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Cancer Research

मानव हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं में ऑन्कोजेनिक विषमयुग्मित गेन-ऑफ-फंक्शन म्यूटेशन इंजीनियरिंग

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64558
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1,3
1Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical University of Graz, 2Division of Hematology, Stanford Cancer Institute, Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine, Medical University of Graz

Summary

हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) में दैहिक उत्परिवर्तन को ईमानदारी से मॉडल करने के लिए नई रणनीतियां हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल जीव विज्ञान और हेमेटोलॉजिकल विकृतियों का बेहतर अध्ययन करने के लिए आवश्यक हैं। यहां, CRISPR / Cas9 और दोहरे rAAV दाता पारगमन के उपयोग के संयोजन से HSPCs में विषम लाभ-ऑफ-फ़ंक्शन उत्परिवर्तन को मॉडल करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।

Abstract

अपने पूरे जीवनकाल में, हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाएं (एचएसपीसी) दैहिक उत्परिवर्तन प्राप्त करती हैं। इनमें से कुछ उत्परिवर्तन एचएसपीसी कार्यात्मक गुणों जैसे प्रसार और भेदभाव को बदलते हैं, जिससे हेमेटोलॉजिक विकृतियों के विकास को बढ़ावा मिलता है। आवर्तक दैहिक उत्परिवर्तन के कार्यात्मक परिणामों को मॉडल, चिह्नित और बेहतर ढंग से समझने के लिए एचएसपीसी के कुशल और सटीक आनुवंशिक हेरफेर की आवश्यकता होती है। उत्परिवर्तन एक जीन पर हानिकारक प्रभाव डाल सकते हैं और इसके परिणामस्वरूप हानि-ऑफ-फ़ंक्शन (एलओएफ) हो सकता है या, इसके विपरीत, फ़ंक्शन को बढ़ा सकता है या यहां तक कि किसी विशेष जीन की नई विशेषताओं को जन्म दे सकता है, जिसे गेन-ऑफ-फंक्शन (जीओएफ) कहा जाता है। एलओएफ उत्परिवर्तन के विपरीत, जीओएफ उत्परिवर्तन लगभग विशेष रूप से विषम फैशन में होते हैं। वर्तमान जीनोम-संपादन प्रोटोकॉल व्यक्तिगत एलील्स के चयनात्मक लक्ष्यीकरण की अनुमति नहीं देते हैं, जिससे विषम जीओएफ उत्परिवर्तन को मॉडल करने की क्षमता में बाधा आती है। यहां, हम कुशल डीएनए दाता टेम्पलेट स्थानांतरण के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत और पुनः संयोजक एएवी 6 तकनीक के संयोजन से मानव एचएसपीसी में विषम जीओएफ हॉटस्पॉट म्यूटेशन को इंजीनियर करने के तरीके पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, यह रणनीति एक दोहरे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग करती है ताकि सफलतापूर्वक विषम रूप से संपादित एचएसपीसी की ट्रैकिंग और शुद्धिकरण की अनुमति मिल सके। इस रणनीति को सटीक रूप से जांचने के लिए नियोजित किया जा सकता है कि जीओएफ उत्परिवर्तन एचएसपीसी फ़ंक्शन और हेमेटोलॉजिकल विकृतियों की ओर उनकी प्रगति को कैसे प्रभावित करते हैं।

Introduction

नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (सीआरआईएसपीआर)/सीएएस9 तकनीक के विकास के साथ, वैज्ञानिकों के टूलकिट में एक नया और बेहद शक्तिशाली उपकरण जोड़ा गया है। यह तकनीक जीनोम की सटीक इंजीनियरिंग के लिए अनुमति देती है और न केवल अनुसंधान उद्देश्यों के लिए खुद को बेहद उपयोगी साबित किया है (ह्सू एट अल 1 में समीक्षा की गई है) बल्कि हाल ही में नैदानिक सेटिंग 2,3,4 में भी सफलतापूर्वक अनुवाद किया गया है। CRISPR / Cas9 संपादन रणनीतियाँ Cas9 प्रोटीन और एकल-गाइड आरएनए (sgRNA) 5,6,7 की गतिविधि पर निर्भर करती हैं। मेजबान सेल में, कैस 9 प्रोटीन को डीएनए में एक विशिष्ट साइट पर निर्देशित किया जाता है जो एसजीआरएनए अनुक्रम का पूरक है और डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) पेश करेगा। एक बार डीएसबी उत्पन्न होने के बाद, दो मुख्य और प्रतिस्पर्धी मरम्मत तंत्र हो सकते हैं जो हो सकते हैं: गैर-समरूप अंत जुड़ने (एनएचईजे) और होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर)। एनएचईजे एक त्रुटि-प्रवण, मुख्य रूप से उपयोग किया जाने वाला मरम्मत तंत्र है जो सम्मिलन और विलोपन (इंडेल) के लिए अग्रणी है, जबकि एचडीआर, मरम्मत टेम्पलेट के रूप में बहन क्रोमैटिड का उपयोग करके, बहुत सटीक है लेकिन सेल चक्र8 के एस या जी 2 चरण तक सीमित है। जीनोम इंजीनियरिंग में, एचडीआर का उपयोग एक दाता टेम्पलेट प्रदान करके डीएनए के लक्षित संशोधन के लिए किया जा सकता है जो कैस 9-प्रेरित डीएसबी (चित्रा 1) के दोनों डीएनए सिरों के समान होमोलॉजी हथियारों से घिरा हुआ है। एचडीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले दाता टेम्पलेट का प्रकार संपादन दक्षता को बहुत प्रभावित कर सकता है। मानव एचएसपीसी में आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए, एडेनो से जुड़े वायरस सीरोटाइप 6 (एएवी 6) को हाल ही में एकल-फंसे डीएनए टेम्पलेट 9,10 के वितरण के लिए एक उत्कृष्ट वाहन के रूप में वर्णित किया गया है।

CRISPR / Cas9 जीनोम इंजीनियरिंग को हानिकारक उत्परिवर्तन11 को ठीक करने के लिए चिकित्सीय रूप से नियोजित किया जा सकता है, लेकिन कैंसर के विकास को मॉडल करने के लिए डीएनए में रोगजनक उत्परिवर्तन पेश करने के लिए भी उपयोग किया जा सकताहै। रक्त कैंसर, जैसे ल्यूकेमिया, स्वस्थ एचएसपीसी13,14 में दैहिक उत्परिवर्तन के अनुक्रमिक अधिग्रहण के माध्यम से विकसित होता है। प्रारंभिक आनुवंशिक घटनाओं से क्लोनल प्रोलिफेरेटिव लाभ होता है, जिसके परिणामस्वरूप अनिश्चित क्षमता (CHIP) 15,16 के क्लोनल हेमटोपोइजिस होते हैं। उत्परिवर्तन के आगे अधिग्रहण से अंततः ल्यूकेमिक परिवर्तन और रोग का विकास होगा। दैहिक उत्परिवर्तन आत्म-नवीकरण, अस्तित्व, प्रसार और भेदभाव को नियंत्रित करने वाले जीन में पाए जासकते हैं।

स्वस्थ एचएसपीसी में जीनोम इंजीनियरिंग के माध्यम से व्यक्तिगत उत्परिवर्तन पेश करने से इस चरणबद्ध ल्यूकेमोजेनिक प्रक्रिया को सटीक रूप से मॉडलिंग करने की अनुमति मिलती है। माइलॉयड नियोप्लाज्म जैसे तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल) 18,19 में पाए जाने वाले आवर्तक उत्परिवर्तनों की सीमित संख्या इस बीमारी को विशेष रूप से जीनोम इंजीनियरिंग उपकरणों का उपयोग करके पुन: प्राप्त करने योग्य बनाती है।

दैहिक उत्परिवर्तन केवल एक एलील (मोनोएलील / विषम उत्परिवर्तन) या दोनों एलील (बाइएलील / होमोजीगस उत्परिवर्तन) पर उभर सकते हैं और जीन के कार्य पर गहरा प्रभाव डाल सकते हैं, जो हानि-ऑफ-फ़ंक्शन (एलओएफ) या गेन-ऑफ-फंक्शन (जीओएफ) का कारण बन सकता है। एलओएफ उत्परिवर्तन जीन के कम (यदि एक एलील प्रभावित होता है) या पूर्ण (यदि दोनों एलील प्रभावित होते हैं) एलओएफ का कारण बनते हैं, जबकि जीओएफ उत्परिवर्तन जीन के सक्रियण या नए कार्य को बढ़ाते हैं। जीओएफ उत्परिवर्तन आमतौर पर विषम20 होते हैं।

महत्वपूर्ण रूप से, युग्मनजता (हेटेरो- बनाम होमोजीगोस) में उत्परिवर्तन को ईमानदारी से मॉडल करने के प्रयास के लिए प्रमुख निहितार्थ हैं; इसलिए, एक जीन के केवल एक एलील का लक्षित हेरफेर विषम हॉटस्पॉट जीओएफ उत्परिवर्तन को इंजीनियर करने के लिए आवश्यक है। त्रुटि-प्रवण एनएचईजे विभिन्न लंबाई21 के इंडेल की ओर जाता है जो अलग-अलग, अप्रत्याशित जैविक परिणामों का कारण बन सकता है। हालांकि, चूंकि एनएचईजे डीएसबी की शुरुआत के बाद कोशिकाओं द्वारा नियोजित प्रमुख मरम्मत कार्यक्रम है, इसलिए वर्तमान में एचएसपीसी में हेरफेर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 प्लेटफॉर्म आनुवंशिक परिणाम22,23 की सटीक भविष्यवाणी करने की अनुमति नहीं देते हैं। इसके विपरीत, CRISPR/Cas9-मध्यस्थता डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (DSB) की शुरूआत, HDR के माध्यम से जीनोम इंजीनियरिंग के लिए पुनः संयोजक एडेनो-संबद्ध वायरस (rAAV) वेक्टर-आधारित डीएनए दाता टेम्पलेट्स के उपयोग के साथ मिलकर, मानव HSPCs11,24 में उत्परिवर्तन के एलील-विशिष्ट सम्मिलन की अनुमति देता है। अलग-अलग एलील्स पर अलग-अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ युग्मित एक उत्परिवर्ती और एक जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) अनुक्रम का एक साथ एकीकरण एक विषम जीनोटाइप (चित्रा 2) के लिए चयन करने के लिए किया जा सकता है। एचएसपीसी फ़ंक्शन, रोग दीक्षा और प्रगति पर आवर्तक, ल्यूकेमिक, विषम जीओएफ हॉटस्पॉट म्यूटेशन के प्रभावों को सटीक रूप से चिह्नित करने के लिए इस रणनीति का लाभ उठाया जा सकता है।

इस लेख में, प्राथमिक मानव एचएसपीसी में वर्तमान में उत्परिवर्तित विषम जीओएफ उत्परिवर्तन की कुशल इंजीनियरिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। यह रणनीति विषम जीओएफ उत्परिवर्तन की संभावित पीढ़ी के लिए डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती डीएनए दाता टेम्पलेट प्रदान करने के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 और दोहरे एएवी 6 ट्रांसडक्शन के उपयोग को जोड़ती है। एक उदाहरण के रूप में, कैलरेटिकुलिन (सीएएलआर) जीन में आवर्तक टाइप 1 उत्परिवर्तन (52 बीपी विलोपन) की इंजीनियरिंग25 दिखाई जाएगी। सीएएलआर के एक्सॉन 9 में विषम जीओएफ उत्परिवर्तन वर्तमान में आवश्यक थ्रोम्बोसिथेमिया (ईटी) और प्राथमिक मायलोफाइब्रोसिस (पीएमएफ) 26 जैसे मायलोप्रोलिफेरेटिव विकारों में पाया जाता है। सीएएलआर एक एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम निवासी प्रोटीन है जिसमें मुख्य रूप से नए संश्लेषित प्रोटीन की तह प्रक्रिया में गुणवत्ता नियंत्रण कार्य होता है। इसकी संरचना को तीन मुख्य डोमेन में विभाजित किया जा सकता है: एक एमिनो (एन)-टर्मिनल डोमेन और एक प्रोलाइन-समृद्ध पी डोमेन, जो प्रोटीन के चैपरोन फ़ंक्शन में शामिल हैं, और एक सी-डोमेन, जो कैल्शियम भंडारण और विनियमन27,28 में शामिल है। सीएएलआर उत्परिवर्तन +1 फ्रेमशिफ्ट का कारण बनता है, जिससे एक उपन्यास विस्तारित सी-टर्मिनल अंत का प्रतिलेखन होता है और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) -प्रतिधारण संकेत (केडीईएल) का नुकसान होता है। उत्परिवर्ती सीएएलआर को थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ) रिसेप्टर को बांधने के लिए दिखाया गया है, जिससे प्रसार में वृद्धि के साथ टीपीओ-स्वतंत्र सिग्नलिंगहोती है।

Figure 1
चित्रा 1: एनएचईजे और एचडीआर मरम्मत। डीएनए में डबल-फंसे ब्रेक की शुरूआत के बाद एनएचईजे और एचडीआर मरम्मत तंत्र का सरलीकृत योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: बाइएलील एचडीआर संपादन रणनीति का योजनाबद्ध अवलोकन। योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व लक्षित एलील्स में दाता टेम्पलेट्स के एकीकरण को दर्शाता है, जिसके बाद कार्यशील एमआरएनए में उनका अनुवाद होता है। नारंगी डॉटेड बॉक्स बाएं होमोलॉजी आर्म (एलएचए) और राइट होमोलॉजी आर्म (आरएचए) के अनुरूप क्षेत्रों को इंगित करते हैं। एचए का आदर्श आकार प्रत्येक 400 बीपी है। हरे रंग का बिंदीदार बॉक्स एसए अनुक्रम के अनुरूप क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। SA का आकार 150 bp है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

इस प्रोटोकॉल के लिए स्वस्थ दाता-व्युत्पन्न सीडी 34 + एचएसपीसी के उपयोग की आवश्यकता होती है और स्थानीय संस्थागत समीक्षा बोर्डों (आईआरबी) से नैतिक अनुमोदन और हस्ताक्षरित सूचित सहमति की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सीडी 34 + एचएसपीसी को टर्म डिलीवरी (>34 सप्ताह के गर्भधारण) के गर्भनाल रक्त (यूसीबी) से अलग किया गया था। प्रसव से पहले माताओं से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी, और यूसीबी के संग्रह के लिए नैतिक अनुमोदन प्राप्त किया गया था (आईआरबी अनुमोदन: 31-322 पूर्व 18/19) मेडिकल यूनिवर्सिटी ऑफ ग्राज़ से। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों की एक पूरी सूची सामग्री की तालिका में पाई जा सकती है।

1. एसजीआरएनए डिजाइन और काटने की क्षमता का मूल्यांकन

  1. एक ऑनलाइन डेटाबेस टूल (जैसे, कॉस्मिक, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic) पर वांछित उत्परिवर्तन और सही प्रतिलेख के स्थान की खोज करें।
  2. एसजीआरएनए डिजाइन टूल का उपयोग करके उत्परिवर्तन (एक्सोनिक लक्ष्यीकरण) या पिछले इंट्रॉन (इंट्रोनिक लक्ष्यीकरण) से सटे एसजीआरएनए का चयन करें। इस प्रोटोकॉल में, बेंचलिंग से ऑनलाइन टूल का उपयोग किया जाता है। एसजीआरएनए डिजाइन के लिए संभावित ऑनलाइन उपकरणों की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।
  3. डीएनए अनुक्रम आयात > डेटाबेस से आयात > डीएनए अनुक्रम > + (बनाएं) विकल्प का चयन करें। वांछित जीन जैसे, CALR दर्ज करें और प्रजातियों के रूप में मानव का चयन करें > खोज > आयात > सही प्रतिलेख (जैसे, CALR-201 -ENST00000316448) का चयन करें। रुचि के क्षेत्र का चयन करें जिसमें डीएस ब्रेक को पेश करना है (उदाहरण के लिए, इंट्रोन 7)।
  4. स्क्रीन के दाईं ओर CRISPR विकल्प का चयन करें और डिज़ाइन और विश्लेषण गाइड का चयन करें। एकल गाइड का चयन करें, गाइड की लंबाई 20 बीपी तक रखें, और SpCas9 (NGG) के साथ संपादन के लिए PAM अनुक्रम।
  5. एक उच्च ऑन-टारगेट स्कोर (वांछित स्थान पर संपादन के लिए उच्च मौका) और एक उच्च ऑफ-टारगेट स्कोर (अवांछित लोकी पर संपादन का कम मौका) के साथ एक गाइड चुनें। सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन करने वाले एसजीआरएनए को खोजने के लिए परीक्षण करने के लिए कम से कम तीन गाइड चुनें। एक वाणिज्यिक विक्रेता से रासायनिक रूप से संशोधित सिंथेटिक एसजीआरएनए के रूप में एसजीआरएनए का आदेश दें।
    नोट: इस स्तर पर प्रारंभिक स्क्रीन के लिए सिंथेटिक एसजीआरएनए की एक छोटी मात्रा का आदेश देना उचित है। एक बार जब एक अच्छा प्रदर्शन करने वाले एसजीआरएनए की पहचान हो जाती है, तो चयनित एसजीआरएनए के एक बड़े क्रम के साथ आगे बढ़ें।
  6. कोशिकाओं को10 एमएल पूर्व-गर्म आरपीएमआई 1640 में स्थानांतरित करें, जो 1% एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक है।
    नोट: >90% शुद्धता वाले सीडी 34 + एचएसपीसी का उपयोग सर्वोत्तम और सबसे अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए किया जाना चाहिए।
  7. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज। कोशिकाओं को हेमोसाइटोमीटर के साथ गिनें और एसएफईएम II माध्यम में कोशिकाओं को निलंबित करें, जिसमें 0.2% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), 100 एनजी / एमएल थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ), 100 एनजी / एमएल स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ),100 एनजी / एमएल एफएमएस जैसे टायरोसिन किनेज 3 लिगैंड (एफएलटी 3 एल), 100 एनजी / एमएल इंटरल्यूकिन -6 (आईएल -6), 35 एनएम यूएम 171, और 0.75 एनएम यूएम 171 की एकाग्रता के साथ पूरक है। 48 घंटे -72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: पूर्ण माध्यम को अब से एचएसपीसी प्रतिधारण माध्यम के रूप में संदर्भित किया जाएगा।
  8. कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें और कोशिकाओं की गिनती करें। ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण द्वारा सेल व्यवहार्यता की जांच करें।
    1. शुरू करने से पहले, अभिकर्मक प्रणाली चालू करें और क्यूवेट के लिए विकल्प का चयन करें। एचएसपीसी के लिए उपयुक्त प्रोग्राम और न्यूक्लियोफेक्शन समाधान का चयन करें (सामग्री की तालिका देखें)। 2 x 105 और 5 x 10के बीच 6 कोशिकाओं को एक 100 μL क्यूवेट में न्यूक्लियोफ़ेक्ट किया जा सकता है। डब्ल्यूटी नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाने के लिए 48 घंटे के लिए संस्कृति में रखने के लिए कोशिकाओं की एक छोटी संख्या (जैसे, 1 x 105-2 x 10 5) को अलग रखें।
  9. आरएनपी कॉम्प्लेक्स तैयार करें। एक 1.5 एमएल ट्यूब में, कैस 9 के 15 μg और sgRNA के 8μg (दाढ़ अनुपात 1: 2.5) जोड़ें और एक हीटिंग ब्लॉक में 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. जबकि आरएनपी कॉम्प्लेक्स इनक्यूबेट कर रहा है, 5 मिनट के लिए आरटी पर 350 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और पिपेट का उपयोग करके सुपरनैटेंट को छोड़ दें। न्यूक्लियोफेक्शन समाधान के 100 μL में कोशिकाओं को निलंबित करें।
  11. कोशिकाओं को आरएनपी कॉम्प्लेक्स के साथ मिलाएं और क्यूवेट में स्थानांतरित करें। स्थानांतरण के दौरान बनने वाले किसी भी अंतिम हवा के बुलबुले को हटाने के लिए धीरे से क्यूवेट टैप करें।
  12. संकर्मक प्रणाली के धारक में क्यूवेट डालें और डीजेड -100 प्रोग्राम के साथ कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट करें।
  13. इलेक्ट्रोपोरेशन के तुरंत बाद, पी / एस के बिना पूर्व-गर्म एचएसपीसी प्रतिधारण माध्यम के 400 μL जोड़ें।
  14. सेल संख्या के आधार पर, 0.25 x 10 6 और 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के बीच घनत्व तक पहुंचने के लिए एक उपयुक्त कल्चर प्लेट (24-, 12-, या6-वेल प्लेट) का उपयोग करें।
  15. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। न्यूक्लियो संक्रमित कोशिकाओं को 6-8 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  16. 6-8 घंटे के बाद, पुराने माध्यम को हटा दें और पी / एस के साथ पूरक ताजा पूर्व-गर्म एचएसपीसी प्रतिधारण माध्यम के साथ बदलें। कोशिकाओं को 2.5 x 10 5 और 5 x10 5 के बीच एकाग्रता पर निलंबित करें और सेल कल्चर प्लेट (24-, 12-, या 6-वेल प्लेट) में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  17. 5 मिनट के लिए आरटी पर 2 x 105 कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज को 350 x g पर काटें। शुरू करने से पहले, हीटिंग ब्लॉक को 65 डिग्री सेल्सियस और 98 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  18. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें और कोशिकाओं को 1.5 एमएल ट्यूब में 1x DPBS के 1 mL में निलंबित करें। 5 मिनट के लिए आरटी पर 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  19. सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और डीएनए निष्कर्षण समाधान के 50 μL में कोशिकाओं को निलंबित करें। 15 सेकंड के लिए भंवर।
  20. 65 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 15 सेकंड के लिए भंवर और 98 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  21. पीसीआर द्वारा डीएसबी के क्षेत्र को प्राइमरों का उपयोग करके बढ़ाएं जो केंद्र में डीएसबी के साथ लगभग 400-600 बीपी का एम्प्लिकॉन उत्पन्न करते हैं। पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए निकाले गए डीएनए के 0.5-1 μL का उपयोग करें।
    नोट: डीएनए निष्कर्षण समाधान की संरचना के कारण, डीएनए सांद्रता को स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा सटीक रूप से निर्धारित नहीं किया जा सकता है।
  22. 45-60 मिनट के लिए 100 वी पर 1.5% एगारोस जेल पर डीएनए सीढ़ी के साथ पीसीआर उत्पाद चलाएं। जेल को नीली रोशनी या यूवी ट्रांसिल्युमिनेटर पर रखें।
  23. निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके जेल से सही आकार के डीएनए बैंड को निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  24. पीसीआर से फॉरवर्ड प्राइमर या रिवर्स प्राइमर का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण द्वारा नमूनों को अनुक्रमित करें। लंबाई में 400-600 बीपी के पीसीआर उत्पादों के लिए, 15 μL की कुल मात्रा में 5 ng / mL की एकाग्रता के साथ अनुक्रमण के लिए 75 ng DNA की आवश्यकता होती है।
  25. एसजीआरएनए द्वारा उत्पादित सम्मिलन और विलोपन की पहचान करके संपादन दक्षता की गणना करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रोग्राम में अनुक्रमण फ़ाइलों को अपलोड करके एसजीआरएनए की संपादन दक्षता का विश्लेषण करें। आगे बढ़ने के लिए सबसे अच्छा प्रदर्शन करने वाले एसजीआरएनए का चयन करें।
    नोट: समर्पित ऑनलाइन उपकरण सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध हैं। इस विश्लेषण के लिए ट्रांसक्रिप्टेड और डब्ल्यूटी एचएसपीसी, एसजीआरएनए अनुक्रम और पीएएम अनुक्रम की .ab1 फ़ाइलों की आवश्यकता होती है।

2. होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) वेक्टर निर्माण

  1. HDR टेम्पलेट डिजाइन
    नोट: दो एचडीआर टेम्प्लेट डिज़ाइन किए जाने चाहिए: डब्ल्यूटी अनुक्रम के लिए एक टेम्पलेट और उत्परिवर्तित अनुक्रम के लिए एक टेम्पलेट।
    1. आणविक क्लोनिंग के लिए एक उपयुक्त सॉफ्टवेयर में वांछित जीन के जीनोमिक अनुक्रम और कोडिंग अनुक्रम (सीडीएस) को आयात करें (समर्पित उपकरण सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध पाए जा सकते हैं)। जीनोमिक अनुक्रम फ़ाइल से, डीएसबी के 5 'छोर पर आदर्श रूप से 400 बीपी का चयन करके बाएं होमोलॉजी आर्म (एचए) को डिजाइन करें। इस अनुक्रम को एक नई फ़ाइल में चिपकाएँ.
    2. यदि एक इंट्रोन को एसजीआरएनए के साथ लक्षित किया जाता है, तो एक स्प्लिस स्वीकर्ता (एसए) अनुक्रम को शामिल करने की आवश्यकता होती है। लक्षित इंट्रॉन के अंतिम 150 बीपी का चयन करें और इसे बाएं एचए के बाद पेस्ट करें। यदि एक्सॉन को सीधे लक्षित किया जाता है, तो यह अनुक्रम आवश्यक नहीं है (चित्रा 3)।
    3. CDS फ़ाइल से, रुचि के cdna का चयन करें। यदि एक एक्सोनिक अनुक्रम को लक्षित किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि सीडीएनए डीएसबी साइट के तुरंत डाउनस्ट्रीम शुरू होता है और इसमें रुचि के जीन के साथ-साथ स्टॉप कोडन के निम्नलिखित सभी एक्सॉन शामिल हैं। यदि एक इंट्रोन को लक्षित किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि सीडीएनए निम्नलिखित एक्सॉन के पहले कोडन से शुरू होता है। कोडन-सीडीएनए को अनुकूलित करें और एसए अनुक्रम के बाद इसे डालें। इस उद्देश्य के लिए समर्पित ऑनलाइन उपकरणों का उपयोग करें (सामग्री की तालिका)।
    4. रुचि के सीडीएनए (जैसे, एसवी 40 या बीजीएच) के बाद 3 'पॉलीएडेनाइलेशन (पॉलीए) संकेत डालें (तालिका 1)। पॉलीए के बाद, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एक प्रमोटर अनुक्रम (जैसे, प्लीहा फोकस बनाने वाले वायरस [एसएफएफवी] या पॉलीयूबिकिटिन सी [यूबीसी], तालिका 1) डालें।
    5. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए अनुक्रम डालें (यानी, या तो जीएफपी, बीएफपी, या एमचेरी)। एक दूसरा लेकिन अलग पॉलीए सिग्नल डालें।
      नोट: एक अलग पॉलीए अनुक्रम का सम्मिलन प्लास्मिड के जीवाणु पुनर्संयोजन या टेम्पलेट में दो समान अनुक्रमों के कारण अनुक्रम संरेखण के साथ समस्याओं जैसी समस्याओं से बच जाएगा।
    6. जीनोमिक अनुक्रम फ़ाइल से, डीएसबी के 3 'छोर पर आदर्श रूप से 400 बीपी का चयन करके सही एचए डिजाइन करें। दूसरे पॉलीए के बाद इस अनुक्रम को सम्मिलित करें।
    7. पूरे टेम्पलेट की एक प्रति बनाएं और रुचि के सीडीएनए को संशोधित करें ताकि इसमें वांछित उत्परिवर्तन का अनुक्रम हो।
    8. फ्लोरोसेंट प्रोटीन को एक अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक्सचेंज करें। उदाहरण के लिए, यदि जीएफपी का उपयोग डब्ल्यूटी टेम्पलेट के लिए किया गया था, तो इसे उत्परिवर्ती टेम्पलेट के लिए बीएफपी या एमचेरी के साथ विनिमय करें। पीएएवी-एमसीएस प्लास्मिड (या अन्य उपयुक्त रीढ़) में एचडीआर टेम्प्लेट का निर्माण और क्लोन करें।
      नोट: असेंबली के लिए आवश्यक टुकड़े या तो पीसीआर द्वारा उत्पादित किए जा सकते हैं या व्यावसायिक रूप से आदेश दिए जा सकते हैं और उनके पड़ोसी टुकड़ों के साथ अतिव्यापी अनुक्रमों को शामिल करने की आवश्यकता होती है। यदि ब्याज का उत्परिवर्तन एक बिंदु उत्परिवर्तन, एक छोटा सम्मिलन, या एक छोटा विलोपन है, तो उत्परिवर्तित सीडीएनए को पीसीआर द्वारा डब्ल्यूटी सीडीएनए युक्त एचडीआर टेम्पलेट पर साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस करके उत्पादित किया जा सकता है।
    9. हीट शॉक विधि का उपयोग करके इकट्ठे उत्पाद के साथ सक्षम एस्चेरिचिया कोलाई को बदलें। शुरू करने से पहले, बैक्टीरिया को 10 मिनट के लिए बर्फ पर पिघलने के लिए रखें।
    10. 50 μL बैक्टीरिया में इकट्ठे उत्पादों के 2 μL जोड़ें। सामग्री को कोमल फ्लिक करके मिलाएं।
    11. नमूने को 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। नमूने को 30 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोब्लॉक सेट में स्थानांतरित करें।
    12. नमूने को 5 मिनट के लिए बर्फ पर स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान एसओसी माध्यम के 450 μL जोड़ें और नमूनों को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    13. एम्पीसिलीन युक्त एलबी एगर प्लेटों पर नमूने फैलाएं। प्रत्येक नमूने के लिए, एकल कॉलोनियों के साथ एलबी एगर प्लेटों को प्राप्त करने के लिए बैक्टीरिया के घोल (बिना पतला, 1: 5, और 1: 10) के तीन अलग-अलग कमजोर पड़ने के 100 μL फैलाएं जिन्हें उठाया जा सकता है। प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    14. अगले दिन, प्रति नमूना तीन कॉलोनियों को चुनें। कॉलोनियों को 15 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें, जिसमें 4 एमएल एलबी माध्यम युक्त कैप्स होते हैं जो एम्पीसिलीन के साथ पूरक होते हैं और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक शेकर में रात भर इनक्यूबेट करते हैं।
    15. प्रत्येक कॉलोनी से जीवाणु समाधान के 500 μL का एलिकोट करें और बाद में उपयोग के लिए इसे फ्रिज में स्टोर करें। निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लास्मिड डीएनए निकालने के लिए एक मिनी-तैयारी करें।
    16. प्लास्मिड की सही असेंबली की पुष्टि करने के लिए सेंगर अनुक्रमण के लिए नमूने भेजें। निर्बाध अनुक्रम पुष्टि सुनिश्चित करने के लिए प्लास्मिड में वितरित पर्याप्त प्राइमरों का उपयोग करें, आदर्श रूप से प्रत्येक क्षेत्र को आगे और पीछे पढ़ने के साथ दो बार कवर करें।
    17. एम्पीसिलीन के साथ पूरक एलबी मीडिया के 200 एमएल में सही ढंग से इकट्ठे प्लास्मिड वाले जीवाणु समाधान का 200 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक शेकर में इनक्यूबेट करें।
    18. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्लास्मिड डीएनए निकालने के लिए एक मिडी- या मैक्सी-प्रेप करें। प्लास्मिड डीएनए को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. पुनः संयोजक AAV6 की तैयारी
    नोट: दो अलग-अलग एएवी 6 तैयारी करने की आवश्यकता होगी: एक डब्ल्यूटी एचडीआर टेम्पलेट के साथ आरएएवी 6 के लिए और एक उत्परिवर्तित एचडीआर टेम्पलेट के साथ आरएएवी 6 के लिए। यह खंड केवल एक वायरस की तैयारी के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करता है।
    1. एचईके 293 टी कोशिकाओं को पिघलाएं, कोशिकाओं को 10% एफबीएस, 1% पी / एस और 25 एमएम एचईपीईएस के साथ पूरक पूर्व-गर्म डीएमईएम के 10 एमएल में स्थानांतरित करें, और 5 मिनट के लिए आरटी पर 350 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. कोशिकाओं को 1 x 105 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर निलंबित करें और एक उपयुक्त फ्लास्क (जैसे, 175 सेमी2 फ्लास्क) में स्थानांतरित करें। फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
      नोट: एचईके 293 टी कोशिकाओं को पहले से पिघलाया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं को पूरी तरह से ठीक होने और पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त करने की अनुमति मिल सके (एक वायरस के उत्पादन के लिए 11 x 107 कोशिकाएं आवश्यक हैं)। कम से कम तीन मार्गों के बाद कोशिकाओं का उपयोग करने और कोशिकाओं को 20 मार्ग से नीचे रखने की सिफारिश की जाती है। HEK293T कोशिकाओं को सप्ताह में तीन बार विभाजित किया जाना चाहिए। कोशिकाओं को बनाए रखते समय, इन्हें 70% -80% कंफ्लुएंसी से अधिक नहीं होना चाहिए। एएवी तैयारी में उपयोग किए जाने वाले डीएमईएम को पहले से ही एल-ग्लूटामाइन और सोडियम पाइरूवेट के साथ पूरक किया जाना चाहिए।
    3. कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें और 5 मिनट के लिए आरटी पर 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. 10% एफबीएस, 1% पी / एस, और 25 एमएम एचईपीईएस के साथ पूरक डीएमईएम के 20 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित करें और हेमोसाइटोमीटर के साथ गिनती करें। मृत कोशिका बहिष्करण के लिए ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करें।
    5. डीएमईएम के 20 एमएल में बीज 3 x 106 कोशिकाओं को 175सेमी 2 फ्लास्क में 10% एफबीएस, 1% पी / एस और 25 एमएम एचईपीईएस के साथ पूरक किया जाता है। एक वायरस के उत्पादन के लिए, कम से कम चार 175 सेमी2 फ्लास्क तैयार करें। कोशिकाओं को 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह चरण शुक्रवार को सबसे अच्छा प्रदर्शन किया जाता है क्योंकि यह सप्ताहांत के दौरान कोशिकाओं का विस्तार करने की अनुमति देता है।
    6. HEK293T कोशिकाओं की कटाई और गिनती करें।
    7. वायरस में से एक की तैयारी के लिए, दस 150 मिमी व्यंजन तैयार करें, जिनमें से प्रत्येक में 10% एफबीएस, 1% पी / एस और 25 एमएम एचईपीईएस के साथ पूरक डीएमईएम के 20 एमएल में 11 x 106 एचईके 293 टी शामिल हैं।
    8. व्यंजन को इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर रखें। पुराने माध्यम को सावधानीपूर्वक छोड़ दें और 10% एफबीएस, 25 एमएम एचईपीईएस और 1 एमएम सोडियम ब्यूटाइरेट के साथ पूरक एंटीबायोटिक-मुक्त डीएमईएम के 20 एमएल के साथ बदलें। आगे बढ़ने से पहले, जांच लें कि कोशिकाओं की स्थिरता 80% से ऊपर नहीं है।
    9. दो 15 एमएल ट्यूब तैयार करें जिनमें अभिकर्मक मिश्रण होंगे। ट्यूब 1 में, कम सीरम माध्यम के 5 एमएल, आरएएवी 6 उत्परिवर्तित एचडीआर प्लास्मिड के 60 μg और पीडीजीएम 6 (हेल्पर प्लास्मिड) के 220 μg जोड़ें। ट्यूब 2 में, कम सीरम माध्यम के 5 एमएल और 1 मिलीग्राम / एमएल पॉलीथाइलेनिमाइन समाधान (पीईआई, अभिकर्मक अभिकर्मक) के 1120 μL जोड़ें।
    10. ट्यूब 2 की सामग्री को ट्यूब 1 में जोड़ें और 30 सेकंड के लिए भंवर। पीईआई मिसेल में डीएनए के उचित एनकैप्सुलेशन को सुनिश्चित करने के लिए आरटी में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: समाधान को 20 मिनट से अधिक समय तक न रखें।
    11. सावधानी से प्रत्येक डिश में घोल के ड्रॉपवाइज 1.1 एमएल जोड़ें और धीरे से घूमकर वितरित करें। व्यंजन को इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर रखें।
    12. 48 घंटे के बाद, प्रत्येक डिश में 0.5 एम ईडीटीए का 250 μL जोड़ें और व्यंजनों को 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखें। डिश को धोकर कोशिकाओं को काटें और 500 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब या कई 50 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    13. सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 x g पर। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें। सतह पर तैरने वाले को पूरी तरह से हटाने के लिए, सेंट्रीफ्यूज फिर से 2,000 x g पर 1 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    14. किसी भी शेष सुपरनैटेंट को छोड़ दें। कोई भी अवशिष्ट सतह पर तैरने वाला वायरस के शुद्धिकरण को खराब कर सकता है।
    15. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एएवी शुद्धिकरण किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके गोली को ढीला करें और वायरस निकालें। वैकल्पिक रूप से, आयोडिक्सानोल ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन30,31 द्वारा निष्कर्षण करें।
    16. शुद्ध वायरस को एलिकोट करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इष्टतम पारगमन स्थितियों को निर्धारित करने के लिए एएवी को कार्यात्मक रूप से टाइट करें या डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडीपीसीआर) 32 द्वारा एएवी टिटर की मात्रा निर्धारित करें।
    17. आरएएवी 6 डब्ल्यूटी एचडीआर प्लास्मिड की तैयारी के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  3. डीडीपीसीआर द्वारा एएवी अनुमापन
    1. शुरू करने से पहले, हीटिंग ब्लॉक को 65 डिग्री सेल्सियस और 98 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    2. वायरस के 5 μL में डीएनए निष्कर्षण समाधान के 15 μL जोड़कर वायरल डीएनए निकालें। 15 सेकंड के लिए भंवर।
    3. 65 डिग्री सेल्सियस पर 6 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 15 सेकंड के लिए भंवर। 98 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. निकाले गए डीएनए (जो वायरल डीएनए का 1: 4 कमजोर पड़ना है) का उपयोग डीडीपीसीआर के लिए न्यूक्लियस फ्री (एनएफ) एच2ओ के साथ सीरियल कमजोर पड़ने (1: 400, 1: 40,000, 1: 160,000, 1: 640,000) तैयार करने के लिए करें।
      नोट: यदि डीडीपीसीआर तुरंत नहीं किया जाएगा तो कमजोर पड़ने को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    5. डीडीपीसीआर के लिए कमजोर पड़ने वाले तीन का चयन करें। उपयोग करने के लिए कमजोर पड़ने का विकल्प वायरस की एकाग्रता पर निर्भर करता है। अधिमानतः, मशीन की पहचान सीमा के भीतर सबसे अच्छा कमजोर पड़ने का पता लगाने के लिए तीन अलग-अलग कमजोर पड़ने (जैसे, 1: 40,000, 1: 160,000, और 1: 640,000) का उपयोग करें।
    6. काम करते समय अभिकर्मकों को बर्फ पर रखें। एक मास्टर मिश्रण तैयार करें (सभी नमूने डुप्लिकेट में मापा जाएगा)। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, निम्नलिखित तैयार करें: प्रोब्स के लिए डीडीपीसीआर सुपरमिक्स का 12.5 μL, कोई dUTP नहीं, प्राइमटाइम Std qPCR परख का 1.25 μL, AAV-ITR ( सामग्री की तालिका देखें), और 6.25 μL nf-H2O।
    7. मास्टर मिश्रण के 20 μL के साथ 5 μL DNA मिलाएं। इसे 1: 40,000, 1: 160, 000, और 1: 640, 000 कमजोर पड़ने के लिए करें।
    8. कारतूस धारक में एक कारतूस रखें। तेल के रूप में नामित पंक्ति में जांच में 70 μL ड्रॉपलेट जनरेशन ऑयल जोड़ें। सावधान रहें कि कोई बुलबुला उत्पन्न न करें।
    9. नमूना के रूप में नामित पंक्ति में नमूना मात्रा का 20 μL जोड़ें। सावधान रहें कि कोई बुलबुला उत्पन्न न करें।
    10. गैसकेट के साथ कारतूस को सील करें और इसे ड्रॉपलेट जनरेटर में रखें। मशीन पर स्टार्ट बटन दबाकर बूंदों को उत्पन्न करें, गैसकेट को हटा दें, और एक मल्टी-चैनल पिपेट के साथ, उत्पन्न बूंदों के 40 μL को 96-वेल प्लेट में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। बूंदों और हवा के बुलबुले के विनाश से बचने के लिए धीरे-धीरे काम करें।
    11. पीसीआर प्लेट सीलर का उपयोग करके पियर्स फॉइल (लाल पट्टी के सामने) के साथ 96-वेल प्लेट को सील करें। प्लेट को थर्मोसाइक्लर में रखें।
    12. वॉल्यूम को 40 μL पर सेट करें, ढक्कन तापमान 105 °C पर, और रैंप दरों को 2 °C / s पर सेट करें। तालिका 2 में वर्णित पीसीआर प्रोग्राम चलाएँ।
    13. उपयोग करने से 30 मिनट पहले ड्रॉपलेट रीडर चालू करें। डेस्कटॉप पर सॉफ़्टवेयर खोलें।
    14. प्लेट लेआउट दर्ज करें और प्रयोग टैब में एबीएस और सुपरमिक्स टैब में डीडीपीसीआर सुपरमिक्स का चयन करें। फिर, पहले प्राइम दबाएं, उसके बाद सिस्टम शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर पर फ्लश सिस्टम पर क्लिक करें।
    15. प्लेट को रीडर में दर्ज करें। रन प्रारंभ करें और, समाप्त होने पर, डेटा को स्प्रेडशीट के रूप में बाद के विश्लेषण के लिए CSV फ़ाइल के रूप में निर्यात करें।
      नोट: सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न संख्याएं जीनोम प्रतियां (जीसी) प्रति μL हैं। इन्हें कमजोर पड़ने वाले कारकों से गुणा करने की आवश्यकता है: जीसी / μL x 5 (मास्टर मिश्रण में डीएनए का कमजोर पड़ना) x प्रारंभिक कमजोर पड़ना (यानी, 40,000 या 160,000)।

Figure 3
चित्रा 3: CRISPR / Cas9 HDR नॉक-इन के दौरान इनट्रोनिक और एक्सोनिक लक्ष्यीकरण का योजनाबद्ध अवलोकन। CRISPR / Cas9 HDR नॉक-इन के लिए इनट्रोनिक और एक्सॉनिक लक्ष्यीकरण रणनीतियों के बीच योजनाबद्ध तुलना। (ए) इनट्रोनिक लक्ष्यीकरण के दौरान, डीएनए के इंट्रोन में एक डबल-फंसे हुए ब्रेक को पेश किया जाता है। एचडीआर टेम्पलेट में एक एलएचए, सीडीएनए अनुक्रम और आरएचए शामिल हैं। इनट्रोनिक लक्ष्यीकरण के लिए, इसके अतिरिक्त, 3 'स्प्लिस साइट, शाखा बिंदु और पॉलीपाइरिमिडीन पथ वाले स्लाइस स्वीकर्ता की उपस्थिति की आवश्यकता होती है। यह सही स्प्लिसिंग की अनुमति देता है। हरे रंग का बिंदीदार बॉक्स एसए अनुक्रम के अनुरूप क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) एक्सॉनिक लक्ष्यीकरण सीधे एक्सॉन में डबल-फंसे ब्रेक के उत्पादन पर निर्भर करता है। एचडीआर टेम्पलेट में एक एलएचए, सीडीएनए अनुक्रम और आरएचए शामिल हैं। नारंगी बिंदीदार बक्से एलएचए और आरएचए के अनुरूप क्षेत्रों को इंगित करते हैं। एचए का आदर्श आकार प्रत्येक 400 बीपी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रमोटरों
नाम लंबाई वर्णन
SFFV 492 बीपी प्लीहा फोकस बनाने वाला वायरस प्रमोटर। मजबूत स्तनधारी प्रमोटर। संवैधानिक रूप से व्यक्त
UBC 400 bp प्रमोटर मानव यूबिकिटिन सी जीन से प्राप्त होता है। संवैधानिक रूप से व्यक्त किया गया।
CMV 508 bp साइटोमेगालोवायरस से प्राप्त प्रमोटर। इसमें एक एन्हांसर क्षेत्र हो सकता है। संवैधानिक रूप से व्यक्त किया गया। मजबूत स्तनधारी प्रमोटर। चुप कराया जा सकता है।
EF-1a 1182 बीपी मानव यूकेरियोटिक अनुवाद बढ़ाव कारक 1 अल्फा प्रमोटर। संवैधानिक रूप से व्यक्त किया गया। मजबूत स्तनधारी प्रमोटर।
EFS 200-300 bp ईएफ -1 अल्फा इंट्रॉन-कम लघु रूप
सीएजी 584 bp हाइब्रिड स्तनधारी प्रमोटर जिसमें सीएमवी प्रारंभिक एन्हांसर (सी), चिकन बीटा एक्टिन प्रमोटर (ए), और खरगोश बीटा-ग्लोबिन जीन (जी) के लिए स्प्लिस स्वीकर्ता शामिल हैं। संवैधानिक रूप से व्यक्त किया गया।
पॉलीएडेनाइलेशन (पॉलीए) संकेत
संक्षेपण लंबाई वर्णन
SV40 PolyA 82-122 बीपी सिमियन वायरस 40 पॉलीएडेनाइलेशन सिग्नल
बीजीएच पॉलीए 224 बीपी गोजातीय विकास हार्मोन पॉलीएडेनाइलेशन संकेत
rbGlob PolyA 56 बीपी खरगोश बीटा ग्लोबिन पॉलीएडेनाइलेशन सिग्नल

तालिका 1: प्रमोटर और पॉलीएडेनाइलेशन सिग्नल।

क़दम तापमान समय चक्र
एंजाइम सक्रियण 95° C 10 मिनट 1x
विकृतीकरण 94° C 30 सेकंड 42x
एनीलिंग 60 ° C 1 मिनट
विस्तार 72° C 30 सेकंड
एंजाइम निष्क्रियीकरण 98 ° C 10 मिनट 1x
पकड 4° C ∞

तालिका 2: डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर प्रोग्राम।

3. एचएसपीसी का संपादन

  1. एचएसपीसी का अभिकर्मक और पारगमन
    1. सीडी 34 + एचएसपीसी को पिघलाएं और कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए आरटी पर 350 x ग्राम पर 1% पी / एस सेंट्रीफ्यूज के साथ पूरक 10 एमएल पूर्व-गर्म आरपीएमआई में स्थानांतरित करें।
    2. एचएसपीसी प्रतिधारण माध्यम में कोशिकाओं को 2.5 x 105 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता तक निलंबित करें और 48 घंटे -72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेट करें।
    3. कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में काटें। कोशिकाओं की गणना करें और ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण द्वारा सेल व्यवहार्यता की जांच करें। 2 x 105 और 5 x 10 के बीच6 कोशिकाओं को एक ही क्यूवेट में न्यूक्लियोफ़ेक्ट किया जा सकता है। अपने परिकलित सेल नंबर के आधार पर क्यूवेट की उचित संख्या तैयार करें।
    4. आरएनपी कॉम्प्लेक्स तैयार करें। एक 1.5 एमएल ट्यूब में, कैस 9 के 15 μg और sgRNA के 8μg (दाढ़ अनुपात 1: 2.5) जोड़ें और एक हीटिंग ब्लॉक में 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. जबकि आरएनपी कॉम्प्लेक्स इनक्यूबेट हो रहा है, 5 मिनट के लिए 350 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    6. न्यूक्लियोफेक्शन समाधान के 100 μL में कोशिकाओं को निलंबित करें। कोशिकाओं को आरएनपी कॉम्प्लेक्स के साथ मिलाएं और क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
    7. स्थानांतरण के दौरान बनने वाले किसी भी अवशिष्ट हवा के बुलबुले को हटाने के लिए धीरे से क्यूवेट को टैप करें।
    8. संकर्मक प्रणाली के धारक में क्यूवेट डालें और कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरेट करें जैसा कि पहले एसजीआरएनए डिजाइन अनुभाग में वर्णित है।
    9. इलेक्ट्रोपोरेशन के तुरंत बाद, पी /एस के बिना पूर्व-गर्म एचएसपीसी प्रतिधारण माध्यम के 400 μL जोड़ें और P/ S के बिना पूर्व-गर्म एचएसपीसी प्रतिधारण माध्यम के 500 μL वाले ऊतक संवर्धन प्लेट में एक ठीक स्थानांतरण पिपेट के साथ कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। सेल संख्या के आधार पर, 0.25 x 10 6 और 1 x 106 कोशिकाओं / mL के बीच घनत्व तक पहुंचने के लिए एक उपयुक्त कल्चर प्लेट (24-, 12-, या6-वेल प्लेट) का उपयोग करें। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस/5% सीओ2 पर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
    10. बर्फ पर जमे हुए आरएएवी वाली शीशियों को पिघलाएं। सेल निलंबन के लिए प्रत्येक आरएएवी 6 की इष्टतम मात्रा को पाइप करके कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें। उच्च पारगमन क्षमता प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद 20-30 मिनट के भीतर पारगमन करें।
      नोट: प्रत्येक वायरस की इष्टतम एकाग्रता (डब्ल्यूटी एचडीआर टेम्पलेट के लिए एक वायरस और उत्परिवर्तित एचडीआर टेम्पलेट के लिए दूसरा अलग वायरस) प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। आमतौर पर, 5,000-10,000 जीसी / सेल (उदाहरण के लिए, 1 x 106 कोशिकाओं के लिए 5 x 109 जीसी) के परिणामस्वरूप उच्च पारगमन होता है।
    11. धीरे से पिपेट के साथ सेल निलंबन मिलाएं। ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को 6-8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें। 6-8 घंटे के बाद, कोशिकाओं को एक ट्यूब में इकट्ठा करें और 5 मिनट के लिए आरटी पर 350 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    12. पुराने माध्यम को छोड़ दें और पी / एस के साथ पूरक ताजा पूर्व-गर्म एचएसपीसी प्रतिधारण माध्यम के साथ बदलें।
    13. कोशिकाओं को 2.5 x 10 5-5 x 105 कोशिकाओं / एमएल के बीच एकाग्रता पर निलंबित करें और ऊतक-उपचारित सेल कल्चर प्लेट (24-, 12-, या 6-वेल प्लेट) में स्थानांतरित करें। छंटाई के साथ आगे बढ़ने से पहले कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ2 पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. विषम जीओएफ उत्परिवर्तन वाले इंजीनियर एचएसपीसी की प्रवाह छंटाई
    1. कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में काटें और सेंट्रीफ्यूज को 5 मिनट के लिए आरटी पर 350 x g पर काटें। सतह पर तैरने वाले को हटा दें, 0.1% बीएसए युक्त डीपीबीएस के 1 एमएल में कोशिकाओं को निलंबित करें, और 5 मिनट के लिए आरटी पर 350 x g पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. सुपरनैटेंट को छोड़ दें और सेल संख्या के आधार पर डीपीबीएस + 0.1% बीएसए की उचित मात्रा में कोशिकाओं को निलंबित करें।
      नोट: सॉर्टर को बंद करने के जोखिम को कम करने के लिए कोशिकाओं को 200 μL की न्यूनतम मात्रा पर निलंबित करने और 1 x 107 कोशिकाओं / mL से अधिक नहीं होने की सिफारिश की जाती है।
    3. कोशिकाओं को एक टोपी से लैस बाँझ एफएसीएस ट्यूब में स्थानांतरित करें। मृत सेल बहिष्करण के लिए सेल निलंबन में 7-एएडी या अन्य व्यवहार्यता डाई (फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ उनकी संगतता के आधार पर) जोड़ें।
    4. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के लिए डबल पॉजिटिव जीवित कोशिकाओं को एक संग्रह ट्यूब में क्रमबद्ध करें जिसमें एचएसपीसी प्रतिधारण माध्यम का 200 μL होता है।
      नोट: सॉर्टिंग प्रक्रिया के दौरान उचित गेटिंग सुनिश्चित करने के लिए केवल एएवी के साथ ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं से युक्त उचित नियंत्रण जोड़े जाने चाहिए।
    5. आरटी पर 350 x g पर क्रमबद्ध कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और संस्कृति में आगे विस्तार के लिए 2.5 x 105 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर एचएसपीसी प्रतिधारण माध्यम में कोशिकाओं को निलंबित करें या कार्यात्मक परख के लिए सीधे कोशिकाओं का उपयोग करें।

4. सफल जीन संपादन की पुष्टि

  1. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण
    1. शुरू करने से पहले, हीटिंग ब्लॉक को 65 डिग्री सेल्सियस और 98 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें। 2 x 105 जीनोम-संपादित और सॉर्ट-शुद्ध कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज को 5 मिनट के लिए 350 x g पर काटें।
    2. पहले वर्णित के रूप में जीडीएनए निकालें। या तो पीसीआर के लिए सीधे डीएनए समाधान का उपयोग करें या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. इन-आउट पीसीआर
    1. 5'सम्मिलन स्थल (चित्रा 4 ए) को बढ़ाने के लिए दो प्राइमर डिजाइन करें: प्राइमर फॉरवर्ड 1 बाएं होमोलॉजी आर्म के बाहर जीनोमिक लोकस को लक्षित करता है; प्राइमर रिवर्स 2 एकीकृत अनुक्रम को लक्षित करता है।
    2. इन-आउट पीसीआर के लिए, प्रति प्रतिक्रिया निम्नलिखित पीसीआर मिश्रण तैयार करें:
      पीसीआर मास्टर मिक्स के 10 μL (2x; सामग्री की तालिका देखें)
      प्राइमर फॉरवर्ड 1 (10 μM स्टॉक) का 1 μL
      प्राइमर रिवर्स 2 का 1 μL (10 μM स्टॉक)
      निकाले गए डीएनए का 0.5-1.0 μL
      न्यूक्लियस-मुक्त H2O 20 μL की अंतिम मात्रा के लिए
      नोट: एक से अधिक प्रतिक्रियाओं के लिए, एक मास्टर मिश्रण तैयार करना उचित है जिसमें पिपेटिंग त्रुटियों के लिए एक अतिरिक्त प्रतिक्रिया होती है। मॉक-उपचारित नमूने से एक गैर-टेम्पलेट नियंत्रण और टेम्पलेट डीएनए को शामिल करना महत्वपूर्ण है।
    3. पीसीआर प्रतिक्रियाओं को उपयुक्त थर्मल साइकिलिंग प्रोग्राम के साथ चलाएं (निर्माता के निर्देश देखें)।
      नोट: इष्टतम एनीलिंग तापमान के लिए पहले प्राइमर जोड़ी का परीक्षण करना उचित है। यह टीएम की गणना करके और फिर पीसीआर को थर्मोसाइक्लर के साथ चलाकर किया जा सकता है जो ढाल तापमान कर सकता है।
    4. 45-60 मिनट के लिए 100 वी पर 1.5% एगारोस जेल पर डीएनए सीढ़ी के साथ पीसीआर उत्पादों को चलाएं (चित्रा 4 बी)। जेल को नीली रोशनी या यूवी ट्रांसिल्युमिनेटर पर रखें। जेल से बैंड का उत्पादन करें।
    5. डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके बैंड से डीएनए निकालें। अंतर्जात जीन लोकस पर वांछित सीडीएनए के सही और निर्बाध एकीकरण की पुष्टि करने के लिए सेंगर अनुक्रमण के लिए उपयुक्त प्राइमरों के साथ निकाले गए पीसीआर नमूने भेजें।

Figure 4
चित्रा 4: इन-आउट पीसीआर द्वारा जीनोमिक एकीकरण का सत्यापन। (ए) इन-आउट पीसीआर रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। चित्रित रणनीति में, दो प्राइमर डिजाइन किए गए थे। प्राइमर फॉरवर्ड 1 एलएचए के बाहर जीनोमिक लोकस को लक्षित करता है, और प्राइमर रिवर्स 2 कोडन-अनुकूलित अनुक्रम को लक्षित करता है। (बी) एक अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। केवल सफलतापूर्वक संपादित कोशिकाएं (आरएनपी + एएवी) इन-आउट पीसीआर के दौरान पीसीआर उत्पाद उत्पन्न करेंगी, जबकि असंपादित नमूने (केवल एएवी) पीसीआर उत्पाद उत्पन्न नहीं करेंगे। संक्षिप्त नाम: एनटीसी = गैर-टेम्पलेट नियंत्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

उपर्युक्त वर्णित प्रोटोकॉल को लागू करके, कॉर्ड-ब्लड व्युत्पन्न एचएसपीसी में विषम प्रकार 1 सीएएलआर उत्परिवर्तन ों को पुन: पेश किया गया था। इस उत्परिवर्तन में एक्सॉन 9 (सीएएलआर का अंतिम एक्सॉन) में 52 बीपी विलोपन होता है, जिसके परिणामस्वरूप +1 फ्रेमशिफ्ट होता है, जिससे एक उपन्यास सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए सी-टर्मिनल डोमेन26,33 का अनुवाद होता है। अंतर्जात जीन लोकस पर सीएएलआर उत्परिवर्तन को पेश करने के लिए, एक्सॉन 9 के अपस्ट्रीम में एक इनट्रोनिक लक्ष्यीकरण रणनीति अपनाई गई थी, क्योंकि यह उन मामलों में कोडिंग अनुक्रम में किसी भी अवांछित परिवर्तन को दरकिनार कर देगा जहां सीएएस 9-प्रेरित डीएसबी को एचडीआर तंत्र के माध्यम से मरम्मत नहीं की गई थी। इस विशिष्ट मामले में, इंट्रॉन 7 के लिए एक एसजीआरएनए को अनुकूल होमोलॉजी आर्म्स (अनुक्रम दोहराव की कमी) के संयोजन में उच्च ऑन-टारगेट और कम ऑफ-टारगेट अनुक्रमों की उपलब्धता के कारण डिजाइन किया गया था। चित्रा 5 ए)।

दो दाता टेम्प्लेट तब एएवी 6 वैक्टर में डिजाइन और पैक किए गए थे। अंतर्जात एक्सॉन से एकीकृत सीडीएनए में सही स्प्लिसिंग को सक्षम करने के लिए, दाता टेम्प्लेट में (i) 3'स्प्लिस-साइट, शाखा बिंदु और पॉलीपाइरिमिडीन पथ सहित एक एसए अनुक्रम होता है, (ii) एक्सॉन 8-9 के कोडन-अनुकूलित सीडीएनए अनुक्रम, जिसमें या तो डब्ल्यूटी (सीएएलआरडब्ल्यूटी) या उत्परिवर्तित अनुक्रम (सीएएलआरडीईएल) होता है एक स्टॉप कोडन, (iii) एक सिमियन वायरस 40 (एसवी 40) पॉलीए सिग्नल, (iv) अलग आंतरिक प्रमोटर, प्लीहा फोकस बनाने वाले वायरस (एसएफएफवी) प्रमोटर के नियंत्रण में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एक अनुक्रम एन्कोडिंग, इसके बाद (वी) एक गोजातीय विकास हार्मोन (बीजीएच) पॉलीए सिग्नल। CALRWT cDNA युक्त दाता टेम्पलेट को GFP कैसेट रखने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि CALRDEL cDNA अनुक्रम वाले दाता टेम्पलेट को BFP कैसेट रखने के लिए डिज़ाइन किया गया था। पूरा निर्माण एक बाएं और दाएं एचए (चित्रा 5 ए) से घिरा हुआ था।

आरएनपी कॉम्प्लेक्स के साथ अभिकर्मक और आरएएवी 6 वायरस के साथ पारगमन के दो दिन बाद, कोशिकाओं का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। चार मुख्य आबादी का पता लगाया जा सकता है: (i) कोशिकाएं न तो जीएफपी और न ही बीएफपी को व्यक्त करती हैं, बिना एचडीआर-आधारित जीनोम संपादन वाली कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं, (ii) कोशिकाएं केवल जीएफपी के लिए सकारात्मक होती हैं, जो केवल डब्ल्यूटी निर्माण को एकीकृत करती हैं, (iii) कोशिकाएं केवल बीएफपी के लिए सकारात्मक होती हैं, जो केवल उत्परिवर्तित निर्माण को एकीकृत करती हैं, और (iv) जीएफपी और बीएफपी डबल-पॉजिटिव कोशिकाएं। उन कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करना जिन्होंने डब्ल्यूटी और उत्परिवर्तित अनुक्रम दोनों को एकीकृत किया था (चित्रा 5 बी)। विषम प्रकार 1 सीएएलआर उत्परिवर्तन वाले एचएसपीसी की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए, डबल-पॉजिटिव कोशिकाओं को फ्लो साइटोमेट्री द्वारा क्रमबद्ध किया गया था। एचएसपीसी जिसमें दो डब्ल्यूटी अनुक्रमों को खटखटाया गया था, उन्हें नियंत्रण कोशिकाओं (जीएफपी + एमचेरी +) के रूप में उपयोग किया गया था। चित्रा 5 बी)। नियंत्रण कोशिकाओं के रूप में उपयोग करने का एक वैध विकल्प एचएसपीसी होगा जिसमें एक सुरक्षित बंदरगाह लोकस (यानी, एएवीएस 1; नहीं दिखाया गया) में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के द्विस्तरीय एकीकरण के साथ होगा। क्रमबद्ध एचएसपीसी पर किए गए ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण द्वारा सेल गिनती ने संकेत दिया कि 90% से अधिक कोशिकाएं व्यवहार्य थीं।

इन-आउट पीसीआर रणनीति (चित्रा 6 ए) को लागू करके संरचनाओं के निर्बाध ऑन-टारगेट एकीकरण की पुष्टि की गई थी। इस विशिष्ट मामले में, हमने दो अलग-अलग इन-आउट पीसीआर का प्रदर्शन किया, एक नॉक-इन सीएएलआरडब्ल्यूटी अनुक्रम ( चित्रा 6 ए में जेल वैद्युतकणसंचलन का लेन 1) और एक नॉक-इन सीएएलआरडीईएल अनुक्रम ( चित्रा 6 ए के जेल वैद्युतकणसंचलन का लेन 2) के लिए। जेल बैंड से निकाले गए डीएनए पर किए गए सेंगर अनुक्रमण ने सीएएलआरडीईएल / डब्ल्यूटी एचएसपीसी (चित्रा 6 बी) में डब्ल्यूटी और उत्परिवर्तित अनुक्रमों के सही सम्मिलन की पुष्टि की।

Figure 5
चित्र 5: विषमयुग्मी सीएएलआर उत्परिवर्तन वाले एचएसपीसी का उत्पादन। (ए) विषमयुग्मी सीएएलआर उत्परिवर्तन के सम्मिलन के लिए संपादन रणनीति को दर्शाती प्रतिनिधि योजना। आरएनपी कॉम्प्लेक्स सीएएलआर जीन के एक्सॉन 7 और एक्सॉन 8 के बीच इंट्रोन को लक्षित करता है। दो एएवी, एक में उत्परिवर्तित एक्सॉन 8-9 और एक बीएफपी और दूसरे में डब्ल्यूटी एक्सॉन 8-9 और एक जीएफपी होता है, दाता मरम्मत टेम्पलेट के रूप में काम करेगा और एक एलील में उत्परिवर्तित अनुक्रम के एकीकरण और शेष एलील में डब्ल्यूटी अनुक्रम के एकीकरण को बढ़ावा देगा। (B) HSPCs के अभिकर्मक और पारगमन के बाद GFP और BFP या GFP और mCherry 48 घंटे की अभिव्यक्ति को दर्शाने वाले प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री प्लॉट। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
(ए) एएवी नियंत्रण, सीएएलआरडब्ल्यूटी/ डब्ल्यूटी, और सीएएलआर डीईएल / डब्ल्यूटी से निकाले गए जीनोमिक डीएनए पर किए गए इन-आउट पीसीआर के उत्पादों से जेल वैद्युतकणसंचलन। एक 100 बीपी डीएनए सीढ़ी का उपयोग किया गया था। संक्षिप्त नाम: एनटीसी = गैर-टेम्पलेट नियंत्रण। (ख)सीएएलआर डीईएल/डब्ल्यूटी पर किए गए इन-आउट पीसीआर से प्राप्त सेंगर अनुक्रमण परिणाम डब्ल्यूटी और उत्परिवर्तित अनुक्रमों के सफल एकीकरण की पुष्टि करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

मानव प्राथमिक एचएसपीसी का कुशल और सटीक आनुवंशिक हेरफेर सामान्य हेमटोपोइजिस को प्रभावित करने वाली प्रक्रियाओं का पता लगाने और समझने का एक शानदार अवसर का प्रतिनिधित्व करता है, और सबसे महत्वपूर्ण बात, हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं का ल्यूकेमिक परिवर्तन।

इस प्रोटोकॉल में, आवर्तक विषम जीओएफ उत्परिवर्तन को व्यक्त करने के लिए मानव एचएसपीसी को इंजीनियर करने के लिए एक कुशल रणनीति का वर्णन किया गया था। इस प्रक्रिया ने CRISPR / Cas9 तकनीक और rAAV6 वैक्टर का डीएनए टेम्पलेट्स के लिए दाताओं के रूप में लाभ उठाया ताकि डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती डीएनए अनुक्रमों को उनके अंतर्जात जीन लोकी में सटीक रूप से सम्मिलित किया जा सके। अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के साथ इंजीनियर सीडीएनए (डब्ल्यूटी और उत्परिवर्ती) को युग्मित करने से कोशिकाओं के संवर्धन और ट्रैकिंग के लिए एक निश्चित विषम अवस्था के साथ अनुमति मिलती है।

यह रणनीति अक्सर उपयोग किए जाने वाले लेंटिवायरल (एलवी) -आधारित तरीकों की तुलना में कई फायदे प्रस्तुत करती है। एक मुख्य लाभ यह है कि CRISPR / Cas9-आधारित प्रणाली अंतर्जात लोकी में सटीक संपादन की अनुमति देती है, जिसके परिणामस्वरूप अंतर्जात प्रमोटरों और नियामक तत्वों का संरक्षण होता है। यह कोशिकाओं में संपादित जीन की अभिव्यक्ति में एकरूपता की ओर जाता है, एक लक्ष्य जो एलवी-आधारित विधि का उपयोग करते समय शायद ही प्राप्त किया जा सकता है। एलवी वैक्टर के साथ जीन स्थानांतरण ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय साइटों के लिए वरीयता के साथ जीन के अर्ध-यादृच्छिक एकीकरण की ओर जाताहै। यह संपादित कोशिकाओं के बीच स्थानांतरित जीन और विषमता के अतिवृद्धि में अनुवाद कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अंततः उत्परिवर्तन और जीन इंटरैक्शन की भूमिका की जांच और विश्लेषण करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। एक दूसरा लाभ यह है कि वर्णित प्रणाली, एक साइट-विशिष्ट संपादन प्रणाली होने के नाते, सम्मिलन म्यूटेनेसिस35 के जोखिमों को समाप्त करती है।

दोहरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर रणनीति उन कोशिकाओं के सटीक संवर्धन और ट्रैकिंग की अनुमति देती है जिन्हें दोनों एलील पर सफलतापूर्वक संपादित किया गया था, जिसमें एक एलील डब्ल्यूटी सीडीएनए को एकीकृत करता है और दूसरा एलील उत्परिवर्तित सीडीएनए अनुक्रमों को एकीकृत करता है। केवल एक रिपोर्टर को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं या तो केवल मोनोएलील एकीकरण या एक ही फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ एचडीआर टेम्प्लेट के बाइएलील एकीकरण का प्रतिनिधित्व करती हैं। दोनों परिदृश्यों को केवल तभी सटीक रूप से अलग किया जा सकता है जब एकल सेल-व्युत्पन्न क्लोन का उत्पादन और व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया जाता है। हालांकि, एचएसपीसी के पास विट्रो में केवल सीमित प्रोलिफेरेटिव क्षमता होती है, और जब विस्तारित अवधि के लिए संस्कृति में रखा जाता है, तो एचएसपीसी अधिक परिपक्व संतान में अंतर करना शुरू कर देते हैं और अपनी आत्म-नवीकरण और एनग्राफमेंट क्षमता खो देते हैं। यह वांछित विषम उत्परिवर्तन को आश्रय देने वाले एकल-कोशिका क्लोनों का चयन और विस्तार करना असंभव बनाता है। विषम उत्परिवर्तन वाले कोशिकाओं के लिए फ्लो साइटोमेट्री द्वारा दोहरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन रणनीति और संवर्धन का अनुप्रयोग विस्तारित इन विट्रो संस्कृति द्वारा प्रेरित समस्याओं को दरकिनार करने की अनुमति देता है।

इस विशिष्ट उदाहरण में, यह सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया गया था कि एचएसपीसी को कुशलतापूर्वक इंजीनियर और क्रमबद्ध किया जा सकता है ताकि विषम सीएएलआरडीईएल / डब्ल्यूटी उत्परिवर्तन वाले एचएसपीसी की शुद्ध आबादी प्राप्त की जा सके।

हालांकि, यह प्रणाली इंजीनियरिंग विषम फ्रेमशिफ्ट म्यूटेशन तक सीमित नहीं है, बल्कि इसे अन्य उत्परिवर्तन प्रकारों को बनाने के लिए भी आसानी से अपनाया जा सकता है, जिसमें गलत समझ और बकवास उत्परिवर्तन शामिल हैं। विभिन्न फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन के साथ डब्ल्यूटी या उत्परिवर्तित अनुक्रमों वाले एएवी के विभिन्न संयोजनों को लागू करके, इस प्रणाली का उपयोग होमोजीगोस म्यूटेशन (दो आरएएवी के साथ एक साथ पारगमन दोनों उत्परिवर्ती सीडीएनए लेकिन अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर) या यहां तक कि उत्परिवर्तन के सुधार के लिए भी किया जा सकता है (दो एएवी के साथ एक साथ पारगमन दोनों डब्ल्यूटी सीडीएनए लेकिन अलग फ्लोरोसेंट रिपोर्टर ले जाते हैं)। इसके अतिरिक्त, यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि यह रणनीति ऑन्कोजेनिक जीओएफ उत्परिवर्तन की शुरूआत तक सीमित नहीं है। वास्तव में, वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग जीन नॉक-आउट, जीन रिप्लेसमेंट36,37, ट्रांसजेन्स के लक्षित नॉक-इन (यानी, चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स) 38 और यहां तक कि रोग पैदा करने वाले उत्परिवर्तन11,39 के सुधार सहित कई वैकल्पिक रणनीतियों के लिए किया जा सकता है।

कई फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ CRISPR / Cas9 और AAV6 के संयोजन की रणनीति को कई अन्य सेल प्रकारों में भी लागू दिखाया गया है जिसमें टी-सेल, प्लास्मोसाइटोइड डेंड्राइटिक कोशिकाएं, प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल, न्यूरोनल स्टेम सेल और वायुमार्ग स्टेम सेल 24,38,40,41,42,43,44 शामिल हैं। . इस रणनीति को बेहतर चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाओं के उत्पादन के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह हाल ही में प्रकाशित किया गया था कि सीएआर टी कोशिकाओं में टीजीएफबीआर 2 जीन का सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता नॉक-आउट दमनकारी टीजीएफ -β समृद्ध ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट45 में उनके कार्य को बहुत बढ़ाता है। इस तरह का दृष्टिकोण सीएआर को व्यक्त करने के लिए टी कोशिकाओं को इंजीनियर करने और टीजीएफबीआर 2 जीन को विशेष रूप से टीजीएफबीआर 2 जीन के दोनों एलील में सीएआर डालने के लिए टीजीएफबीआर 2 जीन को नॉक आउट करने के लिए एक-चरण प्रोटोकॉल प्रदान कर सकता है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण टी सेल रिसेप्टर अल्फा कॉन्स्टेंट (टीआरएसी) जीन46,47 में सीएआर को एकीकृत करके सार्वभौमिक सीएआर टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए भी उपयोगी हो सकता है।

प्रजनन क्षमता बढ़ाने और कोशिकाओं के कुशल संपादन की गारंटी देने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण विचारों का ध्यान रखा जाना चाहिए। कोशिकाओं के सफल संपादन को सुनिश्चित करने के लिए मुख्य महत्वपूर्ण बिंदु (i) एसजीआरएनए का चयन, (ii) एचडीआर टेम्पलेट का डिजाइन, और (iii) आरएएवी 6 उत्पादन में रहते हैं।

एक अच्छा प्रदर्शन करने वाले एसजीआरएनए का चयन महत्वपूर्ण है क्योंकि यह एलील्स की अधिकतम संख्या निर्धारित करेगा जिसमें एचडीआर टेम्पलेट को एकीकृत किया जा सकता है। कई सॉफ्टवेयर के कारण जो अब उपलब्ध हैं, उम्मीदवार एसजीआरएनए की खोज को सरल बनाया गया है। रुचि के क्षेत्र का चयन करके, सॉफ्टवेयर ऑन-टारगेट स्कोर और एक ऑफ-टारगेट स्कोर के साथ एसजीआरएनए की एक श्रृंखला का प्रस्ताव कर सकता है जो क्रमशः वांछित स्थान और अवांछित लोकी पर संपादन की संभावनाओं को इंगित करता है। इन स्कोर की गणना पहले प्रकाशित स्कोरिंग मॉडल48,49 के आधार पर की जाती है। यद्यपि यह एक अच्छे प्रदर्शन वाले एसजीआरएनए का चयन करने के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है, एसजीआरएनए के प्रदर्शन की पुष्टि करने की आवश्यकता है क्योंकि सिलिको में इसका अनुमानित प्रदर्शन हमेशा विट्रो में एक कुशल एसजीआरएनए के अनुरूप नहीं होता है। इसलिए, सबसे अच्छा एसजीआरएनए खोजने की संभावना बढ़ाने के लिए कम से कम तीन एसजीआरएनए को डिजाइन और परीक्षण करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। एक बार जब एक सच्चे अच्छे प्रदर्शन वाले एसजीआरएनए की पहचान की जाती है, तो एचडीआर टेम्पलेट के डिजाइन के साथ आगे बढ़ने का सुझाव दिया जाता है।

एचडीआर टेम्पलेट डिजाइन करते समय सावधानियों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। बाएं और दाएं होमोलॉजी आर्म्स (एलएचए और आरएचए, क्रमशः) को क्रमशः एसजीआरएनए कट साइट के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम में 400 बीपी का विस्तार करना चाहिए, क्योंकि छोटे एचए के परिणामस्वरूप एचडीआर आवृत्तियों में कमी आ सकती है। सीडीएनए का आकार जिसे एचडीआर के माध्यम से पेश किया जा सकता है, एएवी की पैकेजिंग क्षमताओं पर निर्भर है, जो लगभग 4.7 केबी है। एचडीआर टेम्पलेट (एलएचए, आरएचए, एसए, पॉलीए, प्रमोटर और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अनुक्रम) के भीतर अनिवार्य कई तत्वों के कारण, उत्परिवर्तित या डब्ल्यूटी सीडीएनए के लिए शेष स्थान सीमित है। यह समस्याग्रस्त नहीं है यदि वांछित उत्परिवर्तन जीन के 3 'छोर के पास या समग्र लघु सीडीएस वाले जीन में स्थित है। हालांकि, ऐसे मामलों में जहां उत्परिवर्तन एक लंबे सीडीएस (एएवी के शेष पैकिंग स्थान से अधिक) के साथ जीन के ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्ट साइड (टीएसएस) के पास स्थित है, यह वर्णित दृष्टिकोण संभव नहीं हो सकता है। इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, एक रणनीति जो एचडीआर टेम्पलेट को दो एएवी में विभाजित करने पर निर्भर करती है, हाल ही में बाक और सहयोगियों द्वारा विकसित की गई है। यह रणनीति एक बड़े जीन50 के अंतिम निर्बाध एकीकरण को प्राप्त करने के लिए दो अलग-अलग एचडीआर-मध्यस्थता एकीकरण पर निर्भर करती है।

वायरस की गुणवत्ता और इसके टिटर अतिरिक्त कारक हैं जो कोशिकाओं की सफल जीनोम इंजीनियरिंग को बना या तोड़ सकते हैं। इष्टतम उपज के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि संस्कृति में बनाए रखते हुए एचईके 293 टी को पूर्ण सामंजस्य तक न पहुंचने दें। आदर्श रूप से, एचईके 293 टी कोशिकाओं को विभाजित किया जाना चाहिए जब 70% -80% कंफ्लुएंसी तक पहुंच जाता है। इसके अतिरिक्त, एचईके 293 टी को लंबे समय तक सुसंस्कृत नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि इससे वायरस का उत्पादन करने की उनकी क्षमता कम हो सकती है। नई एचईके 293 टी कोशिकाओं को 20 मार्गों के बाद पिघलाने की आवश्यकता होती है। प्रयोगों की दक्षता और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए उच्च वायरस टिटर्स प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। कम वायरल टिटर्स एचएसपीसी के पारगमन के लिए आवश्यक आरएएवी समाधान की बड़ी मात्रा में अनुवाद करेंगे। एक सामान्य नियम के रूप में, न्यूक्लियो संक्रमित कोशिकाओं में जोड़ा गया आरएएवी समाधान एचएसपीसी प्रतिधारण माध्यम की कुल मात्रा के 20% से अधिक नहीं होना चाहिए। एएवी समाधान की उच्च मात्रा से कोशिका मृत्यु, कम प्रसार और बिगड़ा हुआ पारगमन क्षमता बढ़ सकती है। कम वायरस टिटर्स के मामले में, इसलिए, वायरस को और अधिक केंद्रित करने की सिफारिश की जाती है।

सारांश में, यह प्रोटोकॉल अतिरिक्त दोहरे फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ CRIPSR / Cas9 और rAAV6 दाता टेम्पलेट्स के एक साथ उपयोग के माध्यम से मानव एचएसपीसी को सटीक और कुशलता से हेरफेर करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण सामान्य हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल जीव विज्ञान और ल्यूकेमोजेनेसिस में उत्परिवर्तन के योगदान का अध्ययन करने में एक महान उपकरण साबित हुआ है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम ऑस्ट्रियाई विज्ञान निधि (एफडब्ल्यूएफ; संख्या पी 32783 और आई 5021) से एआर को अनुदान द्वारा समर्थित है, एआर को अतिरिक्त धन ऑस्ट्रियाई सोसाइटी ऑफ इंटरनल मेडिसिन (जोसेफ स्कोडा फैलोशिप), ऑस्ट्रियाई सोसाइटी ऑफ हेमेटोलॉजी एंड ऑन्कोलॉजी (ओईजीएचओ) द्वारा भी प्रदान किया जाता है; नैदानिक अनुसंधान अनुदान), और एमईएफओग्राज़। टीके ल्यूकेमिया एंड लिम्फोमा सोसाइटी के एक विशेष फेलो हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated Corning 431080
150 mm x 25 mm dishes Corning 430599
293T DSMZ ACC 635 https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nucleofector Core Unit Lonza - For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program.
4D Nucleofector X Unit Lonza -
500 ml Centrifuge Tube Corning 431123
7-AAD BD Biosciences 559925
AAVpro Purification Kit Takara 6666
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 Integrated DNA Technologies (IDT) 1081058
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge Beckman Coulter -
Benchling sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad -
Chemically modified synthetic sgRNA Synthego Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’         An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases.     *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)
CHOPCHOP sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3526
CRISPick sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
CRISPOR sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net
ddPCR 96-Well Plates Bio-Rad 12001925
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863024
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator  Bio-Rad 1864008
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator  Bio-Rad 1863009
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific K1081
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 1863005
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose Sigma-Aldrich D6429-6X500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
FACSAria Fusion BD Biosciences -
Falcon 5 mL Round Bottom Corning 352054
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml Pan Biotech P40-47500
FlowJo 10.8.0 BD Biosciences  -
GenAgarose L.E. Inno-train GX04090
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo Scientific SM0321
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs Inc. (NEB) E2611L
HEK293T
HEPES solution Sigma-Aldrich H0887-100ML
ICE Synthego https://ice.synthego.com
IDT codon optimization tool IDT https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool
IDT sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium Sigma-Aldrich L7658-1KG
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium Sigma-Aldrich L7533-1KG
Midori Green Advance Nippon Genetics MG04
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010L
Monarch DNA Gel Extraction Kit NEB T1020L
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) NEB C2987U
Nuclease-Free Water, 5X100 ml Ambion AM9939
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml Gibco 31985070
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor  X Kit L Lonza V4XP-3024 The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix.
pAAV-MCS2 Addgene 46954
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable Bio-Rad 1814040
pDGM6 Addgene 110660
Penicillin-Streptomycin (P/S) Gibco 15140122
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966 Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C.
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap
Primers  Eurofins - Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)                                                     Primer 1 Fwd:    AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;                Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;                     Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC
PrimeTime qPCR Primer Assay IDT - PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers)  that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std - qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6
PX1 PCR Plate Sealer Bio-Rad 1814000
QuantaSoft Software Bio-Rad
Quick Extract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T
QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 1864002
QX200 Droplet Reader Bio-Rad
Recombinant human Flt3-ligand Peprotech 300-19
Recombinant human IL-6 Peprotech 200-06
Recombinant Human SCF Peprotech 300-07
Recombinant Human TPO Peprotech 300-18
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758-6X500ML
SnapGene Dotmatics Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used.
Soc outgrowth medium NEB B9020S
Sodium-butyrate Sigma-Aldrich B5887-1G
Stem Regenin 1 (SR1) Biogems 1224999
StemSpan SFEM II STEMCELL Technologies 9655
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X Thermo Scientific  B49
TIDE http://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154-100ML
TrypLE (with phenol red), 500 ml Thermo Scientific 16605-028
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml Thermo Scientific 15575-038
UM171 STEMCELL Technologies 72914
Vector Builder codon optimization tool Vector Builder https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html

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References

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Sconocchia, T., Foßelteder, J., Köhnke, T., Majeti, R., Reinisch, A. Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (193), e64558, doi:10.3791/64558 (2023).

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