Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kontrollere partikkelfraksjon i mikroporøse annealede partikkelstillaser for 3D-cellekultur

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64554
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biomedical Engineering, Duke University, 2Departments of Biomedical Engineering, Neurology, and Dermatology, Duke University

Summary

Minimering av variasjonen i partikkelfraksjonen i granulære stillaser muliggjør reproduserbar eksperimentering. Dette arbeidet beskriver metoder for å generere granulære stillaser med kontrollerte partikkelfraksjoner for in vitro vevstekniske applikasjoner.

Abstract

Mikrogeler er byggesteinene til mikroporøse glødede partikler (MAP) stillaser, som fungerer som en plattform for både in vitro cellekultur og in vivo vevsreparasjon. I disse granulære stillasene muliggjør den medfødte porøsiteten som genereres av tomrommet mellom mikrogeler celleinfiltrasjon og migrasjon. Kontroll av voidfraksjonen og partikkelfraksjonen er kritisk for MAP-stillasdesign, da porøsitet er et bioaktivt signal for celler. Sfæriske mikrogeler kan genereres på en mikrofluidisk enhet for kontrollert størrelse og form og deretter frysetørkes ved hjelp av metoder som forhindrer oppsprekking av polymernettverket. Ved rehydrering fører de lyofiliserte mikrogelene til kontrollerte partikkelfraksjoner i MAP-stillaser. Implementeringen av disse metodene for mikrogel lyofilisering har ført til reproduserbare studier som viser effekten av partikkelfraksjon på makromolekyldiffusjon og cellespredning. Følgende protokoll vil dekke fabrikasjon, lyofilisering og rehydrering av mikrogeler for å kontrollere partikkelfraksjonen i MAP-stillaser, samt annealing mikrogelene gjennom bio-ortogonal tverrbinding for 3D-cellekultur in vitro.

Introduction

Mikroporøse glødede partikler (MAP) stillaser er en underklasse av granulære materialer der mikrogel (μgel) byggesteinene er sammenkoblet for å danne et bulk, porøst stillas. Med den unike mikroarkitekturen til disse granulære stillasene, støtter den medfødte porøsiteten som genereres av tomrommet mellom sammenkoblet sfærisk mikrogel akselerert celleinfiltrasjon og migrasjon1. Mikrogelbyggesteinene til MAP-stillas kan fremstilles av både syntetiske og naturlige polymerer med kjemiske modifikasjoner2. Metodene beskrevet her fremhever spesielt bruken av mikrogeler som består av en hyaluronsyre (HA) ryggrad modifisert med funksjonelle norbornene (NB) håndtak. Det funksjonelle håndtaket NB på HA-polymeren støtter klikkkjemireaksjoner for å danne mikrogeler og koble dem sammen for å generere MAP-stillaser 3,4. Tallrike ordninger har blitt brukt for å koble mikrogelene sammen (dvs. glødning), for eksempel enzymatisk1, lysbasert 5,6 og additivfri klikkkjemi 3,7 reaksjoner. Additivfri klikkkjemi er beskrevet i dette arbeidet, ved hjelp av tetrazin-norbornen invers elektronbehov Diels-Alder-konjugering for sammenkobling av HA-NB-mikrogelene.

For å fremstille MAP-stillaser genererer brukerne først mikrogelbyggesteinene ved hjelp av omvendte emulsjoner enten i batchsystemer eller i mikrofluidiske enheter, samt med elektrohydrodynamisk sprøyting, litografi eller mekanisk fragmentering2. Produksjonen av sfæriske HA-NB mikrogeler er godt beskrevet og tidligere rapportert ved bruk av både batchemulsjon2 og mikrofluidisk dråpegenereringsteknikker 8,9,10,11. I dette arbeidet ble sfæriske HA-NB mikrogeler generert på en strømningsfokuserende mikrofluidisk plattform for kontrollert størrelse og form, som tidligere beskrevet 8,9,10. Etter rensing eksisterer mikrogelene i en vandig suspensjon og må konsentreres for å indusere en fastkjørt tilstand. Når de sitter fast, viser mikrogeler skjærfortynnende egenskaper, noe som gjør at de kan fungere som injiserbare, plassfyllende materialer1. En metode for å indusere en fastkjørt tilstand er å tørke mikrogelene via lyofilisering eller frysetørking, og deretter rehydrere det tørkede produktet i et kontrollert volum12. Alternativt kan overflødig buffer fjernes fra mikrogeloppslemmingen via sentrifugering over en sil eller med manuell fjerning av bufferen fra mikrogelpelleten enten ved aspirasjon eller ved bruk av et absorberende materiale. Imidlertid kan bruk av sentrifugering for å tørke mikrogelene generere et svært variabelt utvalg av partikkelfraksjoner og tomromsfraksjoner når du lager granulære stillaser12. Teknikker for lyofilisering av mikrogeler er beskrevet ved bruk av 70% IPA for polyetylenglykol (PEG) mikrogeler13, fluorerte oljer for gelatinmetakryloyl (GelMa) mikrogeler14 og 70% etanol for HA-mikrogeler12. Denne protokollen fremhever metoder for frysetørking av sfæriske HA-mikrogeler ved bruk av 70% etanol, et standard laboratoriereagens, for å beholde de opprinnelige mikrogelegenskapene under tørkeprosessen. De frysetørkede HA-mikrogelene kan veies og rehydreres ved brukerdefinerte vektprosenter for å kontrollere de endelige partikkelfraksjonene i MAP-stillas12.

Det siste trinnet i MAP-stillasdannelsen er avhengig av å gløde mikrogelene for å lage et bulk, porøst stillas1. Ved å bruke innfødte ekstracellulære matrikskomponenter og bruke bioortogonale glødningsordninger, fungerer MAP-stillas som en biokompatibel plattform for både in vitro cellekultur og in vivo vevsreparasjon3. Gjennom disse tilnærmingene kan MAP-stillaser fremstilles fra HA-NB byggeklosser med brukerdefinerte partikkelfraksjoner for deres bruk i vevstekniske applikasjoner12. Følgende protokoll beskriver mikrofluidisk produksjon av HA-NB mikrogeler etterfulgt av lyofilisering og rehydrering for å kontrollere partikkelfraksjonen i MAP-stillas. Til slutt beskrives trinn for glødning av mikrogelene ved hjelp av bioortogonal kjemi for in vitro 3D-cellekultureksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikrofluidisk fremstilling av enheter

  1. Mykt litografi
    MERK: Denne protokollen beskriver enhetsfabrikasjon av en flytfokuserende mikrofluidisk enhetsdesign fra de Wilson et al.9. Denne protokollen kan imidlertid brukes med hvilken som helst enhetsdesign på en SU-8-wafer. Waferen kan teipes til en petriskål, og må deretter silaniseres for å forhindre overholdelse av PDMS til waferfunksjonene15.
    1. Bland polydimetylsiloksan (PDMS) elastomerbasen med herdemiddelet (se materialtabell) i forholdet 10:1. Forbered ca. 100 g for å dekke waferen med ~ 5 mm PDMS. Hell PDMS-blandingen på waferen og degaene i en tørkemaskin i ca. 30 minutter. Når alle boblene er borte, sett i en ovn ved 60 °C i minst 2 timer for å kurere PDMS.
    2. Bruk en kniv til å forsiktig spore rundt parameteren til enheten uten å sprekke waferen; deretter skrell PDMS forsiktig av waferen. Bruk en 1 mm biopsistans (se materialtabell) for å lage innløps- og utløpskanaler.
      MERK: Vær forsiktig når du slår den mikrofluidiske enheten. Rifter eller riper rundt innløps- eller utløpskanalene kan forårsake lekkasjer under mikrogelproduksjon.
    3. Bruk tape for å fjerne støv fra enheten på funksjonssiden. Plasser enhetene og rengjør glassglassene på en kokeplate ved 135 °C i minst 15 minutter for å fjerne fuktighet.
    4. I en avtrekkshette, bruk en koronaplasmapistol (se Table of Materials) høyt på både glassglassene og enhetene (funksjonssiden eksponert) i omtrent 30 s, og bind dem deretter raskt sammen. Trykk forsiktig for å sikre en god forsegling mellom enheten og glassglasset. Plasser apparatene i en ovn på 60 °C over natten for å feste båndet.

2. Mikrofluidisk produksjon av hyaluronsyre (HA) mikrogeler med norbornen (NB) funksjonelle håndtak

  1. HA-NB syntese
    MERK: HA-norbornene (HA-NB) syntese ble tilpasset fra Darling et al.3 ved bruk av 79 kDa natrium HA med molare ekvivalenter på 1: 1,5: 2,5 av HA-repetisjonsenheter til 4- (4,6-dimetoksy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-metylmorfoliniumklorid (DMTMM) til 5-norbornen-2-metylamin (NMA).
    1. Vei reaktantene. Løs opp hyaluronsyren ved 20 mg/ml i 200 mM MES-buffer (pH ~6) ved å røre i et beger eller kolbe på en røreplate. Når DMTMM er oppløst, tilsett HA-oppløsningen og la den reagere i ca. 20 minutter ved romtemperatur. For eksempel kan 1 g HA + 1,09 g DMTMM + 845 μL NMA brukes.
    2. Tilsett NMA dråpevis i HA/DMTMM-løsningen. Tilsett parafilm i åpningen av reaksjonsbeholderen for å minimere fordampning og dekke reaksjonsbeholderen med folie. Fortsett å røre mens du lar reaksjonen fortsette i ca. 24 timer.
    3. Etter 24 timer, chill 200 bevis etanol (ca. 10x reaksjonsvolumet). På en røreplate overfører du reaksjonen dråpevis til den kjølte etanolen for å utfelle HA-NB og fortsetter omrøringen ved 200-300 o / min i 20 minutter.
    4. Overfør løsningen til 50 ml koniske rør, og sentrifuger deretter ved 5000 x g i 10 minutter. Hell av overflødig etanol for å avhende som avfall. På dette tidspunktet skal HA-NB-produktet være hvite pellets i de koniske rørene. Trekk vakuum på HA-NB i en tørkemaskin for å tørke over natten.
    5. Rens HA-NB ved hjelp av 12-14 kDa molekylvekt cut-off cellulosedialyserør (se tabell over materialer). Løs opp HA-NB i 2 M NaCl-oppløsning og overfør til dialyseslangen. Bind slangen og fest med klemmer, om nødvendig. Overfør den fylte dialyseslangen til en bøtte med 5 liter ultrarent vann og dialyser HA-NB mot vann over natten.
    6. Neste dag, fjern vannet og erstatt med 1 M NaCl-løsning i 30 minutter. Fjern NaCl-løsningen, og dialyser deretter mot ultrarent vann i 3 dager, og erstatt vannet daglig.
    7. Filtrer det dialyserte produktet ved hjelp av 0,2 μm vakuumdrevet filter, og overfør deretter det filtrerte produktet til 50 ml koniske rør.
    8. Tilsett flytende nitrogen i en kryogen beholder og frys HA-NB-rørene i 10 minutter. Fjern deretter de koniske rørene med tang og fjern raskt hetten og dekselet med et vev av laboratoriekvalitet (se Materialtabell). Fest vevet med et gummibånd og overfør til en lyofiliseringsbeholder eller kammer (se materialtabell) og lyofiliser. Oppbevar det frysetørkede produktet ved -20 °C.
      FORSIKTIG: Flytende nitrogen er et farlig stoff. Bruk passende personlig verneutstyr når du arbeider med flytende nitrogen.
    9. Kvantifiser norbornenmodifisering ved å oppløse HA-NB ved 10 mg/ml i D2O og analysere via proton NMR (figur 1A)16.
      1. For å bestemme mengden funksjonalisering, kalibrer først D2O løsningsmiddeltoppen til 4,8 PPM. Integrer toppen for HA-metylprotonene (δ2.05) og kalibrer integrasjonen til 3.0. Deretter integrerer du toppene for pendelnorbornengruppene ved δ6.33 og δ6.02 (vinylprotoner, endo). Normaliser integrasjonen av disse toppene til det tilsvarende antall protoner for å bestemme gjennomsnittlig grad av modifikasjon3.
  2. Tilberedning av HA-NB mikrogel forløper
    1. Forbered 50 mM HEPES-buffer (pH 7,5) og filtrer bufferen sterilt ved hjelp av et 0,2 μm vakuumdrevet filter. Bruk HEPES-bufferen til å klargjøre respektive 50 mM lagre av litiumfenyl(2,4,6,-trimetylbenzoyl)fosfinat (LAP) fotoinitiator og tris(2-karboksyetyl)fosfin (TCEP) reduksjonsmiddel. Hold LAP-løsningen borte fra lys.
    2. Forbered de andre mikrogel forløperkomponentene ved å fremstille respektive 50 mM lagre av di-tiol linker og RGD peptid i sterilt destillert vann. Vei ut HA-NB og oppløs i HEPES-buffer for å tilberede et lager på 10 mg/ml.
      MERK: Ulike di-tiol-linkere kan brukes til intern kryssbinding av mikrogelene basert på brukerens preferanser. Både en nedbrytbar (dvs. MMP-spaltbar) og ikke-nedbrytbar (dithiothreitol eller DTT) linker er oppført i materialtabellen. RGD-peptidet er inkludert i mikrogelformuleringen for å fremme celleadhesjon i MAP-stillaser, men denne komponenten kan fjernes og erstattes med like volum HEPES-buffer.
    3. Kombiner forløperkomponentene med endelige konsentrasjoner på 9,9 mM LAP, 0,9375 mM TCEP (4 tiol/TCEP), 2,8 mM di-tiollinker, 1 mM RGD-peptid og 3,5 vekt% (w/v) HA-NB ved å legge til ekstra HEPES-buffer for å nå ønsket sluttvolum. Bland forløperen godt ved hjelp av en pipette med positiv forskyvning.
    4. Bruk en P1000-pipette til å trekke sakte opp hele blandingen. Sett spissen på enden av en 1 ml sprøyte og løs spissen ut av pipetten. Trekk sprøytestemplet for å legge blandingen i sprøyten, og tilsett deretter et 0,2 μm filter på enden av sprøyten og filtrer inn i et nytt mikrosentrifugerør på 1,5 ml. Sentrifuger den filtrerte forløperløsningen for å fjerne boblene som produseres under filtrering.
    5. Igjen, ved hjelp av en P1000-pipette, trekk sakte opp den filtrerte forløperen og vær forsiktig så du ikke lager bobler. Hvis det er bobler, trykk forsiktig på spissen for at de skal løsne og flyte til toppen.
    6. Plasser spissen på enden av en 1 ml sprøyte og ta spissen ut av pipetten. Hold sprøyten loddrett og trekk sprøytestemplet sakte til hele forløperoppløsningen er i sprøyten. Legg en butt kanyle til sprøyten og skyv forløperen gjennom kanylespissen. Pakk sprøyten inn i folie for å holde den ute av lyset.
  3. Fremstilling av mikrogel klemmeløsning
    1. Forbered 5% v / v Span-80 i tung hvit mineralolje og bland godt. Uttørk for å fjerne bobler. Oppbevar overflateaktivt middel/oljeblandingen ved romtemperatur innpakket i folie. Bland godt og uttørk før hver bruk.
    2. Bruk en 5 ml sprøyte til å trekke opp olje/overflateaktivt middelblanding (minimer bobler) til avstanden mellom stempelet og fingerfestet er omtrent lik avstanden til forløpersprøyten. Legg en butt nål til sprøyten og skyv oljen gjennom spissen av nålen.
  4. Oppsett av mikrofluidisk enhet
    1. Legg en butt kanyle til en 1 ml sprøyte og fyll med syntetisk hydrofob behandlingsoppløsning (se Materialtabell). Flyt løsningen forsiktig gjennom den mikrofluidiske enheten til den samles ved hvert innløp/utløp. La løsningen tørke i enheten på benken i ca. 30 minutter, og trekk deretter vakuum på utløpet for å fjerne overflødig løsning. Fest enheten med klemmer på et bordmikroskop.
    2. Pakk et 15 ml konisk rør med folie og legg i et rørstativ for å tjene som mikrogeloppsamlingsbeholder. Bruk et ringstativ med en klemme for å plassere UV-lyssonden i åpningen av oppsamlingsrøret. Bruk en UV-detektor (se materialtabell) til å måle UV-intensiteten, og beveg sonden til 20 mW/cm2 er oppnådd. Slå av UV-lyset til senere.
    3. Klipp slangen i en lengde som kommer fra den mikrofluidiske enheten til oppsamlingsbeholderen. På den ene enden av slangen, kutt en 45 ° vinkel. Sett den vinklede enden av slangen forsiktig inn i utløpskanalen.
      MERK: Vær forsiktig når du setter slangen inn i mikrofluidisk enhet. Rifter eller riper rundt innløps- eller utløpskanalene kan forårsake lekkasjer under mikrogelproduksjon.
    4. Fest både forløper- og oljefasesprøytene på en dobbeltsprøytepumpe (se materialtabell). Klipp ytterligere to stykker rør i en lengde som kommer fra sprøytespisser til mikrofluidisk enhet. På den ene enden av hvert rør, kutt en 45 ° vinkel. Fest slangen forsiktig (stump ende) på begge sprøytespissene.
    5. Endre innstillingene på pumpen for 1 ml sprøyten og inkluder omtrentlig forløpervolum. Skyv pumpen sakte fremover til det tilføres nok trykk på sprøytestemplene til å skyve både oljen og forløperen til endene av slangen, og fjern all luft fra systemet. La trykket utligne 5-10 min før du går videre til trinn 2.4.6.
    6. Sett forsiktig den vinklede enden av slangen inn i innløpskanalene til den mikrofluidiske enheten med mikrogelforløperløsningen i det fremre innløpet og klemmeoljen i bakinnløpet. Flytt pumpen fremover i små trinn til strømmen begynner i enheten og sfæriske mikrogeler begynner å danne seg i det strømningsfokuserende området. Start pumpen med en strømningshastighet på 0,4 μL/min, og la enheten gå til den stabiliserer seg. Juster om nødvendig strømningshastigheten ±0,1 μL / min i små trinn for å stabilisere mikrogelproduksjonen.
    7. Når mikrogelproduksjonen stabiliserer seg som vist i figur 1B, erstatt oppsamlingsrøret med et nytt rør og slå på UV-lyset. Kontroller kjøringen med jevne mellomrom for å sikre at mikrogelproduksjonen er stabil i løpet av løpet.

Figure 1
Figur 1: Mikrovæskeproduksjon av hyaluronsyre (HA) mikrogeler med norbornen (NB) funksjonelle håndtak. (A) Omtrent 31% av HA-repetisjonsenhetene ble vellykket modifisert med NB, som bestemt av proton NMR-analyse utført i deuteriumoksid. 1 H NMR-skift av anhengsnorbornener ved δ6.33 og δ6.02 (vinylprotoner, endo), og δ6.26 og δ6.23 ppm (vinylprotoner, exo) ble sammenlignet med HA-metylgruppen δ2.05 ppm for å bestemme funksjonalisering. Gjengitt fra Anderson et al.12 med tillatelse fra Elsevier. (B) Skjematisk av den strømningsfokuserende mikrofluidiske enheten som brukes til å generere HA-NB μgeler. (C) Maksimal intensitetsprojeksjoner fra konfokalmikroskopi ble brukt til å visualisere fluorescerende merkede μgeler (skalabar = 500 μm). (D) Frekvensfordelinger av mikrogeldiameter fra uavhengige kjøringer på mikrofluidisk oppsett demonstrerer kontroll over mikrogelstørrelse ~ 50 μm eller ~ 100 μm, avhengig av hvilken enhet som brukes. (E) Mikrogeldiameter rapporteres som gjennomsnitt og standardavvik for hver uavhengige kjøring. Gjengitt fra Wilson et al.9 med tillatelse fra Wiley. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Rensende og tørkende mikrogeler

  1. Rensing av mikrogeler
    1. Forbered mikrogelvaskebufferen (300 mM HEPES, 50 mM NaCl, 50 mM CaCl 2) samt2% (w / v) Pluronic F-127 overflateaktiv løsning i vaskebuffer. Steriliser løsningene ved hjelp av et 0,2 μm vakuumdrevet filter.
    2. Sentrifuge mikrogeloppsamlingsrøret (5000 x g) i 5 minutter. I en steril hette aspirerer du forsiktig supernatantoljefasen. Kombiner μgels 1: 1 med 2% Pluronic F-127 overflateaktiv løsning og virvel for å blande godt. Sentrifuge (5 000 x g) i 5 minutter og aspirer supernatant vaskeoppløsning.
    3. Tilsett vaskebuffer ved 4x mikrogelvolum og virvel for å blande godt. Sentrifuge (5,000 x g) blandingen i 5 minutter og aspirer vaskeoppløsningen. Fullfør 4-8 vasker med vaskebufferen til overflateaktivt middel er fjernet fra systemet (dvs. ingen bobler forblir).
  2. Fluorescerende merking av HA-NB mikrogeler
    MERK: Den interne syntesen av en fluorescerende merket tetrazin er avhengig av to basekatalyserte tiol-Michael addisjonsreaksjoner i serier som er godt beskrevet og tidligere rapportert3. For dette arbeidet ble Alexa Fluor-488 konjugert med tetrazin for merking av norbornen-modifiserte μgeler. Det lyofiliserte produktet (Alexa Flour 488-Tet) ble oppløst i dimetylformamid ved 1 mg/ml og lagret ved -20 °C.
    1. For å fluorescerende merke μgels, må du først lage en arbeidsløsning av Alexa Fluor 488-Tet ved å fortynne 1 mg / ml lager 1:14 i steril 1x PBS. I en steril hette, kombiner μgelene med arbeidsløsningen (2: 1 volum).
    2. Bruk en forskyvningspipette og bland godt. Inkuber blandingen i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
    3. Sentrifuge (5000 x g) og aspirere fargeløsningen. Vask μgelene to ganger med 1x PBS (1:1 i volum) for å fjerne Alexa Fluor 488-Tet som ikke er repet.
      MERK: På dette tidspunktet kan de fluorescerende merkede μgelene avbildes på et konfokalt mikroskop for å kvantifisere mikrogelstørrelsen (figur 1C-E)9. Metoder for måling av mikrogelstørrelse er grundig beskrevet av Roosa et al.17.
  3. Tørking av HA-NB mikrogeler
    1. Overfør rensede μgeler (figur 2A) til et kryosikkert skrukorpeter ved hjelp av en pipette med positiv forskyvning. Tilsett 70% etanol til de rensede μgels 50% (v / v) og bland godt med en forskyvningspipette. Sentrifuge i 5 min ved 5 000 x g.
      FORSIKTIG: Etanol er et svært brannfarlig stoff.
      MERK: Det kryosikre skrukorettrøret kan veies før tilsetning av μgeler, og deretter veies igjen etter lyofilisering for å bestemme massen av μgeler. Dette anbefales for å minimere feil ved bruk av mengder mindre enn 1 mg. Sørg for at vekten er internt justert eller kalibrert før bruk.
    2. Aspirer supernatantvæsken og erstatt med 70 % etanol (50 % v/v) (figur 2B). Bland godt med en forskyvningspipette. Rug over natten ved 4 °C.
      MERK: Mikrogeler kan lagres i 70% etanol ved 4 ° C før lyofilisering for langtidsoppbevaring, om nødvendig. Lyofiliserte mikrogeler er vist i figur 2C. Andre frysemedier kan brukes i dette trinnet hvis kryogeldannelse er ønskelig (figur 2D).
    3. Sentrifuge kort for å sikre at μgelene er i bunnen av skrukorkrøret. Tilsett flytende nitrogen i en kryogen beholder, og tilsett deretter røret med μgeler for å fryse ned.
    4. Etter 5-10 minutter, fjern røret av μgels med tang. Fjern raskt hetten og dekselet med et vev av laboratoriekvalitet. Fest vevet med et gummibånd og overfør til en lyofiliseringsbeholder eller kammer.
    5. Legg prøven på lyofilisatoren ved å følge produsentens instruksjoner. Lyofiliser ved 0,066 Torr og -63 °C. Oppbevar de lyofiliserte μgelene (lyo-μgels) tett forseglet ved romtemperatur.
      MERK: Lyofilisering er fullført når all væske fjernes fra røret og et tørket produkt forblir. Organiske løsningsmidler kan redusere levetiden til gummiarmaturene på vanlige lyofiliseringssystemer.

Figure 2
Figur 2: Tørking av HA-NB mikrogeler. (A) Maksimal intensitetsprojeksjon av μgeler i vandig løsning (skalabar = 100 μm). (B) Rensede μgeler kan inkuberes 1: 1 i volum i det valgte lyofiliseringsmediet og lyofiliseres. (C) Maksimal intensitetsprojeksjon av tørkede lyo-μgeler (skalabar = 100 μm). (D) Mikrogeler resuspenderes etter lyofilisering. EtOH (70%) anbefales for å beholde de opprinnelige egenskapene til μgelene gjennom hele lyofiliseringsprosessen; Imidlertid kan andre medier som isopropylalkohol (IPA), vann og acetonitril (MeCN) brukes om hverandre for å lette kryogeldannelse (skalabar = 100 eller 50 μm som nevnt). (E) Måling av HA-NB mikrogeldiameter før (grå) og etter lyofilisering (grønn) i 70% EtOH vist som frekvensfordelinger for tre mikrogelpopulasjoner. Gjengitt fra Anderson et al.12 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Fabrikasjon av MAP-stillas

  1. Tetrazin linker syntese
    MERK: Tetrazine linkers kan brukes til å knytte sammen μgeler som bærer frie norbornene grupper (figur 3A). HA-tetrazin (HA-Tet) synteseprosedyre ble tilpasset fra Zhang et al.18 ved bruk av 79 kDa natrium HA med molare ekvivalenter på 1: 1: 0,25 av HA-repetisjonsenheter til DMTMM til tetrazin-amin (figur 3B) 12.
    1. Vei reaktantene. Løs opp hyaluronsyren ved 20 mg/ml i 200 mM MES-buffer (pH ~6) ved å røre i et beger eller kolbe på en røreplate. Når DMTMM er oppløst, tilsett HA-oppløsningen og la den reagere i ca. 20 minutter ved romtemperatur. For eksempel kan 100 mg HA + 72,8 mg DMTMM + 14,14 mg tetrazin-amin brukes.
    2. Løs opp tetrazin-aminet ved 15 mg/ml i 200 mM MES-buffer og tilsett dråpevis til HA/DMTMM-løsningen. Se figur 3C for reaksjonsoppsettet HA-Tet.
    3. Tilsett parafilm i åpningen av reaksjonsbeholderen for å minimere fordampning og dekke reaksjonsbeholderen med folie. Fortsett å røre mens du lar reaksjonen fortsette i ca. 24 timer.
    4. Etter 24 timer, chill 200 bevis etanol (ca. 10x reaksjonsvolumet). På en røreplate overfører du reaksjonen dråpevis til den kjølte etanolen for å utfelle HA-Tet (figur 3D) og fortsetter omrøringen i 20 minutter.
    5. Overfør løsningen til 50 ml koniske rør, og sentrifuger deretter ved 5000 x g i 10 minutter. Hell av overflødig etanol for å avhende som avfall. Trekk vakuum på HA-Tet i en tørkemaskin for å tørke over natten. Et eksempel på det tørkede produktet på dette trinnet i protokollen finner du i figur 3E.
    6. Rens HA-Tet ved hjelp av dialyse. Løs opp HA-Tet i 2 M NaCl-oppløsning og overfør til cellulosedialyserør med 12-14 kDa molekylvekt. Overfør den fylte dialyseslangen til en bøtte med 5 liter ultrarent vann, og dialyser HA-Tet mot vann over natten.
    7. Neste dag, fjern vannet og erstatt med 1 M NaCl-løsning i 30 minutter. Fjern NaCl-løsningen, og dialyser deretter mot ultrarent vann i 3 dager, og erstatt vannet daglig.
    8. Filtrer det dialyserte produktet med 0,2 μm vakuumdrevet filter, og overfør deretter det filtrerte HA-Tet-produktet til 50 ml koniske rør.
    9. Flash-frys de koniske rørene i flytende nitrogen i 10 minutter, og fjern deretter de koniske rørene med tang. Fjern raskt hetten og dekselet med et vev av laboratoriekvalitet. Fest vevet med et gummibånd og overfør til en lyofiliseringsbeholder eller kammer og lyofiliser. Oppbevar det frysetørkede produktet (figur 3F) ved -20 °C.
    10. Kvantifiser tetrazinmodifisering ved å oppløse HA-Tet ved 10 mg/ml i D2O og analysere via proton NMR (figur 3G)16.
      1. For å bestemme mengden funksjonalisering, kalibrer først D2O løsningsmiddeltoppen til 4,8 PPM. Integrer toppen for HA-metylprotonene (δ2.05) og kalibrer integrasjonen til 3.0. Deretter integrerer du toppene for anhengstetrazingruppene ved δ8.5 (2H) og δ7.7 (2H) (aromatiske protoner). Normaliser integrasjonen av disse toppene til det tilsvarende antall protoner for å bestemme gjennomsnittlig grad av modifikasjon12.
  2. Sammenkobling av lyo-μgeler for å danne MAP-stillaser for karakterisering
    1. Forbered MAP-stillaskomponentene (dvs. μgeler, HA-Tet, rehydreringsvolum). Vei lyo-μgelene (figur 4A) og rekonstituer i 84 % av det endelige MAP-volumet på 1x PBS. La mikrogelene hovne opp i ca. 20 minutter (figur 4B,C). WT% MAP som brukes til rehydrering kan velges basert på brukerens preferanse for endelig partikkelfraksjon (se figur 4D, E).
    2. Løs opp HA-Tet i 1x PBS ved valgt konsentrasjon (se NOTE nedenfor).
      MERK: Endring av både pakningsfraksjonen (via vekt% MAP) samt konsentrasjonen av HA-Tet vil endre mekaniske egenskaper for bulkstillas. For eksempel genererer et 3,4 vekt% MAP-stillas tverrbundet med 0,02 mg/ml HA-Tet (glødningsforhold på 2,6 mol Tet:mol HA-NB) MAP-stillas med ca. 700 Pa-skjærlagringsmodul12.
    3. Bruk en forskyvningspipette til å kombinere HA-Tet og lyo-μgels og bland godt. På dette tidspunktet kan blandingen overføres via forskyvningspipette til glassglass, brønnplater eller en beholder etter brukerens valg. La μgels anneal ved 37 ° C i 25 minutter, og bruk deretter en slikkepott for å overføre MAP-stillasene til brønnplater fylt med 1x PBS. Oppbevar MAP-stillas i 1x PBS til de er klare for karakterisering.
  3. Beregning av MAP-stillaspartikkelfraksjon
    1. For forbedret bildekvalitet, overfør MAP-stillaset til et glassdeksel ved hjelp av en slikkepott. Image MAP stillaser på et konfokalt mikroskop ved hjelp av laseren for FITC-eksitasjon og utslipp. Image MAP stillaser på et 20x mål og oppnår en Z-stack som krysser 250-300 μm i Z-retning med en trinnstørrelse på 2,5 μm. Legg merke til μm/pikselkalibreringen av bildet.
    2. Importer Z-stack-bildet til analyseprogramvaren (se Materialtabell). Velg knappen Legg til nye overflater . Merk av for Segmenter bare et interesseområde, og velg deretter den blå pilknappen Neste: Interesseområde.
    3. Definer et interesseområde, og hold oversikt over X-, Y- og Z-dimensjonene til volumet som analyseres. Velg den blå pilknappen Neste: Kildekanal.
      MERK: X- og Y-dimensjoner er i enheter av piksler mens Z-dimensjon er antall trinn. En anbefalt Z-høyde for interesseområdet bør inneholde minst to μgeler.
    4. Bruk rullegardinlisten Kildekanal til å velge FITC-kanalen. Merk av i boksen ved siden av Glatt og skriv inn en overflatedetalj på 2,50 μm. Velg Absolutt intensitet under Terskelverdi, og velg deretter den blå pilknappen Neste: Terskel.
    5. Bruk den foreslåtte terskelverdien for FITC-kanalen. Roter 3D-projeksjonen for å vurdere gjengivelseskvaliteten og juster etter behov. Velg Neste: Klassifiser overflater.
      MERK: Tilbake-knappen kan brukes til å redigere tidligere trinn i prosessen, for eksempel Z-dimensjon, etter behov.
    6. Kontroller om Antall Voxels er 10,0, og velg deretter den grønne dobbeltpilknappen Fullfør: Utfør alle opprettelsestrinn og avslutt veiviseren.
      MERK: Volumgjengivelsesparametere kan lagres for batchanalyse, slik at de samme innstillingene brukes til å analysere alle stillasene.
    7. Hvis du vil eksportere dataene, velger du Statistikk-fanen og deretter kategorien Detaljert . Bruk den andre rullegardinlisten til å velge variabelen Volum. Velg diskettknappen Eksporter statistikk på fanevisning til fil og lagre som en regnearkfil (.xls) når du blir bedt om det.
    8. Åpne filen og bruk SUMMER-funksjonen i kolonne A-volum til å bestemme totalvolumet (μm3) for μgelene i interesseområdet.
    9. Konverter dimensjonene til interesseområdet som ble analysert fra piksler til μm. Bruk μm/pikselkalibreringen av bildet fra trinn 4.3.1 til å konvertere X- og Y-dimensjonene. Multipliser Z-dimensjonen (antall trinn) med trinnstørrelsen for bildet for å konvertere Z-dimensjonen til μm. Beregn volumet av interesseområdet (μm3) ved å multiplisere X-, Y- og Z-dimensjonene.
    10. For å bestemme partikkelfraksjonen av stillaset, divider det totale volumet av μgelene i interesseområdet (funnet i trinn 4.3.8) med volumet av interesseområdet (funnet i trinn 4.3.9).

Figure 3
Figur 3: Syntese av tetrazinkobling for fremstilling av mikroporøse glødede partikler (MAP) stillaser. (A) Skjematisk av HA-NB μgeler som er sammenkoblet med en tetrazinkobling for å danne MAP-stillaser. (B) Reaksjonsskjema for HA-Tet syntese. (C) HA-Tet-reaksjonen ble satt opp og fikk lov til å reagere over natten etterfulgt av (D) utfelling av HA-Tet i etanol. (E) Når den var renset og tørket, ble HA-Tet rehydrert og lyofilisert for å gi (F) et tørket, lys rosa produkt. (G) Proton NMR-analyse viser vellykket modifisering av 11% av HA-repetisjonsenhetene. Gjengitt fra Anderson et al.12 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Rehydrering av lyofiliserte mikrogeler for MAP-stillasfabrikasjon. (A) Maksimal intensitetsprojeksjon av tørkede lyo-μgeler (skalabar = 100 μm). (B) Etter frysetørking er rehydrering av lyo-μgeler vist å ta ca. 20 minutter (skalabar = 100 μm). (C) Lyo-μgeler kan rehydreres ved varierende vekt% MAP for å produsere fastkjørte μgeler (skalabar = 100 μm). (D) Økning av vekt% MAP ved rehydrering av lyo-μgeler endrer partikkelfraksjonen i MAP-stillas, som vist ved enkle Z-skiver av MAP-stillas og volumprojeksjoner (skalalinje = 100 μm). (E) Ved å bruke disse brukerdefinerte vekt% MAP-stillasene, kan unike partikkelfraksjoner oppnås (NL = ikke-lyofiliserte μgeler). En enveis ANOVA med Tukey HSD ble utført på prøvene (n = 3), med signifikans rapportert ved p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,005 (***) og p < 0,001 (****). Gjengitt fra Anderson et al.12 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

5.3D cellekultur i kartstillas

  1. Klargjøre cellekulturenheter
    1. Hvis du vil opprette en egendefinert cellekulturenhet for disse eksperimentene (figur 5A-C), bruker du en 3D-skriver til å skrive ut en negativ form ved hjelp av CAD-filen som finnes i tilleggskodingsfil 1.
      MERK: Dimensjonene til cellekulturenheten er som følger: 94,9 mm x 94,9 mm x 4,8 mm med 2,6 mm total brønnhøyde. Diameteren på de indre brønnene og ytre brønnene er henholdsvis 4 mm og 6 mm.
    2. Bland polydimetylsiloksan (PDMS) elastomerbase med herdemiddelet i et 10: 1-forhold etter masse. Hell PDMS-blandingen i en stor petriskål og degaer i plast i en tørkemaskin i ca. 30 minutter eller til alle boblene har forsvunnet.
    3. Når alle boblene har forsvunnet, plasser forsiktig den 3D-printede formen i PDMS for å minimere dannelsen av nye bobler. Sett i ovnen ved 60 °C i minst 2 timer for å kurere PDMS.
    4. Bruk en kniv eller barberblad til å forsiktig spore rundt parameteren til kulturenheten, og fjern deretter formen forsiktig. Bruk en 4 mm biopsistans for å fjerne PDMS fra bunnen av brønnene. Klipp enhetene slik at de passer på et glassdeksel.
      MERK: Cellekulturenheter kan også bindes til glassglass, men glassdeksler forbedrer prøveavbildningen.
    5. Bruk tape for å fjerne støv fra undersiden av kulturenhetene. Plasser de rene glassdekslene og kulturanordningene (nederste side opp) på en kokeplate ved 135 °C i minst 15 minutter for å fjerne fuktighet.
    6. I en avtrekkshette, bruk en koronaplasmapistol høyt på både glassdekselet og undersiden av enheten i 30 s, og bind deretter de behandlede overflatene raskt sammen. Trykk forsiktig for å sikre en god forsegling mellom kulturenheten og glassdekselet.
    7. Gjenta trinn 5.1.6 for alle enheter, og sett deretter i en ovn på 60 °C over natten for å feste båndet. Autoklave enhetene for å sterilisere før bruk in vitro.
  2. Cellekultur i MAP-stillas
    1. Forbered MAP-stillaskomponentene (dvs. μgeler, HA-Tet, medievolum) basert på ønsket partikkelfraksjon (se figur 4D-E). Vei lyo-μgelene i en steril hette og rekonstituer i 84 % av det endelige MAP-volumet av cellemedier basert på valgt vekt% MAP. La μgelene svulme i ca. 20 minutter.
      MERK: Disse metodene krever at brukeren veier lyo-mikrogelproduktet for rehydrering. For små masser (1 mg eller mindre) anbefales det å først veie kryotuben før du tilsetter og lyofiliserer μgeler, og deretter oppveier røret etter lyofilisering for å bestemme massen av produktet for å minimere feil.
    2. Oppløs HA-Tet i cellemedier i 16 % av det endelige MAP-volumet.
      Følgende trinn for å klargjøre celler for såing i MAP-stillaser kan endres avhengig av celletypen som brukes. I denne protokollen ble D1-mus mesenkymale celler dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 1% penicillin-streptomycin (penn-strep) og 10% føtalt bovint serum (FBS) (se materialtabell). Standard adherente cellekulturprotokoller bør følges for disse cellene, med kulturer opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO2 i vevskulturbehandlede kulturbeholdere.
    3. Når D1 mus mesenkymale celler har nådd 70% -80% sammenløp, aspirere media og vaske cellene med 1x PBS. Løft cellene ved å legge til nok volum av 1% trypsin-EDTA for å dekke til overflaten av vevskulturbeholderen. Inkuber ved 37 ° C i 1-3 minutter, og slukk deretter trypsiniseringen ved å legge til DMEM-medier supplert med 1% penn-strep og 10% FBS ved 2x volumet av trypsin-EDTA.
    4. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 100 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene. Aspirer supernatantmediet og resuspend cellene i 1 ml DMEM-medier supplert med 1% penn-strep og 10% FBS.
    5. Forsikre deg om at cellesuspensjonen er godt blandet, og overfør deretter 20 μL til et nytt mikrosentrifugerør. Tilsett 20 μL trypan blå løsning og bland godt. Bruk 20 μL av denne blandingen til å telle cellene ved hjelp av enten et hemocytometer eller en automatisert celleteller med celletellingskammerlys.
    6. Overfør antall celler som trengs for såing av 10.000 celler / μL MAP til et nytt mikrosentrifugerør. Sentrifuge ved 100 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å pelletere cellene. Aspirer forsiktig supernatantmediet fra cellepelleten uten å aspirere cellene.
    7. Tilsett μgels og tverrbinding til cellepelleten med en forskyvningspipette. Bland godt med en forskyvningspipette, og frø deretter 10 μL av blandingen per brønn. Ved plettering, pipette i en sirkulær bevegelse for å fordele blandingen jevnt i brønnen.
    8. La μgelene gløde ved 37 °C i celleinkubatoren i 25 minutter før du tilsetter cellemedier for å fylle brønnene (~50 μL media per brønn). Oppretthold 3D-kulturene ved 37 °C og bytt medium etter behov. For å unngå å aspirere stillaset når du skifter medium, stabiliser pipettespissen langs kanten av den øvre brønnen.
      MERK: Når du tilsetter eller fjerner væske fra kulturbrønnene, hviler du enden av pipettespissen på avsatsen over MAP-stillaset for å minimere sjansen for å forstyrre eller aspirere stillaset fra brønnen.
    9. På de ønskede tidspunktene, fest prøver ved å fjerne mediet og tilsett 50 μL 4% paraformaldehyd per brønn i 30 minutter ved romtemperatur. Vask prøvene 3x med 50 μL 1x PBS eller foretrukket buffer. På dette punktet i protokollen kan standardmetoder for immunfluorescens eller fluorescensfarging følges, ved bruk av 50 μL per og arbeidsvolum.
      MERK: Disse metodene for fiksering og cellefarging beskriver spesifikt bruken av fluorescerende flekker; Imidlertid kan immunostaining med primære og / eller sekundære antistoffkonjugasjoner utføres i disse stillasene, samt etter produsentens instruksjoner ved bruk av 50 μL som arbeidsvolum per brønn.
    10. Bildeceller i MAP-stillas på et konfokalt mikroskop ved hjelp av et 20x-mål og oppnår en Z-stack som krysser 200-250 μm i Z-retningen med en trinnstørrelse på 2,5 μm. Et eksempel på fluorescensfarging med DAPI (kjernefysisk flekk fortynnet 1:1000 i 0,15% Triton-X i 1x PBS) og phalloidin-647 (F-aktinflekk fortynnet 1:40 i 0,15% Triton-X i 1x PBS) er vist i figur 5E, F med faste D1-celler dyrket i MAP-stillaser i 3 dager.
      MERK: Plasmabehandling av glassflater resulterer i økt hydrofilitet, noe som har vist seg å forbedre celleadhesjon. Celler vil sannsynligvis bli observert spredt langs bunnen av cellekulturbrønnene, men bør ikke inkluderes i celletall eller cellevolumkvantifisering for å vurdere cellerespons i MAP-stillaser.

Figure 5
Figur 5: Cellekultur i MAP-stillaser. (A) Formen for å lage cellekulturbrønner kan 3D-printes og støpes med PDMS. Hele formen er 95 mm i diameter, de store brønnene er 6 mm i diameter, og de små indre brønnene er 4 mm i diameter. (B) Når de er støpt med PDMS, er cellekulturenhetene plasmabundet til deksel for forbedrede mikroskopifunksjoner. (C) Tverrsnittet av en cellekulturbrønn viser reservoaret for cellemedier (~ 50 μL) og et mindre reservoar for såing av MAP-stillas med celler (~ 10 μL). (D) Prosessen med å så celler i MAP-stillaser er først avhengig av rehydrering av lyo-μgeler ved brukerens ønskede vekt%, etterfulgt av blanding med celler og tverrbindingen for sammenkobling av μgelene. (E) Celler kan innkapsles i MAP-stillaser (grønn) med variert vekt% MAP. Representative bilder er fra dag 5 av D1 cellekultur i MAP stillaser (skala bar = 100 μm). (F) Enkle Z-skiver viser forskjeller i cellevekst i stillaser som består av forskjellig vekt% MAP (målestokk = 50 μm). Gjengitt fra Anderson et al.12 med tillatelse fra Elsevier. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med denne protokollen er å demonstrere fremstilling av mikroporøse glødede partikler (MAP) stillaser med et bioortogonalt tverrbindingsskjema samt kontrollerte partikkelfraksjoner for 3D-cellekultur. Først ble HA modifisert med norbornene pendelgrupper som skal brukes i både mikrogeldannelse og sammenkobling for å danne MAP-stillaser. Ved hjelp av disse metodene ble ca. 31 % av HA-repetisjonsenhetene modifisert med et norbornen funksjonelt håndtak (figur 1A). Mikrofluidiske enheter med et strømningsfokuserende område (figur 1B) ble vist å produsere HA-NB μgeler på enten ~ 50 μm eller ~ 100 μm i diameter (figur 1C, D). Μgelene som ble brukt gjennom resten av dette arbeidet hadde en gjennomsnittlig diameter på 92 μm (Q1 = 79 μm, Q3 = 103 μm) (figur 1E).

For å kontrollere partikkelfraksjonen ble μgeler tørket via lyofilisering (figur 2A-C) for å produsere et produkt som kunne veies av brukeren og rehydreres for å oppnå hovne μgeler. Mediet for lyofilisering av μgelene ble optimalisert for å forhindre kryogeldannelse (dvs. interne defekter) ved bruk av 70% etanol, men det har også vist seg at kryogeler ble oppnådd ved bruk av andre medier for lyofilisering hvis kryogeler er ønsket av brukeren (figur 2D). En omfattende studie av ulike lyofiliseringsmedier for mikrogelkryogeldannelse finnes i arbeidet til Anderson et al.12. Ved hjelp av konfokalmikroskopi ble HA-NB mikrogeldiameter kvantifisert både før og etter lyofilisering med 70% etanol (figur 2E), noe som ikke indikerte noen signifikant endring i mikrogelstørrelse med denne tørkeprosessen.

For å lette bio-ortogonal sammenkobling av HA-NB μgeler ble en lineær HA-Tet tverrbinding syntetisert (figur 3). Proton NMR-spektroskopi viste vellykket modifisering av 11% av HA-repetisjonsenhetene med en tetrazin-anhengsgruppe ved bruk av trinnene som er beskrevet i dette arbeidet (figur 3G), og reaksjonsutbyttet var 95%. Ved hjelp av HA-Tet-linkeren ble det tørkede lyo-mikrogelproduktet (figur 4A) rehydrert med spesifiserte volumer for å oppnå forskjellige vekt% (w / v) formuleringer av μgeler (figur 4B, C) i MAP-stillaser fra 10 μL (4 mm diameter) til 50 μL (8 mm diameter) i størrelse for henholdsvis cellekultureksperimenter og materialkarakterisering. Disse brukerdefinerte vekt% av μgelene i MAP-stillas tilsvarte unike partikkelfraksjoner i stillasene (Figur 4D,E).

Denne protokollen detaljerte også prosessen for såing av celler i MAP-stillaser for 3D-kultur (figur 5D) ved hjelp av bio-ortogonale glødningsordninger. Lyo-μgelene ble rehydrert ved ønsket vekt% i cellemediet, og deretter blandet med cellepellet og HA-Tet for sammenkobling av μgelene. Denne blandingen ble deretter belagt i cellekulturenheter (figur 5A-C) for å gi celler innkapslet i tomrommet mellom μgeler i MAP-stillaser. Celler i 3D-kultur i MAP-stillas ble festet på dag 5, farget og avbildet på et konfokalt mikroskop som vist i figur 5E. Et eksempel på cellene i tomrommet til MAP-stillasene for forskjellige vekt% formuleringer er vist i figur 5F.

Tilleggskodingsfil 1: CAD-fil som brukes til å 3D-printe formen for cellekulturenheter. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrofluidisk produksjon av HA-NB mikrogeler har vist seg å generere mikrogeler med et smalere størrelsesfordelingsområde enn emulsjonsbatchproduksjon 3,9. Mikrogelene beskrevet i denne protokollen ble formulert ved hjelp av en MMP-spaltbar tverrbinding (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) for å støtte materialforringelse. Imidlertid kan HA-NB mikrogeler også kryssbindes ved hjelp av en alternativ di-tiol-linker som dithiothreitol (DTT), som ikke er nedbrytbar. På samme måte kan andre fotoinitiatorer, som Irgacure 2959 2-hydroxy-4-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone, brukes i HA-NB-forløperen i stedet for LAP for å lette tiol-ene tverrbinding10. Disse mikrogelene var sammensatt av 3,5 vekt% HA basert på et tidligere arbeid som viste at viskositeten til en 3,5 vekt% forløperløsning var egnet til å klemme inn i dråper på en mikrofluidisk plattform6. Andre har beskrevet HA-NB mikrogelfabrikasjon på strømningsfokuserende mikrofluidiske enheter ved bruk av lavere vekt% formuleringer (3 vekt% HA-NB) samt 8,10,11. Selv om denne metoden er gunstig for å produsere mikrogelpopulasjoner med lav polydispersitet, er den mer tids- og arbeidskrevende enn batchemulsjonsteknikker som kan brukes til HA-NB mikrogelproduksjon også3.

Mikrogel lyofiliseringsprosessen er avhengig av frysing av tverrbundne polymernettverk. Defekter kan oppstå under frysing når krystallstrukturer i lyofiliseringsmediet dannes og fungerer som ponogener, og de resulterende kryogelene utviser forbedret porøsitet og forskjellige mekaniske egenskaper sammenlignet med det opprinnelige materialet19,20. Hittil har det vært beskrevet metoder for frysetørking av mikrogeler som forhindrer kryogeldannelse for polyetylenglykol (PEG)13, GelMa 14 og HA-formuleringer12 ved bruk av forskjellige medier for lyofilisering. For denne protokollen kan brukeren bytte 70% etanol med et annet lyofiliseringsmedium etter eget valg hvis kryogeler er ønsket. Mens kryogeler kan være fordelaktige for noen applikasjoner, ble 70% etanol fremhevet i denne protokollen som lyofiliseringsmedium fordi det er et vanlig laboratoriereagens, det inkorporerer fordelen med sterilisering i prosessen med MAP-fabrikasjon, og det gjør at HA-mikrogelene kan beholde sin opprinnelige størrelse, form og stivhet samtidig som de minimerer interne defekter når de er rehydrert12 . I tillegg til disse vurderingene av mikrogelegenskaper, kan miljøskanningelektronmikroskopi (SEM) implementeres som et potensielt verktøy for å vurdere mikrogelmorfologi før og etter lyofilisering.

Metodene beskrevet i dette arbeidet for tørking av HA-NB mikrogeler ble introdusert for å omgå variabiliteten i partikkelfraksjon og produsere konsistente MAP-stillaser med brukerdefinerte vekt% formuleringer. Studien av kontrollert partikkelfraksjon ved forskjellig vekt% rehydrering var begrenset til studier av sfæriske mikrogeler. Andre mikrogelformer, som stenger8,21 eller uregelmessige former10,22, er ikke undersøkt for å vurdere forholdet mellom wt% MAP og partikkelfraksjon. Partikkelfraksjon er vurdert i MAP-stillas ved bruk av konsistente proporsjoner av rehydrerte lyomikrogeler (84 %) og HA-Tet tverrbinding (16 %) basert på en tidligere studie2; Disse fraksjonene kan imidlertid endres etter brukerens skjønn så lenge HA-Tet-volumet er tilstrekkelig til å oppløse HA-Tet ved ønsket tverrbindingsforhold. Norbornen-tetrazin klikkkjemi reaksjon har vært effektiv i annealing mikrogeler for å danne MAP stillaser ved hjelp av bi-funksjonell23, multi-arm3, samt den lineære12 tetrazin linker beskrevet i disse metodene. Om ønskelig kan molarforholdet til Tet:HA-NB varieres for å oppnå forskjellige stivheter i bulk MAP-stillasene12. Disse teknikkene for rehydrerte lyo-mikrogeler har ennå ikke blitt vurdert for andre glødende kjemikalier i tillegg til tetrazin-norbornen.

3D-cellekultur i MAP-stillaser har tidligere blitt beskrevet med mange celletyper, for eksempel endotelceller8, fibroblaster 1,3,4,24, nevrale stamceller9 og mesenkymale stamceller 25,26. Resterende etanol ble observert via proton NMR etter at HA-NB mikrogeler ble lyofilisert i 70% etanol; Det ble imidlertid også bekreftet at spormengdene etanol ikke påvirket cellens levedyktighet12. Dyrkning i MAP-stillas bestående av lyomikrogeler er så langt bare påvist med mesenkymale stamcellerfra mus 12; Denne protokollen for såing av celler i MAP-stillaser med lyo-mikrogeler kan imidlertid byttes ut med andre celletyper og deres tilsvarende cellemedier. For D1-cellekultur har F-aktinintensitet og totalt cellevolum vist seg å avta etter hvert som vekt% MAP øker12. Det er også vist at økning av vekt% MAP tilsvarer en økning i bulkstillasstivhet (ikke lokal mikrogelstivhet) ettersom tomrommet mellom mikrogeler blir mindre, noe som fører til mindre celleproliferasjon i høye vekt% MAP-stillaser12.

Dette arbeidet beskrev metoder for å produsere HA-NB mikrogeler på en mikrofluidisk plattform etterfulgt av frysetørking av mikrogelene for enten å beholde de opprinnelige mikrogelegenskapene eller produsere kryogeler. Denne protokollen skisserte syntesen av en tetrazinkobling som brukes til å knytte sammen lyomikrogelene når de har blitt rehydrert ved brukerdefinerte vektprosenter for å lage MAP-stillaser med kontrollerte partikkelfraksjoner. Til slutt detaljerte dette arbeidet trinnene for dyrking av celler i disse MAP-stillasene med brukerdefinerte mikroarkitekturer. Å lage granulære stillaser med konsistente partikkelfraksjoner forbedrer reproduserbarheten av eksperimentelle resultater for MAP-brukere, som strekker seg utover celleresponser på massetransport og mekaniske egenskaper, samt12. MAP-stillaser generert ved hjelp av disse teknikkene kan brukes fremover for in vivo-applikasjoner . Bruk av et lyofilisert produkt for granulær stillasfabrikasjon er gunstig for å forbedre materialets holdbarhet og vil også være fordelaktig for fremtidig oversettelse av MAP-stillas til en klinisk setting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ARA og TS har innlevert et foreløpig patent på denne teknologien.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke National Institutes of Health, National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (1R01NS112940, 1R01NS079691, R01NS094599) og National Institute of Allergy and Infectious Disease (1R01AI152568). Dette arbeidet ble utført delvis på Duke University Shared Materials Instrumentation Facility (SMIF), medlem av North Carolina Research Triangle Nanotechnology Network (RTNN), som støttes av National Science Foundation (prisnummer ECCS-2025064) som en del av National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI). Forfatterne vil gjerne takke laboratoriets tidligere postdoktor Dr. Lucas Schirmer samt Ethan Nicklow for deres hjelp til å generere den 3D-printede enheten for cellekultureksperimenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309628
5 mL Luer-Lok syringe sterile, single use, polycarbonate BD 309646
Alexa Fluor 488 C5 maleimide Invitrogen A10254 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287 For staining cell culture samples
Aluminum foil VWR 89107-726
Biopsy punch with plunger, 1.0 mm Integra Miltex 69031-01
Biopsy punch, 4 mm Integra Miltex 33-34
Blunt needle, 23 G 0.5", Non-Sterile, Capped SAI Infusion Technologies B23-50
Bottle-top vacuum filter, 0.22 μm Corning CLS430521
Calcium chloride VWR 1B1110 For microgel washing buffer
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 1000 μL max. volume Rainin 17008609
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 25 μL max. volume Rainin 17008605
Capillary-piston assemblies for positive-displacement pipettes, 250 μL max. volume Rainin 17008608
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
Centrifuge tube, 15 mL CELLTREAT 667015B
Centrifuge tube, 50 mL CELLTREAT 229421
Chloroform, ACS grade, Glass Bottle Stellar Scientific CP-C7304 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Corona plasma gun, BD-10A High Frequency Generator ETP 11011
CryoTube Vials, Polypropylene, Internal Thread with Screw Cap Nunc 368632
D1 mouse mesenchymal cells ATCC CRL-12424 Example cell line for culture in MAP gels
DAPI Sigma-Aldrich D9542 For staining cell culture samples
Deuterium oxide, 99.9 atom% D Sigma-Aldrich 151882 For NMR spectroscopy
Dialysis tubing, regenerated cellulose membrane, 12-14 kDa molecular weight cut-off Spectra/Por 132703 For purifying HA-NB and HA-Tet
Diethyl ether VWR BDH1121-4LPC For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Dimethylformamide Sigma-Aldrich 277056 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride (DMTMM)  TCI-Chemicals D2919 For modifying HA
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861 Non-degradable dithiol linker (substitute for MMP-cleavable peptide)
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich D6429-500ML For D1 cell culture
EMS Paraformaldehyde, Granular VWR 100504-162 For making 4% PFA
Ethanol absolute (200 proof) KOPTEC 89234-850
Fetal bovine serum (FBS) ATCC 30-2020 For D1 cell culture
Heating Plate Kopf Instruments HP-4M
Hemacytometer with coverglass Daigger Scientific EF16034F
2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid (HEPES) Sigma-Aldrich H3375
Sodium hyaluronate, 79 kDa average molecular weight, produced in bacteria Streptococcus zooepidemicus, pharmaceutical grade, microbial contamination <100 CFU/g, bacterial endotoxins <0.050 IU/mg Contipro N/A 79 kDa average molecular weight was used for HA-Tet synthesis, but these methods could be adapted for other molecular weights.
IMARIS Essentials software package Oxford Instruments N/A Microscopy image analysis software
Infusion pump, dual syringe Chemyx N/A
Kimwipe Kimberly-Clark 34120
Laboratory stand with support lab clamp Geyer 212100
Liquid nitrogen Airgas NI 180LT22
Lithium Phenyl(2,4,6-trimethylbenzoyl)phosphinate TCI-Chemicals L0290
Lyophilizer Labconco N/A Labconco FreeZone 6 plus has been discontinued, but other lab grade console freeze dryers could be used for this protocol.
Methyltetrazine-PEG4-maleimide Kerafast FCC210 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
2-(4-Morpholino)ethane Sulfonic Acid (MES) Fisher Scientific BP300-100 For modifying HA
Micro cover glass, 24 x 60 mm No. 1 VWR 48393-106
Microfluidic device SU8 master wafer FlowJem Custom design made either in-house in clean room or outsourced
Mineral oil, heavy Sigma-Aldrich 330760
MMP-cleavable dithiol crosslinker peptide (Ac-GCRDGPQGIWGQDRCG-NH2) GenScript N/A
5-Norbornene-2-methylamine TCI-Chemicals 95-10-3 For HA-NB synthesis
Packing tape Scotch 3M 1426
Parafilm Bemis PM996
PEG(thiol)2 JenKem Technology USA A4001-1 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Penicillin-Streptomycin, 10,000 units/mL Thermo Fisher Scientific 15140122 For D1 cell culture
Petri dish, polystyrene, disposable, Dia. x H=150 x 15 mm Corning 351058
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443 For washing HMPs
Phosphate buffered saline (PBS) 1x Gibco 10010023
RainX water repellent glass treatment Grainger 465D20 Synthetic hydrophobic treatment solution for microfluidic device treatment
RGD peptide (Ac-RGDSPGERCG-NH2) GenScript N/A
Rubber bands Staples 112417
Sodium chloride Chem-Impex 30070 For dialysis
Span 80 for synthesis Sigma-Aldrich 1338-43-8
Sylgard 184 Silicone Elastomer Electron Microscopy Science 4019862 polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer for making microfluidic devices and tissue culture devices
Syringe filter, Whatman Uniflo, 0.2 μm PES, 13 mm diameter Cytvia 09-928-066
Tetraview LCD digital microscope Celestron 44347
Tetrazine-amine HCl salt Chem-Impex 35098 For HA-Tet synthesis
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283 For synthesis of fluorescently-labeled tetrazine
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) Millipore Sigma 51805-45-9
Triton X-100 VWR 97063-864
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
Trypsin EDTA (0.25%), Phenol red Fisher Scientific 25-200-056 For lifting adherent cells to seed in MAP gels
Tygon ND-100-80 Non-DEHP Medical Tubing, Needle Gauge=23, Wall Thickness=0.020 in, Internal diameter = 0.020, Outer diameter = 0.060 in Thomas Scientific 1204G82
UV curing system controller, LX500 LED  OmniCure 010-00369R
UV curing head, LED spot UV OmniCure N/A
UV light meter, Traceable VWR 61161-386
Vacuum dessicator Bel-Art 08-594-15C
X-Acto Z Series Precision Utility Knife Elmer's XZ3601W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
  2. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
  3. Darling, N. J., et al. Click by click Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
  4. Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2020).
  5. Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of Microporous Annealed Particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
  6. Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
  7. Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
  8. Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
  9. Wilson, K. L., et al. Stoichiometric post modification of hydrogel microparticles dictates neural stem cell fate in microporous annealed particle scaffolds. Advanced Materials. 34 (33), 2201921 (2022).
  10. Muir, V. G., Qazi, T. H., Shan, J., Groll, J., Burdick, J. A. Influence of microgel fabrication technique on granular hydrogel properties. ACS Biomaterials Science & Engineering. 7 (9), 4269-4281 (2021).
  11. Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2018).
  12. Anderson, A. R., Nicklow, E., Segura, T. Particle fraction as a bioactive cue in granular scaffolds. Acta Biomaterialia. 150, 111-127 (2022).
  13. Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. R. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
  14. Sheikhi, A., et al. Microengineered emulsion-to-powder technology for the high-fidelity preservation of molecular, colloidal, and bulk properties of hydrogel suspensions. ACS Applied Polymer Materials. 1 (8), 1935-1941 (2019).
  15. Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step variable height photolithography for valved multilayer microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments. (119), e55276 (2017).
  16. JoVE. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE Science Education Database. Organic Chemistry. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).
  17. Roosa, C., et al. Microfluidic synthesis of microgel building blocks for microporous annealed particle scaffold. Journal of Visualized Experiments. (184), e64119 (2022).
  18. Zhang, H., Dicker, K. T., Xu, X., Jia, X., Fox, J. M. Interfacial bioorthogonal crosslinking. ACS Macro Letters. 3 (8), 727-731 (2014).
  19. Welzel, P. B., et al. Cryogel micromechanics unraveled by atomic force microscopy-based nanoindentation. Advanced Healthcare Materials. 3 (11), 1849-1853 (2014).
  20. Plieva, F., Huiting, X., Galaev, I. Y., Bergenståhl, B., Mattiasson, B. Macroporous elastic polyacrylamide gels prepared at subzero temperatures: control of porous structure. Journal of Materials Chemistry. 16 (41), 4065-4073 (2006).
  21. Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
  22. Kurt, E., Segura, T. Nucleic acid delivery from granular hydrogels. Advanced Healthcare Materials. 11 (3), 2101867 (2021).
  23. Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
  24. Truong, N. F., Lesher-Pérez, S. C., Kurt, E., Segura, T. Pathways governing polyethylenimine polyplex transfection in Microporous Annealed Particle scaffolds. Bioconjugate Chemistry. 30 (2), 476-486 (2019).
  25. Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
  26. Li, F., et al. Cartilage tissue formation through assembly of microgels containing mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 77, 48-62 (2018).

Tags

Bioteknologi utgave 188
Kontrollere partikkelfraksjon i mikroporøse annealede partikkelstillaser for 3D-cellekultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, A. R., Segura, T.… More

Anderson, A. R., Segura, T. Controlling Particle Fraction in Microporous Annealed Particle Scaffolds for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (188), e64554, doi:10.3791/64554 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter