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Bioengineering

Contrôle de la fraction de particules dans des échafaudages de particules microporeuses recuites pour culture cellulaire 3D

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64554
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Departments of Biomedical Engineering, Neurology, and Dermatology, Duke University

Summary

La minimisation de la variabilité de la fraction de particules dans les échafaudages granulaires facilite l’expérimentation reproductible. Ce travail décrit des méthodes de génération d’échafaudages granulaires avec des fractions de particules contrôlées pour des applications d’ingénierie tissulaire in vitro .

Abstract

Les microgels sont les éléments constitutifs des échafaudages de particules microporeuses recuites (MAP), qui servent de plate-forme à la fois pour la culture cellulaire in vitro et la réparation tissulaire in vivo . Dans ces échafaudages granulaires, la porosité innée générée par l’espace vide entre les microgels permet l’infiltration et la migration cellulaire. Le contrôle de la fraction vide et de la fraction particulaire est essentiel pour la conception d’échafaudages MAP, car la porosité est un signal bioactif pour les cellules. Les microgels sphériques peuvent être générés sur un dispositif microfluidique pour une taille et une forme contrôlées, puis lyophilisés à l’aide de méthodes empêchant la fracturation du réseau de polymères. Lors de la réhydratation, les microgels lyophilisés conduisent à des fractions de particules contrôlées dans les échafaudages MAP. La mise en œuvre de ces méthodes de lyophilisation sur microgel a conduit à des études reproductibles montrant l’effet de la fraction de particules sur la diffusion des macromolécules et la propagation cellulaire. Le protocole suivant couvrira la fabrication, la lyophilisation et la réhydratation de microgels pour contrôler la fraction de particules dans les échafaudages MAP, ainsi que le recuit des microgels par réticulation bio-orthogonale pour la culture cellulaire 3D in vitro.

Introduction

Les échafaudages à particules microporeuses recuites (MAP) sont une sous-classe de matériaux granulaires dans lesquels les blocs de construction en microgel (μgel) sont reliés entre eux pour former un échafaudage poreux en vrac. Avec la microarchitecture unique de ces échafaudages granulaires, la porosité innée générée par l’espace vide entre microgel sphérique interconnecté favorise l’infiltration cellulaire accélérée et la migration1. Les blocs de construction en microgel des échafaudages MAP peuvent être fabriqués à partir de polymères synthétiques et naturels avec des modifications chimiques2. Les méthodes décrites ici mettent spécifiquement en évidence l’utilisation de microgels composés d’un squelette d’acide hyaluronique (HA) modifié avec des poignées fonctionnelles de norbornène (NB). La poignée fonctionnelle NB sur le polymère HA supporte les réactions chimiques de clic pour former des microgels et les relier entre eux pour générer des échafaudages MAP 3,4. De nombreux schémas ont été utilisés pour relier les microgels entre eux (c’est-à-dire le recuit), tels que les réactions enzymatiques1, 5,6 à base de lumière et chimiques de clicsans additifs 3,7. La chimie du clic sans additif est décrite dans ce travail, en utilisant la conjugaison Diels-Alder à demande inverse tétrazine-norbornène pour interconnecter les microgels HA-NB.

Pour fabriquer des échafaudages MAP, les utilisateurs génèrent d’abord les blocs de construction de microgel en utilisant des émulsions inverses dans des systèmes discontinus ou dans des dispositifs microfluidiques, ainsi qu’avec la pulvérisation électrohydrodynamique, la lithographie ou la fragmentation mécanique2. La production de microgels sphériques HA-NB a été bien décrite et a déjà été rapportée à l’aide des techniques d’émulsiondiscontinue 2 et de génération de gouttelettes microfluidiques 8,9,10,11. Dans ce travail, des microgels sphériques HA-NB ont été générés sur une plate-forme microfluidique focalisant l’écoulement pour une taille et une forme contrôlées, comme décrit précédemment 8,9,10. Après purification, les microgels existent dans une suspension aqueuse et doivent être concentrés pour induire un état de coincement. Lorsqu’ils sont coincés, les microgels présentent des propriétés d’amincissement par cisaillement, ce qui leur permet de fonctionner comme des matériaux injectables qui remplissent l’espace1. Une méthode pour induire un état de bourrage consiste à sécher les microgels par lyophilisation, ou lyophilisation, puis à réhydrater ensuite le produit séché dans un volume contrôlé12. Alternativement, l’excès de tampon peut être éliminé de la boue de microgel par centrifugation sur une passoire ou par retrait manuel du tampon de la pastille de microgel, soit par aspiration, soit à l’aide d’un matériau absorbant. Cependant, l’utilisation de la centrifugation pour sécher les microgels peut générer une gamme très variable de fractions de particules et de fractions de vide lors de la fabrication d’échafaudages granulaires12. Des techniques de lyophilisation des microgels ont été décrites en utilisant 70% d’IPA pour les microgels de polyéthylène glycol (PEG)13, des huiles fluorées pour les microgels méthacryloyl (GelMa) 14 et 70% d’éthanol pour les microgels HA12. Ce protocole met en évidence des méthodes de lyophilisation de microgels HA sphériques utilisant de l’éthanol à 70%, un réactif de laboratoire standard, afin de conserver les propriétés originales du microgel pendant le processus de séchage. Les microgels HA lyophilisés peuvent être pesés et réhydratés à des pourcentages pondéraux définis par l’utilisateur pour contrôler les fractions de particules finales dans les échafaudages MAP12.

La dernière étape de la formation de l’échafaudage MAP repose sur le recuit des microgels pour créer un échafaudage poreux en vrac1. En utilisant des composants de matrice extracellulaire natifs et en utilisant des schémas de recuit bio-orthogonaux, les échafaudages MAP servent de plate-forme biocompatible pour la culture cellulaire in vitro et la réparation tissulaire in vivo 3. Grâce à ces approches, les échafaudages MAP peuvent être fabriqués à partir de blocs de construction HA-NB avec des fractions de particules définies par l’utilisateur pour leur utilisation dans des applications d’ingénierie tissulaire12. Le protocole suivant décrit la production microfluidique de microgels HA-NB suivie d’une lyophilisation et d’une réhydratation pour contrôler la fraction de particules dans les échafaudages MAP. Enfin, les étapes de recuit des microgels sont décrites à l’aide de la chimie bio-orthogonale pour des expériences de culture cellulaire 3D in vitro .

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Protocol

1. Fabrication de dispositifs microfluidiques

  1. Lithographie douce
    REMARQUE : Ce protocole décrit la fabrication d’un dispositif microfluidique focalisant l’écoulement de Wilson et coll.9. Cependant, ce protocole peut être utilisé avec n’importe quelle conception de périphérique sur une plaquette SU-8. La plaquette peut être collée sur une boîte de Pétri, puis doit être silanisée pour empêcher l’adhérence du PDMS aux caractéristiques de la plaquette15.
    1. Mélanger la base élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) avec l’agent de durcissement (voir le tableau des matières) dans un rapport de 10:1. Préparer environ 100 g pour couvrir la plaquette avec ~5 mm PDMS. Verser le mélange PDMS sur la plaquette et dégazer dans un dessiccateur pendant environ 30 minutes. Une fois toutes les bulles disparues, placer dans un four à 60 °C pendant au moins 2 h pour durcir le PDMS.
    2. Utilisez un couteau pour tracer doucement autour du paramètre de l’appareil sans fissurer la plaquette; Ensuite, décollez soigneusement le PDMS de la plaquette. Utilisez un poinçon de biopsie de 1 mm (voir le tableau des matériaux) pour créer les canaux d’entrée et de sortie.
      REMARQUE: Soyez doux lorsque vous poinçonnez le dispositif microfluidique. Les déchirures ou les déchirures autour des canaux d’entrée ou de sortie peuvent provoquer des fuites pendant la production de microgel.
    3. Utilisez du ruban adhésif pour enlever la poussière de l’appareil côté fonctionnalité. Placez les appareils et nettoyez les lames de verre sur une plaque chauffante à 135 °C pendant au moins 15 minutes pour éliminer l’humidité.
    4. Dans une hotte, utilisez un pistolet à plasma corona (voir le tableau des matériaux) en hauteur sur les lames de verre et les dispositifs (côté caractéristique exposée) pendant environ 30 s, puis collez-les rapidement ensemble. Appliquez doucement une pression pour assurer une bonne étanchéité entre l’appareil et la lame de verre. Placez les appareils dans un four à 60 °C pendant une nuit pour fixer la liaison.

2. Production microfluidique de microgels d’acide hyaluronique (HA) avec poignées fonctionnelles de norbornène (NB)

  1. Synthèse HA-NB
    REMARQUE : La synthèse de l’HA-norbornène (HA-NB) a été adaptée de Darling et coll.3 à l’aide de 79 kDa de sodium HA avec des équivalents molaires de 1:1,5:2,5 d’unités de répétition d’HA au chlorure de 4-(4,6-diméthoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-méthylmorpholinium (DMTMM) à la 5-norbornène-2-méthylamine (NMA).
    1. Peser les réactifs. Dissoudre l’HA à 20 mg/mL dans un tampon MES de 200 mM (pH ~6) en agitant dans un bécher ou une fiole sur une plaque à agiter. Une fois dissous, ajouter le DMTMM à la solution HA et laisser réagir pendant environ 20 min à température ambiante. Par exemple, 1 g HA + 1,09 g DMTMM + 845 μL NMA peut être utilisé.
    2. Ajoutez NMA goutte à goutte à la solution HA/DMTMM. Ajouter du parafilm à l’ouverture de la cuve de réaction pour minimiser l’évaporation et couvrir la cuve de réaction avec une feuille d’aluminium. Continuer à agiter tout en laissant la réaction se poursuivre pendant environ 24 h.
    3. Après 24 h, refroidir l’éthanol résistant à 200 (environ 10 fois le volume de réaction). Sur une plaque agitée, transférer la réaction goutte à goutte à l’éthanol refroidi pour précipiter l’HA-NB et continuer à agiter à 200-300 tr/min pendant 20 min.
    4. Transférer la solution dans des tubes coniques de 50 mL, puis centrifuger à 5 000 x g pendant 10 min. Versez l’excès d’éthanol pour l’éliminer comme déchet. À ce stade, le produit HA-NB devrait être constitué de granulés blancs dans les tubes coniques. Tirez l’aspirateur sur le HA-NB dans un dessiccateur pour le faire sécher pendant la nuit.
    5. Purifier le HA-NB à l’aide d’un tube de dialyse en cellulose de 12 à 14 kDa (voir le tableau des matériaux). Dissoudre HA-NB dans une solution de NaCl 2 M et transférer dans la tubulure de dialyse. Attachez le tube et fixez-le avec des pinces, si nécessaire. Transférer le tube de dialyse rempli dans un seau avec 5 L d’eau ultrapure et dialyser le HA-NB contre l’eau pendant la nuit.
    6. Le lendemain, retirer l’eau et remplacer par 1 M de solution de NaCl pendant 30 min. Retirez la solution de NaCl, puis dialysez contre de l’eau ultrapure pendant 3 jours, en remplaçant l’eau quotidiennement.
    7. Filtrer le produit dialysé à l’aide d’un filtre à vide de 0,2 μm, puis transférer le produit filtré dans des tubes coniques de 50 mL.
    8. Ajouter de l’azote liquide dans un contenant cryogénique et congeler les tubes HA-NB pendant 10 min. Ensuite, retirez les tubes coniques à l’aide d’une pince et retirez rapidement le capuchon et recouvrez avec un mouchoir en papier de qualité laboratoire (voir le tableau des matériaux). Fixez le tissu à l’aide d’un élastique et transférez-le dans un récipient ou une chambre de lyophilisation (voir le tableau des matériaux) et lyophilisez. Conserver le produit lyophilisé à -20 °C.
      ATTENTION : L’azote liquide est une substance dangereuse. Portez l’équipement de protection individuelle approprié lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide.
    9. Quantifier la modification du norbornène en dissolvant l’HA-NB à 10 mg/mL dansD2Oet en analysant par RMN du proton (Figure 1A)16.
      1. Pour déterminer la quantité de fonctionnalisation, étalonnez d’abord le pic de solvant D2O à 4,8 PPM. Intégrer le pic pour les protons méthyliques HA (δ2.05) et calibrer l’intégration à 3.0. Ensuite, intégrez les pics pour les groupes norbornène pendants à δ6,33 et δ6,02 (protons vinyliques, endo). Normaliser l’intégration de ces pics au nombre correspondant de protons pour déterminer le degré moyen de modification3.
  2. Préparation du précurseur de microgel HA-NB
    1. Préparer un tampon HEPES de 50 mM (pH 7,5) et filtrer le tampon stérile à l’aide d’un filtre à vide de 0,2 μm. À l’aide du tampon HEPES, préparer les stocks respectifs de 50 mM de photo-initiateur de phényle (2,4,6,-triméthylbenzoyl)phosphinate (LAP) et d’agent réducteur de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (PTCE). Gardez la solution LAP à l’abri de la lumière.
    2. Préparer les autres composants précurseurs du microgel en préparant les stocks respectifs de 50 mM de liant di-thiol et de peptide RGD dans de l’eau distillée stérile. Peser HA-NB et dissoudre dans un tampon HEPES pour préparer un stock de 10 mg/mL.
      REMARQUE: Différents liants di-thiol peuvent être utilisés pour la réticulation interne des microgels en fonction des préférences de l’utilisateur. Un agent de liaison dégradable (c.-à-d. clivable MMP) et non dégradable (dithiothréitol ou DTT) a été répertorié dans le tableau des matériaux. Le peptide RGD est inclus dans la formulation du microgel pour favoriser l’adhésion cellulaire dans les échafaudages MAP, mais ce composant pourrait être retiré et remplacé par un volume égal de tampon HEPES.
    3. Combiner les composants précurseurs avec des concentrations finales de 9,9 mM LAP, 0,9375 mM de TCEP (4 thiol/TCEP), 2,8 mM de liant di-thiol, 1 mM de peptide RGD et 3,5 % en poids (p/v) HA-NB en ajoutant un tampon HEPES supplémentaire pour atteindre le volume final souhaité. Bien mélanger le précurseur à l’aide d’une pipette volumétrique.
    4. À l’aide d’une pipette P1000, tirez lentement le mélange entier. Placez l’embout sur l’extrémité d’une seringue de 1 mL et éjectez l’embout de la pipette. Tirez sur le piston de la seringue pour charger le mélange dans la seringue, puis ajoutez un filtre de 0,2 μm à l’extrémité de la seringue et filtrez dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL. Centrifuger la solution précurseur filtrée pour éliminer les bulles produites lors de la filtration.
    5. Encore une fois, à l’aide d’une pipette P1000, tirez lentement vers le haut le précurseur filtré en faisant attention à ne pas créer de bulles. S’il y a des bulles, tapotez doucement la pointe pour qu’elles se délogent et flottent vers le haut.
    6. Placez l’embout sur l’extrémité d’une seringue de 1 mL et éjectez l’embout de la pipette. Gardez la seringue verticale et tirez lentement sur le piston de la seringue jusqu’à ce que toute la solution de précurseur soit dans la seringue. Ajouter une aiguille émoussée à la seringue et pousser le précurseur à travers l’extrémité de l’aiguille. Enveloppez la seringue dans du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.
  3. Préparation de la solution de pincement au microgel
    1. Préparer 5% v/v Span-80 dans de l’huile minérale blanche lourde et bien mélanger. Dessécher pour éliminer les bulles. Conserver le mélange surfactant/huile à température ambiante enveloppé dans du papier d’aluminium. Bien mélanger et déshydrater avant chaque utilisation.
    2. Utilisez une seringue de 5 mL pour aspirer le mélange huile/surfactant (minimiser les bulles) jusqu’à ce que la distance entre le piston et la poignée soit approximativement égale à la distance de la seringue précurseur. Ajouter une aiguille émoussée à la seringue et pousser l’huile à travers l’extrémité de l’aiguille.
  4. Configuration du dispositif microfluidique
    1. Ajouter une aiguille émoussée à une seringue de 1 mL et remplir avec une solution de traitement hydrophobe synthétique (voir le tableau des matières). Faites circuler doucement la solution à travers le dispositif microfluidique jusqu’à ce qu’elle s’accumule à chaque entrée/sortie. Laissez la solution sécher dans l’appareil sur la paillasse pendant environ 30 minutes, puis tirez le vide sur la sortie pour éliminer l’excès de solution. Fixez l’appareil avec des pinces sur un microscope de table.
    2. Envelopper un tube conique de 15 ml avec du papier d’aluminium et le placer dans une grille à tubes pour servir de contenant de collecte de microgel. Utilisez un support annulaire avec une pince pour placer la sonde de lumière UV dans l’ouverture du tube de collecte. Utilisez un détecteur UV (voir le tableau des matériaux) pour mesurer l’intensité des UV, en déplaçant la sonde jusqu’à ce que 20 mW/cm2 soient atteints. Éteignez la lumière UV jusqu’à plus tard.
    3. Couper le tube à une longueur qui ira du dispositif microfluidique au récipient de collecte. À une extrémité du tube, coupez un angle de 45°. Insérez doucement l’extrémité inclinée du tube dans le canal de sortie.
      REMARQUE: Soyez doux lorsque vous insérez le tube dans le dispositif microfluidique. Les déchirures ou les déchirures autour des canaux d’entrée ou de sortie peuvent provoquer des fuites pendant la production de microgel.
    4. Fixez les seringues précurseur et la seringues en phase huileuse sur une pompe à seringue double (voir le tableau des matières). Coupez deux autres morceaux de tube à une longueur qui ira de l’extrémité de la seringue au dispositif microfluidique. À une extrémité de chaque tube, couper un angle de 45°. Fixez soigneusement le tube (extrémité émoussée) sur les deux embouts de la seringue.
    5. Modifiez les réglages de la pompe pour la seringue de 1 mL et incluez le volume approximatif du précurseur. Poussez lentement la pompe vers l’avant jusqu’à ce qu’une pression suffisante soit appliquée aux pistons de la seringue pour pousser à la fois l’huile et le précurseur aux extrémités du tube, éliminant ainsi tout air du système. Laissez la pression s’équilibrer 5 à 10 minutes avant de passer à l’étape 2.4.6.
    6. Insérez délicatement l’extrémité inclinée du tube dans les canaux d’entrée du dispositif microfluidique avec la solution de précurseur de microgel à l’entrée avant et l’huile de pincement à l’entrée arrière. Déplacez la pompe vers l’avant par petits incréments jusqu’à ce que l’écoulement commence dans l’appareil et que des microgels sphériques commencent à se former dans la région de focalisation du débit. Démarrez la pompe avec un débit de 0,4 μL/min et laissez l’appareil fonctionner jusqu’à ce qu’il se stabilise. Si nécessaire, ajuster le débit ±0,1 μL/min par petits incréments pour stabiliser la production de microgel.
    7. Une fois que la production de microgel se stabilise comme le montre la figure 1B, remplacez le tube collecteur par un nouveau tube et allumez la lumière UV. Vérifiez périodiquement l’essai pour vous assurer que la production de microgel est stable pendant toute la durée de l’essai.

Figure 1
Figure 1 : Production microfluidique de microgels d’acide hyaluronique (HA) avec poignées fonctionnelles en norbornène (NB). (A) Environ 31 % des unités de répétition HA ont été modifiées avec succès avec NB, comme déterminé par l’analyse RMN protonique effectuée dans l’oxyde de deutérium. 1 Les décalages RMN H des norbornènes pendants à δ6,33 et δ6,02 (protons vinyliques, endo), et δ6,26 et δ6,23 ppm (protons vinyliques, exo) ont été comparés au groupe méthyle HA δ2,05 ppm pour déterminer la fonctionnalisation. Reproduit à partir d’Anderson et al.12 avec la permission d’Elsevier. (B) Schéma du dispositif microfluidique de focalisation d’écoulement utilisé pour générer des μgels HA-NB. (C) Des projections d’intensité maximale de la microscopie confocale ont été utilisées pour visualiser les μgels marqués par fluorescence (barre d’échelle = 500 μm). (D) Les distributions de fréquence du diamètre du microgel provenant d’essais indépendants sur la configuration microfluidique démontrent le contrôle de la taille du microgel ~50 μm ou ~100 μm selon le dispositif utilisé. (E) Le diamètre du microgel est indiqué comme la moyenne et l’écart type pour chaque série indépendante. Reproduit à partir de Wilson et al.9 avec la permission de Wiley. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Microgels purifiants et séchants

  1. Purification des microgels
    1. Préparer le tampon de lavage microgel (300 mM HEPES, 50 mM NaCl, 50 mMCaCl2) ainsi que la solution tensioactive pluronique F-127 à 2% (p/v) dans le tampon de lavage. Stériliser les solutions à l’aide d’un filtre à vide de 0,2 μm.
    2. Centrifuger le tube de collecte de microgel (5 000 x g) pendant 5 min. Dans une hotte stérile, aspirer soigneusement la phase d’huile surnageante. Combinez les μgels 1:1 avec la solution de tensioactif pluronique F-127 à 2% et le vortex pour bien mélanger. Centrifuger (5 000 x g) pendant 5 min et aspirer la solution de lavage surnageante.
    3. Ajouter le tampon de lavage à 4x le volume de microgel et le vortex pour bien mélanger. Centrifuger (5 000 x g) le mélange pendant 5 min et aspirer la solution de lavage. Effectuer 4 à 8 lavages avec le tampon de lavage jusqu’à ce que le surfactant soit retiré du système (c.-à-d. qu’il ne reste plus de bulles).
  2. Marquage fluorescent des microgels HA-NB
    REMARQUE:La synthèse interne d’une tétrazine marquée par fluorescence repose sur deux réactions d’addition thiol-Michael catalysées par la base en série qui ont été bien décrites et précédemment rapportées3. Pour ce travail, Alexa Fluor-488 a été conjugué avec de la tétrazine pour le marquage des μgels modifiés par le norbornène. Le produit lyophilisé (farine Alexa 488-Tet) a été dissous dans du diméthylformamide à 1 mg/mL et conservé à -20 °C.
    1. Pour marquer les μgels par fluorescence, préparez d’abord une solution de travail d’Alexa Fluor 488-Tet en diluant le stock 1 mg / mL 1:14 dans 1x PBS stérile. Dans une hotte stérile, combiner les μgels avec la solution de travail (2:1 en volume).
    2. Utilisez une pipette à déplacement et mélangez bien. Incuber le mélange pendant 1 h à température ambiante ou pendant une nuit à 4 °C.
    3. Centrifuger (5 000 x g) et aspirer la solution de coloration. Lavez les μgels deux fois avec 1x PBS (1:1 par volume) pour éliminer l’Alexa Fluor 488-Tet qui n’a pas réagi.
      REMARQUE : À ce stade, les μgels marqués par fluorescence peuvent être imagés au microscope confocal pour quantifier la taille du microgel (Figure 1C-E)9. Les méthodes de mesure de la taille des microgels ont été décrites en détail par Roosa et coll.17.
  3. Séchage des microgels HA-NB
    1. Transvaser les μgels purifiés (figure 2A) dans un tube à vis cryo-sécuritaire à l’aide d’une pipette volumétrique. Ajouter 70% d’éthanol aux μgels purifiés 50% (v/v) et bien mélanger avec une pipette volumétrique. Centrifuger pendant 5 min à 5 000 x g.
      ATTENTION : L’éthanol est une substance hautement inflammable.
      REMARQUE: Le tube à vis cryo-sûr peut être pesé avant l’ajout de μgels, puis pesé à nouveau après lyophilisation pour déterminer la masse de μgels. Ceci est recommandé pour minimiser les erreurs lors de l’utilisation de quantités inférieures à 1 mg. Assurez-vous que la balance est ajustée ou étalonnée en interne avant utilisation.
    2. Aspirer le liquide surnageant et le remplacer par de l’éthanol à 70 % (50 % v/v) (figure 2B). Bien mélanger avec une pipette à déplacement. Incuber pendant une nuit à 4 °C.
      REMARQUE : Les microgels peuvent être conservés dans de l’éthanol à 70 % à 4 °C avant la lyophilisation pour un stockage à long terme, si nécessaire. Les microgels lyophilisés sont représentés à la figure 2C. D’autres milieux de lyophilisation peuvent être utilisés dans cette étape si la formation de cryogel est souhaitée (Figure 2D).
    3. Centrifuger brièvement pour s’assurer que les μgels sont au fond du tube à vis. Ajouter de l’azote liquide dans un récipient cryogénique, puis ajouter le tube de μgels à la congélation instantanée.
    4. Après 5-10 min, retirez le tube de μgels avec une pince. Retirez rapidement le capuchon et recouvrez-le avec un mouchoir en papier de qualité laboratoire. Fixez le tissu avec un élastique et transférez-le dans un récipient ou une chambre de lyophilisation.
    5. Chargez l’échantillon sur le lyophiliseur en suivant les instructions du fabricant. Lyophiliser à 0,066 Torr et -63 °C. Conserver hermétiquement les μgels lyophilisés (lyo-μgels) hermétiquement fermés à température ambiante.
      NOTE: La lyophilisation est complète lorsque tout le liquide est retiré du tube et qu’un produit séché reste. Les solvants organiques peuvent réduire la longévité des appareils en caoutchouc sur les systèmes de lyophilisation courants.

Figure 2
Figure 2 : Séchage des microgels HA-NB. (A) Projection de l’intensité maximale des μgels en solution aqueuse (échelle = 100 μm). (B) Les μgels purifiés peuvent être incubés 1:1 en volume dans le milieu lyophilisant de choix et lyophilisés. (C) Projection d’intensité maximale de lyo-μgels séchés (barre d’échelle = 100 μm). (D) Les microgels sont remis en suspension après lyophilisation. L’EtOH (70%) est recommandé pour conserver les propriétés originales des μgels tout au long du processus de lyophilisation; cependant, d’autres milieux tels que l’alcool isopropylique (IPA), l’eau et l’acétonitrile (MeCN) peuvent être utilisés de manière interchangeable pour faciliter la formation de cryogel (barre d’échelle = 100 ou 50 μm comme indiqué). (E) Mesure du diamètre du microgel HA-NB avant (gris) et après lyophilisation (vert) dans 70 % d’EtOH présentée sous forme de distributions de fréquence pour trois populations de microgels. Reproduit à partir d’Anderson et al.12 avec la permission d’Elsevier. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Fabrication d’échafaudages MAP

  1. Synthèse de liant tétrazine
    REMARQUE : Les agents de liaison tétrazine peuvent être utilisés pour relier des μgels portant des groupes norbornène libres (Figure 3A). La procédure de synthèse de la HA-tétrazine (HA-Tet) a été adaptée de Zhang et coll.18 en utilisant 79 kDa de HA sodique avec des équivalents molaires de 1:1:0,25 d’unités de répétition HA à DMTMM à tétrazine-amine (figure 3B)12.
    1. Peser les réactifs. Dissoudre l’HA à 20 mg/mL dans un tampon MES de 200 mM (pH ~6) en agitant dans un bécher ou une fiole sur une plaque à agiter. Une fois dissous, ajouter le DMTMM à la solution HA et laisser réagir pendant environ 20 min à température ambiante. Par exemple, 100 mg HA + 72,8 mg DMTMM + 14,14 mg de tétrazine-amine peuvent être utilisés.
    2. Dissoudre la tétrazine-amine à 15 mg/mL dans un tampon MES 200 mM et ajouter goutte à goutte à la solution HA/DMTMM. Reportez-vous à la figure 3C pour la configuration de la réaction HA-Tet.
    3. Ajouter du parafilm à l’ouverture de la cuve de réaction pour minimiser l’évaporation et couvrir la cuve de réaction avec une feuille d’aluminium. Continuer à agiter tout en laissant la réaction se poursuivre pendant environ 24 h.
    4. Après 24 h, refroidir l’éthanol résistant à 200 (environ 10 fois le volume de réaction). Sur une plaque d’agitation, transférer la réaction goutte à goutte à l’éthanol refroidi pour précipiter le HA-Têt (figure 3D) et continuer à agiter pendant 20 min.
    5. Transférer la solution dans des tubes coniques de 50 mL, puis centrifuger à 5 000 x g pendant 10 min. Versez l’excès d’éthanol pour l’éliminer comme déchet. Tirez l’aspirateur sur le HA-Tet dans un dessiccateur pour sécher pendant la nuit. Un exemple du produit séché à cette étape du protocole se trouve à la figure 3E.
    6. Purifier le HA-Tet par dialyse. Dissoudre HA-Tet dans une solution de NaCl 2 M et transférer dans un tube de dialyse en cellulose avec une coupure de poids moléculaire de 12-14 kDa. Transférer le tube de dialyse rempli dans un seau avec 5 L d’eau ultrapure et dialyser le HA-Tet contre l’eau pendant la nuit.
    7. Le lendemain, retirer l’eau et remplacer par 1 M de solution de NaCl pendant 30 min. Retirez la solution de NaCl, puis dialysez contre de l’eau ultrapure pendant 3 jours, en remplaçant l’eau quotidiennement.
    8. Filtrer le produit dialysé à l’aide d’un filtre à vide de 0,2 μm, puis transférer le produit HA-Tet filtré dans des tubes coniques de 50 mL.
    9. Congeler les tubes coniques dans de l’azote liquide pendant 10 min, puis retirer les tubes coniques avec une pince. Retirez rapidement le capuchon et recouvrez-le avec un mouchoir en papier de qualité laboratoire. Fixez le tissu avec un élastique et transférez-le dans un récipient ou une chambre de lyophilisation et lyophilisez. Conserver le produit lyophilisé (figure 3F) à -20 °C.
    10. Quantifier la modification de la tétrazine en dissolvant le HA-Tet à 10 mg/mL dansD2Oet en analysant par RMN du proton (Figure 3G)16.
      1. Pour déterminer la quantité de fonctionnalisation, étalonnez d’abord le pic de solvant D2O à 4,8 PPM. Intégrer le pic pour les protons méthyliques HA (δ2.05) et calibrer l’intégration à 3.0. Ensuite, intégrez les pics des groupes tétrazine pendants à δ8,5 (2H) et δ7,7 (2H) (protons aromatiques). Normaliser l’intégration de ces pics au nombre correspondant de protons pour déterminer le degré moyen de modification12.
  2. Relier les lyo-μgels pour former des échafaudages MAP pour la caractérisation
    1. Préparer les composants de l’échafaudage MAP (c.-à-d. μgels, HA-Tet, volume de réhydratation). Peser les lyo-μgels (Figure 4A) et reconstituer dans 84% du volume final de MAP de 1x PBS. Laisser les microgels gonfler pendant environ 20 min (Figure 4B,C). Le MAP en poids utilisé pour la réhydratation peut être choisi en fonction de la préférence de l’utilisateur pour la fraction finale des particules (voir Figure 4D, E).
    2. Dissoudre le HA-Tet dans 1x PBS à la concentration choisie (voir NOTE ci-dessous).
      NOTE: La modification de la fraction d’emballage (via le MAP % en poids) ainsi que de la concentration de HA-Tet modifiera les propriétés mécaniques de l’échafaudage en vrac. Par exemple, un échafaudage MAP de 3,4 % en poids réticulé avec 0,02 mg/mL de HA-Tet (rapport de recuit de 2,6 mol Tet:mol HA-NB) génère des échafaudages MAP avec un module de stockage de cisaillement d’environ 700 Pa12.
    3. Utilisez une pipette à déplacement pour combiner le HA-Tet et les lyo-μgels et bien mélanger. À ce stade, le mélange peut être transféré via une pipette de déplacement sur des lames de verre, des plaques de puits ou un récipient au choix de l’utilisateur. Laisser recuire les μgels à 37 °C pendant 25 min, puis utiliser une spatule pour transférer les échafaudages MAP sur des plaques de puits remplies de 1x PBS. Conservez les échafaudages MAP dans 1x PBS jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la caractérisation.
  3. Calcul de la fraction de particules d’échafaudage MAP
    1. Pour une meilleure qualité d’image, transférez l’échafaudage MAP sur une lamelle de couverture en verre à l’aide d’une spatule. Image MAP échafaudages sur un microscope confocal utilisant le laser pour l’excitation et l’émission FITC. Image MAP échafaudages sur un objectif 20x et obtenir une pile Z traversant 250-300 μm dans la direction Z avec une taille de pas de 2,5 μm. Notez l’étalonnage μm/pixel de l’image.
    2. Importez l’image Z-stack dans le logiciel d’analyse (voir Tableau des matériaux). Sélectionnez le bouton Ajouter de nouvelles surfaces . Cochez la case Segmenter uniquement une région d’intérêt, puis sélectionnez la flèche bleue Suivant : Région d’intérêt.
    3. Définissez une région d’intérêt, en gardant une trace des dimensions X, Y et Z du volume analysé. Sélectionnez la flèche bleue Suivant : Canal source.
      REMARQUE: Les dimensions X et Y sont exprimées en unités de pixels tandis que la dimension Z est le nombre d’étapes. Une hauteur Z recommandée pour la région d’intérêt devrait inclure un minimum de deux μgels.
    4. Utilisez la liste déroulante Canal source pour sélectionner le canal FITC. Cochez la case en regard de Lissage et entrez un détail de surface de 2,50 μm. Sous Seuillage, sélectionnez Intensité absolue, puis sélectionnez la flèche bleue Suivant : Seuil.
    5. Utilisez la valeur de seuil suggérée pour le canal FITC. Faites pivoter la projection 3D pour évaluer la qualité du rendu et ajuster si nécessaire. Sélectionnez Suivant : Classer les surfaces.
      REMARQUE: Le bouton Précédent peut être utilisé pour modifier les étapes précédentes du processus, telles que la dimension Z, selon les besoins.
    6. Vérifiez si le nombre de voxels est égal à 10,0, puis sélectionnez le bouton vert à double flèche Terminer : exécutez toutes les étapes de création et terminez l’assistant.
      Remarque : Les paramètres de rendu de volume peuvent être stockés pour l’analyse par lots afin que les mêmes paramètres soient appliqués pour analyser tous les échafaudages.
    7. Pour exporter les données, sélectionnez l’onglet Statistiques , puis l’onglet Détaillé . Utilisez la deuxième liste déroulante pour sélectionner la variable Volume. Sélectionnez le bouton Exporter les statistiques de l’onglet Afficher vers un fichier et les enregistrer en tant que fichier de feuille de calcul (.xls) lorsque vous y êtes invité.
    8. Ouvrez le fichier et utilisez la fonction SOMME sur le volume de la colonne A pour déterminer le volume total (μm3) des μgels dans la région d’intérêt.
    9. Convertissez les dimensions de la région d’intérêt analysée des pixels en μm. Utilisez l’étalonnage μm/pixel de l’image de l’étape 4.3.1 pour convertir les dimensions X et Y. Multipliez la dimension Z (nombre d’étapes) par la taille du pas de l’image pour convertir la dimension Z en μm. Calculez le volume de la région d’intérêt (μm3) en multipliant les dimensions X, Y et Z.
    10. Pour déterminer la fraction particulaire de l’échafaudage, diviser le volume total des μgels dans la région d’intérêt (à l’étape 4.3.8) par le volume de la région d’intérêt (à l’étape 4.3.9).

Figure 3
Figure 3 : Synthèse d’un agent de liaison tétrazine pour la fabrication d’échafaudages à particules microporeuses recuites (MAP). (A) Schéma des μgels HA-NB reliés entre eux avec un agent de liaison tétrazine pour former des échafaudages MAP. (B) Schéma de réaction pour la synthèse HA-Tet. (C) La réaction HA-Tet a été configurée et laissée réagir pendant la nuit, suivie de (D) précipitation de HA-Tet dans l’éthanol. (E) Une fois purifié et séché, le HA-Tet a été réhydraté et lyophilisé pour donner (F) un produit séché rose pâle. (G) L’analyse RMN du proton montre une modification réussie de 11% des unités de répétition HA. Reproduit à partir d’Anderson et al.12 avec la permission d’Elsevier. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Réhydratation de microgels lyophilisés pour la fabrication d’échafaudages MAP. (A) Projection d’intensité maximale de lyo-μgels séchés (barre d’échelle = 100 μm). (B) Après lyophilisation, la réhydratation des lyo-μgels prend environ 20 minutes (barre d’échelle = 100 μm). (C) Les Lyo-μgels peuvent être réhydratés à différents % en poids de MAP pour produire des μgels coincés (barre d’échelle = 100 μm). (D) L’augmentation du MAP en % en poids lors de la réhydratation de lyo-μgels modifie la fraction de particules dans les échafaudages MAP, comme le montrent les tranches Z uniques des échafaudages MAP et les projections de volume (barre d’échelle = 100 μm). (E) En utilisant ces échafaudages MAP en % en poids définis par l’utilisateur, des fractions de particules uniques peuvent être obtenues (NL = μgels non lyophilisés). Une ANOVA unidirectionnelle avec Tukey HSD a été réalisée sur les échantillons (n = 3), avec une signification rapportée à p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,005 (***) et p < 0,001 (****). Reproduit à partir d’Anderson et al.12 avec la permission d’Elsevier. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5.3D Culture cellulaire dans des échafaudages cartographiques

  1. Préparer des dispositifs de culture cellulaire
    1. Pour créer un dispositif de culture cellulaire personnalisé pour ces expériences (Figure 5A-C), utilisez une imprimante 3D pour imprimer un moule négatif à l’aide du fichier CAO trouvé dans le fichier de codage supplémentaire 1.
      NOTE: Les dimensions du dispositif de culture cellulaire sont les suivantes: 94,9 mm x 94,9 mm x 4,8 mm avec une hauteur totale de puits de 2,6 mm. Les diamètres des puits intérieurs et extérieurs sont respectivement de 4 mm et 6 mm.
    2. Mélanger la base d’élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) avec l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1 en masse. Verser le mélange PDMS dans une grande boîte de Petri en plastique et dégazer dans un dessiccateur pendant environ 30 minutes ou jusqu’à ce que toutes les bulles aient disparu.
    3. Une fois que toutes les bulles ont disparu, placez soigneusement le moule imprimé en 3D dans le PDMS pour minimiser la formation de nouvelles bulles. Placer au four à 60 °C pendant au moins 2 h pour durcir le PDMS.
    4. Utilisez un couteau ou une lame de rasoir pour tracer doucement autour du paramètre du dispositif de culture, puis retirez soigneusement la moisissure. Utilisez un poinçon de biopsie de 4 mm pour retirer tout PDMS du fond des puits. Coupez les appareils pour qu’ils s’adaptent sur une lamelle de couverture en verre.
      REMARQUE: Les dispositifs de culture cellulaire peuvent également être collés à des lames de verre, mais les lamelles de couverture en verre améliorent l’imagerie des échantillons.
    5. Utilisez du ruban adhésif pour enlever la poussière de la face inférieure des dispositifs de culture. Placer les lamelles de verre propres et les dispositifs de culture (côté inférieur vers le haut) sur une plaque chauffante à 135 °C pendant au moins 15 minutes pour éliminer l’humidité.
    6. Dans une hotte aspirante, utilisez un pistolet à plasma corona sur la lame de verre et le côté inférieur de l’appareil pendant 30 s, puis collez rapidement les surfaces traitées ensemble. Appliquez doucement une pression pour assurer une bonne étanchéité entre le dispositif de culture et la lamelle de couvercle en verre.
    7. Répétez l’étape 5.1.6 pour tous les appareils, puis placez-les dans un four à 60 °C pendant une nuit pour fixer le lien. Autoclaver les dispositifs à stériliser avant utilisation in vitro.
  2. Culture cellulaire dans des échafaudages MAP
    1. Préparer les composants de l’échafaudage MAP (c.-à-d. μgels, HA-Tet, volume du milieu) en fonction de la fraction de particules souhaitée (voir la figure 4D-E). Peser les lyo-μgels dans une hotte stérile et reconstituer dans 84% du volume MAP final du milieu cellulaire en fonction du % en poids de MAP choisi. Laisser les μgels gonfler pendant environ 20 min.
      REMARQUE: Ces méthodes exigent que l’utilisateur pèse le produit lyo-microgel pour la réhydratation. Pour les petites masses (1 mg ou moins), il est suggéré de peser d’abord le cryotube avant d’ajouter et de lyophiliser des μgels, puis de repeser le tube après lyophilisation pour déterminer la masse du produit afin de minimiser les erreurs.
    2. Dissoudre le HA-Tet dans le milieu cellulaire dans 16% du volume MAP final.
      Remarque : Les étapes suivantes pour préparer les cellules pour l’ensemencement dans les modèles MAP peuvent être modifiées en fonction du type de cellule utilisé. Dans ce protocole, des cellules mésenchymateuses de souris D1 ont été cultivées dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 1 % de pénicilline-streptomycine (pen-streptocoque) et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) (voir le tableau des matériaux). Les protocoles standard de culture de cellules adhérentes doivent être suivis pour ces cellules, les cultures étant maintenues à 37 °C et à 5 % de CO2 dans des récipients de culture traités par culture tissulaire.
    3. Une fois que les cellules mésenchymateuses de souris D1 ont atteint 70% à 80% de confluence, aspirez le média et lavez les cellules avec 1x PBS. Soulever les cellules en ajoutant suffisamment de volume de trypsine-EDTA à 1% pour couvrir la surface du récipient de culture tissulaire. Incuber à 37 °C pendant 1 à 3 min, puis éteindre la trypsinisation en ajoutant un milieu DMEM complété par 1% de pen-streptocoque et 10% de FBS à 2x le volume de trypsine-EDTA.
    4. Centrifuger la suspension cellulaire à 100 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules. Aspirer le milieu surnageant et remettre les cellules en suspension dans un milieu DMEM de 1 mL complété par 1 % de stylo-streptocoque et 10 % de FBS.
    5. Assurez-vous que la suspension cellulaire est bien mélangée, puis transférez 20 μL dans un nouveau tube microcentrifugé. Ajouter 20 μL de solution de bleu trypan et bien mélanger. Utilisez 20 μL de ce mélange pour compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé avec des lames de chambre de comptage de cellules.
    6. Transférer le nombre de cellules nécessaires pour ensemencer 10 000 cellules/μL de MAP dans un nouveau tube à microcentrifugeuse. Centrifuger à 100 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules. Aspirez soigneusement le milieu surnageant de la pastille cellulaire sans aspirer les cellules.
    7. Ajouter les μgels et le réticulant à la pastille de cellule à l’aide d’une pipette à déplacement. Bien mélanger avec une pipette à déplacement, puis ensemencer 10 μL du mélange par puits. Lors du placage, pipeter dans un mouvement circulaire pour répartir uniformément le mélange dans le puits.
    8. Laisser recuire les μgels à 37 °C dans l’incubateur cellulaire pendant 25 min avant d’ajouter des milieux cellulaires pour remplir les puits (~50 μL de milieu par puits). Maintenez les cultures 3D à 37 °C et changez de support si nécessaire. Pour éviter d’aspirer l’échafaudage lors du changement de média, stabilisez l’extrémité de la pipette le long de la crête du puits supérieur.
      REMARQUE : Lorsque vous ajoutez ou retirez du liquide des puits de culture, posez l’extrémité de l’embout de la pipette sur le rebord au-dessus de l’échafaudage MAP afin de minimiser les risques de perturbation ou d’aspiration de l’échafaudage du puits.
    9. Aux moments souhaités, fixer les échantillons en retirant le média et en ajoutant 50 μL de paraformaldéhyde à 4 % par puits pendant 30 minutes à température ambiante. Lavez les échantillons 3x avec 50 μL de 1x PBS ou tampon préféré. À ce stade du protocole, des méthodes standard d’immunofluorescence ou de coloration par fluorescence peuvent être suivies, en utilisant 50 μL par puits comme volume de travail.
      NOTE: Ces méthodes de fixation et de coloration cellulaire décrivent spécifiquement l’utilisation de colorants fluorescents; cependant, l’immunomarquage avec des conjugaisons d’anticorps primaires et/ou secondaires peut également être effectué dans ces échafaudages en suivant les instructions du fabricant en utilisant 50 μL comme volume de travail par puits.
    10. Imagez des cellules dans des échafaudages MAP sur un microscope confocal à l’aide d’un objectif 20x et obtenez une pile Z traversant 200-250 μm dans la direction Z avec une taille de pas de 2,5 μm. Un exemple de coloration par fluorescence avec DAPI (coloration nucléaire diluée 1:1000 dans 0,15% Triton-X dans 1x PBS) et phalloïdine-647 (coloration F-actine diluée 1:40 dans 0,15% Triton-X dans 1x PBS) est montré à la figure 5E, F avec des cellules D1 fixes cultivées dans des échafaudages MAP pendant 3 jours.
      REMARQUE: Le traitement plasma des surfaces en verre entraîne une augmentation de l’hydrophilie, ce qui améliore l’adhésion cellulaire. On observera probablement des cellules se répandre le long du fond des puits de culture cellulaire, mais elles ne devraient pas être incluses dans le nombre de cellules ou la quantification du volume cellulaire pour évaluer la réponse cellulaire dans les échafaudages MAP.

Figure 5
Figure 5 : Culture cellulaire dans des échafaudages MAP. (A) Le moule pour la création de puits de culture cellulaire peut être imprimé en 3D et coulé avec PDMS. L’ensemble du moule mesure 95 mm de diamètre, les grands puits 6 mm de diamètre et les petits puits intérieurs 4 mm de diamètre. (B) Une fois coulés avec PDMS, les dispositifs de culture cellulaire sont liés au plasma à des lamelles de couverture pour améliorer les capacités de microscopie. (C) La section transversale d’un puits de culture cellulaire représente le réservoir pour les milieux cellulaires (~50 μL) et un réservoir plus petit pour l’ensemencement de l’échafaudage MAP avec des cellules (~10 μL). (D) Le processus d’ensemencement des cellules dans les échafaudages MAP repose d’abord sur la réhydratation des lyo-μgels au poids souhaité par l’utilisateur, suivie d’un mélange avec les cellules et le réticulateur pour interconnecter les μgels. (E) Les cellules peuvent être encapsulées dans des échafaudages MAP (vert) avec un MAP en % en poids varié. Les images représentatives proviennent du jour 5 de la culture cellulaire D1 dans des échafaudages MAP (barre d’échelle = 100 μm). (F) Les coupes Z simples montrent des différences dans la croissance cellulaire dans les échafaudages comprenant différents % en poids de MAP (barre d’échelle = 50 μm). Reproduit à partir d’Anderson et al.12 avec la permission d’Elsevier. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

L’objectif de ce protocole est de démontrer la préparation d’échafaudages de particules microporeuses recuites (MAP) avec un schéma de réticulation bio-orthogonale ainsi que des fractions de particules contrôlées pour la culture cellulaire 3D. Tout d’abord, HA a été modifié avec des groupes pendants norbornène à utiliser à la fois dans la formation de microgel et l’interconnexion pour former des échafaudages MAP. À l’aide de ces méthodes, environ 31 % des unités de répétition HA ont été modifiées avec succès avec une poignée fonctionnelle en norbornène (figure 1A). Il a été démontré que les dispositifs microfluidiques avec une région de focalisation de l’écoulement (figure 1B) produisent des μgels HA-NB de ~50 μm ou ~100 μm de diamètre (figure 1C,D). Les μgels utilisés dans le reste de ce travail avaient un diamètre moyen de 92 μm (Q1 = 79 μm, Q3 = 103 μm) (Figure 1E).

Pour contrôler la fraction particulaire, les μgels ont été séchés par lyophilisation (Figure 2A-C) pour produire un produit qui pourrait être pesé par l’utilisateur et réhydraté pour obtenir des μgels gonflés. Le milieu de lyophilisation des μgels a été optimisé pour empêcher la formation de cryogel (c.-à-d. défauts internes) en utilisant de l’éthanol à 70%, mais il a également été démontré que les cryogels ont été obtenus en utilisant d’autres milieux pour la lyophilisation si les cryogels sont souhaités par l’utilisateur (Figure 2D). Une étude complète des différents milieux de lyophilisation pour la formation de cryogel microgel peut être trouvée dans les travaux d’Anderson et al.12. À l’aide de la microscopie confocale, le diamètre du microgel HA-NB a été quantifié avant et après lyophilisation avec de l’éthanol à 70 % (figure 2E), ce qui n’a indiqué aucun changement significatif de la taille du microgel avec ce procédé de séchage.

Pour faciliter l’interconnexion bio-orthogonale des μgels HA-NB, un agent de réticulation linéaire HA-Tet a été synthétisé (Figure 3). La spectroscopie RMN protonique a montré une modification réussie de 11% des unités de répétition HA avec un groupe suspendu tétrazine en utilisant les étapes détaillées dans ce travail (Figure 3G), et le rendement de réaction était de 95%. À l’aide de l’agent de liaison HA-Tet, le produit de lyo-microgel séché (figure 4A) a été réhydraté avec des volumes spécifiés pour obtenir différentes formulations en % en poids (p/v) de μgels (figure 4B, C) dans des échafaudages MAP allant de 10 μL (4 mm de diamètre) à 50 μL (8 mm de diamètre) pour les expériences de culture cellulaire et la caractérisation des matériaux, respectivement. Ces % en poids de μgels définis par l’utilisateur dans les échafaudages MAP correspondaient à des fractions de particules uniques dans les échafaudages (Figure 4D,E).

Ce protocole a également détaillé le processus d’ensemencement des cellules dans des échafaudages MAP pour la culture 3D (Figure 5D) à l’aide de schémas de recuit bio-orthogonaux. Les lyo-μgels ont été réhydratés au % en poids souhaité dans le milieu cellulaire, puis mélangés avec la pastille cellulaire et HA-Tet pour interconnecter les μgels. Ce mélange a ensuite été plaqué dans des dispositifs de culture cellulaire (Figure 5A-C) pour donner des cellules encapsulées dans l’espace vide entre μgels dans des échafaudages MAP. Les cellules en culture 3D dans des échafaudages MAP ont été fixées au jour 5, colorées et imagées sur un microscope confocal, comme le montre la figure 5E. Un exemple des cellules dans l’espace vide des échafaudages MAP pour différentes formulations en % en poids est présenté à la figure 5F.

Fichier de codage supplémentaire 1: fichier CAO utilisé pour imprimer en 3D le moule pour les dispositifs de culture cellulaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Il a été démontré que la production microfluidique de microgels HA-NB génère des microgels avec une gamme de distribution granulométrique plus étroite que la production par lots d’émulsion 3,9. Les microgels décrits dans ce protocole ont été formulés à l’aide d’un agent de réticulation clivable MMP (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) pour soutenir la dégradation des matériaux. Cependant, les microgels HA-NB peuvent également être réticulés à l’aide d’un liant di-thiol alternatif tel que le dithiothréitol (DTT), qui est non dégradable. De même, d’autres photo-initiateurs, tels que le 2-hydroxy-4-(2-hydroxyéthoxy)-2-méthylpropiophénone Irgacure 2959, peuvent être utilisés dans le précurseur HA-NB au lieu de LAP pour faciliter la réticulationthiol-ène 10. Ces microgels étaient composés de 3,5 % en poids d’HA sur la base d’un travail antérieur qui a démontré que la viscosité d’une solution de précurseurs à 3,5 % en poids se prêtait à un pincement en gouttelettes sur une plate-forme microfluidique6. D’autres ont décrit la fabrication de microgel HA-NB sur des dispositifs microfluidiques focalisant l’écoulement en utilisant des formulations à faible % en poids (3 % en poids HA-NB) ainsi que 8,10,11. Bien que cette méthode soit bénéfique pour la production de populations de microgels à faible polydispersité, elle exige plus de temps et de main-d’œuvre que les techniques d’émulsion discontinue qui peuvent également être utilisées pour la production de microgel HA-NB3.

Le procédé de lyophilisation du microgel repose sur la congélation de réseaux de polymères réticulés. Des défauts peuvent survenir lors de la congélation lorsque des structures cristallines dans le milieu de lyophilisation se forment et agissent comme des porogènes, et les cryogels qui en résultent présentent une porosité accrue et des propriétés mécaniques différentes par rapport au matériau d’origine19,20. À ce jour, des méthodes ont été décrites pour les microgels lyophilisés qui empêchent la formation de cryogel pour les formulations de polyéthylèneglycol (PEG)13, GelMa 14 et HA12 en utilisant différents milieux pour la lyophilisation. Pour ce protocole, l’utilisateur pourrait échanger de l’éthanol à 70% avec un autre milieu de lyophilisation de son choix si des cryogels le souhaitent. Bien que les cryogels puissent être avantageux pour certaines applications, l’éthanol à 70 % a été mis en évidence dans ce protocole comme milieu de lyophilisation parce qu’il s’agit d’un réactif de laboratoire courant, qu’il intègre les avantages de la stérilisation dans le processus de fabrication du MAP et qu’il permet aux microgels HA de conserver leur taille, leur forme et leur rigidité d’origine tout en minimisant les défauts internes une fois réhydratés12 . En plus de ces évaluations des caractéristiques des microgels, la microscopie électronique à balayage environnemental (MEB) pourrait être mise en œuvre comme outil potentiel pour évaluer la morphologie des microgels avant et après la lyophilisation.

Les méthodes décrites dans ce travail pour le séchage des microgels HA-NB ont été introduites pour contourner la variabilité de la fraction des particules et produire des échafaudages MAP cohérents avec des formulations en % en poids définies par l’utilisateur. L’étude de la fraction contrôlée de particules à différentes % en poids de réhydratation s’est limitée à l’étude des microgels sphériques. D’autres formes de microgel, telles que les bâtonnets8,21 ou les formes irrégulières10,22, n’ont pas été étudiées pour évaluer la relation entre le % en poids de MAP et la fraction particulaire. La fraction de particules a été évaluée dans des échafaudages MAP en utilisant des proportions constantes de lyo-microgels réhydratés (84%) et de réticulant HA-Tet (16%) sur la base d’une étude antérieure2; cependant, ces fractions peuvent être modifiées à la discrétion de l’utilisateur tant que le volume HA-Tet est suffisant pour dissoudre HA-Tet au rapport de réticulation souhaité. La réaction chimique de clic norbornène-tétrazine a été efficace pour recuire des microgels afin de former des échafaudages MAP en utilisant le liant bifonctionnel23, multibras3, ainsi que le liant linéaire12 tétrazine décrit dans ces méthodes. Si vous le souhaitez, le rapport molaire de Tet:HA-NB peut être modifié pour obtenir différentes rigidités des échafaudages MAP en vrac12. Ces techniques pour les lyo-microgels réhydratés n’ont pas encore été évaluées pour d’autres produits chimiques de recuit en plus de la tétrazine-norbornène.

La culture cellulaire 3D dans des échafaudages MAP a été décrite précédemment avec de nombreux types de cellules, telles que les cellules endothéliales8, les fibroblastes 1,3,4,24, les cellules progénitrices neurales9 et les cellules souches mésenchymateuses 25,26. De l’éthanol résiduel a été observé par RMN protonique après lyophilisation des microgels HA-NB dans de l’éthanol à 70 %; Cependant, il a également été confirmé que les traces d’éthanol n’avaient pas d’impact sur la viabilité cellulaire12. La culture dans des échafaudages MAP comprenant des lyo-microgels n’a été démontrée jusqu’à présent qu’avec des cellules souches mésenchymateusesde souris 12 ; cependant, ce protocole d’ensemencement des cellules dans les échafaudages MAP avec des lyo-microgels pourrait être interchangé avec d’autres types de cellules et leurs milieux cellulaires correspondants. Pour la culture cellulaire D1, il a été démontré que l’intensité de la F-actine et le volume cellulaire total diminuent à mesure que le % en poids de MAP augmente12. Il a également été démontré que l’augmentation du % en poids de MAP correspond à une augmentation de la rigidité de l’échafaudage en vrac (et non de la rigidité locale du microgel) à mesure que l’espace vide entre les microgels devient plus petit, ce qui entraîne une diminution de la prolifération cellulaire dans les échafaudages MAP à % en poidsélevé 12.

Ce travail décrivait des méthodes de production de microgels HA-NB sur une plate-forme microfluidique suivie d’une lyophilisation des microgels pour conserver les propriétés originales des microgels ou produire des cryogels. Ce protocole décrivait la synthèse d’un agent de liaison tétrazine utilisé pour relier les lyo-microgels une fois qu’ils ont été réhydratés à des pourcentages de poids définis par l’utilisateur pour créer des échafaudages MAP avec des fractions de particules contrôlées. Enfin, ce travail a détaillé les étapes de culture de cellules dans ces échafaudages MAP avec des microarchitectures définies par l’utilisateur. La création d’échafaudages granulaires avec des fractions de particules cohérentes améliore la reproductibilité des résultats expérimentaux pour les utilisateurs de MAP, allant au-delà des réponses cellulaires au transport de masse et aux propriétés mécaniques12. Les échafaudages MAP générés à l’aide de ces techniques peuvent être utilisés à l’avenir pour des applications in vivo . L’utilisation d’un produit lyophilisé pour la fabrication d’échafaudages granulaires est bénéfique pour améliorer la durée de conservation du matériau et sera également avantageuse pour la traduction future des échafaudages MAP dans un contexte clinique.

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Disclosures

ARA et TS ont déposé un brevet provisoire sur cette technologie.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier les National Institutes of Health, les National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) et le National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568). Ce travail a été réalisé en partie au Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), membre du North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), qui est soutenu par la National Science Foundation (numéro de prix ECCS-2025064) dans le cadre de la National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Les auteurs tiennent à remercier l’ancien post-doctorant du laboratoire, le Dr Lucas Schirmer, ainsi qu’Ethan Nicklow, pour leur aide dans la génération du dispositif imprimé en 3D pour les expériences de culture cellulaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309628
5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimide Invitrogen A10254 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287 For staining cell culture samples
Aluminum foil VWR 89107-726
Biopsy punch with plunger, 1.0 mm Integra Miltex 69031-01
Biopsy punch, 4 mm Integra Miltex 33-34
Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped SAI Infusion Technologies B23-50
Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm Corning CLS430521
Calcium chloride VWR 1B1110 For microgel washing buffer
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume Rainin 17008609
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume Rainin 17008605
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume Rainin 17008608
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Centrifuge tube, 15 mL CELLTREAT 667015B
Centrifuge tube, 50 mL CELLTREAT 229421
Chloroform, ACS grade, Glass Bottle Stellar Scientific CP-C7304 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator ETP 11011
CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap Nunc 368632
D1 mouse mesenchymal cells ATCC CRL-12424 Example cell line for culture in MAP gels
DAPI Sigma-Aldrich D9542 For staining cell culture samples
Deuterium oxide, 99.9 atom% D Sigma-Aldrich 151882 For NMR spectroscopy
Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off Spectra/Por 132703 For purifying HA-NB and HA-Tet
Diethyl ether VWR BDH1121-4LPC For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Dimethylformamide Sigma-Aldrich 277056 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)  TCI-Chemicals D2919 For modifying HA
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861 Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich D6429-500ML For D1 cell culture
EMS Paraformaldehyde, Granular VWR 100504-162 For making 4% PFA
Ethanol absolute (200 proof) KOPTEC 89234-850
Fetal bovine serum (FBS) ATCC 30-2020 For D1 cell culture
Heating Plate Kopf Instruments HP-4M
Hemacytometer with coverglass Daigger Scientific EF16034F
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg Contipro N/A 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights.
IMARIS Essentials software package Oxford Instruments N/A Microscopy image analysis software
Infusion pump, dual syringe Chemyx N/A
Kimwipe Kimberly-Clark 34120
Laboratory stand with support lab clamp Geyer 212100
Liquid nitrogen Airgas NI 180LT22
Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate TCI-Chemicals L0290
Lyophilizer Labconco N/A Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol.
Methyltetrazine-PEG4-maleimide Kerafast FCC210 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) Fisher Scientific BP300-100 For modifying HA
Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 VWR 48393-106
Microfluidic device SU8 master wafer FlowJem Custom design made either in-house in clean room or outsourced
Mineral oil, heavy Sigma-Aldrich 330760
MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) GenScript N/A
5-Norbornene-2-methylamine TCI-Chemicals 95-10-3 For HA-NB synthesis
Packing tape Scotch 3M 1426
Parafilm Bemis PM996
PEG(thiol)2 JenKem Technology USA A4001-1 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL Thermo Fisher Scientific 15140122 For D1 cell culture
Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm Corning 351058
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 For washing HMPs
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010023
RainX water repellent glass treatment Grainger 465D20 Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment
RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) GenScript N/A
Rubber bands Staples 112417
Sodium chloride Chem-Impex 30070 For dialysis
Span 80 for synthesis Sigma-Aldrich 1338-43-8
Sylgard 184 Silicone Elastomer Electron Microscopy Science 4019862 polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices
Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter Cytvia 09-928-066
Tetraview LCD digital microscope Celestron 44347
Tetrazine-amine HCl salt Chem-Impex 35098 For HA-Tet synthesis
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Millipore Sigma 51805-45-9
Triton X-100 VWR 97063-864
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red Fisher Scientific 25-200-056 For lifting adherent cells to seed in MAP gels
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in Thomas Scientific 1204G82
UV curing system controller, LX500 LED  OmniCure 010-00369R
UV curing head, LED spot UV OmniCure N/A
UV light meter, Traceable VWR 61161-386
Vacuum dessicator Bel-Art 08-594-15C
X-Acto Z Series Precision Utility Knife Elmer's XZ3601W

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References

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Bioengineering numéro 188
Contrôle de la fraction de particules dans des échafaudages de particules microporeuses recuites pour culture cellulaire 3D
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Anderson, A. R., Segura, T.… More

Anderson, A. R., Segura, T. Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (188), e64554, doi:10.3791/64554 (2022).

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