Summary

Kontrolle der Partikelfraktion in mikroporös geglühten Partikelgerüsten für die 3D-Zellkultur

Published: October 28, 2022
doi:

Summary

Die Minimierung der Variabilität der Partikelfraktion innerhalb von Granulatgerüsten erleichtert reproduzierbare Experimente. Diese Arbeit beschreibt Methoden zur Erzeugung granularer Gerüste mit kontrollierten Partikelfraktionen für in vitro Tissue Engineering Anwendungen.

Abstract

Mikrogele sind die Bausteine von mikroporösen geglühten Partikeln (MAP)-Gerüsten, die als Plattform für die In-vitro-Zellkultur und die In-vivo-Gewebereparatur dienen. In diesen körnigen Gerüsten ermöglicht die angeborene Porosität, die durch den Hohlraum zwischen Mikrogelen erzeugt wird, die Zellinfiltration und -migration. Die Kontrolle der Hohlraumfraktion und der Partikelfraktion ist entscheidend für das MAP-Gerüstdesign, da die Porosität ein bioaktiver Hinweis für Zellen ist. Sphärische Mikrogele können auf einer mikrofluidischen Vorrichtung für kontrollierte Größe und Form erzeugt und anschließend gefriergetrocknet werden, wobei Methoden verwendet werden, die das Brechen des Polymernetzwerks verhindern. Bei der Rehydratation führen die lyophilisierten Mikrogele zu kontrollierten Partikelfraktionen in MAP-Gerüsten. Die Implementierung dieser Methoden zur Mikrogel-Lyophilisation hat zu reproduzierbaren Studien geführt, die den Einfluss der Partikelfraktion auf die Makromoleküldiffusion und Zellausbreitung zeigen. Das folgende Protokoll umfasst die Herstellung, Lyophilisierung und Rehydratation von Mikrogelen zur Kontrolle der Partikelfraktion in MAP-Gerüsten sowie das Glühen der Mikrogele durch bioorthogonale Vernetzung für die 3D-Zellkultur in vitro.

Introduction

Mikroporöse geglühte Partikel (MAP)-Gerüste sind eine Unterklasse von körnigen Materialien, in denen die Mikrogel-Bausteine (μgel) miteinander verbunden sind, um ein poröses Gerüst zu bilden. Mit der einzigartigen Mikroarchitektur dieser körnigen Gerüste unterstützt die angeborene Porosität, die durch den Hohlraum zwischen vernetztem sphärischem Mikrogel erzeugt wird, eine beschleunigte Zellinfiltration und -migration1. Die Mikrogel-Bausteine von MAP-Gerüsten können sowohl aus synthetischen als auch aus natürlichen Polymeren mit chemischen Modifikationen hergestelltwerden 2. Die hier beschriebenen Methoden heben insbesondere die Verwendung von Mikrogelen hervor, die aus einem Hyaluronsäure (HA)-Rückgrat bestehen, das mit funktionellen Norbornen (NB)-Griffen modifiziert ist. Der funktionelle NB-Griff am HA-Polymer unterstützt Klickchemiereaktionen zur Bildung von Mikrogelen und deren Verknüpfung zu MAP-Gerüsten 3,4. Zahlreiche Verfahren wurden verwendet, um die Mikrogele miteinander zu verbinden (d.h. Glühen), wie enzymatische1, lichtbasierte5,6 und additivfreie Klickchemie 3,7 Reaktionen. In dieser Arbeit wird die additivfreie Klickchemie beschrieben, wobei die inverse Tetrazin-Norbornen-Elektronenbedarfs-Diels-Alder-Konjugation zur Verknüpfung der HA-NB-Mikrogele verwendet wird.

Zur Herstellung von MAP-Gerüsten erzeugen Anwender die Mikrogelbausteine zunächst unter Verwendung von Umkehremulsionen entweder in Batch-Systemen oder in mikrofluidischen Geräten sowie durch elektrohydrodynamisches Spritzen, Lithographie oder mechanische Fragmentierung2. Die Herstellung von sphärischen HA-NB-Mikrogelen wurde gut beschrieben und zuvor unter Verwendung von Batchemulsion2 und mikrofluidischen Tröpfchenerzeugungstechniken 8,9,10,11 berichtet. In dieser Arbeit wurden sphärische HA-NB-Mikrogele auf einer strömungsfokussierenden mikrofluidischen Plattform für kontrollierte Größe und Form erzeugt, wie zuvor beschrieben 8,9,10. Nach der Reinigung liegen die Mikrogele in einer wässrigen Suspension vor und müssen konzentriert werden, um einen verklemmten Zustand zu induzieren. Wenn sie verklemmt sind, weisen Mikrogele scherverdünnende Eigenschaften auf, die es ihnen ermöglichen, als injizierbare, raumfüllende Materialien zu fungieren1. Eine Methode zur Induktion eines gestauten Zustands besteht darin, die Mikrogele durch Lyophilisation oder Gefriertrocknung zu trocknen und anschließend das getrocknete Produkt in einem kontrollierten Volumen zu rehydrieren12. Alternativ kann überschüssiger Puffer aus der Mikrogelaufschlämmung durch Zentrifugieren über einem Sieb oder durch manuelles Entfernen des Puffers aus dem Mikrogelpellet entweder durch Absaugen oder unter Verwendung eines absorbierenden Materials entfernt werden. Die Verwendung von Zentrifugation zum Trocknen der Mikrogele kann jedoch bei der Herstellung von körnigen Gerüsten12 einen sehr variablen Bereich von Partikelfraktionen und Hohlraumfraktionen erzeugen. Techniken zur Lyophilisierung von Mikrogelen wurden unter Verwendung von 70% IPA für Polyethylenglykol (PEG)-Mikrogele13, fluorierten Ölen für Gelatinemethacryloyl (GelMa)-Mikrogele 14 und 70% Ethanol für HA-Mikrogele12 beschrieben. Dieses Protokoll hebt Methoden zur Gefriertrocknung kugelförmiger HA-Mikrogele unter Verwendung von 70% Ethanol, einem Standardlaborreagenz, hervor, um die ursprünglichen Mikrogeleigenschaften während des Trocknungsprozesses beizubehalten. Die gefriergetrockneten HA-Mikrogele können mit benutzerdefinierten Gewichtsprozentsätzen gewogen und rehydriert werden, um die endgültigen Partikelfraktionen in MAP-Gerüsten12 zu kontrollieren.

Der letzte Schritt bei der MAP-Gerüstbildung beruht auf dem Glühen der Mikrogele, um ein poröses Gerüst zu erzeugen1. Durch die Verwendung nativer extrazellulärer Matrixkomponenten und den Einsatz bioorthogonaler Glühschemata dienen MAP-Gerüste als biokompatible Plattform sowohl für die In-vitro-Zellkultur als auch für die In-vivo-Gewebereparatur 3. Durch diese Ansätze können MAP-Gerüste aus HA-NB-Bausteinen mit benutzerdefinierten Partikelfraktionen für ihren Einsatz in Tissue-Engineering-Anwendungen hergestellt werden12. Das folgende Protokoll beschreibt die mikrofluidische Produktion von HA-NB-Mikrogelen gefolgt von Lyophilisation und Rehydratation zur Kontrolle der Partikelfraktion in MAP-Gerüsten. Schließlich werden Schritte zum Glühen der Mikrogele unter Verwendung bioorthogonaler Chemie für in vitro 3D-Zellkulturexperimente beschrieben.

Protocol

1. Herstellung mikrofluidischer Bauelemente Weiche LithographieHINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Geräteherstellung eines strömungsfokussierenden mikrofluidischen Gerätedesigns von de Wilson et al.9. Dieses Protokoll kann jedoch mit jedem Gerätedesign auf einem SU-8-Wafer verwendet werden. Der Wafer kann auf eine Petrischale geklebt werden und muss dann silanisiert werden, um ein Anhaften des PDMS an den Wafermerkmalen15 zu verhinder…

Representative Results

Ziel dieses Protokolls ist es, die Herstellung von mikroporösen geglühten Partikeln (MAP)-Gerüsten mit einem bioorthogonalen Vernetzungsschema sowie kontrollierten Partikelfraktionen für die 3D-Zellkultur zu demonstrieren. Zunächst wurde HA mit Norbornen-Anhängergruppen modifiziert, um sowohl bei der Mikrogelbildung als auch bei der Verkettung zu MAP-Gerüsten verwendet zu werden. Mit diesen Methoden wurden etwa 31% der HA-Wiederholungseinheiten erfolgreich mit einem Norbornen-Funktionsgriff modifiziert (<strong cl…

Discussion

Die mikrofluidische Herstellung von HA-NB-Mikrogelen erzeugt nachweislich Mikrogele mit einem engeren Größenverteilungsbereich als dieEmulsionschargenproduktion 3,9. Die in diesem Protokoll beschriebenen Mikrogele wurden unter Verwendung eines MMP-spaltbaren Vernetzers (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) formuliert, um den Materialabbau zu unterstützen. HA-NB-Mikrogele können jedoch auch mit einem alternativen Dithiol-Linker wie Dithiothreitol (DTT) vernetz…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken den National Institutes of Health, den National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) und dem National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568). Diese Arbeit wurde zum Teil an der Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF) durchgeführt, einem Mitglied des North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), das von der National Science Foundation (Preisnummer ECCS-2025064) als Teil der National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI) unterstützt wird. Die Autoren danken dem ehemaligen Postdoc des Labors, Dr. Lucas Schirmer, sowie Ethan Nicklow für ihre Unterstützung bei der Erstellung des 3D-gedruckten Geräts für Zellkulturexperimente.

Materials

1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309628
5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimide Invitrogen A10254 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287 For staining cell culture samples
Aluminum foil VWR 89107-726
Biopsy punch with plunger, 1.0 mm Integra Miltex 69031-01
Biopsy punch, 4 mm Integra Miltex 33-34
Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped SAI Infusion Technologies B23-50
Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm Corning CLS430521
Calcium chloride VWR 1B1110 For microgel washing buffer
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume Rainin 17008609
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume Rainin 17008605
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume Rainin 17008608
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Centrifuge tube, 15 mL CELLTREAT 667015B
Centrifuge tube, 50 mL CELLTREAT 229421
Chloroform, ACS grade, Glass Bottle Stellar Scientific CP-C7304 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator ETP 11011
CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap Nunc 368632
D1 mouse mesenchymal cells ATCC CRL-12424 Example cell line for culture in MAP gels
DAPI Sigma-Aldrich D9542 For staining cell culture samples
Deuterium oxide, 99.9 atom% D Sigma-Aldrich 151882 For NMR spectroscopy
Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off Spectra/Por 132703 For purifying HA-NB and HA-Tet
Diethyl ether VWR BDH1121-4LPC For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Dimethylformamide Sigma-Aldrich 277056 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)  TCI-Chemicals D2919 For modifying HA
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861 Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich D6429-500ML For D1 cell culture
EMS Paraformaldehyde, Granular VWR 100504-162 For making 4% PFA
Ethanol absolute (200 proof) KOPTEC 89234-850
Fetal bovine serum (FBS) ATCC 30-2020 For D1 cell culture
Heating Plate Kopf Instruments HP-4M
Hemacytometer with coverglass Daigger Scientific EF16034F
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg Contipro N/A 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights.
IMARIS Essentials software package Oxford Instruments N/A Microscopy image analysis software
Infusion pump, dual syringe Chemyx N/A
Kimwipe Kimberly-Clark 34120
Laboratory stand with support lab clamp Geyer 212100
Liquid nitrogen Airgas NI 180LT22
Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate TCI-Chemicals L0290
Lyophilizer Labconco N/A Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol.
Methyltetrazine-PEG4-maleimide Kerafast FCC210 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) Fisher Scientific BP300-100 For modifying HA
Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 VWR 48393-106
Microfluidic device SU8 master wafer FlowJem Custom design made either in-house in clean room or outsourced
Mineral oil, heavy Sigma-Aldrich 330760
MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) GenScript N/A
5-Norbornene-2-methylamine TCI-Chemicals 95-10-3 For HA-NB synthesis
Packing tape Scotch 3M 1426
Parafilm Bemis PM996
PEG(thiol)2 JenKem Technology USA A4001-1 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL Thermo Fisher Scientific 15140122 For D1 cell culture
Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm Corning 351058
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 For washing HMPs
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010023
RainX water repellent glass treatment Grainger 465D20 Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment
RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) GenScript N/A
Rubber bands Staples 112417
Sodium chloride Chem-Impex 30070 For dialysis
Span 80 for synthesis Sigma-Aldrich 1338-43-8
Sylgard 184 Silicone Elastomer Electron Microscopy Science 4019862 polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices
Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter Cytvia 09-928-066
Tetraview LCD digital microscope Celestron 44347
Tetrazine-amine HCl salt Chem-Impex 35098 For HA-Tet synthesis
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Millipore Sigma 51805-45-9
Triton X-100 VWR 97063-864
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red Fisher Scientific 25-200-056 For lifting adherent cells to seed in MAP gels
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in Thomas Scientific 1204G82
UV curing system controller, LX500 LED  OmniCure 010-00369R
UV curing head, LED spot UV OmniCure N/A
UV light meter, Traceable VWR 61161-386
Vacuum dessicator Bel-Art 08-594-15C
X-Acto Z Series Precision Utility Knife Elmer's XZ3601W

References

  1. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  2. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  3. Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
  4. Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
  5. Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
  6. Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
  7. Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
  8. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
  9. Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921 (2022).
  10. Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  11. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2018).
  12. Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
  13. Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
  14. Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
  15. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  16. JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , (2022).
  17. Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119 (2022).
  18. Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
  19. Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
  20. Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
  21. Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
  22. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
  23. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  24. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  25. Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
  26. Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).

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Cite This Article
Anderson, A. R., Segura, T. Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (188), e64554, doi:10.3791/64554 (2022).

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