Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Engineering onkogene heterozygote gain-of-function mutasjoner i humane hematopoietiske stamceller og stamceller

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64558
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1,3
1Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical University of Graz, 2Division of Hematology, Stanford Cancer Institute, Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Blood Group Serology and Transfusion Medicine, Medical University of Graz

Summary

Nye strategier for å trofast modellere somatiske mutasjoner i hematopoietiske stam- og stamceller (HSPCs) er nødvendige for å bedre studere hematopoietisk stamcellebiologi og hematologiske maligniteter. Her beskrives en protokoll for å modellere heterozygote gain-of-function-mutasjoner i HSPC-er ved å kombinere bruken av CRISPR/Cas9 og dobbel rAAV-donortransduksjon.

Abstract

Gjennom hele levetiden får hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCs) somatiske mutasjoner. Noen av disse mutasjonene endrer HSPC funksjonelle egenskaper som spredning og differensiering, og dermed fremme utviklingen av hematologiske maligniteter. Effektiv og presis genetisk manipulering av HSPCer er nødvendig for å modellere, karakterisere og bedre forstå de funksjonelle konsekvensene av tilbakevendende somatiske mutasjoner. Mutasjoner kan ha en skadelig effekt på et gen og resultere i tap av funksjon (LOF) eller, i sterk kontrast, kan forbedre funksjonen eller til og med føre til nye egenskaper av et bestemt gen, kalt gain-of-function (GOF). I motsetning til LOF-mutasjoner forekommer GOF-mutasjoner nesten utelukkende på en heterozygot måte. Nåværende genomredigeringsprotokoller tillater ikke selektiv målretting av individuelle alleler, noe som hindrer muligheten til å modellere heterozygote GOF-mutasjoner. Her gir vi en detaljert protokoll om hvordan man konstruerer heterozygote GOF-hotspot-mutasjoner i menneskelige HSPC-er ved å kombinere CRISPR/Cas9-mediert homologi-rettet reparasjon og rekombinant AAV6-teknologi for effektiv DNA-donormaloverføring. Det er viktig at denne strategien bruker et dobbelt fluorescerende reportersystem for å muliggjøre sporing og rensing av vellykket heterozygously redigerte HSPC-er. Denne strategien kan brukes til å nøyaktig undersøke hvordan GOF-mutasjoner påvirker HSPC-funksjonen og deres progresjon mot hematologiske maligniteter.

Introduction

Med utviklingen av den grupperte regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / Cas9-teknologien, har et nytt og ekstremt kraftig instrument blitt lagt til verktøykassen til forskere. Denne teknologien tillater presis prosjektering av genomet og har vist seg å være ekstremt nyttig, ikke bare for forskningsformål (gjennomgått i Hsu et al.1), men har nylig også blitt oversatt til den kliniske innstillingen 2,3,4. CRISPR / Cas9 redigeringsstrategier er avhengige av aktiviteten til et Cas9-protein og et enkeltstyrt RNA (sgRNA) 5,6,7. I vertscellen ledes Cas9-proteinet til et bestemt sted i DNA som er komplementært til sgRNA-sekvensen og vil introdusere en DNA-dobbeltstrengsbrudd (DSB). Når en DSB er generert, er det to hoved- og konkurrerende reparasjonsmekanismer som kan oppstå: ikke-homolog endeforbindelse (NHEJ) og homologi-rettet reparasjon (HDR). NHEJ er en feilutsatt, hovedsakelig brukt reparasjonsmekanisme som fører til innsettinger og slettinger (indels), mens HDR, ved å bruke søsterkromatid som reparasjonsmal, er veldig presis, men begrenset til S- eller G2-fasen av cellesyklusen8. I genomteknikk kan HDR brukes til målrettet modifisering av DNA ved å gi en donormal som er flankert av homologiarmer som er identiske med begge DNA-endene av Cas9-indusert DSB (figur 1). Typen donormal som brukes til HDR kan i stor grad påvirke redigeringseffektiviteten. For genteknologi i humane HSPCer har adeno-assosiert virus serotype 6 (AAV6) nylig blitt beskrevet som et utmerket kjøretøy for levering av enkeltstrengede DNA-maler 9,10.

CRISPR / Cas9 genomteknikk kan brukes terapeutisk for å korrigere skadelige mutasjoner11, men kan også brukes til å introdusere patogene mutasjoner i DNA for å modellere kreftutvikling12. Blodkreft, som leukemi, utvikler seg via sekvensiell oppkjøp av somatiske mutasjoner i friske HSPCs13,14. Tidlige genetiske hendelser fører til en klonal proliferativ fordel, noe som resulterer i klonal hematopoiesis av ubestemt potensial (CHIP) 15,16. Videre oppkjøp av mutasjoner vil til slutt føre til leukemisk transformasjon og utvikling av sykdommen. Somatiske mutasjoner finnes i gener som styrer selvfornyelse, overlevelse, spredning og differensiering17.

Innføring av individuelle mutasjoner via genomteknikk i sunne HSPC-er gjør det mulig å modellere denne trinnvise leukemogene prosessen nøyaktig. Det begrensede antallet tilbakevendende mutasjoner funnet i myeloide neoplasmer som akutt myelogen leukemi (AML) 18,19 gjør denne sykdommen spesielt egnet til å bli rekapitulert ved hjelp av genomtekniske verktøy.

Somatiske mutasjoner kan oppstå på bare ett allel (monoalleliske/heterozygote mutasjoner) eller på begge alleler (bialleliske/homozygote mutasjoner) og kan ha dyptgående effekter på genets funksjon, noe som kan føre til tap av funksjon (LOF) eller gevinst-av-funksjon (GOF). LOF-mutasjoner fører til en redusert (hvis ett allel påvirkes) eller fullstendig (hvis begge allelene påvirkes) LOF av genet, mens GOF-mutasjoner fører til økt aktivering eller ny funksjon av genet. GOF-mutasjoner er typisk heterozygote20.

Det er viktig at zygositeten (hetero- vs. homozygot) har store implikasjoner for forsøket på å trofast modellere en mutasjon; Derfor er målrettet manipulering av bare ett allel av et gen nødvendig for å konstruere heterozygote hotspot GOF-mutasjoner. Feilutsatt NHEJ fører til indels av forskjellige lengder21 som kan føre til varierende, uforutsigbare biologiske konsekvenser. Men siden NHEJ er det dominerende reparasjonsprogrammet som brukes av celler etter introduksjonen av en DSB, tillater de fleste CRISPR / Cas9-plattformer som for tiden brukes til å manipulere HSPC-er, ikke nøyaktig å forutsi det genetiske utfallet22,23. I motsetning til dette tillater introduksjonen av en CRISPR / Cas9-mediert dobbeltstrengsbrudd (DSB), kombinert med bruk av rekombinante adeno-assosierte virus (rAAV) vektorbaserte DNA-donormaler for genomteknikk via HDR, allelspesifikk innsetting av mutasjoner i humane HSPCer11,24. Samtidig integrasjon av en mutant og en villtype (WT) sekvens kombinert med distinkte fluorescerende reportere på de enkelte alleler kan utføres for å selektere for en heterozygot genotype (figur 2). Denne strategien kan utnyttes som et kraftig verktøy for å nøyaktig karakterisere effekten av tilbakevendende, leukemiske, heterozygote GOF-hotspotmutasjoner på HSPC-funksjon, sykdomsinitiering og progresjon.

I denne artikkelen er det gitt en detaljert protokoll for effektiv prosjektering av tilbakevendende muterte heterozygote GOF-mutasjoner i primære humane HSPCer. Denne strategien kombinerer bruken av CRISPR/Cas9 og en dobbel AAV6-transduksjon for å gi WT- og mutante DNA-donormaler for den potensielle genereringen av den heterozygote GOF-mutasjonen. Som et eksempel vil prosjektering av de tilbakevendende type 1-mutasjonene (52 bp-delesjon) i calreticulin (CALR) -genet bli vist25. Den heterozygote GOF-mutasjonen i ekson 9 av CALR er gjentatte ganger funnet i myeloproliferative lidelser som essensiell trombocytemi (ET) og primær myelofibrose (PMF)26. CALR er et endoplasmatisk retikulum bosatt protein som primært har en kvalitetskontrollfunksjon i foldeprosessen av nylig syntetiserte proteiner. Dens struktur kan deles inn i tre hoveddomener: et amino (N) -terminaldomene og et prolinrikt P-domene, som er involvert i proteinets chaperonefunksjon, og et C-domene, som er involvert i kalsiumlagring og regulering27,28. CALAR-mutasjoner forårsaker en +1 rammeforskyvning, noe som fører til transkripsjon av en ny utvidet C-terminal ende og tap av endoplasmatisk retikulum (ER) -retensjonssignal (KDEL). Mutant CALR har vist seg å binde trombopoietinreseptoren (TPO), og dermed føre til TPO-uavhengig signalering med økt proliferasjon29.

Figure 1
Figur 1: NHEJ og HDR reparasjon. Forenklet skjematisk fremstilling av NHEJ- og HDR-reparasjonsmekanismer etter innføring av et dobbeltstrenget brudd i DNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk oversikt over biallelisk HDR-redigeringsstrategi. Skjematisk fremstilling som viser integrering av donormalene i de målrettede allelene etterfulgt av deres oversettelse til fungerende mRNA-er. De oransje stiplede boksene indikerer regionene som tilsvarer venstre homologiarm (LHA) og høyre homologiarm (RHA). Den ideelle størrelsen på HAs er 400 bp hver. Den grønne stiplede boksen representerer regionen som tilsvarer SA-sekvensen. Størrelsen på SA er 150 bp. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Denne protokollen krever bruk av sunne donoravledede CD34+ HSPC-er og krever etisk godkjenning fra de lokale institusjonelle gjennomgangsstyrene (IRB) og signert informert samtykke. CD34+ HSPC-ene som ble brukt i denne protokollen ble isolert fra navlestrengsblodet (UCB) av terminleveranser (>34 ukers svangerskap). Informert samtykke ble innhentet fra mødrene før levering, og etisk godkjenning for innsamling av UCB ble innhentet (IRB-godkjenning: 31-322 ex 18/19) fra Medical University of Graz. En fullstendig liste over materialer som brukes i denne protokollen, finner du i materialtabellen.

1. sgRNA-design og evaluering av skjæreeffektivitet

  1. Søk etter plasseringen av ønsket mutasjon og riktig transkripsjon på et online databaseverktøy (f.eks. COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).
  2. Velg et sgRNA ved siden av mutasjonen (eksonisk målretting) eller i forrige intron (intronic targeting) ved hjelp av et sgRNA-designverktøy. I denne protokollen brukes det elektroniske verktøyet fra Benchling. Se materialtabellen for en liste over mulige elektroniske verktøy for sgRNA-design.
  3. Velg alternativet + (opprett) > DNA-sekvens > Importer DNA-sekvenser > Importer fra databaser. Skriv inn ønsket gen, for eksempel CALR og velg menneske som art > Søk > Velg riktig transkripsjon (f.eks. CALR-201 -ENST00000316448) > Import. Velg interesseområdet der du vil introdusere DS-pausen (f.eks. intron 7).
  4. Velg CRISPR-alternativet på høyre side av skjermen, og velg Utform og analyser støttelinjer. Velg enkelt guide, hold guidelengden til 20 bp, og PAM-sekvens for redigering med SpCas9 (NGG).
  5. Velg en guide med høy poengsum på målet (høy sjanse for redigering på ønsket sted) og en høy off-target score (lav sjanse for redigering ved uønskede loci). Velg minst tre guider for å teste for å finne det best presterende sgRNA. Bestill sgRNA som et kjemisk modifisert syntetisk sgRNA fra en kommersiell leverandør.
    MERK: Det anbefales på dette stadiet å bestille en liten mengde syntetiske sgRNA for startskjermbildet. Når et godt utførende sgRNA er identifisert, fortsett med en større rekkefølge av det valgte sgRNA.
  6. Tine 2 x 105-5 x 105 CD34+ HSPCs. Overfør cellene til 10 ml forvarmet RPMI1640 supplert med 1% antibiotika (f.eks. Penicillin / streptomycin).
    MERK: CD34+ HSPC-er med en renhet på >90 % bør brukes for å oppnå de beste og mest reproduserbare resultatene.
  7. Sentrifuge ved 350 x g ved romtemperatur (RT) i 10 minutter. Tell cellene med et hemocytometer og suspendere cellene i SFEM II-medium supplert med 0,2% penicillin / streptomycin (P / S), 100 ng / ml trombopoietin (TPO), 100 ng / ml stamcellefaktor (SCF), 100 ng / ml FMS-lignende tyrosinkinase 3 ligand (FLT3L), 100 ng / ml interleukin-6 (IL-6), 35 nM UM171 og 0,75 μM StemRegenin1 (SR1) til en konsentrasjon på 2,5 x 105 celler / ml . Inkuber ved 37 °C/5 % CO2 i 48 timer – 72 timer.
    MERK: Det komplette mediet vil fra nå av bli referert til som HSPC-oppbevaringsmedium.
  8. Samle cellene i et 15 ml rør og telle cellene. Kontroller cellens levedyktighet ved å trypan blå ekskludering.
    1. Før du starter, slå på transfeksjonssystemet og velg alternativet for kyvettene. Velg riktig program og nukleofeksjonsløsning for HSPC-er (se tabell over materialer). Mellom 2 x 10 5 og5 x 106 celler kan nukleofekteres i en 100 μL kyvette. Sett av et lite antall celler (f.eks. 1 x 10 5-2 x 105) for å holde i kultur i 48 timer som skal brukes som en WT-kontroll.
  9. Forbered RNP-komplekset. I et 1,5 ml rør, tilsett 15 μg Cas9 og 8 μg sgRNA (molforhold 1: 2,5) og inkuber ved 25 ° C i 10 minutter i en varmeblokk.
  10. Mens RNP-komplekset inkuberer, sentrifugerer cellene ved 350 x g ved RT i 5 minutter og kaster supernatanten ved hjelp av en pipette. Suspender cellene i 100 μL nukleofeksjonsløsning.
  11. Bland cellene med RNP-komplekset og overfør til kyvetten. Trykk forsiktig på kyvetten for å fjerne eventuelle luftbobler som kan ha dannet seg under overføringen.
  12. Sett kyvetten inn i holderen til transfeksjonssystemet og elektroporate cellene med DZ-100-programmet.
  13. Umiddelbart etter elektroporering, tilsett 400 μL forvarmet HSPC-retensjonsmedium uten P/S.
  14. Overfør cellene med en fin overføringspipette til en kulturplate som inneholder forvarmet HSPC-retensjonsmedium uten P/S. Avhengig av cellenummeret, bruk en passende kulturplate (24-, 12- eller 6-brønnsplate) for å nå en tetthet mellom 0,25 x 106 og 1 x 106 celler/ml.
  15. Overfør platen til inkubatoren ved 37 °C/5 % CO2. Inkuber de nukleofiserte cellene i 6-8 timer.
  16. Etter 6-8 timer, fjern det gamle mediet og erstatt med ferskt forvarmet HSPC-retensjonsmedium supplert med P / S. Suspender cellene i en konsentrasjon mellom 2,5 x 105 og 5 x 105 og overfør til en cellekulturplate (24-, 12- eller 6-brønnplate). Inkuber cellene i 48 timer ved 37 °C/5 % CO2.
  17. Høst 2 x 10 5 celler og sentrifuger ved 350 x g ved RT i5 minutter. Før start skal varmeblokkene settes til 65 °C og 98 °C.
  18. Kast supernatanten og suspender cellene i 1 ml 1x DPBS i et 1,5 ml rør. Sentrifuge ved 350 x g ved RT i 5 min.
  19. Kast supernatanten og suspender cellene i 50 μL DNA-ekstraksjonsløsning. Vortex for 15 s.
  20. Rug i 6 minutter ved 65 °C. Virvel i 15 s og inkuber i 2 minutter ved 98 °C.
  21. Forsterk regionen til DSB ved PCR ved hjelp av primere som genererer en amplicon på omtrent 400-600 bp med DSB i midten. Bruk 0,5-1 μL ekstrahert DNA for PCR-reaksjonen.
    MERK: På grunn av sammensetningen av DNA-ekstraksjonsløsningen kan DNA-konsentrasjonene ikke kvantifiseres nøyaktig ved spektrofotometri.
  22. Kjør PCR-produktet med en DNA-stige på en 1,5 % agarosegel ved 100 V i 45-60 minutter. Plasser gelen på et blått lys eller UV-transilluminator.
  23. Trekk ut DNA-båndet av riktig størrelse fra gelen ved å bruke et kommersielt tilgjengelig sett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabell).
  24. Sekvenser prøvene ved hjelp av Sanger-sekvensering ved hjelp av fremoverprimeren eller omvendt primer fra PCR. For PCR-produkter på 400-600 bp i lengde er det nødvendig med 75 ng DNA for sekvensering med en konsentrasjon på 5 ng / ml i et totalt volum på 15 μL.
  25. Analyser redigeringseffektiviteten til sgRNA-ene ved å laste opp sekvenseringsfilene til et program designet for å beregne redigeringseffektiviteten ved å identifisere innsetting og slettinger produsert av sgRNA. Velg det sgRNA-et som gir best resultater, for å fortsette med.
    MERK: Dedikerte elektroniske verktøy er oppført i materialtabellen. Denne analysen krever .ab1-filene til de transfiserte og WT HSPC-ene, sgRNA-sekvensen og PAM-sekvensen.

2. Homologi-rettet reparasjon (HDR) vektor konstruksjon

  1. HDR mal design
    MERK: To HDR-maler bør utformes: en mal for WT-sekvensen og en mal for den muterte sekvensen.
    1. Importer genomsekvensen og kodesekvensen (CDS) av det ønskede genet til en passende programvare for molekylær kloning (dedikerte verktøy finnes oppført i materialtabellen). Fra genomisk sekvensfil designer du venstre homologiarm (HA) ved å velge ideelt 400 bp på 5'-enden av DSB. Lim inn denne sekvensen i en ny fil.
    2. Hvis et intron er målrettet med sgRNA, må en spleiseakseptorsekvens (SA) inkluderes. Velg de siste 150 bp av det målrettede intronet og lim det inn etter venstre HA. Hvis eksonet er direkte målrettet, er denne sekvensen ikke nødvendig (figur 3).
    3. Fra CDS-filen velger du cDNA av interesse. I tilfelle en eksonisk sekvens er målrettet, må du sørge for at cDNA starter umiddelbart nedstrøms for DSB-stedet og inkluderer alle følgende eksoner av genet av interesse, samt stoppkodonet. Hvis et intron er målrettet, må du sørge for at cDNA starter med det første kodonet av følgende ekson. Codon-optimaliser cDNA og sett den inn etter SA-sekvensen. Bruk dedikerte elektroniske verktøy til dette formålet (Table of Materials).
    4. Sett inn et 3' polyadenyleringssignal (PolyA) etter cDNA av interesse (f.eks. SV40 eller bGH) (tabell 1). Etter PolyA, sett inn en promotorsekvens (f.eks. miltfokusdannende virus [SFFV] eller polyubiquitin C [UBC], tabell 1) for det fluorescerende proteinet.
    5. Sett inn sekvensen for det fluorescerende proteinet (dvs. enten GFP, BFP eller mCherry). Sett inn et annet, men annet PolyA-signal.
      MERK: Innsetting av en annen PolyA-sekvens vil unngå problemer som bakteriell rekombinasjon av plasmidet eller problemer med sekvensjustering på grunn av to identiske sekvenser i malen.
    6. Fra den genomiske sekvensfilen designer du riktig HA ved å velge ideelt 400 bp på 3'-enden av DSB. Sett inn denne sekvensen etter den andre PolyA.
    7. Lag en kopi av hele malen og modifiser cDNA av interesse slik at den inneholder sekvensen av ønsket mutasjon.
    8. Bytt det fluorescerende proteinet med et annet fluorescerende protein. Hvis GFP for eksempel ble brukt for WT-malen, bytter du den ut med BFP eller mCherry med mutantmalen. Konstruer og klon HDR-malene i pAAV-MCS-plasmidet (eller andre passende ryggrader).
      MERK: Fragmentene som kreves for montering kan produseres enten ved PCR eller bestilles kommersielt og må inneholde overlappende sekvenser med sine nærliggende fragmenter. Hvis mutasjonen av interesse er en punktmutasjon, en liten innsetting eller en liten sletting, kan det muterte cDNA produseres ved PCR ved å utføre en stedsrettet mutagenese på HDR-malen som inneholder WT cDNA.
    9. Transformer kompetent Escherichia coli med det monterte produktet ved å bruke varmesjokkmetoden. Før du starter, legg bakteriene til å tine på is i 10 minutter.
    10. Tilsett 2 μL av de monterte produktene til 50 μL bakterier. Bland innholdet ved å bla forsiktig.
    11. Legg prøvene på is i 30 min. Overfør prøvene til et termoblokksett til 42 °C i 30 s.
    12. Overfør prøvene på is i 5 min. Tilsett 450 μL romtemperatur SOC-medium og inkuber prøvene ved 37 °C i 1 time.
    13. Spred prøvene på LB-agarplater som inneholder ampicillin. For hver prøve, spred 100 μL av tre forskjellige fortynninger av bakterieoppløsningen (ufortynnet, 1:5 og 1:10) for å oppnå LB-agarplater med enkeltkolonier som kan plukkes. Inkuber platene over natten ved 37 °C.
    14. Neste dag velger du tre kolonier per prøve. Overfør koloniene til 15 ml rør med lokk som inneholder 4 ml LB-medium supplert med ampicillin og inkubert over natten i en shaker ved 37 °C.
    15. Aliquot 500 μL av bakterieoppløsningen fra hver koloni og oppbevar den i kjøleskapet for senere bruk. Utfør en mini-prep for å trekke ut plasmid-DNA i henhold til produsentens instruksjoner.
    16. Send prøvene for Sanger-sekvensering for å bekrefte riktig montering av plasmidene. Bruk nok primere fordelt over hele plasmidet for å sikre uavbrutt sekvensbekreftelse, og dekk ideelt hver region to ganger med forover- og bakoveravlesninger.
    17. Tilsett 200 μL av bakterieoppløsningen som inneholder riktig montert plasmid til 200 ml LB-medier supplert med ampicillin og inkuber i en shaker over natten ved 37 °C.
    18. Utfør en midi- eller maxi-prep for å trekke ut plasmid-DNA i henhold til produsentens instruksjoner. Oppbevar plasmid-DNA ved -20 °C.
  2. Rekombinant AAV6 tilberedning
    MERK: To separate AAV6-preparater må utføres: en for rAAV6 med WT HDR-malen og en for rAAV6 med den muterte HDR-malen. Denne delen beskriver trinnene som trengs for å forberede bare ett virus.
    1. Tine HEK293T-celler, overfør cellene til 10 ml forvarmet DMEM supplert med 10% FBS, 1% P / S og 25 mM HEPES, og sentrifuge ved 350 x g ved RT i 5 minutter.
    2. Suspendere cellene i en konsentrasjon på 1 x 105 celler / ml og overføre til en egnet kolbe (f.eks en 175 cm2 kolbe). Overfør kolben til en inkubator ved 37 °C/5 % CO2.
      MERK: HEK293T-celler bør tines på forhånd for å tillate cellene å fullstendig gjenopprette og for å oppnå et tilstrekkelig antall celler (11 x 107 celler er nødvendige for produksjon av ett virus). Det anbefales å bruke cellene etter minst tre passasjer og å holde cellene under 20 passasjer. HEK293T-celler skal deles tre ganger i uken. Mens du opprettholder cellene, bør disse ikke overstige 70% -80% sammenløp. DMEM som brukes i AAV-preparatet, bør også allerede suppleres med L-glutamin og natriumpyruvat.
    3. Samle cellene i et 50 ml rør og sentrifuge ved 350 x g ved RT i 5 minutter.
    4. Suspender cellene i 20 ml DMEM supplert med 10% FBS, 1% P / S og 25 mM HEPES og telle med et hemocytometer. Bruk trypanblå for utelukkelse av døde celler.
    5. Frø 3 x 106 celler i 20 ml DMEM supplert med 10% FBS, 1% P / S og 25 mM HEPES i en 175 cm2 kolbe. For produksjon av ett virus, lag minst fire 175 cm2 kolber. Inkuber cellene ved 37 °C/5 % CO2 i 3 dager.
      MERK: Dette trinnet utføres best på en fredag, da det gjør at cellene kan utvide seg i løpet av helgen.
    6. Høst og tell HEK293T-cellene.
    7. For tilberedning av et av virusene, tilbered ti 150 mm retter som hver inneholder 11 x 106 HEK293T i 20 ml DMEM supplert med 10% FBS, 1% P / S og 25 mM HEPES.
    8. Plasser oppvasken i inkubatoren ved 37 °C/5% CO2 i 24 timer. Kast forsiktig det gamle mediet og erstatt med 20 ml antibiotikafri DMEM supplert med 10% FBS, 25 mM HEPES og 1 mM natriumbutyrat. Før du fortsetter, må du kontrollere at sammenløpet av cellene ikke er over 80%.
    9. Forbered to 15 ml rør som vil inneholde transfeksjonsblandingene. Til rør 1, tilsett 5 ml redusert serummedium, 60 μg rAAV6 mutert HDR-plasmid og 220 μg pDGM6 (hjelperplasmid). Til rør 2, tilsett 5 ml redusert serummedium og 1120 mikroliter 1 mg/ml polyetyleniminoppløsning (PEI, transfeksjonsreagens).
    10. Tilsett innholdet i Tube 2 til Tube 1 og vortex i 30 s. Inkuber i 15 minutter ved RT for å sikre riktig innkapsling av DNA i PEI-micellene.
      MERK: Ikke oppbevar oppløsningen i mer enn 20 minutter.
    11. Tilsett forsiktig dråpevis 1,1 ml av løsningen til hver tallerken og fordel ved å virvle forsiktig. Plasser oppvasken i inkubatoren ved 37 °C/5 % CO2 i 48 timer.
    12. Etter 48 timer, tilsett 250 μL 0,5 M EDTA til hver tallerken og legg oppvasken i inkubatoren i 10 minutter. Høst cellene ved å vaske dem av fatet og overfør til et 500 ml sentrifugerør eller flere 50 ml rør.
    13. Sentrifuge ved 2 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten. For å sikre fullstendig fjerning av supernatanten, sentrifuger du igjen ved 2000 x g i 1 min ved 4 °C.
    14. Kast eventuell gjenværende supernatant. Enhver gjenværende supernatant kan svekke virusrensingen.
    15. Løsne pelleten ved vortexing og trekk ut viruset ved å bruke et AAV-rensesett (se Materialfortegnelse) i henhold til produsentens instruksjoner. Alternativt kan du utføre ekstraksjon ved iodixanol gradient ultracentrifugation30,31.
    16. Aliquot det rensede viruset og lagre ved -80 ° C. Titrere AAV funksjonelt eller kvantifisere AAV-titeren med digital dråpe-PCR (ddPCR)32 for å bestemme de optimale transduksjonsforholdene.
    17. Gjenta denne prosessen for fremstilling av rAAV6 WT HDR-plasmidet.
  3. AAV-titrering med ddPCR
    1. Før start skal varmeblokkene settes til 65 °C og 98 °C.
    2. Ekstrahering av viralt DNA ved å tilsette 15 μL DNA-ekstraksjonsløsning til 5 μL av viruset. Vortex for 15 s.
    3. Rug i 6 minutter ved 65 °C. Vortex for 15 s. Rug i 2 minutter ved 98 °C.
    4. Bruk det ekstraherte DNA (som er en 1: 4 fortynning av viralt DNA) for å forberede serielle fortynninger (1: 400, 1: 40,000, 1: 160,000, 1: 640,000) med nukleasefri (nf) H2O for ddPCR.
      MERK: Fortynningene kan oppbevares ved −20 °C hvis ddPCR ikke vil bli utført umiddelbart.
    5. Velg tre av fortynningene for ddPCR. Valget av fortynning som skal brukes, avhenger av konsentrasjonen av viruset. Bruk helst tre forskjellige fortynninger (f.eks. 1:40 000, 1:160 000 og 1:640 000) for å finne den beste fortynningen som er innenfor maskinens deteksjonsgrense.
    6. Hold reagensene på is mens du arbeider. Forbered en masterblanding (alle prøvene vil bli målt i duplikater). For hver reaksjon, forbered følgende: 12,5 μL ddPCR Supermix for sonder, ingen dUTP, 1,25 μL PrimeTime Std qPCR Assay, AAV-ITR (se Materialtabell) og 6,25 μL nf-H2O.
    7. Bland 5 μL DNA med 20 μL av masterblandingen. Utfør dette for fortynningene 1:40 000, 1:160 000 og 1:640 000.
    8. Plasser en sylinderampulle i sylinderampulleholderen. Tilsett 70 μL dråpegenereringsolje til sondene i raden denominert som Olje. Vær forsiktig så du ikke genererer bobler.
    9. Legg til 20 μL av prøvevolumet i raden betegnet som Prøve. Vær forsiktig så du ikke genererer bobler.
    10. Forsegl patronen med pakningen og legg den i dråpegeneratoren. Generer dråpene ved å trykke på startknappen på maskinen, fjern pakningen og overfør forsiktig, med en flerkanalspipette, 40 μL av de genererte dråpene til en 96-brønnsplate. Arbeid sakte for å unngå ødeleggelse av dråper og luftbobler.
    11. Forsegl 96-brønnsplaten med gjennomboringsfolie (den røde stripen vendt opp) ved hjelp av PCR-plateforsegleren. Plasser platen i en termocycler.
    12. Sett volumet til 40 μL, lokktemperaturen til 105 °C og rampehastigheten til 2 °C/s. Kjør PCR-programmet som beskrevet i tabell 2.
    13. Slå på dråpetelleren 30 min før bruk. Åpne programvaren på skrivebordet.
    14. Skriv inn plateoppsettet og velg ABS i eksperimentfanen og ddPCR Supermix i Supermix-fanen . Trykk deretter først på PRIME, etterfulgt av å klikke FLUSH SYSTEM på programvaren for å starte systemet.
    15. Sett platen inn i leseren. Start kjøringen, og når du er ferdig, eksporter du dataene som en CSV-fil for senere analyse som et regneark.
      MERK: Tallene som genereres av programvaren er genomkopier (GC) per μL. Disse må multipliseres med fortynningsfaktorene: GC/μL x 5 (fortynning av DNA i masterblandingen) x initial fortynning (dvs. 40 000 eller 160 000).

Figure 3
Figur 3: Skjematisk oversikt over intronisk og eksonisk målretting under CRISPR/Cas9 HDR knock-in. Skjematisk sammenligning mellom introniske og eksoniske målrettingsstrategier for CRISPR/Cas9 HDR knock-in. (A) Under intronisk målretting introduseres et dobbeltstrenget brudd i et intron av DNA. HDR-malen består av en LHA-, cDNA-sekvens og RHA. Den introniske målrettingen krever i tillegg tilstedeværelsen av en skiveakseptor som inneholder 3 'spleisestedet, grenpunktet og polypyrimidinkanalen. Dette gir mulighet for korrekt spleising. Den grønne stiplede boksen representerer regionen som tilsvarer SA-sekvensen. Størrelsen på SA er 150 bp. (B) Exonic målretting er avhengig av produksjon av en dobbeltstrenget pause direkte i eksonet. HDR-malen består av en LHA-, cDNA-sekvens og RHA. De oransje stiplede boksene indikerer regionene som tilsvarer LHA og RHA. Den ideelle størrelsen på HAs er 400 bp hver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Arrangører
Navn Lengde Beskrivelse
SFFV 492 bp Milt Fokus Forming Virus promotor. Sterk pattedyrpromotor. Konstitutivt uttrykt
UBC 400 bp Promotor avledet fra det humane ubiquitin C-genet. Konstitutivt uttrykt.
CMV 508 bp Promotor avledet fra cytomegalovirus. Det kan inneholde en enhancer region. Konstitutivt uttrykt. Sterk pattedyrpromotor. Kan bringes til taushet.
EF-1a 1182 bp Human eukaryotisk oversettelse forlengelse faktor 1 alfa promotor. Konstitutivt uttrykt. Sterk pattedyrpromotor.
EFS 200-300 bp EF-1 alfa intron-mindre kortform
CAG 584 bp Hybrid pattedyrpromotor som inneholder CMV early enhancer (C), kylling beta aktin promotor (A), og spleis akseptor for kanin beta-globin genet (G). Konstitutivt uttrykt.
Polyadenylering (PolyA) signaler
Forkortelse Lengde Beskrivelse
SV40 PolyA 82-122 bp Simian virus 40 polyadenylering signal
bGH PolyA 224 bp Bovin veksthormon polyadenylering signal
rbGlob PolyA 56 bp Kanin beta globin polyadenylering signal

Tabell 1: Promotorer og polyadenyleringssignaler.

Skritt Temperatur Tid Sykluser
Enzymaktivering 95 °C 10 minutter 1x
Denaturering 94 °C 30 sekunder 42x
Annealing 60 °C 1 minutt
Forlengelse 72 °C 30 sekunder
Deaktivering av enzymer 98 °C 10 minutter 1x
Holde 4 °C ∞

Tabell 2: Digitalt dråpe-PCR-program.

3. Redigering av HSPC-er

  1. Transfeksjon og transduksjon av HSPCer
    1. Tine CD34+ HSPC-er og overføre cellene til 10 ml forvarmet RPMI supplert med 1 % P/S. Sentrifuge ved 350 x g ved RT i 10 minutter.
    2. Suspender cellene i HSPC-retensjonsmedium til en konsentrasjon på 2,5 x 10 5 celler/ml og inkuber ved 37 °C/5 % CO2 i 48 timer - 72 timer.
    3. Høst cellene i et 15 ml rør. Tell cellene og sjekk cellens levedyktighet ved trypan blå eksklusjon. Mellom 2 x 10 5 og5 x 106 celler kan nukleofekteres i en enkelt kyvette. Klargjør riktig antall kyvetter avhengig av beregnet cellenummer.
    4. Forbered RNP-komplekset. I et 1,5 ml rør, tilsett 15 μg Cas9 og 8 μg sgRNA (molforhold 1: 2,5) og inkuber ved 25 ° C i 10 minutter i en varmeblokk.
    5. Mens RNP-komplekset inkuberer, sentrifugerer cellene ved 350 x g i 5 minutter og kaster bort supernatanten.
    6. Suspender cellene i 100 μL nukleofeksjonsløsning. Bland cellene med RNP-komplekset og overfør til kyvetten.
    7. Bank forsiktig på kyvetten for å fjerne eventuelle gjenværende luftbobler som kan ha dannet seg under overføringen.
    8. Sett kyvetten inn i holderen til transfeksjonssystemet og elektroporate cellene som tidligere beskrevet i sgRNA-designseksjonen.
    9. Umiddelbart etter elektroporering, tilsett 400 μL forvarmet HSPC-retensjonsmedium uten P/S og overfør cellene med en fin overføringspipette til en vevskulturplate som inneholder 500 μL forvarmet HSPC-retensjonsmedium uten P/S. Avhengig av cellenummeret, bruk en passende kulturplate (24-, 12- eller 6-brønnsplate) for å nå en tetthet mellom 0,25 x 106 og 1 x 106 celler / ml. Overfør platen til inkubatoren ved 37 °C/5 % CO2.
    10. Tine hetteglassene med de frosne rAAV-ene på is. Transduser cellene ved å pipettere den optimale mengden av hver rAAV6 til cellesuspensjonen. Utfør transduksjonen innen 20-30 minutter etter elektroporeringen for å få høy transduksjonseffektivitet.
      MERK: Den optimale konsentrasjonen av hvert virus (ett virus for WT HDR-malen og et annet separat virus for den muterte HDR-malen) bør bestemmes eksperimentelt. Vanligvis resulterer 5,000-10,000 GC / celle (f.eks. 5 x 109 GC for 1 x 106 celler) i høy transduksjon.
    11. Bland cellesuspensjonen forsiktig med pipetten. Inkuber de transduserte cellene i 6-8 timer ved 37 °C/5 % CO2. Etter 6-8 timer, samle cellene i et rør og sentrifuge ved 350 x g ved RT i 5 minutter.
    12. Kast det gamle mediet og erstatt med ferskt forvarmet HSPC-oppbevaringsmedium supplert med P/S.
    13. Suspender cellene i en konsentrasjon mellom 2,5 x 105-5 x 105 celler / ml og overfør til en vevsbehandlet cellekulturplate (24-, 12- eller 6-brønnplate). Inkuber cellene i 48 timer ved 37 °C/5 % CO2 før du fortsetter med sorteringen.
  2. Strømningssortering av de konstruerte HSPC-ene med den heterozygote GOF-mutasjonen
    1. Høst cellene i et 15 ml rør og sentrifuge ved 350 x g ved RT i 5 minutter. Fjern supernatanten, suspender cellene i 1 ml DPBS som inneholder 0,1% BSA, og sentrifuger igjen ved 350 x g ved RT i 5 minutter.
    2. Kast supernatanten og suspender cellene i et passende volum DPBS + 0,1% BSA, avhengig av cellenummeret.
      MERK: Det anbefales å suspendere cellene med et minimumsvolum på 200 μL og ikke overstige 1 x 107 celler / ml for å redusere risikoen for tilstopping av sorteringsmaskinen.
    3. Overfør cellene til et sterilt FACS-rør utstyrt med en hette. Tilsett 7-AAD eller annet levedyktighetsfargestoff (avhengig av deres kompatibilitet med fluorescerende proteiner) til cellesuspensjonen for levende / døde celleekskludering.
    4. Sorter levende celler som er dobbelt positive for fluorescerende reporterproteiner i et samlingsrør som inneholder 200 μL HSPC-retensjonsmedium.
      MERK: Passende kontroller som består av celler som bare er transdusert med AAV-er, bør legges til for å sikre riktig gating under sorteringsprosedyren.
    5. Sentrifuger de sorterte cellene ved 350 x g ved RT i 5 minutter og suspenderer cellene i HSPC-retensjonsmedium ved en konsentrasjon på 2,5 x 105 celler / ml for videre ekspansjon i kultur eller bruk cellene direkte til funksjonelle analyser.

4. Bekreftelse på vellykket genredigering

  1. Genomisk DNA-ekstraksjon
    1. Før start skal varmeblokkene settes til 65 °C og 98 °C. Høst 2 x 10 5 genomredigerte og sorterte celler og sentrifuge ved 350 x g i5 minutter.
    2. Trekk ut gDNA som tidligere beskrevet. Bruk enten DNA-oppløsningen direkte til PCR eller oppbevar ved −20 °C.
  2. Inn-ut PCR
    1. Design to primere for å forsterke 5' innsettingsstedet (figur 4A): primer forward 1 retter seg mot det genomiske lokuset utenfor venstre homologiarm; primer omvendt 2 retter seg mot den integrerte sekvensen.
    2. For in-out PCR, lag følgende PCR-blanding per reaksjon:
      10 μL PCR Master Mix (2x; se materialtabell)
      1 μL primer fremover 1 (10 μM lager)
      1 μL primer revers 2 (10 μM lager)
      0,5-1,0 μL ekstrahert DNA
      Nukleasefri H2O til et endelig volum på 20 μL
      MERK: For mer enn én reaksjon anbefales det å lage en masterblanding som inneholder en ekstra reaksjon for å ta hensyn til pipetteringsfeil. Det er viktig å inkludere en ikke-malkontroll og mal-DNA fra en mock-behandlet prøve.
    3. Kjør PCR-reaksjonene med riktig termisk sykkelprogram (se produsentens instruksjoner).
      MERK: Det anbefales å først teste ut primerparet for optimal glødetemperatur. Dette kan gjøres ved å beregne Tm og deretter ved å kjøre PCR med en termocykler som kan utføre en gradienttemperatur.
    4. Kjør PCR-produktene med en DNA-stige på en 1,5% agarosegel ved 100 V i 45-60 minutter (figur 4B). Plasser gelen på et blått lys eller UV-transilluminator. Excise båndene fra gelen.
    5. Trekk ut DNA fra båndene ved hjelp av et DNA-gelekstraksjonssett. Send de ekstraherte PCR-prøvene med passende primere for Sanger-sekvensering for å bekrefte riktig og sømløs integrasjon av ønsket cDNA ved det endogene genlokuset.

Figure 4
Figur 4: Validering av genomisk integrasjon ved inn-ut PCR. (A) Skjematisk fremstilling av PCR-strategien inn-ut. I den avbildede strategien ble to primere designet. Primeren fremover 1 retter seg mot det genomiske lokuset utenfor LHA, og primeren omvendt 2 retter seg mot den kodonoptimaliserte sekvensen. (B) Skjematisk fremstilling av en agarosegelelektroforese. Bare vellykkede redigerte celler (RNP + AAV) vil generere et PCR-produkt under PCR-utgangen, mens de uredigerte prøvene (kun AAV) ikke vil generere et PCR-produkt. Forkortelse: NTC = ikke-malkontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Ved å anvende den ovenfor beskrevne protokollen ble heterozygote type 1 CALAR-mutasjoner reproduserbart introdusert i ledningsblodavledede HSPCer. Denne mutasjonen består av en 52 bp sletting i ekson 9 (den siste eksonen av CALR), noe som resulterer i en +1 rammeforskyvning, noe som fører til oversettelse av et nytt positivt ladet C-terminaldomene26,33. For å introdusere CALR-mutasjonen ved det endogene genlokuset ble en intronisk målrettingsstrategi oppstrøms ekson 9 vedtatt, da dette ville omgå uønskede endringer i kodesekvensen i tilfeller der Cas9-indusert DSB ikke ble reparert via HDR-mekanismen. I dette spesifikke tilfellet ble et sgRNA for intron 7 designet på grunn av tilgjengeligheten av høye on-target og lave off-target sekvenser i kombinasjon med gunstige homologiarmer (mangel på sekvensrepetisjoner; Figur 5A).

To donormaler ble deretter designet og pakket i AAV6-vektorer. For å muliggjøre korrekt spleising fra de endogene eksonene til det integrerte cDNA, inneholder donormalene (i) en SA-sekvens inkludert 3'-skjøtestedet, grenpunktet og polypyrimidinkanalen, (ii) den kodonoptimaliserte cDNA-sekvensen av eksoner 8-9, som enten inneholder WT (CALR WT) eller den muterte sekvensen (CALRDEL ) inkludert et stoppkodon, (iii) et simian virus 40 (SV40) polyA-signal, (iv) en sekvenskoding for et fluorescerende protein under kontroll av den separate interne promotoren, miltfokusdannende virus (SFFV) promotor, etterfulgt av (v) et bovint veksthormon (bGH) polyA-signal. Donormalen som inneholder CALR WT cDNA ble designet for å inneholde en GFP-kassett, mens donormalen som inneholder CALRDEL cDNA-sekvensen ble designet for å inneholde en BFP-kassett. Hele konstruksjonen var flankert av en venstre og høyre HA (figur 5A).

To dager etter transfeksjon med RNP-komplekset og transduksjon med rAAV6-virusene ble cellene analysert ved flowcytometri. Fire hovedpopulasjoner kunne oppdages: (i) celler som verken uttrykker GFP eller BFP, representerer celler uten HDR-basert genomredigering, (ii) celler som bare er positive for GFP, som representerer de som bare hadde integrert WT-konstruksjonen, (iii) celler som bare var positive for BFP, som representerte de som bare hadde integrert den muterte konstruksjonen, og (iv) GFP og BFP dobbeltpositive celler, som representerte cellene som hadde integrert både WT og muterte sekvenser (figur 5B). For å oppnå rene populasjoner av HSPCer med den heterozygote type 1 CALAR-mutasjonen , ble de dobbeltpositive cellene sortert etter flowcytometri. HSPC-er der to WT-sekvenser ble slått inn, ble brukt som kontrollceller (GFP+ mCherry+; Figur 5B). Et gyldig alternativ til bruk som kontrollceller ville være HSPCs med en biallelisk integrasjon av fluorescerende proteiner i et safe harbor-lokus (dvs. AAVS1; ikke vist). Celletelling ved trypanblå eksklusjon utført på de sorterte HSPC-ene indikerte at mer enn 90% av cellene var levedyktige.

Sømløs on-target integrasjon av konstruksjonene ble bekreftet ved å bruke in-out PCR-strategien (figur 6A). I dette spesifikke tilfellet utførte vi to separate in-out PCR, en for den bankede CALR WT-sekvensen (lane 1 av gelelektroforesen i figur 6A) og en for den bankede CALRDEL-sekvensen (lane 2 av gelelektroforesen i figur 6A). Sangersekvensering utført på DNA ekstrahert fra gelbåndene bekreftet riktig innsetting av WT og muterte sekvenser i CALRDEL / WT HSPCs (figur 6B).

Figure 5
Figur 5: Generering av HSPCer med den heterozygote CALAR-mutasjonen. (A) Representativt skjema som viser redigeringsstrategien for innsetting av den heterozygote CALER-mutasjonen. RNP-komplekset retter seg mot intronet mellom ekson 7 og ekson 8 i CALAR-genet. To AAV-er, en som inneholder de muterte eksonene 8-9 og en BFP og den andre som inneholder WT-eksonene 8-9 og en GFP, vil fungere som donorreparasjonsmaler og vil fremme integrasjonen av den muterte sekvensen i ett allel og integrasjonen av WT-sekvensen i det gjenværende allelet. (B) Representative flowcytometriplott som viser uttrykket av GFP og BFP eller GFP og mCherry 48 timer etter transfeksjon og transduksjon av HSPCer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Validering av vellykket heterozygot CALAR-mutasjon i HSPCs . (A) Gelelektroforese fra produktene av in-out PCR utført på genomisk DNA ekstrahert fra AAV-kontroller, CALR WT /WT og CALRDEL / WT. En 100 bp DNA-stige ble brukt. Forkortelse: NTC = ikke-malkontroll. (B) Sanger-sekvenseringsresultater oppnådd fra in-out PCR-ene utført på CALRDEL / WT som bekrefter vellykket integrering av WT og muterte sekvenser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Den effektive og presise genetiske manipulasjonen av humane primære HSPCer representerer en flott mulighet til å utforske og forstå prosessene som påvirker normal hematopoiesis, og viktigst, den leukemiske transformasjonen av hematopoietiske celler.

I denne protokollen ble det beskrevet en effektiv strategi for å konstruere menneskelige HSPCer for å uttrykke tilbakevendende heterozygote GOF-mutasjoner. Denne prosedyren benyttet seg av CRISPR/Cas9-teknologi og rAAV6-vektorer som donorer for DNA-maler for nøyaktig å sette inn WT- og mutante DNA-sekvenser i deres endogene genlokier. Kobling av konstruerte cDNAer (WT og mutant) med separerte fluorescerende reporterproteiner muliggjør anrikning og sporing av celler med en definitiv heterozygot tilstand.

Denne strategien gir flere fordeler i forhold til de ofte brukte lentivirale (LV) -baserte metodene. En hovedfordel er at det CRISPR/Cas9-baserte systemet tillater presis redigering i de endogene lociene, noe som resulterer i bevaring av endogene promotorer og regulatoriske elementer. Dette fører til homogenitet i uttrykket av det redigerte genet i cellene, et mål som knapt kan oppnås når en LV-basert metode brukes. Genoverføring med LV-vektorer fører til semi-tilfeldig integrasjon av genet med preferanse for transkripsjonelt aktive steder34. Dette kan oversettes til overekspresjon av det overførte genet og heterogeniteten mellom de redigerte cellene, noe som til slutt resulterer i vanskeligheter med å undersøke og analysere rollen som mutasjoner og geninteraksjoner. En annen fordel er at det beskrevne systemet, som er et stedsspesifikt redigeringssystem, eliminerer risikoen for innsettingsmutagenese35.

Den doble fluorescerende reporterstrategien tillater presis anrikning og sporing av celler som ble redigert på begge alleler, med ett allel som integrerer WT cDNA og det andre allelet som integrerer de muterte cDNA-sekvensene. Celler som bare uttrykker en enkelt reporter, representerer enten bare monoallelisk integrasjon eller biallelisk integrering av HDR-maler med samme fluorescerende reporter. Begge scenariene kan bare skilles nøyaktig hvis enkeltcelleavledede kloner produseres og analyseres individuelt. HSPCs har imidlertid bare begrenset proliferativ kapasitet in vitro, og når de holdes i kultur i lengre perioder, begynner HSPCer å differensiere til mer moden avkom og mister sin selvfornyelses- og engraftmentkapasitet. Dette gjør det umulig å velge og utvide encellede kloner som har den ønskede heterozygote mutasjonen. Anvendelsen av den doble fluorescerende proteinstrategien og anrikning ved flowcytometri for celler som bærer den heterozygote mutasjonen, gjør det mulig å omgå problemene forårsaket av utvidet in vitro-kultur .

I dette spesifikke eksemplet ble det vellykket demonstrert at HSPCer effektivt kunne konstrueres og sorteres for å oppnå rene populasjoner av HSPCer som bærer den heterozygote CALRDEL / WT-mutasjonen.

Dette systemet er imidlertid ikke begrenset til tekniske heterozygote rammeskiftmutasjoner, men kan også enkelt vedtas for å skape andre mutasjonstyper, inkludert missense og nonsense mutasjoner. Ved å bruke forskjellige kombinasjoner av AAV-er som inneholder WT eller muterte sekvenser med forskjellige fluorescerende reporterproteiner, kan dette systemet også brukes til innføring av homozygote mutasjoner (samtidig transduksjon med to rAAV-er som begge bærer mutant cDNA, men forskjellige fluorescerende reportere) eller til og med korreksjon av mutasjoner (samtidig transduksjon med to AAV-er som begge bærer WT cDNA, men forskjellige fluorescerende reportere). I tillegg er det viktig å nevne at denne strategien ikke er begrenset til innføring av onkogene GOF-mutasjoner. Faktisk kan den beskrevne protokollen brukes til flere alternative strategier, inkludert gen knock-out, genutskifting 36,37, målrettet knock-in av transgener (dvs. kimære antigenreseptorer)38, og til og med for korreksjon av sykdomsfremkallende mutasjoner 11,39.

Strategien med å kombinere CRISPR/Cas9 og AAV6 med flere fluorescerende reportere har også vist seg å være anvendelig i mange andre celletyper, inkludert T-celler, plasmacytoide dendrittiske celler, induserte pluripotente stamceller, nevronale stamceller og luftveis stamceller 24,38,40,41,42,43,44 . Denne strategien kan implementeres for produksjon av overlegne kimære antigenreseptor (CAR) T-celler. For eksempel ble det nylig publisert at CRISPR / Cas9-mediert knock-out av TGFBR2-genet i CAR T-celler øker sin funksjon i det undertrykkende TGF-β rike tumormikromiljøet45. En slik tilnærming kan gi en ett-trinns protokoll til både å konstruere T-cellene for å uttrykke CAR og å slå ut TGFBR2-genet ved å spesifikt sette inn CAR i begge allelene i TGFBR2-genet. Videre kan denne tilnærmingen også være nyttig for å generere universelle CAR T-celler ved å integrere CAR i T-cellereseptor alfa-konstant (TRAC) -genet46,47.

For å øke reproduserbarheten og for å garantere effektiv redigering av cellene, må noen viktige hensyn tas i betraktning. De viktigste kritiske punktene for å sikre vellykket redigering av cellene ligger i (i) valget av sgRNA, (ii) utformingen av HDR-malen og (iii) rAAV6-produksjonen.

Valget av et godt fungerende sgRNA er avgjørende, da det vil bestemme det maksimale antallet alleler der HDR-malen kan integreres. På grunn av mange programvare som nå er tilgjengelige, har søket etter kandidat sgRNA blitt forenklet. Ved å velge interesseområde kan programvaren foreslå en serie sgRNA-er med en poengsum på målet og en off-target-poengsum som indikerer sjansene for redigering på henholdsvis ønsket locus og uønsket loci. Disse skårene beregnes ut fra tidligere publiserte skåringsmodeller48,49. Selv om dette er et godt utgangspunkt for å velge et godt utført sgRNA, må ytelsen til sgRNA bekreftes, da den forventede ytelsen i silico ikke alltid samsvarer med et effektivt sgRNA in vitro. Derfor anbefales det sterkt å designe og teste ut minst tre sgRNA for å øke sjansene for å finne det beste sgRNA. Når et ekte sgRNA med god ytelse er identifisert, foreslås det å fortsette med utformingen av HDR-malen.

Forholdsregler bør tas i betraktning når du designer HDR-malen. Venstre og høyre homologiarmer (henholdsvis LHA og RHA) bør hver spenne over henholdsvis 400 bp oppstrøms og nedstrøms for sgRNA-kuttstedet, da kortere HAer kan føre til reduserte HDR-frekvenser. Størrelsen på cDNA som kan introduseres via HDR er avhengig av emballasjeegenskapene til AAV-er, som er omtrent 4,7 kb. På grunn av de mange elementene som er obligatoriske i HDR-malen (LHA, RHA, SA, PolyA, promotor og fluorescerende reportersekvens), er den gjenværende plassen for den muterte eller WT cDNA begrenset. Dette er uproblematisk hvis den ønskede mutasjonen ligger nær 3'-enden av et gen eller i gener med en samlet kort CDS. Men i tilfeller der mutasjonen befinner seg nær transkripsjonsstartsiden (TSS) av genene med en lang CDS (som overskrider det gjenværende pakningsområdet til AAV), kan det hende at denne beskrevne tilnærmingen ikke er mulig. For å omgå dette problemet er en strategi som er avhengig av å dele HDR-malen i to AAV-er nylig utviklet av Bak og kolleger. Denne strategien er avhengig av to separate HDR-medierte integrasjoner for å oppnå den endelige sømløse integrasjonen av et stort gen50.

Kvaliteten på viruset og dets titer er tilleggsfaktorer som kan gjøre eller ødelegge vellykket genomteknikk av cellene. For et optimalt utbytte er det viktig å ikke la HEK293T nå full sammenheng mens den opprettholdes i kulturen. Ideelt sett bør HEK293T-cellene deles når 70% -80% sammenløp er nådd. I tillegg bør HEK293T ikke dyrkes i lange perioder, da dette kan redusere deres evne til å produsere virus. Nye HEK293T-celler må tines etter 20 passeringer. Å skaffe høye virustitere er viktig for å øke effektiviteten og reproduserbarheten av forsøkene. Lave virale titere vil oversette til store mengder rAAV-løsning som kreves for transduksjon av HSPC-ene. Som en generell regel bør rAAV-løsningen tilsatt de nukleofiserte cellene ikke overstige 20% av det totale volumet av HSPC-retensjonsmediet. Høyere volum av AAV-oppløsning kan føre til økt celledød, lavere proliferasjon og nedsatt transduksjonseffektivitet. Når det gjelder lave virustitere, anbefales det derfor å konsentrere viruset ytterligere.

Oppsummert tilbyr denne protokollen en reproduserbar tilnærming for å manipulere menneskelige HSPC-er nøyaktig og effektivt gjennom samtidig bruk av CRIPSR/Cas9- og rAAV6-donormaler med ytterligere doble fluorescerende reportere. Denne tilnærmingen har vist seg å være et flott verktøy for å studere normal hematopoietisk stamcellebiologi og bidragene som mutasjoner gir til leukemogenese.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av tilskudd fra det østerrikske vitenskapsfondet (FWF; nummer P32783 og I5021) til AR Ytterligere finansiering til AR er også gitt av Austrian Society of Internal Medicine (Joseph Skoda Fellowship), Austrian Society of Hematology and Oncology (OeGHO; Klinisk forskningsstipend), og MEFOgraz. T.K. er spesialstipendiat i leukemi- og lymfomforeningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated Corning 431080
150 mm x 25 mm dishes Corning 430599
293T DSMZ ACC 635 https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nucleofector Core Unit Lonza - For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program.
4D Nucleofector X Unit Lonza -
500 ml Centrifuge Tube Corning 431123
7-AAD BD Biosciences 559925
AAVpro Purification Kit Takara 6666
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 Integrated DNA Technologies (IDT) 1081058
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge Beckman Coulter -
Benchling sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad -
Chemically modified synthetic sgRNA Synthego Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’         An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases.     *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)
CHOPCHOP sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3526
CRISPick sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
CRISPOR sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net
ddPCR 96-Well Plates Bio-Rad 12001925
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863024
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator  Bio-Rad 1864008
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator  Bio-Rad 1863009
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific K1081
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 1863005
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose Sigma-Aldrich D6429-6X500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
FACSAria Fusion BD Biosciences -
Falcon 5 mL Round Bottom Corning 352054
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml Pan Biotech P40-47500
FlowJo 10.8.0 BD Biosciences  -
GenAgarose L.E. Inno-train GX04090
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo Scientific SM0321
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs Inc. (NEB) E2611L
HEK293T
HEPES solution Sigma-Aldrich H0887-100ML
ICE Synthego https://ice.synthego.com
IDT codon optimization tool IDT https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool
IDT sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium Sigma-Aldrich L7658-1KG
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium Sigma-Aldrich L7533-1KG
Midori Green Advance Nippon Genetics MG04
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010L
Monarch DNA Gel Extraction Kit NEB T1020L
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) NEB C2987U
Nuclease-Free Water, 5X100 ml Ambion AM9939
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml Gibco 31985070
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor  X Kit L Lonza V4XP-3024 The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix.
pAAV-MCS2 Addgene 46954
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable Bio-Rad 1814040
pDGM6 Addgene 110660
Penicillin-Streptomycin (P/S) Gibco 15140122
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966 Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C.
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap
Primers  Eurofins - Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)                                                     Primer 1 Fwd:    AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;                Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;                     Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC
PrimeTime qPCR Primer Assay IDT - PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers)  that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std - qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6
PX1 PCR Plate Sealer Bio-Rad 1814000
QuantaSoft Software Bio-Rad
Quick Extract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T
QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 1864002
QX200 Droplet Reader Bio-Rad
Recombinant human Flt3-ligand Peprotech 300-19
Recombinant human IL-6 Peprotech 200-06
Recombinant Human SCF Peprotech 300-07
Recombinant Human TPO Peprotech 300-18
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758-6X500ML
SnapGene Dotmatics Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used.
Soc outgrowth medium NEB B9020S
Sodium-butyrate Sigma-Aldrich B5887-1G
Stem Regenin 1 (SR1) Biogems 1224999
StemSpan SFEM II STEMCELL Technologies 9655
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X Thermo Scientific  B49
TIDE http://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154-100ML
TrypLE (with phenol red), 500 ml Thermo Scientific 16605-028
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml Thermo Scientific 15575-038
UM171 STEMCELL Technologies 72914
Vector Builder codon optimization tool Vector Builder https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing transthyretin amyloidosis. New England Journal of Medicine. 385 (6), 493-502 (2021).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  6. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  7. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  8. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  9. Veldwijk, M. R., et al. Pseudotyped recombinant adeno-associated viral vectors mediate efficient gene transfer into primary human CD34+ peripheral blood progenitor cells. Cytotherapy. 12 (1), 107-112 (2010).
  10. Song, L., et al. High-efficiency transduction of primary human hematopoietic stem cells and erythroid lineage-restricted expression by optimized AAV6 serotype vectors in vitro and in a murine xenograft model in vivo. PLoS One. 8 (3), 58757 (2013).
  11. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  12. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  13. Jan, M., et al. Clonal evolution of preleukemic hematopoietic stem cells precedes human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 4 (149), (2012).
  14. Corces-Zimmerman, M. R., Hong, W. J., Weissman, I. L., Medeiros, B. C., Majeti, R. Preleukemic mutations in human acute myeloid leukemia affect epigenetic regulators and persist in remission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2548-2553 (2014).
  15. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  16. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  17. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  18. Cancer Genone Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (22), 2059-2074 (2013).
  19. Ball, M., List, A. F., Padron, E. When clinical heterogeneity exceeds genetic heterogeneity: thinking outside the genomic box in chronic myelomonocytic leukemia. Blood. 128 (20), 2381-2387 (2016).
  20. Varmus, H. E. The molecular genetics of cellular oncogenes. Annual Review of Genetics. 18, 553-612 (2003).
  21. Cox, D. B. T., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: Prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
  22. Tothova, Z., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing in human hematopoietic stem cells models clonal hematopoiesis and myeloid neoplasia. Cell Stem Cell. 21 (4), 547-555 (2017).
  23. Mandal, P. K., et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell. 15 (5), 643-652 (2014).
  24. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 13 (2), 358-376 (2018).
  25. Foßelteder, J., et al. Human gene-engineered calreticulin mutant stem cells recapitulate MPN hallmarks and identify targetable vulnerabilities. Leukemia. , (2023).
  26. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2391-2405 (2013).
  27. Merlinsky, T. R., Levine, R. L., Pronier, E. Unfolding the role of calreticulin in myeloproliferative neoplasm pathogenesis. Clinical Cancer Research. 25 (10), 2956-2962 (2019).
  28. Belčič Mikič, T., Pajič, T., Zver, S., Sever, M. The contemporary approach to CALR-positive myeloproliferative neoplasms. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3371 (2021).
  29. How, J., Hobbs, G. S., Mullally, A. Mutant calreticulin in myeloproliferative neoplasms. Blood. 134 (25), 2242-2248 (2019).
  30. Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nature Protocols. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  31. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
  32. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2011).
  33. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  34. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 1-24 (2021).
  35. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. The Journal of Clinical Investigation. 119 (4), 964-975 (2009).
  36. Vaidyanathan, S., et al. Targeted replacement of full-length CFTR in human airway stem cells by CRISPR-Cas9 for pan-mutation correction in the endogenous locus. Molecular Therapy. 30 (1), 223-237 (2022).
  37. Cromer, M. K., et al. Gene replacement of α-globin with β-globin restores hemoglobin balance in β-thalassemia-derived hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 27 (4), 677-687 (2021).
  38. Wiebking, V., et al. Genome editing of donor-derived T-cells to generate allogenic chimeric antigen receptor-modified T cells: Optimizing αβ T cell-depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica. 106 (3), 847-858 (2021).
  39. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
  40. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 genome engineering in engraftable human brain-derived neural stem cells. iScience. 15, 524-535 (2019).
  41. Laustsen, A., et al. Interferon priming is essential for human CD34+ cell-derived plasmacytoid dendritic cell maturation and function. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  42. Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLife. 6, 27873 (2017).
  43. Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  44. Vaidyanathan, S., et al. selection-free gene repair in airway stem cells from cystic fibrosis patients rescues CFTR function in differentiated epithelia. Cell Stem Cell. 26 (2), 161-171 (2020).
  45. Tang, N., et al. TGF-β inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), 133977 (2020).
  46. Georgiadis, C., et al. Long terminal repeat CRISPR-CAR-coupled "universal" T cells mediate potent anti-leukemic effects. Molecular Therapy. 26 (5), 1215-1227 (2018).
  47. Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
  48. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  49. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  50. Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).

Tags

Kreftforskning utgave 193 CRISPR/Cas9 genomteknikk leukemogenese hematopoietiske stamceller AAV mutasjon homolog rekombinasjon gain-of-function mutasjoner
Engineering onkogene heterozygote gain-of-function mutasjoner i humane hematopoietiske stamceller og stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sconocchia, T., Foßelteder, J., … More

Sconocchia, T., Foßelteder, J., Köhnke, T., Majeti, R., Reinisch, A. Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (193), e64558, doi:10.3791/64558 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter