Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

طريقة التثقيب الكهربائي لتحويل الريكتسيا spp. باستخدام ناقل مكوك يعبر عن البروتين الفلوري في خطوط خلايا القراد

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64562
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Minnesota

Summary

التثقيب الكهربائي هو طريقة سريعة ومعتمدة على نطاق واسع لإدخال الحمض النووي الخارجي في جنس Rickettsia. يوفر هذا البروتوكول طريقة تثقيب كهربائي مفيدة لتحويل البكتيريا داخل الخلايا الملزمة في جنس Rickettsia.

Abstract

تحدث الريكتسيات بسبب مجموعة واسعة من البكتيريا داخل الخلايا الملزمة التي تنتمي إلى جنس الريكتسيا والتي يمكن أن تنتقل إلى مضيفات الفقاريات من خلال لدغة ناقلات المفصليات المصابة. حتى الآن ، لا تزال الريكتسيات الوبائية الناشئة أو التي تعاود الظهور تشكل خطرا على الصحة العامة بسبب صعوبة التشخيص ، حيث أن طرق التشخيص محدودة وغير موحدة أو متاحة عالميا. قد يؤدي التشخيص الخاطئ الناتج عن عدم التعرف على العلامات والأعراض إلى تأخر العلاج بالمضادات الحيوية ونتائج صحية سيئة. إن الفهم الشامل لخصائص الريكتسيا من شأنه أن يحسن في النهاية التشخيص السريري والتقييم والعلاج مع تحسين السيطرة على المرض والوقاية منه.

الدراسات الوظيفية لجينات الريكتسية ضرورية لفهم دورها في التسبب في المرض. تصف هذه الورقة إجراء للتثقيب الكهربائي لسلالة ريكتسيا باركيري Tate's Hell باستخدام ناقل المكوك pRAM18dSFA واختيار R. parkeri المتحول في زراعة خلايا القراد بالمضادات الحيوية (spectinomycin و streptomycin). تم وصف طريقة أيضا لتوطين R. parkeri المحول في خلايا القراد باستخدام الفحص المجهري المناعي البؤري ، وهي تقنية مفيدة للتحقق من التحول في خطوط الخلايا المتجهة. مناهج مماثلة هي أيضا مناسبة لتحويل rickettsiae الأخرى.

Introduction

تحدث الريكتسيات بسبب مجموعة واسعة من البكتيريا داخل الخلايا الملزمة التي تنتمي إلى جنس الريكتسيا (عائلة Rickettsiaceae ، رتبة Rickettsiales). يصنف جنس الريكتسيا إلى أربع مجموعات رئيسية بناء على الخصائص التطورية 1,2: مجموعة الحمى المبقعة (SFG) ، والتي تحتوي على تلك الريكتسيا التي تسبب الريكتسيات الأكثر شدة وفتكا التي تنقلها القراد (على سبيل المثال ، Rickettsia rickettsii ، العامل المسبب لحمى الجبال الصخرية المبقعة) ، مجموعة التيفوس (TG ، على سبيل المثال ، Rickettsia prowazekii ، عامل التيفوس الوبائي) ، المجموعة الانتقالية (TRG ، على سبيل المثال ، Rickettsia felis ، العامل المسبب للحمى المبقعة التي تنقلها البراغيث) ، ومجموعة الأجداد (AG ، على سبيل المثال ، Rickettsia bellii).

من بين أقدم الأمراض المعروفة المنقولة بالنواقل ، يتم الحصول على الريكتسيات بشكل أساسي بعد انتقال مسببات الأمراض من خلال لدغات ناقلات المفصليات المصابة ، بما في ذلك القراد والبراغيث والقمل والعث 3,4. على الرغم من أن اكتشاف المضادات الحيوية الفعالة قد حسن نتائج العلاج ، إلا أن الريكتسيات الوبائية الناشئة والمعاودة الظهور لا تزال تشكل تحديا لاستراتيجيات الوقاية والمكافحة التقليدية. وبالتالي ، فإن الفهم الشامل لتفاعلات الريكتسيا / المضيف / الناقل من شأنه أن يضع في النهاية أساسا قويا لتطوير مناهج جديدة للوقاية من هذه الأمراض القديمة وعلاجها.

في الطبيعة ، يحدث نقل الجينات الأفقي (HGT) في البكتيريا من خلال الاقتران والنقل والتحول5. يستخدم التحول البكتيري في المختبر مفاهيم HGT هذه ، على الرغم من أن الطبيعة داخل الخلايا للريكتسيا تمثل بعض التحديات. حالت ظروف النمو المقيدة وأنظمة الاقتران والتحويل غير المفهومة بشكل جيد في أنواع مختلفة من الريكتسيا دون تطبيق طرق الاقتران والتحويل في الريكتسيا6،7،8. بالمقارنة مع الأجناس البكتيرية الأخرى داخل الخلايا (على سبيل المثال ، الكلاميديا ، Coxiella ، Anaplasma ، و Ehrlichia) ، يختلف جنس Rickettsia فيما يتعلق باستراتيجيات النمو والتكرار داخل سيتوبلازم الخلية ، مما يفرض تحديات محددة على التعديل الوراثي للريكتسيا بسبب ميزات نمط الحياة الفريدة9.

العقبة الأولية التي يجب التغلب عليها عند محاولة التعديل الوراثي للريكتسيا هي تحقيق تحول ناجح. وبالتالي ، فإن تصميم نهج عملي بكفاءة تحويل عالية سيكون ذا قيمة كبيرة لتطوير أدوات وراثية للريكتسيا. هنا ، نركز على التثقيب الكهربائي ، وهي طريقة تحويل معترف بها على نطاق واسع تم استخدامها لإدخال الحمض النووي الخارجي بنجاح في العديد من أنواع الريكتسيا ، بما في ذلك ريكتسيا برووازيكي ، ريكتسيا تيفي ، ريكتسيا كونوري ، ريكتسيا باركيري ، ريكتسيا مونتانينسيس ، ريكتسيا بيلي ، ريكتسيا بيكوكي ، وريكتسيا بوخنيري10، 11،12 ، 13،14،15،16.

تصف هذه الورقة إجراء للتثقيب الكهربائي لسلالة R. parkeri Tate's Hell (الانضمام: GCA_000965145.1) باستخدام ناقل المكوك pRAM18dSFA المشتق من سلالة Rickettsia amblyommatis AaR / SC plasmid pRAM18 المصممة لتشفير mKATE ، وهو بروتين فلوري أحمر بعيد ، و aadA ، يمنح مقاومة سبكتينومايسين والستربتومايسين13،15،20. R. parkeri المحولة قابلة للحياة ويتم الحفاظ عليها بثبات تحت اختيار المضادات الحيوية في خطوط خلايا القراد. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أنه يمكن استخدام توطين R. parkeri المحول في خلايا القراد الحية عبر الفحص المجهري متحد البؤر لتقييم جودة معدلات التحول في خطوط الخلايا المتجهة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. انتشار وتنقية R. parkeri من ثقافة خلايا القراد

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع إجراءات زراعة الخلايا في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية.

  1. اعداد R. parkeri- خلايا القراد المصابة
    1. تنمو خلايا ISE6 في قوارير زراعة الخلايا 25 سم2 عند 34 درجة مئوية في 5 مل من L15C300 المتوسطة17 ، تستكمل مع 5 ٪ مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، 5 ٪ مرق فوسفات التربتوز (TPB) ، و 0.1 ٪ تركيز البروتين الدهني (LPC).
      ملاحظة: ISE6 (خط الخلايا المشتقة من الجنين Ixodes scapularis) هو خط خلية القراد المستخدم على نطاق واسع في العديد من المختبرات ، وبالتالي فهو نموذج أساسي لدراسة تفاعلات القراد والممرض17،18،19. معدل نمو خلايا ISE6 أبطأ من خلايا الثدييات ، حيث تضاعف عدد السكان ≥72 ساعة. على سبيل المثال ، ستستغرق خلايا ISE6 المزروعة من ثقافة متقاربة بنسبة 100٪ بنسبة 1: 5 من 3 إلى 4 أسابيع لاستعادة التقاء 100٪. سيتم تقريب خلايا ISE6 السليمة بشكل عام مع العديد من الخيوط الملتصقة17.
    2. عد خلايا ISE6 باستخدام مقياس الدم تحت المجهر الضوئي. استخدم بتركيز ~ 106 خلايا / مل (100٪ متقارب).
      1. شطف بلطف الخلايا من القارورة مع وسط وتفريق الخلايا عن طريق ماصة لتوليد تعليق خلية متجانسة. أضف 20 ميكرولتر من تعليق الخلية بين مقياس الدم وغطاء الزجاج لحساب الخلايا باستخدام مقياس الدم.
    3. أضف مضيفا من النوع البري الخالي من الخلايا R. parkeri 20 (متوسط العدد: 5 × 10 7-10 × 107) إلى مزارع خلايا ISE6 في قوارير زراعة خلايا 25 سم2. احتضان مزارع خلايا R. parkeri المصابة عند 34 درجة مئوية في 5 مل من وسط كامل يتكون من وسط L15C300 ، 10٪ FBS ، 5٪ TPB ، 0.1٪ LPC ، 0.25٪ بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) ، و 25 mM HEPES حتى تصاب 90٪ -100٪ من الخلايا.
      ملاحظة: يتم تحديد معدل الإصابة ب R. parkeri في خلايا ISE6 عن طريق تلطيخ Giemsa ، ويتراوح وقت الحضانة للوصول إلى 90٪ -100٪ من العدوى من 5 أيام إلى 7 أيام في المتوسط.
    4. تحديد معدل الإصابة عن طريق تلطيخ Giemsa.
      1. في خزانة السلامة الحيوية ، أعد تعليق مزارع الخلايا المصابة وانقل 50 ميكرولتر من المعلق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
      2. قم بتخفيف التعليق بوسط كامل (تخفيف 1: 5) وأجهزة طرد مركزي 100 ميكرولتر على شرائح مجهر زجاجية باستخدام جهاز طرد مركزي عند 113 × جم لمدة 5 دقائق. للحفاظ على احتواء R. parkeri الحي ، استخدم جهاز طرد مركزي مع دوار مغلق مصمم لإزالته من جهاز الطرد المركزي. يتيح ذلك نقل الدوار المختوم داخل وخارج غطاء المحرك.
        ملاحظة: نظرا لأن R. parkeri لا تزال على قيد الحياة قبل الطرد المركزي ، يجب احتواء العينة حتى يتم قتل الريكتسيا. وبالتالي ، يجب أن يكون لجهاز الطرد المركزي المستخدم لتدوير ثقافة R. parkeri على الشريحة دوار مغلق مصمم ليتم رفعه من جهاز الطرد المركزي. مع وجود الدوار في غطاء التدفق الصفحي ، قم بتحميل العينات في مجموعة شرائح مجهر القمع ، وأعد إغلاق الدوار ، ثم ضع الدوار المختوم مرة أخرى في جهاز الطرد المركزي. ثم قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي ، ويتم إيداع العينات على شرائح المجهر. بعد الانتهاء من التشغيل ، قم بإزالة الدوار المختوم من جهاز الطرد المركزي وضعه في غطاء التدفق الصفحي. هناك ، افتح غطاء الدوار ، وقم بتفريغ مجموعة شرائح مجهر القمع داخل الغطاء. بمجرد أن يجف ، اغمر شرائح المجهر الزجاجي في الميثانول المطلق ، الذي يقتل جميع مسببات الأمراض. يتم غمر القمع والناقلات المعدنية في DMQ المخفف ، مما يقتل R. parkeri.
      3. جفف الشرائح في الهواء وثبتها في الميثانول المطلق لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
      4. قم بتلطيخ الشرائح بصبغة Giemsa (4٪ في محلول سورنسون ، درجة الحموضة 6.6) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية واشطفها بالماء لمدة 5 ثوان.
      5. تحديد نسبة الإصابة (عدد الخلايا المصابة بالريكتسيا / 100 خلية) عن طريق الفحص المجهري الضوئي.
        ملاحظة: يوضح الشكل 1 نتائج بقع Giemsa النموذجية.
  2. تحضير R. parkeri الخالي من الخلايا
    ملاحظة: عند إصابة 90٪ -100٪ من الخلايا في المزرعة ، يجب عزل الريكتسيا عن خلايا ISE6 ويجب إجراء التثقيب الكهربائي.
    1. أضف حبيبات كربيد السيليكون المعقمة 60-90 إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة سعة 2 مل إلى حجم 0.2 مل تقريبا.
    2. قم بإزالة 2 مل من الوسط من 100٪ من الثقافات المصابة ب R. parkeri (الخطوة 1.1.3) وأعد تعليق الخلايا في 3 مل المتبقية من الوسط.
    3. انقل أجزاء متساوية من هذا التعليق إلى الأنابيب المعدة في الخطوة 1.2.1.
    4. دوامة كل أنبوب بسرعة عالية لمدة 30 ثانية ثم وضع الأنابيب على الجليد. دع الحصى يستقر في غضون ثوان عن طريق الجاذبية.
    5. في خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية ، احصل على حقنة معقمة سعة 5 مل جاهزة مع تمديد المكبس ونهاية المكبس مثبتة في قاعدة من البوليسترين لأنابيب مخروطية سعة 15 مل.
    6. باستخدام طرف ماصة حاجز معقم سعة 1 مل مثبت على ماصة مناسبة ، قم بإزالة طافي محللة الخلية الدوامة من الأنبوب ، مع الحرص على عدم استنشاق أي حصى. أدخل طرف الماصة في فتحة محور المحقنة وأخرج المحتويات في المحقنة بضغط لطيف. بدلا من ذلك ، استخدم ماصة باستور معقمة 2 مل تعمل بمصباح مطاطي.
    7. قم بتوصيل مرشح معقم بحجم المسام 2 ميكرومتر على محور المحقنة وقم بتصفية مزرعة R. parkeri من الخطوة 1.2.6 إلى أنابيب معقمة سعة 1.5 مل.
    8. اجمع R. parkeri عن طريق الطرد المركزي عند 13600 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
    9. أعد تعليق الحبيبات في 1.2 مل من السكروز المثلج 300 مللي مول وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 13600 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. كرر إعادة التعليق والطرد المركزي لما مجموعه غسلتين من السكروز.
    10. ادمج كريات R. parkeri في أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد ومعقم سعة 1.5 مل في 50 ميكرولتر من السكروز المثلج البارد 300 مللي مول لكل تحويل. نظرا لأن دورق واحد 25 سم2 من R. parkeri يوفر ما يكفي من الريكتسيا لتحويلين إلى ثلاثة تحويلات ، أضف 100-150 ميكرولتر من 300 ملي مل من السكروز البارد.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، يمكن حساب عدد الريكتسيا باستخدام غرفة عد Petroff-Hausser. عند استخدام التلقيح الأولي ل 5 × 107 -10 × 10 7 R. parkeri الخالية من الخلايا ، سيستغرق الأمر من 5 إلى 7 أيام في المتوسط للوصول إلى 90٪ -100٪ من العدوى ، مما ينتج عنه ما يقرب من 5 × 107-10 × 1010 R. parkeri الخالية من الخلايا.
    11. أعد تعليق الحبيبات برفق عن طريق السحب حتى يتم تشتيتها تماما. قسم العينة إلى أجزاء 50 ميكرولتر في أنابيب طرد مركزي دقيقة مبردة ومعقمة سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، يمكن تقييم صلاحية الريكتسية عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد التلوين بصبغة فلورية 21.

2. تحويل R. parkeri مع البلازميد pRAM18dSFA

  1. على الثلج ، أضف 3 ميكروغرام من pRAM18dSFA البلازميد DNA13،15،20 الخالي من السموم الداخلية إلى كل أنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من معلق R. parkeri وحرك الخليط بطرف الماصة برفق ولكن بدقة.
    ملاحظة: عند تحضير الحمض النووي للبلازميد، استخدم مجموعة تنقية تتضمن خطوة إزالة السموم الداخلية للحصول على الحمض النووي البلازميدالخالي من السموم الداخلية 23. وجدنا أن مجموعة من تركيزات البلازميد تتراوح بين 1 ميكروغرام و 3 ميكروغرام لكل 50 ميكرولتر من معلق R. parkeri أدت إلى تحولات ناجحة ، في حين أن زيادة كمية البلازميد إلى 10 ميكروغرام تمنع التحول.
  2. انقل الخليط أعلاه من DNA و R. parkeri إلى كوفيت كوفر مبرد ومعقم بفجوة 0.1 سم (اضغط برفق على الكوفيت حتى يتم توزيع الخليط بالتساوي) واتركه على الثلج لمدة 10-30 دقيقة.
  3. قم بإزالة الوسط من ثقافة متقاربة بنسبة 100٪ لخلايا ISE6 وأعد تعليق طبقات الخلية في 1.5 مل من الوسط الطازج باستخدام NaHCO 3 و HEPES buffer (الموصوف أعلاه في الخطوة 1.1.3). استخدم دورقا واحدا من الخلايا المتقاربة لكل تحويل.
  4. نقل الخلايا المعاد تعليقها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 2 مل (أنبوب واحد لكل دورق 25 سم2 من خلايا ISE6).
  5. قم بالكهرباء خليط R. parkeri / pRAM18dSFA عند 1.8 كيلو فولت ، 200 أوم ، 25 ميكرو فهرنهايت باستخدام جهاز كهربائي.
  6. باستخدام ماصة نقل معقمة وممتدة ذات طرف رفيع ، انقل كمية صغيرة من معلق الخلية ISE6 (الخطوة 2.4) إلى الكوفيت واسحب السائل برفق لأعلى ولأسفل لغسل الكوفيت. انقل الخليط إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل الذي يحتوي على ما تبقى من معلق الخلية ISE6 واخلط خليط التحويل برفق مع الخلايا.
  7. قم بالطرد المركزي للعينات المحولة عند 700 × جم لمدة 2 دقيقة عند RT ، ثم قم بزيادة سرعة الطرد المركزي إلى 13600 × جم لمدة 1 دقيقة أخرى في RT.
    ملاحظة: تعزز سرعتا الطرد المركزي الارتباط الريكتسي مع الخلايا والدخول إليها: يتم استخدام 700 × جم لسحب خلايا ISE6 لأسفل ، بينما يتم استخدام 13600 × جم لسحب الريكتسيا.
  8. اترك العينات تجلس عند RT أو 34 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى 1 ساعة.
  9. أعد تعليق المحولات (اثنان أو ثلاثة) في خلايا ISE6 بطرف ماصة حاجز معقم سعة 2 مل مثبت على ماصة وانقله إلى قوارير زراعة خلية 25 سم2 تحتوي على 3.5 مل من الوسط الطازج مع NaHCO3 و HEPES buffer. بدلا من ذلك ، استخدم ماصة باستور معقمة 2 مل تعمل بمصباح مطاطي.
  10. صخر القوارير لتوزيع الخليط بالتساوي ثم احتضانها عند 34 درجة مئوية.
  11. بعد 16-24 ساعة، أضف 10 ميكرولتر من سبكتينومايسين (50 ملغ/مل) و10 ميكرولتر من الستربتومايسين (50 ملغ/مل) إلى كل دورق في الخطوة 2.10.

3. مراقبة R. parkeri المحول

ملاحظة: استخدم مجهر فوق التألق مع مرشحات الرودامين / TRITC لمراقبة القوارير المحضرة في الخطوة 2.11 بعد 3-7 أيام. بمجرد ظهور اللويحات في الثقافات (5-14 يوما) ، يمكن رؤية R. parkeri المحولة التي تعبر عن البروتين الفلوري الأحمر mKATE ، المشفر على بلازميد pRAM18dSFA.

  1. الفحص المجهري متحد البؤر
    1. أعد تعليق مزارع الخلايا من قوارير الخطوة 2.11 واخلط 100 ميكرولتر من مزارع الخلايا هذه مع 5 ميكرولتر من محلول Hoechst 33342 لمدة 10-30 دقيقة في RT في الظلام.
      ملاحظة: Hoechst 33342 عبارة عن صبغة نووية قابلة للنفاذ الخلوي ترتبط بالحمض النووي لخلية القراد الحية وتنبعث منها مضان أزرق.
    2. جهاز طرد مركزي 50 ميكرولتر من الخليط على مجهر زجاجي ينزلق باستخدام جهاز طرد مركزي عند 5 × جم لمدة 3 دقائق.
    3. أضف 3 ميكرولتر من 1x PBS إلى بقعة الخلايا المودعة على الشريحة ، وتراكب مع زلة غطاء ، وعرض باستخدام مجهر متحد البؤر (هدف 60x). استخدم معلمات الإثارة والانبعاث التالية للتصوير الفلوري: ل 4′،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، الإثارة عند 350 نانومتر ، الانبعاث عند 470 نانومتر ؛ لرباعي ميثيل رودامين (TRITC) ، الإثارة عند 557 نانومتر ، الانبعاث عند 576 نانومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوضح الشكل 1 مورفولوجيا R. parkeri في خلايا ISE6 تحت المجهر الضوئي بعد تلطيخ Giemsa. في الشكل 2 ، يتم عرض R. parkeri المحول الذي يعبر عن بروتين مضان أحمر في خلايا ISE6 باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. هناك زيادة كبيرة في معدل الإصابة ب R. parkeri المحولة (الحمراء) في خلايا ISE6 (الزرقاء ، تتوافق مع النوى) من (A) اليوم 7 إلى (B) اليوم 10 من الحضانة.

Figure 1
الشكل 1: شرائح تظهر ريكتسيا باركيري الملطخة بجيمسا في خلايا ISE6. خلايا ISE6 المصابة ب R. parkeri من النوع البري عند (A) عدوى منخفضة و (B) معدلات إصابة 90٪ -100٪. نوى خلايا ISE6 تلطخ باللون الأرجواني الداكن مع Giemsa. تظهر R. parkeri كقضبان أرجوانية داكنة. تظهر المربعات الحمراء الريكتسيا داخل الخلايا ، وتشير العلامات النجمية الحمراء إلى الريكتسيا خارج الخلية. تم التقاط جميع الصور على مجهر ضوئي بهدف 100x. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. اختصار: N = نوى. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تحويل الريكتسيا باركيري الذي يعبر عن بروتين مضان أحمر في خلايا ISE6. pRAM18dSFA-transform R. parkeri (أحمر) في خلايا ISE6 (أزرق) ، ملطخة ب Hoechst 33342 ويتم اكتشافها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر (A) 7 أيام و (B) بعد 10 أيام من التحول. Hoechst 33342 يلطخ النوى ، وتتشابه أطوال موجات الإثارة والانبعاث مع DAPI. الإشارات المدمجة هي مزيج من صور مرشح DAPI و TRITC. تم التقاط جميع الصور على مجهر متحد البؤر بهدف 60x. قضبان المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: DAPI = 4',6-دياميدينو-2-فينيليندول; TRITC = رباعي ميثيل رودامين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، نوضح طريقة لإدخال الحمض النووي الخارجي المشفر على المكوك البلازميد pRAM18dSFA في الريكتسيا باستخدام التثقيب الكهربائي. في هذا الإجراء ، تم تنقية الريكتسيا الخالية من الخلايا من الخلايا المضيفة ، وتحويلها باستخدام ناقل مكوك ريكتسي ، وإطلاقها على خلايا القراد للعدوى. يوصف أيضا إجراء مضان مناعي متحد البؤر للكشف عن بروتين مضان أحمر يعبر عن R. parkeri في خلايا القراد. طرق مماثلة قابلة للتطبيق على أنواع الريكتسيا الأخرى ومع مزيد من التعديلات قد تكون قابلة للتكيف مع البكتيريا الأخرى داخل الخلايا الملزمة القادرة على الحفاظ على البلازميد.

يتطلب التحول الناجح في هذا البروتوكول ثلاثة مكونات: الحمض النووي الخارجي ، وبكتيريا Rickettsia spp. ، ونوع مناسب من الخلايا المضيفة22. اعتمادا على هدف البحث المحدد ، يمكن تغيير هذه المكونات. أولا ، تم إدخال الحمض النووي الخارجي عبر بلازميد pRAM18dSFA ، والذي يحتوي على علامات قابلة للاختيار من سبكتينومايسين والستربتومايسين ويعبر عن mKATE (بروتين فلوري أحمر بعيد). يمنح هذا البلازميد أيضا مقاومة الأمبيسلين للنمو في الإشريكية القولونية. كما هو موضح في الدراسات السابقة ، من الممكن استبدال علامات مقاومة المضادات الحيوية وجينات البروتينات الفلورية13. ثانيا ، تم اختيار خلايا ISE6 لتمثيل خطوط الخلايا المحولة حيث يستخدم خط الخلية هذا على نطاق واسع في العديد من المختبرات وهو نموذج أساسي لدراسة تفاعلات النواقل والممرضة17،18،19. يمكن أيضا استخدام أنواع أخرى من القراد16 أو خلايا الثدييات23,24 لزراعة الريكتسيا للتحول. أخيرا ، في هذا البروتوكول ، تم استخدام R. parkeri ، والذي يمكن التلاعب به في مختبر السلامة الأحيائية من المستوى 2 (BSL-2) باستخدام خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية مع احتياطات السلامة المناسبة. الريكتسيا الأخرى الأكثر إمراضا (على سبيل المثال ، R. rickettsii; ر. بروازيكي) تتطلب إعداد BSL-3 للتلاعب ؛ ولذلك، يجب استخدام بروتوكول معياري أكثر صرامة للسلامة الأحيائية عند العمل مع هذه العوامل.

على الرغم من أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول كإجراء قياسي لتحويل الريكتسيا ، إلا أن العديد من الخطوات الفنية الرئيسية تتطلب اهتماما خاصا. أولا ، يجب أن تضمن خطوة التنقية الناجحة بقاء الريكتسيا الخالية من الخلايا والعدوى9 ؛ ومن ثم ، فإن الجانب الأكثر أهمية في إجراء التحول هو عزل الريكتسيا المعدية الخالية من الخلايا. أي ملح متبقي في الريكتسيا المنقى سيؤدي إلى فشل الانحناء والتحول. لذلك ، يلزم غسل الريكتسيا المعزولة الخالية من الخلايا بالسكروز لإزالة جميع الأملاح. يحمي محلول السكروز البارد أيضا سلامة غشاء الريكتسية في الحالة خارج الخلية.

عندما تصاب 90٪ -100٪ من الخلايا في المزرعة ، يجب عزل الريكتسيا عن خلايا ISE6 ، ويجب إجراء التثقيب الكهربائي دون تأخير ودون انقطاع ، لأن الريكتسيا كائنات حية داخل الخلايا ولا تعيش بشكل جيد خارج الخلايا. على الرغم من أنه يمكن تخزين مزارع الريكتسية عند 4 درجات مئوية ، إلا أنه لا ينبغي استخدام هذا النوع من المواد للتثقيب الكهربائي. يمكن استخدام المزرعة التي تم تخزينها عند 4 درجات مئوية لتلقيح طبقة جديدة من خلايا ISE6 ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك للتثقيب الكهربائي بمجرد وصول العدوى إلى 90٪ -100٪.

ثانيا ، إعدادات التثقيب الكهربائي ، بما في ذلك الجهد والمقاومة والسعة وثابت الوقت ، خاصة بأنواع الريكتسية المختلفة. على سبيل المثال ، تعتمد شدة المجال المطلوبة أثناء التثقيب الكهربائي على حجم الريكتسيا والحمض النووي الخارجي7. أخيرا ، من المهم الحفاظ على الريكتسيا المحولة تحت اختيار المضادات الحيوية لمنع فقدان البلازميدات الخارجية أثناء الممرات المتعددة في الخلايا المضيفة9. يعتمد تركيز ونوع المضادات الحيوية المستخدمة على أنواع الريكتسيا التي يتم تحويلها ، كما هو موضح سابقا 13،15،16،23 ، ومن المهم ألا تكون علامة المضادات الحيوية المختارة هي التي يتم تطبيقها في العلاجات السريرية.

لاتباع هذا البروتوكول ، يجب استخدام كل من سبكتينومايسين والستربتومايسين للاختيار حتى يتم التخلص من جميع الريكتسيا المتبقية غير المحولة. مجتمعة ، يقتل المضادان الحيويان كلا من الريكتسيا داخل الخلايا وخارجها ويقلل من احتمال ظهور الريكتسيا من النوع البري المقاوم. بالإضافة إلى ذلك ، لا يؤثر استخدام كل من هذه المضادات الحيوية على التجارب النهائية ، مثل القدرة على استخدامها بشكل منفصل لاختيار اثنين من البلازميدات المختلفة ، لأن جين aadA يمنح مقاومة لكل من سبكتينومايسين والستربتومايسين. لا يمنح المضاحيان الحيويان المستخدمان في هذا البروتوكول مقاومة للمضادات الحيوية المستخدمة في العلاج السريري لمرض الريكتسية.

يتميز خط خلية القراد ISE6 المستخدم في هذه الدراسة بمزايا فريدة. أولا ، تم عزل خلايا ISE6 من القراد الأسود Ixodes scapularis Say (Acari: Ixodidae) ، الناقل الرئيسي لسبعة مسببات أمراض بشرية في الولايات المتحدة. ثانيا ، ISE6 هو خط خلايا القراد المستخدم على نطاق واسع في العديد من المختبرات وقد تم استخدامه بنجاح لاستعادة العديد من البكتيريا المرتبطة بالقراد (Rickettsia و Anaplasma و Ehrlichia) بعد التثقيب الكهربائي. ثالثا ، لا يمكن نشر بعض الريكتسيا المسببة للأمراض إلا في خلايا القراد ولكن ليس في خلايا الثدييات17،18،19،24. ومع ذلك ، فإن خطوط خلايا القراد هشة نسبيا مقارنة بخلايا الثدييات ولها متطلبات زراعة أكثر كثافة25،26،27،28. بالإضافة إلى ذلك ، فإن معدل نمو خلايا ISE6 أبطأ بكثير من معدل نمو خطوط خلايا الثدييات ، حتى لو تم زرعها بنفس الكثافة الأولية ، على الرغم من أن التكرار البطيء يمكن أن يكون مفيدا عندما تظهر محولات الريكتسية نموا منخفضا.

يوفر هذا البروتوكول أيضا طريقة لتقييم كفاءة تحويل الريكتسيا في الخلايا الحية في خطوات تجريبية حرجة ، مما يساعد على تحسين إعدادات التثقيب الكهربائي أو في اختبار كفاءة خطوط الخلايا المختلفة لاستعادة المحولات. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول له قيود ، خاصة بالنسبة للقياس الكمي للمحولات التي تم الحصول عليها. يمكن إثبات كفاءة التحول كمؤشر على التحول الناجح في دراسة مستقبلية. يمكن تقييم صلاحية الريكتسية باستخدام مجموعة تلطيخ مناسبة وقياس التدفق الخلوي21 لتحديد المحولات التي يتم الحصول عليها. سيتم استخدام معلمتين لتحديد كفاءة التحويل - عدد الريكتسيات الحية المستخدمة في التحويل وعدد الريكتسيات المحولة التي تعبر عن mKATE.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تحليل الصور مع إشارات التألق لمقارنة معدلات تحويل البلازميدات المختلفة. نظرا لأن الآلية الأساسية لصيانة البلازميد الريكتسية غير مفهومة بشكل جيد ، فإن أنظمة التحويل المميزة جيدا لإدخال البلازميدات الخارجية يمكن أن تكون أدوات قيمة لمزيد من التحقيق. علاوة على ذلك ، فإن التصور المباشر للريكتسيا المعبرة عن البروتين الفلوري في الخلايا أو الأنسجة سيحسن فهمنا لتفاعلات الريكتسيا / المضيف / المتجه. سيوفر هذا معلومات لتصميم استراتيجيات للسيطرة على الريكتسيات ومنعها.

توفر البيانات:
جميع البيانات التي تستند إليها نتائج هذه الدراسة متاحة للجمهور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر تيموثي ج. كورتي وبنيامين كول على مناقشاتهما واقتراحاتهما الثاقبة. تم دعم هذه الدراسة ماليا بمنحة إلى U.G.M. من المعاهد الوطنية للصحة (2R01AI049424) ومنحة إلى U.G.M. من محطة مينيسوتا للتجارب الزراعية (MIN-17-078).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette Bio-Rad 1652083
2 μm pore size filter  GE Healthcare Life Sciences Whatman 6783-2520
5 mL Luer-lock syringe  BD 309646
60-90 silicon carbide grit  LORTONE, inc  591-056
absolute methanol  Fisher Scientific A457-4
Bacto tryptose phosphate broth  BD 260300
Cytospin centrifuge Cytospin4 Thermo Fisher Scientific A78300003 The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) QIAGEN 12362 used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet  Perfector Scientific TP03-5301
fetal bovine serum  Gemini Bio 900-108 The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS Bio-Rad 165-2105 & 165-2110
hemocytometer Thermo Fisher Scientific 267110
HEPES Millipore-Sigma H4034
ImageJ Fiji National Institute of Health raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain  Gibco  2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium Gibco 41300039
lipoprotein concentrate  MP Biomedicals 191476
Nikon Diaphot Nikon epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent  Thermo Fisher Scientific R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope  Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber Hausser Scientific  Chamber 3900
sodium bicarbonate Millipore-Sigma S5761
Vortex Fisher Vortex Genie 2 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillespie, J. J., et al. Plasmids and rickettsial evolution: Insight from Rickettsia felis. PLoS One. 2 (3), 266 (2007).
  2. Murray, G. G., Weinert, L. A., Rhule, E. L., Welch, J. J. The phylogeny of Rickettsia using different evolutionary signatures: How tree-like is bacterial evolution. Systematic Biology. 65 (2), 265-279 (2016).
  3. Parola, P., Paddock, C. D., Raoult, D. Tick-borne rickettsioses around the world: Emerging diseases challenging old concepts. Clinical Microbiology Reviews. 18 (4), 719-756 (2005).
  4. Fang, R., Blanton, L. S., Walker, D. H. Rickettsiae as emerging infectious agents. Clinics in Laboratory Medicine. 37 (2), 383-400 (2017).
  5. Von Wintersdorff, C. J., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7, 173 (2016).
  6. Winkler, H. H. Rickettsia species (as organisms). Annual Review of Microbiology. 44 (1), 131-153 (1990).
  7. Wood, D. O., Azad, A. F. Genetic manipulation of rickettsiae: A preview. Infection and Immunity. 68 (11), 6091-6093 (2000).
  8. Perlman, S. J., Hunter, M. S., Zchori-Fein, E. The emerging diversity of Rickettsia. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 273 (1598), 2097-2106 (2006).
  9. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate intracellular bacteria: Progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 544-558 (2017).
  10. Rachek, L. I., Tucker, A. M., Winkler, H. H., Wood, D. O. Transformation of Rickettsia prowazekii to rifampin resistance. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2118-2124 (1998).
  11. Troyer, J. M., Radulovic, S., Azad, A. F. Green fluorescent protein as a marker in Rickettsia typhi transformation. Infection and Immunity. 67 (7), 3308-3311 (1996).
  12. Kim, H. K., Premaratna, R., Missiakas, D. M., Schneewind, O. Rickettsia conorii O antigen is the target of bactericidal Weil-Felix antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (39), 19659-19664 (2019).
  13. Burkhardt, N. Y., et al. Development of shuttle vectors for transformation of diverse Rickettsia species. PLoS One. 6 (12), 29511 (2011).
  14. Welch, M. D., Reed, S. C., Lamason, R. L., Serio, A. W. Expression of an epitope-tagged virulence protein in Rickettsia parkeri using transposon insertion. PloS One. 7 (5), 37310 (2012).
  15. Oliver, J. D., Burkhardt, N. Y., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. Motility characteristics are altered for Rickettsia bellii transformed to overexpress a heterologous rickA gene. Applied and Environmental Microbiology. 80 (3), 1170-1176 (2014).
  16. Kurtti, T. J., Burkhardt, N. Y., Heu, C. C., Munderloh, U. G. Fluorescent protein expressing Rickettsia buchneri and Rickettsia peacockii for tracking symbiont-tick cell interactions. Veterinary Sciences. 3 (4), 34 (2016).
  17. Oliver, J. D., Chávez, A. S., Felsheim, R. F., Kurtti, T. J., Munderloh, U. G. An Ixodes scapularis cell line with a predominantly neuron-like phenotype. Experimental and Applied Acarology. 66 (3), 427-442 (2015).
  18. Grabowski, J. M., Gulia-Nuss, M., Kuhn, R. J., Hill, C. A. RNAi reveals proteins for metabolism and protein processing associated with Langat virus infection in Ixodes scapularis (black-legged tick) ISE6 cells. Parasites & Vectors. 10 (1), 1-4 (2017).
  19. Al-Rofaai, A., Bell-Sakyi, L. Tick cell Lines in research on tick control. Frontiers in Physiology. 11, 152 (2020).
  20. Wang, X. R., et al. Mitochondrion-dependent apoptosis is essential for Rickettsia parkeri infection and replication in vector cells. mSystems. 6 (2), 01209-01220 (2021).
  21. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
  22. Riley, S. P., Macaluso, K. R., Martinez, J. J. Electrotransformation and clonal isolation of Rickettsia species. Current Protocols in Microbiology. 39, 1-20 (2015).
  23. Burkhardt, N. Y., et al. Examination of rickettsial host range for shuttle vectors based on dnaA and parA genes from the pRM plasmid of Rickettsia monacensis. Applied and Environmental Microbiology. 88 (7), 00210-00222 (2022).
  24. Kurtti, T. J., et al. Rickettsia buchneri sp. nov., a rickettsial endosymbiont of the blacklegged tick Ixodes scapularis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 65, 965 (2015).
  25. Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Formulation of medium for tick cell culture. Experimental & Applied Acarology. 7 (3), 219-229 (1989).
  26. Bell-Sakyi, L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum. The Journal of Parasitology. 77 (6), 1006-1008 (1991).
  27. Mattila, J. T., Burkhardt, N. Y., Hutcheson, H. J., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Isolation of cell lines and a rickettsial endosymbiont from the soft tick Carios capensis (Acari: Argasidae: Ornithodorinae). Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1091-1101 (2007).
  28. Bell-Sakyi, L., Růžek, D., Gould, E. A. Cell lines from the soft tick Ornithodoros moubata. Experimental and Applied Acarology. 49 (3), 209-219 (2009).

Tags

علم الأحياء ، العدد 188 ، التثقيب الكهربائي ، الريكتسيا ، التألق المناعي
طريقة التثقيب الكهربائي لتحويل <em>الريكتسيا</em> spp. باستخدام ناقل مكوك يعبر عن البروتين الفلوري في خطوط خلايا القراد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y.,… More

Wang, X. R., Burkhardt, N. Y., Price, L. D., Munderloh, U. G. An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines. J. Vis. Exp. (188), e64562, doi:10.3791/64562 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter