Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Tekniska onkogena heterozygota förstärkningsmutationer i humana hematopoetiska stam- och stamceller

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64558

Summary

Nya strategier för att troget modellera somatiska mutationer i hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) är nödvändiga för att bättre studera hematopoetisk stamcellsbiologi och hematologiska maligniteter. Här beskrivs ett protokoll för att modellera heterozygota gain-of-function-mutationer i HSPCs genom att kombinera användningen av CRISPR/Cas9 och dubbel rAAV-givartransduktion.

Abstract

Under hela sin livstid förvärvar hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) somatiska mutationer. Några av dessa mutationer förändrar HSPC-funktionella egenskaper såsom proliferation och differentiering, vilket främjar utvecklingen av hematologiska maligniteter. Effektiv och exakt genetisk manipulation av HSPCs krävs för att modellera, karakterisera och bättre förstå de funktionella konsekvenserna av återkommande somatiska mutationer. Mutationer kan ha en skadlig effekt på en gen och resultera i funktionsförlust (LOF) eller, i skarp kontrast, kan förbättra funktionen eller till och med leda till nya egenskaper hos en viss gen, kallad gain-of-function (GOF). Till skillnad från LOF-mutationer förekommer GOF-mutationer nästan uteslutande på ett heterozygot sätt. Nuvarande genomredigeringsprotokoll tillåter inte selektiv inriktning av enskilda alleler, vilket hindrar förmågan att modellera heterozygota GOF-mutationer. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll om hur man konstruerar heterozygota GOF-hotspot-mutationer i humana HSPCs genom att kombinera CRISPR / Cas9-medierad homologistyrd reparation och rekombinant AAV6-teknik för effektiv DNA-donatormallöverföring. Det är viktigt att denna strategi använder ett dubbelt fluorescerande reportersystem för att möjliggöra spårning och rening av framgångsrikt heterozygiskt redigerade HSPC: er. Denna strategi kan användas för att exakt undersöka hur GOF-mutationer påverkar HSPC-funktionen och deras progression mot hematologiska maligniteter.

Introduction

Med utvecklingen av den klustrade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningarna (CRISPR) / Cas9-tekniken har ett nytt och extremt kraftfullt instrument lagts till i forskarnas verktygslåda. Denna teknik möjliggör exakt konstruktion av genomet och har visat sig vara extremt användbar inte bara för forskningsändamål (granskad i Hsu et al.1) utan har nyligen också framgångsrikt översatts till den kliniska miljön 2,3,4. CRISPR/Cas9-redigeringsstrategier förlitar sig på aktiviteten hos ett Cas9-protein och ett enguide-RNA (sgRNA)5,6,7. I värdcellen styrs Cas9-proteinet till en specifik plats i DNA som är komplementär till sgRNA-sekvensen och kommer att införa en DNA-dubbelsträngsbrytning (DSB). När en DSB har genererats finns det två huvudsakliga och konkurrerande reparationsmekanismer som kan uppstå: icke-homolog ändfogning (NHEJ) och homologistyrd reparation (HDR). NHEJ är en felbenägen, övervägande använd reparationsmekanism som leder till insättningar och raderingar (indels), medan HDR, genom att använda systerkromatiden som en reparationsmall, är mycket exakt men begränsad till S- eller G2-fasen i cellcykeln8. Inom genomteknik kan HDR användas för riktad modifiering av DNA genom att tillhandahålla en donatormall som flankeras av homologiarmar som är identiska med båda DNA-ändarna av den Cas9-inducerade DSB (figur 1). Den typ av givarmall som används för HDR kan i hög grad påverka redigeringseffektiviteten. För genteknik i humana HSPC: er har adenoassocierat virus serotyp 6 (AAV6) nyligen beskrivits som ett utmärkt medel för leverans av enkelsträngade DNA-mallar 9,10.

CRISPR/Cas9 genomteknik kan användas terapeutiskt för att korrigera skadliga mutationer11 men kan också användas för att införa patogena mutationer i DNA för att modellera cancerutveckling12. Blodcancer, såsom leukemi, utvecklas via sekventiell förvärv av somatiska mutationer i friska HSPCs13,14. Tidiga genetiska händelser leder till en klonal proliferativ fördel, vilket resulterar i klonal hematopoies med obestämd potential (CHIP)15,16. Ytterligare förvärv av mutationer kommer så småningom att leda till leukemisk omvandling och utveckling av sjukdomen. Somatiska mutationer finns i gener som styr självförnyelse, överlevnad, spridning och differentiering17.

Att introducera individuella mutationer via genomteknik i friska HSPCs möjliggör exakt modellering av denna stegvisa leukemogena process. Det begränsade antalet återkommande mutationer som finns i myeloida neoplasmer såsom akut myeloisk leukemi (AML)18,19 gör denna sjukdom särskilt mottaglig för att rekapituleras med hjälp av genomtekniska verktyg.

Somatiska mutationer kan uppstå på endast en allel (monoalleliska/heterozygota mutationer) eller på båda allelerna (bialleliska/homozygota mutationer) och kan ha djupgående effekter på genens funktion, vilket kan orsaka en funktionsförlust (LOF) eller en funktionsförstärkning (GOF). LOF-mutationer leder till en reducerad (om en allel påverkas) eller fullständig (om båda allelerna påverkas) LOF av genen, medan GOF-mutationer leder till en ökad aktivering eller ny funktion av genen. GOF-mutationer är vanligtvis heterozygota20.

Viktigt är att zygositeten (hetero- vs. homozygot) har stora konsekvenser för försöket att troget modellera en mutation; därför är den riktade manipulationen av endast en allel av en gen nödvändig för att konstruera heterozygota hotspot GOF-mutationer. Felbenägen NHEJ leder till indels av olika längder21 som kan leda till varierande, oförutsägbara biologiska konsekvenser. Men eftersom NHEJ är det dominerande reparationsprogrammet som används av celler efter introduktionen av en DSB, tillåter de flesta CRISPR / Cas9-plattformar som för närvarande används för att manipulera HSPC: er inte exakt att förutsäga det genetiska resultatet22,23. Däremot möjliggör införandet av en CRISPR/Cas9-medierad dubbelsträngsbrytning (DSB), i kombination med användning av rekombinant adenoassocierat virus (rAAV) vektorbaserade DNA-givarmallar för genomteknik via HDR, den allelspecifika införandet av mutationer i humana HSPCs11,24. Samtidig integration av en mutant och en vildtypssekvens (WT) i kombination med distinkta fluorescerande reportrar på de enskilda allelerna kan utföras för att välja för en heterozygot genotyp (figur 2). Denna strategi kan utnyttjas som ett kraftfullt verktyg för att exakt karakterisera effekterna av återkommande, leukemiska, heterozygota GOF-hotspot-mutationer på HSPC-funktion, sjukdomsinitiering och progression.

I den här artikeln tillhandahålls ett detaljerat protokoll för effektiv konstruktion av återkommande muterade heterozygota GOF-mutationer i primära humana HSPC. Denna strategi kombinerar användningen av CRISPR/Cas9 och en dubbel AAV6-transduktion för att tillhandahålla WT- och mutant-DNA-donatormallar för den prospektiva genereringen av den heterozygota GOF-mutationen. Som ett exempel kommer konstruktion av de återkommande typ 1-mutationerna (52 bp-deletion) i calreticulin (CALR) -genen att visas25. Den heterozygota GOF-mutationen i exon 9 av CALR finns återkommande i myeloproliferativa störningar såsom essentiell trombocytemi (ET) och primär myelofibros (PMF)26. CALR är ett endoplasmatiskt retikulumboende protein som främst har en kvalitetskontrollfunktion i vikningsprocessen av nyligen syntetiserade proteiner. Dess struktur kan delas in i tre huvuddomäner: en amino (N) -terminal domän och en prolinrik P-domän, som är involverade i proteinets chaperonfunktion, och en C-domän, som är involverad i kalciumlagring och reglering27,28. CARR-mutationer orsakar en +1 frameshift, vilket leder till transkription av en ny förlängd C-terminal ände och förlust av endoplasmatisk retikulum (ER)-retentionssignal (KDEL). Mutant CALR har visat sig binda trombopoietinreceptorn (TPO), vilket leder till TPO-oberoende signalering med ökad proliferation29.

Figure 1
Bild 1: NHEJ och HDR-reparation. Förenklad schematisk representation av NHEJ- och HDR-reparationsmekanismer efter införandet av ett dubbelsträngat brott i DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk översikt över biallelic HDR-redigeringsstrategi. Schematisk representation som visar integrationen av givarmallarna i de riktade allelerna följt av deras översättning till fungerande mRNA. De orange prickade rutorna anger de regioner som motsvarar den vänstra homologiarmen (LHA) och den högra homologiarmen (RHA). Den ideala storleken på HAs är 400 bp vardera. Den gröna prickade rutan representerar den region som motsvarar SA-sekvensen. Storleken på SA är 150 bp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Detta protokoll kräver användning av friska donator-härledda CD34 + HSPCs och kräver etiskt godkännande från de lokala institutionella granskningsnämnderna (IRB) och undertecknat informerat samtycke. CD34 + HSPC: erna som används i detta protokoll isolerades från navelsträngsblodet (UCB) för terminsleveranser (>34 veckors graviditet). Informerat samtycke erhölls från mödrarna före leverans, och etiskt godkännande för insamling av UCB erhölls (IRB-godkännande: 31-322 ex 18/19) från Medical University of Graz. En fullständig lista över material som används i detta protokoll finns i materialförteckningen.

1. sgRNA-design och utvärdering av skäreffektivitet

  1. Sök efter platsen för önskad mutation och rätt transkript på ett online-databasverktyg (t.ex. COSMIC, https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic).
  2. Välj ett sgRNA intill mutationen (exonisk inriktning) eller i föregående intron (intronisk inriktning) med hjälp av ett sgRNA-designverktyg. I detta protokoll används onlineverktyget från Benchling. Se Materialförteckningen för en lista över möjliga onlineverktyg för sgRNA-design.
  3. Välj alternativet + (skapa) > DNA-sekvens > Importera DNA-sekvenser > Importera från databaser. Ange önskad gen, t.ex. CALR och välj människa som art > Sök > Välj rätt transkript (t.ex. CALR-201 -ENST00000316448) > Importera. Välj den region av intresse där DS-pausen ska introduceras (t.ex. intron 7).
  4. Välj alternativet CRISPR till höger på skärmen och välj Designa och analysera stödlinjer. Välj en enskild stödlinje, behåll stödlinjens längd till 20 bp och PAM-sekvensen för redigering med SpCas9 (NGG).
  5. Välj en guide med en hög poäng på målet (stor chans att redigera på önskad plats) och en hög poäng utanför målet (låg chans att redigera vid oönskade loci). Välj minst tre guider att testa för att hitta det bäst presterande sgRNA. Beställ sgRNA som ett kemiskt modifierat syntetiskt sgRNA från en kommersiell leverantör.
    OBS: Det är lämpligt att i detta skede beställa en liten mängd syntetiska sgRNA för startskärmen. När ett bra presterande sgRNA har identifierats, fortsätt med en större ordning av det valda sgRNA.
  6. Tina 2 x 10 5-5 x 105 CD34+ HSPC: er. Överför cellerna till 10 ml förvärmd RPMI1640 kompletterad med 1% antibiotika (t.ex. penicillin / streptomycin).
    CD34+ HSPC:er med en renhetsgrad >90 % bör användas för att uppnå bästa och mest reproducerbara resultat.
  7. Centrifugera vid 350 x g vid rumstemperatur (RT) i 10 min. Räkna cellerna med en hemocytometer och suspendera cellerna i SFEM II-medium kompletterat med 0,2% penicillin / streptomycin (P / S), 100 ng / ml trombopoietin (TPO), 100 ng / ml stamcellsfaktor (SCF), 100 ng / ml FMS-liknande tyrosinkinas 3 ligand (FLT3L), 100 ng / ml interleukin-6 (IL-6), 35 nM UM171 och 0,75 μM StemRegenin1 (SR1) till en koncentration av 2,5 x 105 celler / ml . Inkubera vid 37 °C/5 % CO2 i 48 timmar -72 timmar.
    OBS: Det kompletta mediet kommer från och med nu att kallas HSPC-lagringsmediet.
  8. Samla cellerna i ett 15 ml rör och räkna cellerna. Kontrollera cellens livskraft genom trypanblå uteslutning.
    1. Innan du börjar, slå på transfektionssystemet och välj alternativet för cuvetterna. Välj lämpligt program och nukleofektionslösning för HSPCs (se Materialförteckning). Mellan 2 x 10 5 och5 x 106 celler kan nukleofekteras i en 100 μL kyvett. Avsätt ett litet antal celler (t.ex. 1 x 10 5-2 x 105) för att hålla i odling i 48 timmar för att användas som WT-kontroll.
  9. Förbered RNP-komplexet. Tillsätt 15 μg Cas9 och 8 μg sgRNA (molförhållande 1:2,5) i ett 1,5 ml rör och inkubera vid 25 °C i 10 minuter i ett värmeblock.
  10. Medan RNP-komplexet inkuberar, centrifugera cellerna vid 350 x g vid RT i 5 minuter och kassera supernatanten med hjälp av en pipett. Suspendera cellerna i 100 μl nukleofektionslösning.
  11. Blanda cellerna med RNP-komplexet och överför till kyvetten. Tryck försiktigt på kyvetten för att ta bort eventuella luftbubblor som kan ha bildats under överföringen.
  12. Sätt in kyvetten i hållaren av transfektionssystemet och elektropolera cellerna med DZ-100-programmet.
  13. Omedelbart efter elektroporering, tillsätt 400 μl förvärmt HSPC-retentionsmedium utan P/S.
  14. Överför cellerna med en fin överföringspipett till en odlingsplatta som innehåller förvärmt HSPC-retentionsmedium utan P/S. Beroende på cellnumret, använd en lämplig odlingsplatta (24-, 12- eller 6-brunnsplatta) för att nå en densitet mellan 0,25 x 10 6 och 1 x 106 celler/ml.
  15. Överför plattan till inkubatorn vid 37 °C/5 %CO2. Inkubera de nukleofekterade cellerna i 6-8 timmar.
  16. Efter 6-8 timmar, ta bort det gamla mediet och ersätt med färskt förvärmt HSPC-retentionsmedium kompletterat med P/S. Suspendera cellerna i en koncentration mellan 2,5 x 10 5 och 5 x 105 och överför till en cellodlingsplatta (24-, 12- eller 6-brunnsplatta). Inkubera cellerna i 48 timmar vid 37 °C/5 %CO2.
  17. Skörda 2 x 10 5 celler och centrifugera vid 350 x g vid RT i5 min. Innan du börjar, ställ in värmeblocken på 65 °C och 98 °C.
  18. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml 1x DPBS i ett 1,5 ml rör. Centrifugera vid 350 x g vid RT i 5 min.
  19. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i 50 μl DNA-extraktionslösning. Vortex i 15 s.
  20. Inkubera i 6 minuter vid 65 °C. Virvel i 15 s och inkubera i 2 min vid 98 °C.
  21. Förstärk DSB-regionen med PCR med hjälp av primers som genererar en amplikon på cirka 400-600 bp med DSB i mitten. Använd 0,5-1 μL extraherat DNA för PCR-reaktionen.
    OBS: På grund av sammansättningen av DNA-extraktionslösningen kan DNA-koncentrationerna inte kvantifieras exakt med spektrofotometri.
  22. Kör PCR-produkten med en DNA-stege på en 1,5 % agarosgel vid 100 V i 45-60 minuter. Placera gelén på ett blått ljus eller UV-transilluminator.
  23. Extrahera DNA-bandet av rätt storlek från gelén med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit enligt tillverkarens instruktioner (se Materialförteckning).
  24. Sekvensera proverna genom Sanger-sekvensering med hjälp av den främre primern eller den omvända primern från PCR. För PCR-produkter med en längd på 400–600 bp krävs 75 ng DNA för sekvensering med en koncentration av 5 ng/ml i en total volym på 15 μl.
  25. Analysera redigeringseffektiviteten för sgRNA genom att ladda upp sekvenseringsfilerna till ett program som är utformat för att beräkna redigeringseffektiviteten genom att identifiera infogning och raderingar som produceras av sgRNA. Välj det bäst presterande sgRNA att fortsätta med.
    OBS: Dedikerade onlineverktyg listas i materialförteckningen. Den här analysen kräver .ab1-filerna för transfekterade HSPC:er och WT-HSPC:er, sgRNA-sekvensen och PAM-sekvensen.

2. Homologi-riktad reparation (HDR) vektorkonstruktion

  1. Design av HDR-mall
    Två HDR-mallar ska utformas: en mall för WT-sekvensen och en mall för den muterade sekvensen.
    1. Importera den genomiska sekvensen och kodningssekvensen (CDS) för den önskade genen till en lämplig programvara för molekylär kloning (dedikerade verktyg finns listade i materialförteckningen). Från den genomiska sekvensfilen designar du den vänstra homologiarmen (HA) genom att välja idealiskt 400 bp på 5'-änden av DSB. Klistra in den här sekvensen i en ny fil.
    2. Om en intron är riktad mot sgRNA måste en skarvacceptor (SA) sekvens inkluderas. Välj de sista 150 bp av den riktade intronen och klistra in den efter vänster HA. Om exonen är direkt riktad är denna sekvens inte nödvändig (figur 3).
    3. Från CDS-filen väljer du det cDNA som är av intresse. Om en exonisk sekvens är riktad, se till att cDNA startar omedelbart nedströms DSB-platsen och inkluderar alla följande exoner av genen av intresse samt stoppkodonet. Om en intron är riktad, se till att cDNA börjar med det första kodonet för följande exon. Kodonoptimera cDNA och sätt in det efter SA-sekvensen. Använd dedikerade onlineverktyg för detta ändamål (materialförteckning).
    4. Sätt in en 3'-polyadenyleringssignal (PolyA) efter det cDNA som är av intresse (t.ex. SV40 eller bGH) (tabell 1). Efter PolyA sätter du in en promotorsekvens (t.ex. mjältfokusbildande virus [SFFV] eller polyubiquitin C [UBC], tabell 1) för det fluorescerande proteinet.
    5. Sätt in sekvensen för det fluorescerande proteinet (dvs. antingen GFP, BFP eller mCherry). Sätt i en andra men annorlunda PolyA-signal.
      OBS: Införandet av en annan PolyA-sekvens kommer att undvika problem som bakteriell rekombination av plasmiden eller problem med sekvensjustering på grund av två identiska sekvenser i mallen.
    6. Från den genomiska sekvensfilen utformar du rätt HA genom att välja idealiskt 400 bp på 3'-änden av DSB. Sätt in den här sekvensen efter den andra PolyA.
    7. Skapa en kopia av hela mallen och ändra cDNA av intresse så att den innehåller sekvensen för den önskade mutationen.
    8. Byt ut det fluorescerande proteinet mot ett annat fluorescerande protein. Om GFP till exempel användes för WT-mallen byter du ut den mot BFP eller mCherry mot mutantmallen. Konstruera och klona HDR-mallarna till pAAV-MCS-plasmiden (eller andra lämpliga ryggrader).
      OBS: De fragment som krävs för monteringen kan produceras antingen av PCR eller beställas kommersiellt och måste innehålla överlappande sekvenser med sina angränsande fragment. Om mutationen av intresse är en punktmutation, en liten insättning eller en liten radering, kan det muterade cDNA produceras av PCR genom att utföra en platsstyrd mutagenes på HDR-mallen som innehåller WT cDNA.
    9. Transformera kompetent Escherichia coli med den monterade produkten med hjälp av värmechockmetoden. Innan du börjar, placera bakterierna för att tina på is i 10 minuter.
    10. Tillsätt 2 μL av de monterade produkterna till 50 μL bakterier. Blanda innehållet genom att försiktigt snärta.
    11. Lägg proverna på is i 30 minuter. Överför proverna till ett termoblock som är inställt på 42 °C i 30 s.
    12. Överför proverna på is i 5 min. Tillsätt 450 μl SOC-medium i rumstemperatur och inkubera proverna vid 37 °C i 1 timme.
    13. Sprid proverna på LB-agarplattor som innehåller ampicillin. För varje prov sprider du 100 μl av tre olika utspädningar av bakterielösningen (outspädd, 1:5 och 1:10) för att erhålla LB-agarplattor med enstaka kolonier som kan plockas. Inkubera plattorna över natten vid 37 °C.
    14. Nästa dag, välj tre kolonier per prov. Överför kolonierna till 15 ml rör med lock som innehåller 4 ml LB-medium kompletterat med ampicillin och inkubera över natten i en skakapparat vid 37 °C.
    15. Alikvot 500 μl av bakterielösningen från varje koloni och förvara den i kylen för senare användning. Utför en mini-prep för att extrahera plasmid-DNA enligt tillverkarens instruktioner.
    16. Skicka proverna för Sanger-sekvensering för att bekräfta korrekt sammansättning av plasmiderna. Använd tillräckligt med primers fördelade över plasmiden för att säkerställa oavbruten sekvensbekräftelse, helst täcker varje region två gånger med framåt- och bakåtläsningar.
    17. Tillsätt 200 μl av bakterielösningen innehållande den korrekt monterade plasmiden till 200 ml LB-medier kompletterat med ampicillin och inkubera i en skakapparat över natten vid 37 °C.
    18. Utför en midi- eller maxi-prep för att extrahera plasmid-DNA enligt tillverkarens instruktioner. Förvara plasmid-DNA vid −20 °C.
  2. Rekombinant AAV6-beredning
    Två separata AAV6-förberedelser måste utföras: en för rAAV6 med WT HDR-mallen och en för rAAV6 med den muterade HDR-mallen. I det här avsnittet beskrivs de steg som krävs för att förbereda endast ett virus.
    1. Tina HEK293T-celler, överför cellerna till 10 ml förvärmd DMEM kompletterad med 10% FBS, 1% P / S och 25 mM HEPES och centrifugera vid 350 x g vid RT i 5 min.
    2. Suspendera cellerna i en koncentration av 1 x 105 celler/ml och överför till en lämplig kolv (t.ex. en 175 cm2 kolv). Överför kolven till en inkubator vid 37 °C/5 %CO2.
      OBS: HEK293T-celler bör tinas i förväg för att cellerna ska kunna återhämta sig helt och för att erhålla ett tillräckligt antal celler (11 x 107 celler är nödvändiga för produktion av ett virus). Det rekommenderas att använda cellerna efter minst tre passager och att hålla cellerna under 20 passager. HEK293T-celler ska delas tre gånger i veckan. Samtidigt som cellerna bibehålls bör dessa inte överstiga 70%-80% sammanflöde. DMEM som används i AAV-preparatet bör också redan kompletteras med L-glutamin och natriumpyruvat.
    3. Samla cellerna i ett 50 ml rör och centrifugera vid 350 x g vid RT i 5 minuter.
    4. Suspendera cellerna i 20 ml DMEM kompletterat med 10% FBS, 1% P / S och 25 mM HEPES och räkna med en hemocytometer. Använd trypanblå för uteslutning av döda celler.
    5. Frö 3 x 106 celler i 20 ml DMEM kompletterat med 10% FBS, 1% P/S och 25 mM HEPES i en 175 cm2 kolv. För produktion av ett virus, förbered minst fyra 175 cm2 kolvar. Inkubera cellerna vid 37 °C/5 %CO2 i 3 dagar.
      OBS: Detta steg utförs bäst på en fredag eftersom det gör att cellerna kan expandera under helgen.
    6. Skörda och räkna HEK293T-cellerna.
    7. För beredning av ett av virusen, förbered tio 150 mm skålar som vardera innehåller 11 x 106 HEK293T i 20 ml DMEM kompletterat med 10% FBS, 1% P / S och 25 mM HEPES.
    8. Placera diskarna i kuvösen vid 37 °C/5 %CO2 i 24 timmar. Kassera försiktigt det gamla mediet och ersätt med 20 ml antibiotikafri DMEM kompletterat med 10% FBS, 25 mM HEPES och 1 mM natriumbutyrat. Innan du fortsätter, kontrollera att cellernas sammanflöde inte är över 80%.
    9. Förbered två 15 ml rör som innehåller transfektionsblandningarna. Till rör 1, tillsätt 5 ml reducerat serummedium, 60 μg rAAV6-muterad HDR-plasmid och 220 μg pDGM6 (hjälparplasmid). Tillsätt 5 ml reducerat serummedium till rör 2 och 1120 μl 1 mg/ml polyetyleniminlösning (PEI, transfektreagens).
    10. Lägg till innehållet i rör 2 till rör 1 och virvel i 30 s. Inkubera i 15 minuter vid RT för att säkerställa korrekt inkapsling av DNA i PEI-micellerna.
      OBS: Förvara inte lösningen i mer än 20 minuter.
    11. Tillsätt försiktigt droppvis 1,1 ml av lösningen till varje maträtt och fördela genom att virvla försiktigt. Placera diskarna i kuvösen vid 37 °C/5 %CO2 i 48 timmar.
    12. Efter 48 h, tillsätt 250 μL 0,5 M EDTA till varje maträtt och placera diskarna i inkubatorn i 10 min. Skörda cellerna genom att tvätta dem från skålen och överför till ett 500 ml centrifugrör eller flera 50 ml rör.
    13. Centrifugera vid 2 000 x g i 10 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten. För att säkerställa att supernatanten avlägsnas helt, centrifugera igen vid 2 000 x g i 1 min vid 4 °C.
    14. Kassera alla kvarvarande supernatanter. Varje kvarvarande supernatant kan försämra virusreningen.
    15. Lossa pelleten genom att virvla och extrahera viruset med hjälp av ett AAV-reningssats (se materialtabell) enligt tillverkarens instruktioner. Alternativt kan extraktion genom jodoxanolgradient ultracentrifugering30,31.
    16. Alikvotera det renade viruset och förvara vid −80 °C. Titrera AAV funktionellt eller kvantifiera AAV-titern med digital dropp-PCR (ddPCR)32 för att bestämma de optimala transduktionsförhållandena.
    17. Upprepa denna process för beredning av rAAV6 WT HDR-plasmiden.
  3. AAV-titrering med ddPCR
    1. Innan du börjar, ställ in värmeblocken på 65 °C och 98 °C.
    2. Extrahera viralt DNA genom att tillsätta 15 μL DNA-extraktionslösning till 5 μL av viruset. Vortex i 15 s.
    3. Inkubera i 6 minuter vid 65 °C. Vortex i 15 s. Inkubera i 2 minuter vid 98 °C.
    4. Använd det extraherade DNA:t (som är en 1:4-utspädning av virus-DNA:t) för att förbereda seriella utspädningar (1:400, 1:40 000, 1:160 000, 1:640 000) med nukleasfritt (nf)H2O-värdeför ddPCR.
      OBS: Utspädningarna kan förvaras vid −20 °C om ddPCR inte utförs omedelbart.
    5. Välj tre av utspädningarna för ddPCR. Valet av utspädning som ska användas beror på virusets koncentration. Använd helst tre olika utspädningar (t.ex. 1:40 000, 1:160 000 och 1:640 000) för att hitta den bästa utspädningen som ligger inom maskinens detektionsgräns.
    6. Håll reagenserna på is medan du arbetar. Förbered en huvudblandning (alla prover mäts i dubbletter). Bered följande för varje reaktion: 12,5 μL ddPCR-supermix för sonder, ingen dUTP, 1,25 μL PrimeTime Std qPCR-analys, AAV-ITR (se materialtabell) och 6,25 μL nf-H2O.
    7. Blanda 5 μL DNA med 20 μL av masterblandningen. Utför detta för utspädningarna 1:40 000, 1:160 000 och 1:640 000.
    8. Placera en patron i patronhållaren. Tillsätt 70 μl droppgenereringsolja till sonderna i raden denominerade som olja. Var försiktig så att du inte genererar några bubblor.
    9. Tillsätt 20 μl av provvolymen i raden som är denominerad som prov. Var försiktig så att du inte genererar några bubblor.
    10. Försegla patronen med packningen och placera den i droppgeneratorn. Generera dropparna genom att trycka på startknappen på maskinen, ta bort packningen och överför försiktigt, med en flerkanalig pipett, 40 μL av de genererade dropparna till en 96-brunnsplatta. Arbeta långsamt för att undvika förstörelse av droppar och luftbubblor.
    11. Försegla 96-brunnsplattan med genomborrad folie (den röda randen uppåt) med PCR-plattförseglaren. Placera plattan i en termocykler.
    12. Ställ in volymen på 40 μl, locktemperaturen på 105 °C och ramphastigheterna på 2 °C/s. Kör PCR-programmet enligt beskrivningen i tabell 2.
    13. Slå på droppläsaren 30 min före användning. Öppna programvaran på skrivbordet.
    14. Ange plattlayouten och välj ABS på experimentfliken och ddPCR Supermix på fliken Supermix. Tryck sedan först på PRIME, följt av att klicka på FLUSH SYSTEM på programvaran för att starta systemet.
    15. Ange plattan i läsaren. Starta körningen och exportera data som en CSV-fil för efterföljande analys som ett kalkylblad när du är klar.
      OBS: Siffrorna som genereras av programvaran är genomkopior (GC) per μL. Dessa måste multipliceras med utspädningsfaktorerna: GC/μL x 5 (utspädning av DNA i masterblandningen) x initial utspädning (dvs. 40 000 eller 160 000).

Figure 3
Bild 3: Schematisk översikt över intronic och exonic targeting under CRISPR/Cas9 HDR knock-in. Schematisk jämförelse mellan introniska och exoniska inriktningsstrategier för CRISPR/Cas9 HDR knock-in. (A) Under intronisk inriktning införs en dubbelsträngad brytning i en intron av DNA. HDR-mallen består av en LHA-, cDNA-sekvens och RHA. Den introniska inriktningen kräver dessutom närvaron av en skivacceptor som innehåller 3 'skarvplatsen, grenpunkten och polypyrimidinkanalen. Detta möjliggör korrekt skarvning. Den gröna prickade rutan representerar den region som motsvarar SA-sekvensen. Storleken på SA är 150 bp. (B) Exonic inriktning förlitar sig på produktion av en dubbelsträngad paus direkt i exon. HDR-mallen består av en LHA-, cDNA-sekvens och RHA. De orange prickade rutorna anger de regioner som motsvarar LHA och RHA. Den ideala storleken på HAs är 400 bp vardera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Initiativtagare
Namn Längd Beskrivning
SFFV 492 punkter Mjälte fokus bildande virus promotor. Stark däggdjurspromotor. Konstitutivt uttryckt
UBC 400 punkter Promotor härledd från den mänskliga ubiquitin C-genen. Konstitutivt uttryckt.
Cvv 508 punkter Promotor härledd från Cytomegalovirus. Det kan innehålla en förstärkarregion. Konstitutivt uttryckt. Stark däggdjurspromotor. Kan tystas.
EF-1a 1182 punkter Mänsklig eukaryot översättningsförlängningsfaktor 1 alfapromotor. Konstitutivt uttryckt. Stark däggdjurspromotor.
EFS 200-300 punkter EF-1 alfa intronfri kortform
CAG 584 punkter Hybriddäggdjurspromotor som innehåller CMV-förstärkaren (C), kycklingbeta-aktinpromotorn (A) och skarvacceptorn för kaninbeta-globingenen (G). Konstitutivt uttryckt.
Polyadenylation (PolyA) signaler
Förkortning Längd Beskrivning
SV40 PolyA 82-122 bp Simianvirus 40 polyadenyleringssignal
bGH PolyA 224 punkter Bovint tillväxthormon polyadenylation signal
rbGlob PolyA 56 punkter Kanin beta globin polyadenylation signal

Tabell 1: Promotorer och polyadenylationssignaler.

Steg Temperatur Tid Cykler
Aktivering av enzym 95°C 10 minuter 1x
Denaturering 94°C 30 sekunder 42x
Glödgning 60°C 1 minut
Förlängning 72°C 30 sekunder
Deaktivering av enzym 98°C 10 minuter 1x
Hålla 4°C

Tabell 2: PCR-program för digital droppe.

3. Redigering av HSPCs

  1. Transfektion och transduktion av HSPC
    1. Tina CD34+ HSPCs och överför cellerna till 10 ml förvärmd RPMI kompletterat med 1% P/S. Centrifugera vid 350 x g vid RT i 10 min.
    2. Suspendera cellerna i HSPC-retentionsmedium till en koncentration av 2,5 x 10 5 celler/ml och inkubera vid 37 °C/5 % CO2 i 48 timmar -72 timmar.
    3. Skörda cellerna i ett 15 ml rör. Räkna cellerna och kontrollera cellens livskraft genom trypanblå uteslutning. Mellan 2 x 10 5 och5 x 106 celler kan nukleofekteras i en enda kyvett. Förbered lämpligt antal kyvetter beroende på ditt beräknade cellnummer.
    4. Förbered RNP-komplexet. Tillsätt 15 μg Cas9 och 8 μg sgRNA (molförhållande 1:2,5) i ett 1,5 ml rör och inkubera vid 25 °C i 10 minuter i ett värmeblock.
    5. Medan RNP-komplexet inkuberar, centrifugera cellerna vid 350 x g i 5 minuter och kassera supernatanten.
    6. Suspendera cellerna i 100 μl nukleofektionslösning. Blanda cellerna med RNP-komplexet och överför till kyvetten.
    7. Tryck försiktigt på kyvetten för att ta bort eventuella kvarvarande luftbubblor som kan ha bildats under överföringen.
    8. Sätt in kyvetten i hållaren av transfektionssystemet och elektropolera cellerna som tidigare beskrivits i avsnittet om sgRNA-design.
    9. Omedelbart efter elektroporering, tillsätt 400 μL förvärmt HSPC-retentionsmedium utan P/S och överför cellerna med en fin överföringspipett till en vävnadsodlingsplatta innehållande 500 μL förvärmt HSPC-retentionsmedium utan P/S. Beroende på cellnumret, använd en lämplig odlingsplatta (24-, 12- eller 6-brunnsplatta) för att nå en densitet mellan 0,25 x 10 6 och 1 x 106 celler / ml. Överför plattan till inkubatorn vid 37 °C/5 %CO2.
    10. Tina injektionsflaskorna som innehåller de frysta rAAV:erna på is. Transducera cellerna genom att pipettera den optimala mängden av varje rAAV6 till cellsuspensionen. Utför transduktionen inom 20-30 minuter efter elektroporationen för att få hög transduktionseffektivitet.
      Den optimala koncentrationen av varje virus (ett virus för WT HDR-mallen och ett annat separat virus för den muterade HDR-mallen) bör bestämmas experimentellt. Vanligtvis resulterar 5 000-10 000 GC/cell (t.ex. 5 x 109 GC för 1 x 106 celler) i hög transduktion.
    11. Blanda försiktigt cellsuspensionen med pipetten. Inkubera de transducerade cellerna i 6–8 timmar vid 37 °C/5 %CO2. Efter 6-8 h, samla cellerna i ett rör och centrifugera vid 350 x g vid RT i 5 min.
    12. Kassera det gamla mediet och ersätt med färskt förvärmt HSPC-retentionsmedium kompletterat med P/S.
    13. Suspendera cellerna i en koncentration mellan 2,5 x 10 5-5 x 105 celler/ml och överför till en vävnadsbehandlad cellodlingsplatta (24-, 12- eller 6-brunnsplatta). Inkubera cellerna i 48 timmar vid 37 °C/5 %CO2 innan sorteringen fortsätter.
  2. Flödessortering av de konstruerade HSPC:erna med den heterozygota GOF-mutationen
    1. Skörda cellerna i ett 15 ml rör och centrifugera vid 350 x g vid RT i 5 minuter. Ta bort supernatanten, suspendera cellerna i 1 ml DPBS innehållande 0,1% BSA och centrifugera igen vid 350 x g vid RT i 5 minuter.
    2. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i en lämplig volym DPBS + 0,1% BSA beroende på cellnumret.
      OBS: Det rekommenderas att suspendera cellerna med en minsta volym på 200 μl och att inte överstiga 1 x 107 celler / ml för att minska risken för igensättning av sorteraren.
    3. Överför cellerna till ett sterilt FACS-rör utrustat med ett lock. Tillsätt 7-AAD eller annat viabilitetsfärgämne (beroende på deras kompatibilitet med de fluorescerande proteinerna) till cellsuspensionen för uteslutning av levande / döda celler.
    4. Sortera de levande cellerna som är dubbelpositiva för de fluorescerande reporterproteinerna i ett uppsamlingsrör som innehåller 200 μL HSPC-retentionsmedium.
      OBS: Lämpliga kontroller bestående av celler som endast transducerats med AAV bör läggas till för att säkerställa korrekt grindning under sorteringsförfarandet.
    5. Centrifugera de sorterade cellerna vid 350 x g vid RT i 5 minuter och suspendera cellerna i HSPC-retentionsmedium i en koncentration av 2,5 x 105 celler/ml för vidare expansion i odling eller använd cellerna direkt för funktionella analyser.

4. Bekräftelse av framgångsrik genredigering

  1. Genomisk DNA-extraktion
    1. Innan du börjar, ställ in värmeblocken på 65 °C och 98 °C. Skörda 2 x 10 5 genomredigerade och sorterade renade celler och centrifugera vid 350 x g i5 minuter.
    2. Extrahera gDNA som tidigare beskrivits. Använd antingen DNA-lösningen direkt för PCR eller förvara vid −20 °C.
  2. In-ut-PCR
    1. Designa två primers för att förstärka 5'-insättningsstället (figur 4A): primer framåt 1 riktar sig mot det genomiska locuset utanför den vänstra homologiarmen; primer reverse 2 riktar sig mot den integrerade sekvensen.
    2. För in-out PCR, förbered följande PCR-blandning per reaktion:
      10 μL PCR Master Mix (2x; se materialförteckning)
      1 μL primer framåt 1 (10 μM lager)
      1 μL primer omvänd 2 (10 μM lager)
      0,5-1,0 μl extraherat DNA
      NukleasfrittH2O-värdetill en slutlig volym på 20 μl
      OBS: För mer än en reaktion är det lämpligt att förbereda en huvudblandning som innehåller en extra reaktion för att ta hänsyn till pipettfel. Det är viktigt att inkludera en icke-mallkontroll och mall-DNA från ett mock-behandlat prov.
    3. Kör PCR-reaktionerna med lämpligt termiskt cykelprogram (se tillverkarens instruktioner).
      OBS: Det är lämpligt att först testa primerparet för optimal glödgningstemperatur. Detta kan göras genom att beräkna Tm och sedan genom att köra PCR med en termocykler som kan utföra en gradienttemperatur.
    4. Kör PCR-produkterna med en DNA-stege på en 1,5% agarosgel vid 100 V i 45-60 min (figur 4B). Placera gelén på ett blått ljus eller UV-transilluminator. Skär ut banden från gelén.
    5. Extrahera DNA från banden med hjälp av ett DNA-gelextraktionssats. Skicka de extraherade PCR-proverna med lämpliga primers för Sanger-sekvensering för att bekräfta korrekt och sömlös integration av önskat cDNA vid den endogena genlokusen.

Figure 4
Figur 4: Validering av genomisk integration genom in-out PCR. (A) Schematisk representation av in-out PCR-strategin. I den avbildade strategin designades två primers. Primern framåt 1 riktar sig mot den genomiska locusen utanför LHA, och primern reverse 2 riktar sig mot den kodonoptimerade sekvensen. (B) Schematisk representation av en agarosgelelektrofores. Endast framgångsrikt redigerade celler (RNP + AAV) genererar en PCR-produkt under in-out PCR, medan de oredigerade proverna (endast AAV) inte genererar en PCR-produkt. Förkortning: NTC = icke-mallkontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Representative Results

Genom att tillämpa det ovan beskrivna protokollet introducerades heterozygota typ 1 CARR-mutationer reproducerbart i HSPC: er som härrör från navelsträngsblod. Denna mutation består av en radering på 52 bp i exon 9 (den sista exonen av CALR), vilket resulterar i en +1 frameshift, vilket leder till översättningen av en ny positivt laddad C-terminal domän26,33. För att introducera CARR-mutationen vid den endogena genplatsen antogs en intronisk inriktningsstrategi uppströms exon 9, eftersom detta skulle kringgå oönskade förändringar i kodningssekvensen i fall där den Cas9-inducerade DSB inte reparerades via HDR-mekanismen. I detta specifika fall designades ett sgRNA för intron 7 på grund av tillgängligheten av höga on-target och low off-target sekvenser i kombination med gynnsamma homologiarmar (brist på sekvensupprepningar; Figur 5A).

Två givarmallar designades och förpackades sedan i AAV6-vektorer. För att möjliggöra korrekt skarvning från de endogena exonerna till det integrerade cDNA innehåller givarmallarna (i) en SA-sekvens inklusive 3'-skarvplatsen, grenpunkten och polypyrimidinkanalen, (ii) den kodonoptimerade cDNA-sekvensen av exoner 8-9, antingen innehållande WT (CALR WT) eller den muterade sekvensen (CALRDEL ) inklusive ett stoppkodon, iii) en simianvirus 40 (SV40) polyA-signal, iv) en sekvens som kodar för ett fluorescerande protein under kontroll av den separata interna promotorn, SFFV-promotorn (sfinenfokusbildande virus), följt av v) en bovin tillväxthormon (bGH) polyA-signal. Donatormallen som innehåller CALR WT cDNA utformades för att innehålla en GFP-kassett, medan givarmallen som innehåller CALRDEL cDNA-sekvensen var utformad för att innehålla en BFP-kassett. Hela konstruktionen flankerades av en vänster och höger HA (figur 5A).

Två dagar efter transfektion med RNP-komplexet och transduktion med rAAV6-virusen analyserades cellerna med flödescytometri. Fyra huvudpopulationer kunde detekteras: (i) celler som varken uttrycker GFP eller BFP, som representerar celler utan HDR-baserad genomredigering, (ii) celler som endast är positiva för GFP, som representerar de som endast hade integrerat WT-konstruktionen, (iii) celler som endast är positiva för BFP, som representerar de som endast hade integrerat den muterade konstruktionen, och (iv) GFP- och BFP-dubbelpositiva celler, som representerar cellerna som hade integrerat både WT- och muterade sekvenser (figur 5B). För att erhålla rena populationer av HSPCs med den heterozygota typ 1 CARR-mutationen sorterades de dubbelpositiva cellerna efter flödescytometri. HSPCs där två WT-sekvenser slogs in användes som kontrollceller (GFP+ mCherry+; Figur 5B). Ett giltigt alternativ att använda som kontrollceller skulle vara HSPC med en biallelisk integration av fluorescerande proteiner i en safe harbor-locus (dvs. AAVS1; visas inte). Cellräkning genom trypanblå exkludering utförd på de sorterade HSPC: erna indikerade att mer än 90% av cellerna var livskraftiga.

Sömlös integrering av konstruktionerna på målet bekräftades genom tillämpning av in-out PCR-strategin (figur 6A). I detta specifika fall utförde vi två separata in-ut-PCR: er, en för den inslagna CALR WT-sekvensen (körfält 1 för gelelektroforesen i figur 6A) och en för den inslagna CALR DEL-sekvensen (körfält 2 i gelelektroforesen i figur 6A). Sanger-sekvensering utförd på DNA extraherat från gelbanden bekräftade korrekt införande av WT och muterade sekvenser i CALRDEL / WT HSPCs (figur 6B).

Figure 5
Figur 5: Generering av HSPC med den heterozygota CAWR-mutationen. (A) Representativt schema som visar redigeringsstrategin för införandet av den heterozygota CAWR-mutationen. RNP-komplexet riktar sig mot intronen mellan exon 7 och exon 8 av CARR-genen. Två AAV: er, en som innehåller de muterade exonerna 8-9 och en BFP och den andra som innehåller WT-exonerna 8-9 och en GFP, kommer att fungera som givarreparationsmallar och kommer att främja integrationen av den muterade sekvensen i en allel och integrationen av WT-sekvensen i den återstående allelen. (B) Representativa flödescytometridiagram som visar uttrycket av GFP och BFP eller GFP och mCherry 48 h efter transfektion och transduktion av HSPC: er. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Validering av framgångsrik heterozygot CAWR-mutation i HSPC. (A) Gelelektrofores från produkterna från in-out PCR utförd på genomiskt DNA extraherat från AAV-kontroller, CALR WT/ WT och CALRDEL / WT. En 100 bp DNA-stege användes. Förkortning: NTC = icke-mallkontroll. (B) Sanger-sekvenseringsresultat som erhållits från de in-out PCR som utförts på CALRDEL / WT som bekräftar framgångsrik integration av WT och muterade sekvenser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den effektiva och exakta genetiska manipulationen av humana primära HSPC representerar ett utmärkt tillfälle att utforska och förstå de processer som påverkar normal hematopoies, och viktigast av allt, den leukemiska omvandlingen av hematopoetiska celler.

I detta protokoll beskrivs en effektiv strategi för att konstruera mänskliga HSPC för att uttrycka återkommande heterozygota GOF-mutationer. Denna procedur utnyttjade CRISPR / Cas9-tekniken och rAAV6-vektorer som givare för DNA-mallar för att exakt infoga WT- och mutanta DNA-sekvenser i deras endogena genloci. Genom att koppla de konstruerade cDNA:erna (WT och mutant) med separerade fluorescerande reporterproteiner möjliggörs anrikning och spårning av celler med ett definitivt heterozygot tillstånd.

Denna strategi har flera fördelar jämfört med de ofta använda lentivirala (LV)-baserade metoderna. En stor fördel är att det CRISPR/Cas9-baserade systemet möjliggör exakt redigering i de endogena loci, vilket resulterar i bevarande av de endogena promotorerna och regleringselementen. Detta leder till homogenitet i uttrycket av den redigerade genen i cellerna, ett mål som knappast kan uppnås när en LV-baserad metod används. Genöverföring med LV-vektorer leder till semi-slumpmässig integration av genen med preferens för transkriptionellt aktiva platser34. Detta kan översättas till överuttryck av den överförda genen och heterogenitet mellan de redigerade cellerna, vilket så småningom resulterar i svårigheter att undersöka och analysera rollen av mutationer och geninteraktioner. En andra fördel är att det beskrivna systemet, som är ett platsspecifikt redigeringssystem, eliminerar riskerna för införande av mutagenes35.

Den dubbla fluorescerande reporterstrategin möjliggör exakt anrikning och spårning av celler som framgångsrikt redigerades på båda allelerna, med en allel som integrerar WT cDNA och den andra allelen som integrerar de muterade cDNA-sekvenserna. Celler som bara uttrycker en enda reporter representerar antingen endast monoallelisk integration eller biallelisk integration av HDR-mallar med samma fluorescerande reporter. Båda scenarierna kan endast särskiljas exakt om kloner med en cell produceras och analyseras individuellt. HSPC har dock endast begränsad spridningskapacitet in vitro, och när de hålls i odling under längre perioder börjar HSPC: er differentiera sig till mer mogen avkomma och förlorar sin självförnyelse- och engraftmentkapacitet. Detta gör det omöjligt att välja och expandera encelliga kloner som hyser den önskade heterozygota mutationen. Tillämpningen av den dubbla fluorescerande proteinstrategin och anrikning genom flödescytometri för celler som bär den heterozygota mutationen möjliggör att kringgå de problem som induceras av utökad in vitro-odling .

I detta specifika exempel visades det framgångsrikt att HSPC: er effektivt kunde konstrueras och sorteras för att erhålla rena populationer av HSPC: er som bär den heterozygota CALRDEL / WT-mutationen.

Detta system är dock inte begränsat till att konstruera heterozygota ramförskjutningsmutationer utan kan också lätt antas för att skapa andra mutationstyper, inklusive missense och nonsensmutationer. Genom att tillämpa olika kombinationer av AAV som innehåller WT eller muterade sekvenser med olika fluorescerande reporterproteiner kan detta system också användas för införande av homozygota mutationer (samtidig transduktion med två rAAV som båda bär mutant cDNA men olika fluorescerande reportrar) eller till och med korrigering av mutationer (samtidig transduktion med två AAV som båda bär WT cDNA men olika fluorescerande reportrar). Dessutom är det viktigt att nämna att denna strategi inte är begränsad till införandet av onkogena GOF-mutationer. Faktum är att det beskrivna protokollet kan användas för flera alternativa strategier inklusive genutslag, genersättning 36,37, riktad knock-in av transgener (dvs. chimära antigenreceptorer)38 och till och med för korrigering av sjukdomsframkallande mutationer 11,39.

Strategin att kombinera CRISPR/Cas9 och AAV6 med flera fluorescerande rapportörer har också visat sig vara tillämplig i många andra celltyper inklusive T-celler, plasmacytoiddendritiska celler, inducerade pluripotenta stamceller, neuronala stamceller och luftvägsstamceller 24,38,40,41,42,43,44 . Denna strategi kan implementeras för produktion av överlägsna chimära antigenreceptorer (CAR) T-celler. Till exempel publicerades det nyligen att CRISPR/Cas9-medierad knock-out av TGFBR2-genen i CAR T-celler kraftigt ökar deras funktion i den suppressiva TGF-β rika tumörmikromiljön45. Ett sådant tillvägagångssätt skulle kunna ge ett enstegsprotokoll för att både konstruera T-cellerna för att uttrycka CAR och för att slå ut TGFBR2-genen per plats som specifikt sätter in CAR i båda allelerna i TGFBR2-genen. Dessutom kan detta tillvägagångssätt också vara användbart för att generera universella CAR T-celler genom att integrera CAR i T-cellreceptorns alfakonstanta (TRAC) gen46,47.

För att öka reproducerbarheten och för att garantera effektiv redigering av cellerna måste några viktiga överväganden tas om hand. De viktigaste kritiska punkterna för att säkerställa framgångsrik redigering av cellerna ligger i (i) valet av sgRNA, (ii) utformningen av HDR-mallen och (iii) rAAV6-produktionen.

Valet av ett högpresterande sgRNA är avgörande eftersom det kommer att avgöra det maximala antalet alleler där HDR-mallen kan integreras. På grund av många program som nu finns tillgängliga har sökandet efter kandidat-sgRNA förenklats. Genom att välja den intressanta regionen kan programvaran föreslå en serie sgRNA med en målpoäng och en off-target-poäng som indikerar chanserna för redigering vid önskad locus respektive oönskade loci. Dessa poäng beräknas baserat på tidigare publicerade poängmodeller48,49. Även om detta är en bra utgångspunkt för att välja ett högpresterande sgRNA, måste sgRNA: s prestanda bekräftas eftersom dess förutsagda prestanda i silico inte alltid motsvarar ett effektivt sgRNA in vitro. Därför rekommenderas det starkt att designa och testa minst tre sgRNA för att öka chanserna att hitta det bästa sgRNA. När ett riktigt bra presterande sgRNA har identifierats föreslås det att du fortsätter med utformningen av HDR-mallen.

Försiktighetsåtgärder bör beaktas vid utformningen av HDR-mallen. De vänstra och högra homologiarmarna (LHA respektive RHA) bör var och en sträcka sig 400 bp uppströms respektive nedströms om sgRNA-skärplatsen, eftersom kortare HA kan resultera i minskade HDR-frekvenser. Storleken på cDNA som kan introduceras via HDR är beroende av förpackningskapaciteten hos AAV: er, vilket är ungefär 4,7 kb. På grund av de många element som är obligatoriska i HDR-mallen (LHA, RHA, SA, PolyA, promotor och fluorescerande reportersekvens) är det återstående utrymmet för det muterade eller WT cDNA begränsat. Detta är oproblematiskt om den önskade mutationen ligger nära 3'-änden av en gen eller i gener med en övergripande kort CDS. I de fall där mutationen ligger nära den transkriptionella startsidan (TSS) för generna med en lång CDS (som överskrider det återstående förpackningsutrymmet för AAV), kanske detta beskrivna tillvägagångssätt inte är genomförbart. För att kringgå detta problem har en strategi som bygger på att dela upp HDR-mallen i två AAV: er nyligen utvecklats av Bak och kollegor. Denna strategi bygger på två separata HDR-medierade integrationer för att få den slutliga sömlösa integrationen av en stor gen50.

Kvaliteten på viruset och dess titer är ytterligare faktorer som kan göra eller bryta cellernas framgångsrika genomteknik. För ett optimalt utbyte är det viktigt att inte låta HEK293T nå full sammanflöde samtidigt som den bibehålls i kulturen. Helst bör HEK293T-cellerna delas när 70%-80% sammanflöde uppnås. Dessutom bör HEK293T inte odlas under långa perioder eftersom detta kan minska deras förmåga att producera virus. Nya HEK293T-celler måste tinas efter 20 passager. Att erhålla höga virustitrar är viktigt för att öka experimentens effektivitet och reproducerbarhet. Låga virala titrar kommer att översättas till stora volymer rAAV-lösning som krävs för transduktion av HSPC: erna. Som en allmän regel bör rAAV-lösningen som tillsätts till de nukleofekterade cellerna inte överstiga 20% av den totala volymen av HSPC-retentionsmediet. Högre volymer av AAV-lösning kan leda till ökad celldöd, lägre spridning och nedsatt transduktionseffektivitet. När det gäller låga virustitrar rekommenderas det därför att ytterligare koncentrera viruset.

Sammanfattningsvis erbjuder detta protokoll ett reproducerbart tillvägagångssätt för att manipulera mänskliga HSPC: er exakt och effektivt genom samtidig användning av CRIPSR / Cas9- och rAAV6-givarmallar med ytterligare dubbla fluorescerande reportrar. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara ett bra verktyg för att studera normal hematopoetisk stamcellsbiologi och de bidrag som mutationer ger till leukemogenes.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från den österrikiska vetenskapsfonden (FWF; nummer P32783 och I5021) till A.R. Ytterligare finansiering till A.R. tillhandahålls också av Austrian Society of Internal Medicine (Joseph Skoda Fellowship), Austrian Society of Hematology and Oncology (OeGHO; Clinical Research Grant) och MEFOgraz. T.K. är en särskild stipendiat i Leukemia & Lymphoma Society.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
175 cm2 Cell Culture Flask, Vent Cap, TC-treated Corning 431080
150 mm x 25 mm dishes Corning 430599
293T DSMZ ACC 635 https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/ACC-635
4D Nucleofector Core Unit Lonza - For nucleofection of human HSPCs use the DZ-100 program.
4D Nucleofector X Unit Lonza -
500 ml Centrifuge Tube Corning 431123
7-AAD BD Biosciences 559925
AAVpro Purification Kit Takara 6666
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 Integrated DNA Technologies (IDT) 1081058
Avanti JXN-30 Ultracentrifuge Beckman Coulter -
Benchling sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://www.benchling.com/crispr
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A7906-100G
C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad -
Chemically modified synthetic sgRNA Synthego Website: https://www.synthego.com/products/crispr-kits/synthetic-sgrna Sequence for the sgRNA targeting intron 7 of CALR: 5’-CGCCTGTAATCCTCGCCCAG-3’         An 80 nucleotide SpCas9 scaffold is added to the 20 nucleotide RNA sequence to complete the sgRNA. Chemical modifications of 2'-O-Methyl are added to the first and last 3 bases and 3' phosphorothioate bonds are added in the first 3 and last 2 bases.     *Alternatively chemically modified synthetic sgRNAs can be acquired from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/oligoentry/index/crispr) and Trilink (https://www.trilinkbiotech.com/custom-oligos)
CHOPCHOP sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://chopchop.cbu.uib.no
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates Corning 3526
CRISPick sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
CRISPOR sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: http://crispor.tefor.net
ddPCR 96-Well Plates Bio-Rad 12001925
ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) Bio-Rad 1863024
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator  Bio-Rad 1864008
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator  Bio-Rad 1863009
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific K1081
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 1863005
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose Sigma-Aldrich D6429-6X500ML
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8537-500ML
FACSAria Fusion BD Biosciences -
Falcon 5 mL Round Bottom Corning 352054
Fetal Bovine Serum (FBS) Good Forte (heat inactivated), 500 ml Pan Biotech P40-47500
FlowJo 10.8.0 BD Biosciences  -
GenAgarose L.E. Inno-train GX04090
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder Thermo Scientific SM0321
Gibson Assembly Master Mix New England Biolabs Inc. (NEB) E2611L
HEK293T
HEPES solution Sigma-Aldrich H0887-100ML
ICE Synthego https://ice.synthego.com
IDT codon optimization tool IDT https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool
IDT sgRNA design tool Online tool for sgRNA design: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_CUSTOM
LB Broth (Lennox) EZMix powder microbial growth medium Sigma-Aldrich L7658-1KG
LB Broth with agar (Lennox) EZMix powder microbial growth medium Sigma-Aldrich L7533-1KG
Midori Green Advance Nippon Genetics MG04
Monarch Plasmid Miniprep Kit NEB T1010L
Monarch DNA Gel Extraction Kit NEB T1020L
NEB 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) NEB C2987U
Nuclease-Free Water, 5X100 ml Ambion AM9939
NucleoBond Xtra Midi Macherey-Nagel 740410
Opti-MEM, Reduced Serum Medium, 500 ml Gibco 31985070
P3 Primary Cell 4D-Nucleofetor  X Kit L Lonza V4XP-3024 The Lonza Primary P3 solution is supplied as a 2.25 mL P3 Primary Cell Nucleofector Solution and 0.5 mL Supplement 1. To reconstitute, add the Supplement 1 to the P3 Primary Cell Nucleofector Solution and mix.
pAAV-MCS2 Addgene 46954
PCR Plate Heat Seal Foil, pierceable Bio-Rad 1814040
pDGM6 Addgene 110660
Penicillin-Streptomycin (P/S) Gibco 15140122
Polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966 Add 50 mL of PBS 4.5 pH (made with HCl) to 50 mg of PEI in a tube. Dissolve by placing the tube in a 70°C water bath and vortexing every 10 minutes until the solution is dissolved. After the solution has reached RT, filter sterilze through a 0.22 μm filter, make 1120 μL aliquots, and store at -80°C.
Polystyrene Test Tube, with Snap Cap
Primers  Eurofins - Primers were ordered from Eurofins (eurofinsgenomics.eu) as unmodified salt free custom oligos. The primers were designed by using PRIMER-Blast (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)                                                     Primer 1 Fwd:    AAGTGATCCGTTCGCCATGAC;                Primer 2 Rev CALR WT specific: ACGTCCTCTTCCTCGTCCTC;                     Primer 2 Rev CALR DEL specific: CCAACCCTGGAGACACGCTTC
PrimeTime qPCR Primer Assay IDT - PrimeTime qPCR Probe Assays (1 probe/2 primers)  that can be ordered from IDT (https://eu.idtdna.com/site/order/qpcr/assayentry). Scale: Std - qPCR Assay 500 reactions; Primer 1 Forward (5'-3') : GGAACCCCTAGTGATGGAGTT; Primer 2 Reverse (5'-3'): CGGCCTCAGTGAGCGA; Probe (5'-3'): CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG; 5' Dye/3' Quencher: FAM/ZEN/IBFQ; Primer to probe ratio: 3.6
PX1 PCR Plate Sealer Bio-Rad 1814000
QuantaSoft Software Bio-Rad
Quick Extract DNA Extraction Solution Lucigen QE0905T
QX200 Droplet Generator  Bio-Rad 1864002
QX200 Droplet Reader Bio-Rad
Recombinant human Flt3-ligand Peprotech 300-19
Recombinant human IL-6 Peprotech 200-06
Recombinant Human SCF Peprotech 300-07
Recombinant Human TPO Peprotech 300-18
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758-6X500ML
SnapGene Dotmatics Molecular cloning software https://www.snapgene.com *Alternatively also Benchling (https://www.benchling.com) and Geneious (https://www.geneious.com) can be used.
Soc outgrowth medium NEB B9020S
Sodium-butyrate Sigma-Aldrich B5887-1G
Stem Regenin 1 (SR1) Biogems 1224999
StemSpan SFEM II STEMCELL Technologies 9655
TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) 50X Thermo Scientific  B49
TIDE http://shinyapps.datacurators.nl/tide/
Trypan blue 0.4% Sigma-Aldrich T8154-100ML
TrypLE (with phenol red), 500 ml Thermo Scientific 16605-028
UltraPure 0.5: EDTA, pH 8.0, 100 ml Thermo Scientific 15575-038
UM171 STEMCELL Technologies 72914
Vector Builder codon optimization tool Vector Builder https://en.vectorbuilder.com/tool/codon-optimization.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gillmore, J. D., et al. CRISPR-Cas9 in vivo gene editing transthyretin amyloidosis. New England Journal of Medicine. 385 (6), 493-502 (2021).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Stadtmauer, E. A., et al. CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science. 367 (6481), (2020).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  6. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  7. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  8. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  9. Veldwijk, M. R., et al. Pseudotyped recombinant adeno-associated viral vectors mediate efficient gene transfer into primary human CD34+ peripheral blood progenitor cells. Cytotherapy. 12 (1), 107-112 (2010).
  10. Song, L., et al. High-efficiency transduction of primary human hematopoietic stem cells and erythroid lineage-restricted expression by optimized AAV6 serotype vectors in vitro and in a murine xenograft model in vivo. PLoS One. 8 (3), 58757 (2013).
  11. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).
  12. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  13. Jan, M., et al. Clonal evolution of preleukemic hematopoietic stem cells precedes human acute myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 4 (149), (2012).
  14. Corces-Zimmerman, M. R., Hong, W. J., Weissman, I. L., Medeiros, B. C., Majeti, R. Preleukemic mutations in human acute myeloid leukemia affect epigenetic regulators and persist in remission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (7), 2548-2553 (2014).
  15. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  16. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  17. Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  18. Cancer Genone Atlas Research Network. Genomic and epigenomic landscapes of adult de novo acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (22), 2059-2074 (2013).
  19. Ball, M., List, A. F., Padron, E. When clinical heterogeneity exceeds genetic heterogeneity: thinking outside the genomic box in chronic myelomonocytic leukemia. Blood. 128 (20), 2381-2387 (2016).
  20. Varmus, H. E. The molecular genetics of cellular oncogenes. Annual Review of Genetics. 18, 553-612 (2003).
  21. Cox, D. B. T., Platt, R. J., Zhang, F. Therapeutic genome editing: Prospects and challenges. Nature Medicine. 21 (2), 121-131 (2015).
  22. Tothova, Z., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing in human hematopoietic stem cells models clonal hematopoiesis and myeloid neoplasia. Cell Stem Cell. 21 (4), 547-555 (2017).
  23. Mandal, P. K., et al. Efficient ablation of genes in human hematopoietic stem and effector cells using CRISPR/Cas9. Cell Stem Cell. 15 (5), 643-652 (2014).
  24. Bak, R. O., Dever, D. P., Porteus, M. H. CRISPR/Cas9 genome editing in human hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 13 (2), 358-376 (2018).
  25. Foßelteder, J., et al. Human gene-engineered calreticulin mutant stem cells recapitulate MPN hallmarks and identify targetable vulnerabilities. Leukemia. , (2023).
  26. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2391-2405 (2013).
  27. Merlinsky, T. R., Levine, R. L., Pronier, E. Unfolding the role of calreticulin in myeloproliferative neoplasm pathogenesis. Clinical Cancer Research. 25 (10), 2956-2962 (2019).
  28. Belčič Mikič, T., Pajič, T., Zver, S., Sever, M. The contemporary approach to CALR-positive myeloproliferative neoplasms. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3371 (2021).
  29. How, J., Hobbs, G. S., Mullally, A. Mutant calreticulin in myeloproliferative neoplasms. Blood. 134 (25), 2242-2248 (2019).
  30. Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nature Protocols. 1 (3), 1412-1428 (2006).
  31. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Therapy. 6 (6), 973-985 (1999).
  32. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2011).
  33. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369 (25), 2379-2390 (2013).
  34. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 1-24 (2021).
  35. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. The Journal of Clinical Investigation. 119 (4), 964-975 (2009).
  36. Vaidyanathan, S., et al. Targeted replacement of full-length CFTR in human airway stem cells by CRISPR-Cas9 for pan-mutation correction in the endogenous locus. Molecular Therapy. 30 (1), 223-237 (2022).
  37. Cromer, M. K., et al. Gene replacement of α-globin with β-globin restores hemoglobin balance in β-thalassemia-derived hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Medicine. 27 (4), 677-687 (2021).
  38. Wiebking, V., et al. Genome editing of donor-derived T-cells to generate allogenic chimeric antigen receptor-modified T cells: Optimizing αβ T cell-depleted haploidentical hematopoietic stem cell transplantation. Haematologica. 106 (3), 847-858 (2021).
  39. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).
  40. Dever, D. P., et al. CRISPR/Cas9 genome engineering in engraftable human brain-derived neural stem cells. iScience. 15, 524-535 (2019).
  41. Laustsen, A., et al. Interferon priming is essential for human CD34+ cell-derived plasmacytoid dendritic cell maturation and function. Nature Communications. 9 (1), 1-14 (2018).
  42. Bak, R. O., et al. Multiplexed genetic engineering of human hematopoietic stem and progenitor cells using CRISPR/Cas9 and AAV6. eLife. 6, 27873 (2017).
  43. Nakauchi, Y., et al. The cell type-specific 5hmC landscape and dynamics of healthy human hematopoiesis and TET2-mutant preleukemia. Blood Cancer Discovery. 3 (4), 346-367 (2022).
  44. Vaidyanathan, S., et al. selection-free gene repair in airway stem cells from cystic fibrosis patients rescues CFTR function in differentiated epithelia. Cell Stem Cell. 26 (2), 161-171 (2020).
  45. Tang, N., et al. TGF-β inhibition via CRISPR promotes the long-term efficacy of CAR T cells against solid tumors. JCI Insight. 5 (4), 133977 (2020).
  46. Georgiadis, C., et al. Long terminal repeat CRISPR-CAR-coupled "universal" T cells mediate potent anti-leukemic effects. Molecular Therapy. 26 (5), 1215-1227 (2018).
  47. Ren, J., et al. Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition. Clinical Cancer Research. 23 (9), 2255-2266 (2017).
  48. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  49. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
  50. Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).

Tags

Cancerforskning nummer 193 CRISPR/Cas9 genomteknik leukemogenes hematopoetiska stamceller AAV mutation homolog rekombination funktionsförstärkningsmutationer
Tekniska onkogena heterozygota förstärkningsmutationer i humana hematopoetiska stam- och stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sconocchia, T., Foßelteder, J., More

Sconocchia, T., Foßelteder, J., Köhnke, T., Majeti, R., Reinisch, A. Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (193), e64558, doi:10.3791/64558 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter