktionen stabiliseres som vist i figur 1B, skal du udskifte opsamlingsrøret med et nyt rør og tænde UV-lyset. Kontroller kørslen med jævne mellemrum for at sikre, at mikrogelproduktionen er stabil i løbet af kørslen.

Figure 1
Figur 1: Mikrofluidisk produktion af hyaluronsyre (HA) mikrogeler med norbornene (NB) funktionelle håndtag. (A) Ca. 31% af HA-gentagelsesenhederne blev med succes modificeret med NB, som bestemt ved proton NMR-analyse udført i deuteriumoxid. 1 H NMR-skift af vedhæng norbornener ved δ6.33 og δ6.02 (vinylprotoner, endo) og δ6.26 og δ6.23 ppm (vinylprotoner, exo) blev sammenlignet med HA-methylgruppen δ2.05 ppm for at bestemme funktionalisering. Genoptrykt fra Anderson et al.12 med tilladelse fra Elsevier. (B) Skematisk af den flowfokuserede mikrofluidiske enhed, der anvendes til at generere HA-NB μgels. (C) Maksimale intensitetsfremskrivninger fra konfokal mikroskopi blev brugt til at visualisere fluorescerende mærkede μgels (skala bar = 500 μm). (D) Frekvensfordelinger af mikrogeldiameter fra uafhængige kørsler på den mikrofluidiske opsætning demonstrerer kontrol over mikrogelstørrelse ~ 50 μm eller ~ 100 μm afhængigt af den anvendte enhed. (E) Microgeldiameter rapporteres som middel- og standardafvigelse for hver uafhængig kørsel. Genoptrykt fra Wilson et al.9 med tilladelse fra Wiley. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Rensning og tørring af mikrogeler

  1. Oprensning af mikrogeler
    1. Forbered mikrogelvaskebufferen (300 mM HEPES, 50 mM NaCl, 50 mM CaCl 2) samt2% (w/v) Pluronic F-127 overfladeaktivt stof opløsning i vaskebuffer. Steriliser opløsningerne ved hjælp af et 0,2 μm vakuumdrevet filter.
    2. Centrifuge mikrogelopsamlingsrøret (5.000 x g) i 5 min. I en steril hætte skal du forsigtigt opsuge supernatantoliefasen. Kombiner μgels 1:1 med 2% Pluronic F-127 overfladeaktivt stof opløsning og hvirvel for at blande godt. Centrifuge (5.000 x g) i 5 minutter og opsug supernatantvaskeopløsningen.
    3. Tilsæt vaskebuffer ved 4x mikrogelvolumen og hvirvel for at blande godt. Centrifuge (5.000 x g) blandingen i 5 min og opsug vaskeopløsningen. Komplet 4-8 vasker med vaskebufferen, indtil det overfladeaktive stof fjernes fra systemet (dvs. der er ingen bobler tilbage).
  2. Fluorescerende mærkning af HA-NB mikrogeler
    BEMÆRK: Den interne syntese af et fluorescerende mærket tetrazin er afhængig af to basekatalyserede thiol-Michael-additionsreaktioner i serier, der er velbeskrevet og tidligere rapporteret3. Til dette arbejde blev Alexa Fluor-488 konjugeret med tetrazin til mærkning af norbornenmodificerede μgeler. Det frysetørrede produkt (Alexa Flour 488-Tet) blev opløst i dimethylformamid ved 1 mg/ml og opbevaret ved -20 °C.
    1. For at fluorescere μgelerne skal du først forberede en arbejdsløsning af Alexa Fluor 488-Tet ved at fortynde 1 mg / ml lager 1:14 i steril 1x PBS. I en steril hætte kombineres μgelerne med arbejdsløsningen (2: 1 volumen).
    2. Brug en forskydningspipette og bland godt. Blandingen inkuberes i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
    3. Der centrifugeres (5.000 x g) og opsuges farvningsopløsningen. Vask μgelerne to gange med 1x PBS (1:1 volumen) for at fjerne ureageret Alexa Fluor 488-Tet.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt kan de fluorescerende mærkede μgeler afbildes på et konfokalmikroskop for at kvantificere mikrogelstørrelsen (figur 1C-E)9. Metoder til måling af mikrogelstørrelse er blevet grundigt beskrevet af Roosa et al.17.
  3. Tørring af HA-NB mikrogeler
    1. Overfør rensede μgeler (figur 2A) til et kryosikkert skruelågsrør ved hjælp af en positiv forskydningspipette. Tilsæt 70% ethanol til de rensede μgeler 50% (v/v) og bland godt med en forskydningspipette. Centrifuge i 5 min ved 5.000 x g.
      FORSIGTIG: Ethanol er et meget brandfarligt stof.
      BEMÆRK: Det kryosikre skruelågsrør kan vejes inden tilsætning af μgeler og derefter vejes igen efter frysetørring for at bestemme massen af μgeler. Dette anbefales for at minimere fejl ved brug af mængder mindre end 1 mg. Sørg for, at vægten er justeret eller kalibreret internt inden brug.
    2. Supernatantvæsken aspireres og erstattes med 70% ethanol (50% v/v) (figur 2B). Bland godt med en forskydningspipette. Inkuberes natten over ved 4 °C.
      BEMÆRK: Microgels kan opbevares i 70% ethanol ved 4 ° C før frysetørring til langtidsopbevaring, hvis det er nødvendigt. Frysetørrede mikrogeler er vist i figur 2C. Andre lyofiliseringsmedier kan bruges i dette trin, hvis kryogeldannelse ønskes (figur 2D).
    3. Centrifuge kort for at sikre, at μgelerne er i bunden af skruelågsrøret. Tilsæt flydende nitrogen til en kryogen beholder, og tilsæt derefter røret med μgeler til flashfrysning.
    4. Efter 5-10 minutter fjernes røret med μgels med tang. Fjern hurtigt hætten og dæksel med et væv af laboratoriekvalitet. Fastgør vævet med et gummibånd og overfør til en frysebeholder eller et kammer.
    5. Læg prøven på fryseapparatet efter producentens anvisninger. Fryser ved 0,066 Torr og -63 °C. Opbevar de frysetørrede μgeler (lyo-μgels) tæt forseglet ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Frysefilisering er afsluttet, når al væske fjernes fra røret, og et tørret produkt forbliver. Organiske opløsningsmidler kan reducere levetiden for gummiarmaturerne på almindelige lyofiliseringssystemer.

Figure 2
Figur 2: Tørring af HA-NB mikrogeler. (A) Maksimal intensitetsprojektion af μgeler i vandig opløsning (skalabar = 100 μm). (B) Oprensede μgeler kan inkuberes 1: 1 volumen i det valgte lyofiliseringsmedium og frysefiliseres. (C) Maksimal intensitetsprojektion af tørrede lyo-μgels (skalabar = 100 μm). (D) Microgels suspenderes igen efter frysetørring. EtOH (70%) anbefales til at bevare μgelernes oprindelige egenskaber gennem hele frysekopieringsprocessen; andre medier såsom isopropylalkohol (IPA), vand og acetonitril (MeCN) kan dog bruges om hverandre til at lette kryogeldannelse (skalabar = 100 eller 50 μm som nævnt). (E) Måling af HA-NB mikrogeldiameter før (grå) og efter lyofilisering (grøn) i 70% EtOH vist som frekvensfordelinger for tre mikrogelpopulationer. Genoptrykt fra Anderson et al.12 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. MAP stillads fabrikation

  1. Tetrazin linker syntese
    BEMÆRK: Tetrazinlinkere kan bruges til at forbinde μgeler med frie norbornengrupper (figur 3A). HA-tetrazin (HA-Tet) synteseprocedure blev tilpasset fra Zhang et al.18 ved anvendelse af 79 kDa natrium HA med molære ækvivalenter på 1: 1: 0.25 af HA-gentagelsesenheder til DMTMM til tetrazin-amin (figur 3B)12.
    1. Vej reaktanterne. HA opløses ved 20 mg/ml i 200 mM MES-buffer (pH ~6) under omrøring i et bægerglas eller en kolbe på en omrøringsplade. Når DMTMM er opløst, tilsættes den til HA-opløsningen, og der reageres i ca. 20 minutter ved stuetemperatur. For eksempel kan 100 mg HA + 72,8 mg DMTMM + 14,14 mg tetrazin-amin anvendes.
    2. Tetrazinaminen opløses ved 15 mg/ml i 200 mM MES-buffer, og der tilsættes dråbevis til HA/DMTMM-opløsningen. Se figur 3C for HA-Tet-reaktionsopsætningen.
    3. Tilsæt parafilm til åbningen af reaktionsbeholderen for at minimere fordampningen, og dæk reaktionsbeholderen med folie. Fortsæt omrøringen, mens reaktionen tillades i ca. 24 timer.
    4. Efter 24 timer afkøles 200 bevis ethanol (ca. 10x reaktionsvolumen). På en omrøringsplade overføres reaktionen dråbevis til den afkølede ethanol for at udfælde HA-Tet (figur 3D) og fortsætte omrøringen i 20 minutter.
    5. Opløsningen overføres til 50 ml koniske rør, og centrifugeres derefter ved 5.000 x g i 10 min. Hæld overskydende ethanol af for at bortskaffe som affald. Træk vakuum på HA-Tet i en dessicator for at tørre natten over. Et eksempel på det tørrede produkt på dette trin i protokollen findes i figur 3E.
    6. Rens HA-Tet ved hjælp af dialyse. HA-Tet opløses i 2 M NaCl-opløsning, og der overføres til cellulosedialyserør med en afskæring på 12-14 kDa molekylvægt. Overfør den fyldte dialyseslange til en spand med 5 liter ultrarent vand, og dialyser HA-Tet mod vand natten over.
    7. Den næste dag fjernes vandet og udskiftes med 1 M NaCl-opløsning i 30 min. Fjern NaCl-opløsningen, og dialysér derefter mod ultrarent vand i 3 dage, og udskift vandet dagligt.
    8. Det dialyserede produkt filtreres ved hjælp af 0,2 μm vakuumdrevet filter, og overfør derefter det filtrerede HA-Tet-produkt til 50 ml koniske rør.
    9. Flash-frys de koniske rør i flydende nitrogen i 10 minutter, og fjern derefter de koniske rør med tang. Fjern hurtigt hætten og dæksel med et væv af laboratoriekvalitet. Fastgør vævet med et gummibånd og overfør til en frysebeholder eller et kammer og lyofiliser. Opbevar det frysetørrede produkt (figur 3F) ved -20 °C.
    10. Tetrazinmodifikation opgøres ved at opløse HA-Tet ved 10 mg/ml iD2O og analysere via proton NMR (figur 3G)16.
      1. For at bestemme mængden af funktionalisering skal du først kalibrere D2O-opløsningsmiddeltoppen til 4,8 PPM. Integrer toppen for HA-methylprotonerne (δ2.05), og kalibrer integrationen til 3.0. Integrer derefter toppe for vedhængstetrazingrupperne ved δ8,5 (2H) og δ7,7 (2H) (aromatiske protoner). Normaliser integrationen af disse toppe til det tilsvarende antal protoner for at bestemme den gennemsnitlige grad af modifikation12.
  2. Sammenkobling af lyo-μgels for at danne MAP-stilladser til karakterisering
    1. Forbered MAP-stilladskomponenterne (dvs. μgels, HA-Tet, rehydreringsvolumen). Lyo-μgels (figur 4A) vejes og rekonstitueres i 84% af det endelige MAP-volumen på 1x PBS. Lad mikrogelerne svulme op i ca. 20 minutter (figur 4B,C). Wt% MAP, der anvendes til rehydrering, kan vælges ud fra brugerens præference for den endelige partikelfraktion (se figur 4D, E).
    2. HA-Tet opløses i 1x PBS i den valgte koncentration (se BEMÆRK nedenfor).
      BEMÆRK: Ændring af både pakningsfraktionen (via wt% MAP) samt koncentrationen af HA-Tet vil ændre bulkstillads mekaniske egenskaber. For eksempel genererer et 3,4 vægt% MAP-stillads tværbundet med 0,02 mg/ml HA-Tet (udglødningsforhold på 2,6 mol Tet:mol HA-NB) MAP-stilladser med ca. 700 Pa forskydningslagringsmodul12.
    3. Brug en forskydningspipette til at kombinere HA-Tet og lyo-μgels og bland godt. På dette tidspunkt kan blandingen overføres via forskydningspipette til glasrutschebaner, brøndplader eller en beholder efter brugerens valg. Lad μgels gløde ved 37 °C i 25 minutter, og brug derefter en spatel til at overføre MAP-stilladserne til brøndplader fyldt med 1x PBS. Opbevar MAP-stilladser i 1x PBS, indtil de er klar til karakterisering.
  3. Beregning af MAP stillads partikelfraktion
    1. For forbedret billedkvalitet skal du overføre MAP-stilladset til en glasdæksel ved hjælp af en spatel. Billede MAP stilladser på et konfokalt mikroskop ved hjælp af laseren til FITC excitation og emission. Billede MAP stilladser på et 20x mål og opnå en Z-stack, der krydser 250-300 μm i Z-retning med en trinstørrelse på 2,5 μm. Noter μm / pixelkalibreringen af billedet.
    2. Importer Z-stack-billedet til analysesoftwaren (se Materialetabel). Vælg knappen Tilføj nye overflader . Markér afkrydsningsfeltet for kun at segmentere et interesseområde, og vælg derefter den blå pileknap Næste: Interesseområde.
    3. Definer et interesseområde, og hold styr på X-, Y- og Z-dimensionerne for det volumen, der analyseres. Vælg den blå pileknap Næste: Kildekanal.
      BEMÆRK: X- og Y-dimensioner er i enheder af pixels, mens Z-dimensionen er antallet af trin. En anbefalet Z-højde for interesseområdet bør omfatte mindst to μgeler.
    4. Brug rullelisten Kildekanal til at vælge FITC-kanalen. Marker afkrydsningsfeltet ud for Glat og indtast en overfladedetalje på 2,50 μm. Under Tærskel skal du vælge Absolut intensitet og derefter vælge den blå pileknap Næste: Tærskel.
    5. Brug den foreslåede tærskelværdi for FITC-kanalen. Drej 3D-projektionen for at vurdere gengivelseskvaliteten og justere efter behov. Vælg Næste: Klassificer overflader.
      BEMÆRK: Knappen Tilbage kan bruges til at redigere tidligere trin i processen, såsom Z-dimension, efter behov.
    6. Kontroller, om antallet af Voxels er 10,0, og vælg derefter den grønne dobbelte pileknap Udfør : Udfør alle oprettelsestrin og afslut guiden.
      BEMÆRK: Volumengengivelsesparametre kan gemmes til batchanalyse, så de samme indstillinger anvendes til at analysere alle stilladserne.
    7. Hvis du vil eksportere dataene, skal du vælge fanen Statistik og derefter fanen Detaljeret . Brug den anden rulleliste til at vælge variablen Lydstyrke. Vælg disketteknappen Eksporter statistik på fanevisning til fil , og gem som en regnearksfil (.xls), når du bliver bedt om det.
    8. Åbn filen, og brug SUM-funktionen på kolonne A-volumen til at bestemme det samlede volumen (μm3) af μgelerne i interesseområdet.
    9. Konverter dimensionerne af det interesseområde, der blev analyseret fra pixels til μm. Brug μm/pixel-kalibreringen af billedet fra trin 4.3.1 til at konvertere X- og Y-dimensionerne. Multiplicer Z-dimensionen (antal trin) med trinstørrelsen for billedet for at konvertere Z-dimensionen til μm. Beregn volumenet af interesseområdet (μm3) ved at gange X-, Y- og Z-dimensionerne.
    10. For at bestemme stilladsets partikelfraktion divideres det samlede volumen af μgelerne i interesseområdet (fundet i trin 4.3.8) med volumenet af interesseområdet (fundet i trin 4.3.9).

Figure 3
Figur 3: Syntese af tetrazinlinker til fremstilling af mikroporøse udglødede partikler (MAP) stilladser. A) Skematisk for HA-NB-μgels, der er forbundet med en tetrazinlinker for at danne MAP-stilladser. (B) Reaktionsskema for HA-Tet-syntese. (C) HA-Tet-reaktionen blev opsat og fik lov til at reagere natten over efterfulgt af (D) udfældning af HA-Tet i ethanol. (E) Når HA-Tet var renset og tørret, blev det rehydreret og frysetørret for at give (F) et tørret, lyserødt produkt. (G) Proton NMR-analyse viser vellykket modifikation af 11% af HA-gentagelsesenheder. Genoptrykt fra Anderson et al.12 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Rehydrering af frysetørrede mikrogeler til fremstilling af MAP-stilladser. (A) Maksimal intensitetsprojektion af tørrede lyo-μgeler (skalabar = 100 μm). (B) Efter frysetørring viser det sig, at rehydrering af lyo-μgels tager ca. 20 minutter (skalabar = 100 μm). (C) Lyo-μgels kan rehydreres med varierende vægt% MAP for at producere fastklemte μgeler (skalabar = 100 μm). (D) Forøgelse af wt% MAP ved rehydrering af lyo-μgels ændrer partikelfraktionen i MAP-stilladser, som vist ved enkelte Z-skiver af MAP-stilladser og volumenprojektioner (skalabjælke = 100 μm). (E) Ved hjælp af disse brugerdefinerede wt% MAP-stilladser kan der opnås unikke partikelfraktioner (NL = ikke-frysetørrede μgeler). En envejs ANOVA med Tukey HSD blev udført på prøverne (n = 3), med signifikans rapporteret ved p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,005 (***) og p < 0,001 (****). Genoptrykt fra Anderson et al.12 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.

5.3D cellekultur i kortstilladser

  1. Forbered cellekulturenheder
    1. Hvis du vil oprette en brugerdefineret cellekulturenhed til disse eksperimenter (figur 5A-C), skal du bruge en 3D-printer til at udskrive en negativ form ved hjælp af CAD-filen, der findes i supplerende kodningsfil 1.
      BEMÆRK: Dimensionerne på cellekulturenheden er som følger: 94,9 mm x 94,9 mm x 4,8 mm med 2,6 mm total brøndhøjde. Diameteren af de indre brønde og ydre brønde er henholdsvis 4 mm og 6 mm.
    2. Bland polydimethylsiloxan (PDMS) elastomerbase med hærdningsmidlet i et masseforhold på 10: 1. Hæld PDMS-blandingen i en stor petriskål af plast og afgass i en ekssikkator i ca. 30 minutter, eller indtil alle boblerne er forsvundet.
    3. Når alle boblerne er forsvundet, skal du forsigtigt placere den 3D-printede form i PDMS for at minimere dannelsen af nye bobler. Anbring i ovnen ved 60 °C i mindst 2 timer for at hærde PDMS.
    4. Brug en kniv eller barberblad til forsigtigt at spore omkring kulturenhedens parameter, og fjern derefter formen forsigtigt. Brug en 4 mm biopsistans til at fjerne eventuelle PDMS fra bunden af brøndene. Skær enhederne, så de passer på en glasdæksel.
      BEMÆRK: Cellekulturenheder kan også limes til glasglas, men glasdæksler forbedrer prøvebilleddannelsen.
    5. Brug tape til at fjerne støv fra bunden af kulturenhederne. Anbring de rene glasdæksler og dyrkningsanordninger (nederst opad) på en kogeplade ved 135 °C i mindst 15 minutter for at fjerne fugt.
    6. I en røghætte skal du bruge en koronaplasmapistol højt på både glasdækslet og undersiden af enheden i 30 s, og derefter hurtigt binde de behandlede overflader sammen. Påfør forsigtigt tryk for at sikre en god tætning mellem kulturenheden og glasdækslet.
    7. Gentag trin 5.1.6 for alle enheder, og sæt derefter i en ovn på 60 °C natten over for at sikre bindingen. Autoklave enhederne til sterilisering før brug in vitro.
  2. Cellekultur i MAP-stilladser
    1. Forbered MAP-stilladskomponenterne (dvs. μgels, HA-Tet, medievolumen) baseret på den ønskede partikelfraktion (se figur 4D-E). Lyo-μgels vejes i en steril hætte og rekonstitueres i 84% af det endelige MAP-volumen af cellemedier baseret på den valgte wt% MAP. Lad μgelerne svulme op i ca. 20 min.
      BEMÆRK: Disse metoder kræver, at brugeren vejer lyo-microgel-produktet til rehydrering. For små masser (1 mg eller mindre) foreslås det først at veje kryotubet, før der tilsættes og fryser μgels, og derefter veje røret igen efter lyofilisering for at bestemme produktets masse for at minimere fejl.
    2. OPLØS HA-Tet i cellemedier i 16% af det endelige MAP-volumen.
      BEMÆRK: Følgende trin til forberedelse af celler til såning i MAP-stilladser kan ændres afhængigt af den celletype, der bruges. I denne protokol blev D1 musemesenkymale celler dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 1% penicillin-streptomycin (pen-strep) og 10% føtalt bovint serum (FBS) (se materialetabel). Standard klæbende cellekulturprotokoller bør følges for disse celler, hvor kulturerne opretholdes ved 37 °C og 5% CO2 i vævskulturbehandlede kulturbeholdere.
    3. Når D1 mus mesenkymale celler har nået 70% -80% sammenløb, aspirere medierne og vaske cellerne med 1x PBS. Løft cellerne ved at tilføje nok volumen på 1% trypsin-EDTA til at dække til overfladen af vævskulturbeholderen. Inkuberes ved 37 ° C i 1-3 minutter, og slukkes derefter trypsiniseringen ved at tilføje DMEM-medier suppleret med 1% pen-strep og 10% FBS ved 2x volumenet af trypsin-EDTA.
    4. Centrifuger cellesuspensionen ved 100 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne. Aspirer supernatantmediet og resuspend cellerne i 1 ml DMEM-medier suppleret med 1% pen-strep og 10% FBS.
    5. Sørg for, at cellesuspensionen er godt blandet, og overfør derefter 20 μL til et nyt mikrocentrifugerør. Tilsæt 20 μL trypanblå opløsning og bland godt. Brug 20 μL af denne blanding til at tælle cellerne ved hjælp af enten et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller med celletællingskammerdias.
    6. Overfør antallet af celler, der er nødvendige til såning af 10.000 celler / μL MAP til et nyt mikrocentrifugerør. Centrifuge ved 100 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at pelletere cellerne. Opsug forsigtigt supernatantmediet fra cellepelleten uden at opsuge cellerne.
    7. Tilsæt μgels og tværbinding til cellepellet med en forskydningspipette. Bland godt med en forskydningspipette, og frø derefter 10 μL af blandingen pr. Brønd. Ved plettering, pipetter i en cirkulær bevægelse for jævnt at fordele blandingen i brønden.
    8. Lad μgelerne gløde ved 37 °C i celleinkubatoren i 25 minutter, før der tilsættes cellemedier for at fylde brøndene (~ 50 μL medier pr. Brønd). Bevar 3D-kulturerne ved 37 °C, og skift medier efter behov. For at undgå at aspirere stilladset, når du skifter medie, skal du stabilisere pipettespidsen langs ryggen af den øverste brønd.
      BEMÆRK: Når du tilføjer eller fjerner væske fra kulturbrøndene, skal du hvile enden af pipettespidsen på afsatsen over MAP-stilladset for at minimere risikoen for at forstyrre eller aspirere stilladset fra brønden.
    9. På de ønskede tidspunkter fikseres prøver ved at fjerne mediet og tilsætte 50 μL 4% paraformaldehyd pr. brønd i 30 minutter ved stuetemperatur. Prøverne vaskes 3x med 50 μL 1x PBS eller foretrukken buffer. På dette tidspunkt i protokollen kan standardmetoder til immunfluorescens eller fluorescensfarvning følges ved hjælp af 50 μL pr.
      BEMÆRK: Disse metoder til fiksering og cellefarvning beskriver specifikt brugen af fluorescerende pletter; Immunostaining med primære og/eller sekundære antistofkonjugationer kan dog også udføres i disse stilladser efter producentens anvisninger ved hjælp af 50 μL som arbejdsvolumen pr. brønd.
    10. Billedceller i MAP-stilladser på et konfokalmikroskop ved hjælp af et 20x mål og opnår en Z-stak, der krydser 200-250 μm i Z-retningen med en trinstørrelse på 2,5 μm. Et eksempel på fluorescensfarvning med DAPI (nuklear plet fortyndet 1:1000 i 0,15% Triton-X i 1x PBS) og phalloidin-647 (F-actin-plet fortyndet 1:40 i 0,15% Triton-X i 1x PBS) er vist i figur 5E, F med faste D1-celler dyrket i MAP-stilladser i 3 dage.
      BEMÆRK: Plasmabehandling af glasoverflader resulterer i øget hydrofilicitet, hvilket har vist sig at forbedre celleadhæsion. Celler vil sandsynligvis blive observeret spredt langs bunden af cellekulturbrøndene, men bør ikke medtages i celletællinger eller cellevolumenkvantificering til vurdering af cellerespons i MAP-stilladser.

Figure 5
Figur 5: Cellekultur i MAP-stilladser. (A) Formen til oprettelse af cellekulturbrønde kan 3D-printes og støbes med PDMS. Hele formen er 95 mm i diameter, de store brønde er 6 mm i diameter, og de små indvendige brønde er 4 mm i diameter. (B) Når de er støbt med PDMS, er cellekulturanordningerne plasmabundet til dækslips for forbedret mikroskopikapacitet. (C) Tværsnittet af en cellekulturbrønd viser reservoiret for cellemedier (~ 50 μL) og et mindre reservoir til såning af MAP-stillads med celler (~ 10 μL). (D) Processen med såning af celler i MAP-stilladser er først afhængig af rehydrering af lyo-μgels ved brugerens ønskede vægt%, efterfulgt af blanding med celler og tværbindingen til sammenkobling af μgelerne. (E) Celler kan indkapsles i MAP-stilladser (grøn) med varieret wt% MAP. Repræsentative billeder er fra dag 5 af D1-cellekultur i MAP-stilladser (skalabjælke = 100 μm). (F) Enkelte Z-skiver viser forskelle i cellevækst i stilladser, der omfatter forskellige wt% MAP (skala bar = 50 μm). Genoptrykt fra Anderson et al.12 med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med denne protokol er at demonstrere fremstillingen af mikroporøse udglødede partikler (MAP) stilladser med et bioortogonalt tværbindingsskema samt kontrollerede partikelfraktioner til 3D-cellekultur. For det første blev HA modificeret med norbornene vedhængsgrupper, der skulle bruges i både mikrogeldannelse og sammenkobling til dannelse af MAP-stilladser. Ved hjælp af disse metoder blev ca. 31% af HA-gentagelsesenhederne med succes modificeret med et norbornen funktionelt håndtag (figur 1A). Mikrofluidiske enheder med et flowfokuserende område (figur 1B) viste sig at producere HA-NB μgeler på enten ~ 50 μm eller ~ 100 μm i diameter (figur 1C, D). De μgeler, der blev brugt i resten af dette arbejde, havde en gennemsnitlig diameter på 92 μm (Q1 = 79 μm, Q3 = 103 μm) (figur 1E).

For at kontrollere partikelfraktionen blev μgeler tørret via lyofilisering (figur 2A-C) for at producere et produkt, der kunne vejes af brugeren og rehydreres for at opnå hævede μgeler. Mediet til lyofilisering af μgelerne blev optimeret til at forhindre kryogeldannelse (dvs. interne defekter) ved at anvende 70% ethanol, men det er også blevet påvist, at kryogeler blev opnået ved hjælp af andre medier til lyofilisering, hvis kryogel ønskes af brugeren (figur 2D). En omfattende undersøgelse af forskellige lyofiliseringsmedier til dannelse af mikrogel kryogel kan findes i arbejdet af Anderson et al.12. Ved hjælp af konfokal mikroskopi blev HA-NB-mikrogeldiameteren kvantificeret både før og efter frysefilisering med 70% ethanol (figur 2E), hvilket ikke indikerede nogen signifikant ændring i mikrogelstørrelse med denne tørringsproces.

For at lette bio-ortogonal sammenkobling af HA-NB μgels blev en lineær HA-Tet tværbinding syntetiseret (figur 3). Proton NMR-spektroskopi viste vellykket modifikation af 11% af HA-gentagelsesenheder med en tetrazin-vedhængsgruppe ved hjælp af de trin, der er beskrevet i dette arbejde (figur 3G), og reaktionsudbyttet var 95%. Ved hjælp af HA-Tet-linkeren blev det tørrede lyo-mikrogelprodukt (figur 4A) rehydreret med specificerede volumener for at opnå forskellige wt% (w/v) formuleringer af μgeler (figur 4B, C) i MAP-stilladser fra 10 μL (4 mm diameter) til 50 μL (8 mm diameter) i størrelse til henholdsvis cellekulturforsøg og materialekarakterisering. Disse brugerdefinerede vægt% af μgels i MAP-stilladser svarede til unikke partikelfraktioner i stilladserne (figur 4D,E).

Denne protokol beskrev også processen for såning af celler i MAP-stilladser til 3D-kultur (figur 5D) ved hjælp af bioortogonale udglødningsordninger. Lyo-μgelerne blev rehydreret ved den ønskede wt% i cellemediet og derefter blandet med cellepellet og HA-Tet til sammenkobling af μgelerne. Denne blanding blev derefter belagt i cellekulturanordninger (figur 5A-C) for at give celler indkapslet i tomrummet mellem μgeler i MAP-stilladser. Celler i 3D-kultur i MAP-stilladser blev fastgjort på dag 5, farvet og afbildet på et konfokalmikroskop som vist i figur 5E. Et eksempel på cellerne i tomrummet på MAP-stilladserne for forskellige wt% formuleringer er vist i figur 5F.

Supplerende kodningsfil 1: CAD-fil, der bruges til at 3D-udskrive formen til cellekulturenheder. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrofluid produktion af HA-NB mikrogeler har vist sig at generere mikrogeler med et snævrere interval af størrelsesfordeling end emulsionsbatchproduktion 3,9. De mikrogeler, der er beskrevet i denne protokol, blev formuleret ved hjælp af en MMP-spaltet tværbinding (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) for at understøtte materialeforringelse. HA-NB-mikrogeler kan dog også tværbindes ved hjælp af en alternativ di-thiol-linker såsom dithiothreitol (DTT), som ikke er nedbrydelig. Tilsvarende kan andre fotoinitiatorer, såsom Irgacure 2959 2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon, anvendes i HA-NB-forløberen i stedet for LAP for at lette thiol-ene tværbinding10. Disse mikrogeler var sammensat af 3,5 vægt% HA baseret på et tidligere arbejde, der viste, at viskositeten af en 3,5 vægt% forløberopløsning var egnet til klemning i dråber på en mikrofluidisk platform6. Andre har beskrevet HA-NB mikrogelfabrikation på flowfokuserende mikrofluidiske enheder ved hjælp af formuleringer med lavere vægt% (3 vægt% HA-NB) samt 8,10,11. Mens denne metode er gavnlig til fremstilling af mikrogelpopulationer med lav polydispersitet, er den mere tids- og arbejdskrævende end batchemulsionsteknikker, der også kan bruges til HA-NB-mikrogelproduktion3.

Microgel-lyofiliseringsprocessen er afhængig af frysning af tværbundne polymernetværk. Defekter kan opstå under frysning, når krystalstrukturer i lyofiliseringsmediet dannes og fungerer som porogener, og de resulterende kryogeler udviser forbedret porøsitet og forskellige mekaniske egenskaber sammenlignet med det originale materiale19,20. Til dato har der været beskrevet metoder til frysetørrende mikrogeler, der forhindrer kryogeldannelse for polyethylenglycol (PEG)13, GelMa 14 og HA-formuleringer12 ved hjælp af forskellige medier til frysetørring. Til denne protokol kunne brugeren udveksle 70% ethanol med et andet lyofiliseringsmedium efter eget valg, hvis kryoger ønskes. Mens kryogeler kan være fordelagtige til nogle applikationer, blev 70% ethanol fremhævet i denne protokol som lyofiliseringsmediet, fordi det er et almindeligt laboratoriereagens, det inkorporerer fordelen ved sterilisering i processen med MAP-fabrikation, og det gør det muligt for HA-mikrogelerne at bevare deres oprindelige størrelse, form og stivhed, samtidig med at de minimerer interne defekter, når de er rehydreret12 . Ud over disse vurderinger af mikrogelegenskaber kan miljøscanningselektronmikroskopi (SEM) implementeres som et potentielt værktøj til at vurdere mikrogelmorfologi før og efter lyofilisering.

De metoder, der er beskrevet i dette arbejde til tørring af HA-NB-mikrogeler, blev introduceret for at omgå variabiliteten i partikelfraktion og producere konsistente MAP-stilladser med brugerdefinerede wt% formuleringer. Undersøgelsen af kontrolleret partikelfraktion ved forskellige wt% rehydrering var begrænset til undersøgelsen af sfæriske mikrogeler. Andre mikrogelformer, såsom stænger8,21 eller uregelmæssige former10,22, er ikke blevet undersøgt for at vurdere forholdet mellem wt% MAP og partikelfraktion. Partikelfraktion er blevet vurderet i MAP-stilladser ved hjælp af konsistente andele af rehydrerede lyo-mikrogeler (84%) og HA-Tet crosslinker (16%) baseret på en tidligere undersøgelse2; disse fraktioner kan dog ændres efter brugerens skøn, så længe HA-Tet-volumenet er tilstrækkeligt til at opløse HA-Tet ved det ønskede tværbindingsforhold. Norbornen-tetrazin-klikkemireaktionen har været effektiv til udglødning af mikrogeler til dannelse af MAP-stilladser ved hjælp af bifunktionel23, multiarm3 samt den lineære12 tetrazinlinker beskrevet i disse metoder. Hvis det ønskes, kan molforholdet mellem Tet:HA-NB varieres for at opnå forskellige stivheder af bulk MAP-stilladserne12. Disse teknikker til rehydrerede lyo-mikrogeler er endnu ikke blevet vurderet for andre udglødningskemikalier ud over tetrazin-norbornen.

3D-cellekultur i MAP-stilladser er tidligere beskrevet med adskillige celletyper, såsom endotelceller8, fibroblaster 1,3,4,24, neurale stamceller9 og mesenkymale stamceller 25,26. Resterende ethanol blev observeret via proton NMR, efter at HA-NB-mikrogeler blev frysetørret i 70% ethanol; Det blev imidlertid også bekræftet, at spormængderne af ethanol ikke påvirkede cellelevedygtigheden12. Kultur i MAP-stilladser bestående af lyo-mikrogeler er hidtil kun påvist med mesenkymale stamceller fra mus12; denne protokol til såning af celler i MAP-stilladser med lyo-mikrogeler kan dog udskiftes med andre celletyper og deres tilsvarende cellemedier. For D1-cellekultur har F-actinintensitet og total cellevolumen vist sig at falde, da WT% MAP stiger12. Det har også vist sig, at forøgelse af wt% MAP svarer til en stigning i bulk stillads stivhed (ikke lokal mikrogel stivhed), da tomrummet mellem mikrogeler bliver mindre, hvilket fører til mindre celleproliferation i høj wt% MAP stilladser12.

Dette arbejde beskrev metoder til fremstilling af HA-NB-mikrogeler på en mikrofluidisk platform efterfulgt af frysetørring af mikrogelerne for enten at bevare de oprindelige mikrogelegenskaber eller producere kryoger. Denne protokol skitserede syntesen af en tetrazinlinker, der bruges til at forbinde lyo-mikrogelerne, når de er blevet rehydreret med brugerdefinerede vægtprocenter for at skabe MAP-stilladser med kontrollerede partikelfraktioner. Endelig detaljerede dette arbejde trinene til dyrkning af celler i disse MAP-stilladser med brugerdefinerede mikroarkitekturer. Oprettelse af granulære stilladser med konsistente partikelfraktioner forbedrer reproducerbarheden af eksperimentelle resultater for MAP-brugere, der strækker sig ud over celleresponser på massetransport og mekaniske egenskaber samt12. MAP-stilladser, der genereres ved hjælp af disse teknikker, kan bruges fremadrettet til in vivo-applikationer . Brugen af et frysetørret produkt til fremstilling af granulatstilladser er gavnligt for at forbedre materialets holdbarhed og vil også være fordelagtigt for fremtidig oversættelse af MAP-stilladser til en klinisk indstilling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ARA og TS har indgivet et midlertidigt patent på denne teknologi.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke National Institutes of Health, National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) og National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568). Dette arbejde blev delvist udført på Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), et medlem af North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), som støttes af National Science Foundation (prisnummer ECCS-2025064) som en del af National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Forfatterne vil gerne takke laboratoriets tidligere post-doc Dr. Lucas Schirmer samt Ethan Nicklow for deres hjælp til at generere den 3D-printede enhed til cellekultureksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309628
5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimide Invitrogen A10254 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287 For staining cell culture samples
Aluminum foil VWR 89107-726
Biopsy punch with plunger, 1.0 mm Integra Miltex 69031-01
Biopsy punch, 4 mm Integra Miltex 33-34
Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped SAI Infusion Technologies B23-50
Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm Corning CLS430521
Calcium chloride VWR 1B1110 For microgel washing buffer
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume Rainin 17008609
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume Rainin 17008605
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume Rainin 17008608
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Centrifuge tube, 15 mL CELLTREAT 667015B
Centrifuge tube, 50 mL CELLTREAT 229421
Chloroform, ACS grade, Glass Bottle Stellar Scientific CP-C7304 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator ETP 11011
CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap Nunc 368632
D1 mouse mesenchymal cells ATCC CRL-12424 Example cell line for culture in MAP gels
DAPI Sigma-Aldrich D9542 For staining cell culture samples
Deuterium oxide, 99.9 atom% D Sigma-Aldrich 151882 For NMR spectroscopy
Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off Spectra/Por 132703 For purifying HA-NB and HA-Tet
Diethyl ether VWR BDH1121-4LPC For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Dimethylformamide Sigma-Aldrich 277056 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)  TCI-Chemicals D2919 For modifying HA
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861 Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich D6429-500ML For D1 cell culture
EMS Paraformaldehyde, Granular VWR 100504-162 For making 4% PFA
Ethanol absolute (200 proof) KOPTEC 89234-850
Fetal bovine serum (FBS) ATCC 30-2020 For D1 cell culture
Heating Plate Kopf Instruments HP-4M
Hemacytometer with coverglass Daigger Scientific EF16034F
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg Contipro N/A 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights.
IMARIS Essentials software package Oxford Instruments N/A Microscopy image analysis software
Infusion pump, dual syringe Chemyx N/A
Kimwipe Kimberly-Clark 34120
Laboratory stand with support lab clamp Geyer 212100
Liquid nitrogen Airgas NI 180LT22
Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate TCI-Chemicals L0290
Lyophilizer Labconco N/A Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol.
Methyltetrazine-PEG4-maleimide Kerafast FCC210 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) Fisher Scientific BP300-100 For modifying HA
Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 VWR 48393-106
Microfluidic device SU8 master wafer FlowJem Custom design made either in-house in clean room or outsourced
Mineral oil, heavy Sigma-Aldrich 330760
MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) GenScript N/A
5-Norbornene-2-methylamine TCI-Chemicals 95-10-3 For HA-NB synthesis
Packing tape Scotch 3M 1426
Parafilm Bemis PM996
PEG(thiol)2 JenKem Technology USA A4001-1 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL Thermo Fisher Scientific 15140122 For D1 cell culture
Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm Corning 351058
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 For washing HMPs
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010023
RainX water repellent glass treatment Grainger 465D20 Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment
RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) GenScript N/A
Rubber bands Staples 112417
Sodium chloride Chem-Impex 30070 For dialysis
Span 80 for synthesis Sigma-Aldrich 1338-43-8
Sylgard 184 Silicone Elastomer Electron Microscopy Science 4019862 polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices
Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter Cytvia 09-928-066
Tetraview LCD digital microscope Celestron 44347
Tetrazine-amine HCl salt Chem-Impex 35098 For HA-Tet synthesis
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Millipore Sigma 51805-45-9
Triton X-100 VWR 97063-864
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red Fisher Scientific 25-200-056 For lifting adherent cells to seed in MAP gels
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in Thomas Scientific 1204G82
UV curing system controller, LX500 LED  OmniCure 010-00369R
UV curing head, LED spot UV OmniCure N/A
UV light meter, Traceable VWR 61161-386
Vacuum dessicator Bel-Art 08-594-15C
X-Acto Z Series Precision Utility Knife Elmer's XZ3601W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  2. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  3. Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
  4. Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
  5. Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
  6. Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
  7. Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
  8. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
  9. Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921 (2022).
  10. Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  11. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2018).
  12. Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
  13. Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
  14. Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
  15. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  16. JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).
  17. Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119 (2022).
  18. Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
  19. Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
  20. Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
  21. Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
  22. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
  23. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  24. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  25. Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
  26. Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).

Tags

Bioengineering udgave 188
Kontrol af partikelfraktion i mikroporøse udglødede partikelstilladser til 3D-cellekultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, A. R., Segura, T.… More

Anderson, A. R., Segura, T. Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (188), e64554, doi:10.3791/64554 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter