Summary
电穿孔是一种快速、广泛采用的方法,用于将外源性 DNA 引入 立克次体属。该协议为立 克次体属中专性细胞内细菌的转化提供了一种有用的电穿孔方法。
Abstract
立克次体病是由属于 立克次体 属的各种专性细胞内细菌引起的,这些细菌可以通过受感染的节肢动物媒介的叮咬传播给脊椎动物宿主。迄今为止,由于诊断困难,新出现或重新出现的流行性立克次体病仍然是一个公共卫生风险,因为诊断方法有限,没有标准化或普遍可及。由于缺乏对体征和症状的认识而导致的误诊可能导致抗生素治疗延迟和不良的健康结局。全面了解 立克次 体的特征最终将改善临床诊断、评估和治疗,改善疾病的控制和预防。
立克次体基因的功能研究对于理解其在发病机制中的作用至关重要。本文描述了使用穿梭载体pRAM18dSFA电穿孔帕氏立克次氏立 克次 氏菌株泰特地狱的程序,以及用抗生素(大观霉素和链霉素)在蜱细胞培养中选择转化的 帕氏立 克次体菌落的程序。还描述了一种使用共聚焦免疫荧光显微镜定位蜱细胞中转化的 R. parkeri 的方法,这是一种检查载体细胞系转化的有用技术。类似的方法也适用于其他立克次体的转化。
Introduction
立克次体病是由属于立克次体属(立克次体科,立 克次 体目)的各种专性细胞内细菌引起的。 立克次 体属根据系统发育特征1,2 分为四大类:斑疹热组 (SFG),其中包含导致最严重和致命的蜱传立克次体病的立克次体(例如,立克次氏体,落基山斑疹热的病原体 )、 斑疹伤寒组(TG,例如, 普罗瓦泽基立克次体,流行性斑疹伤寒的病原体), 过渡组(TRG,例如费利立 克次体,跳蚤传播斑疹热的病原体)和祖先组(AG,例如 贝氏立克次体)。
在已知最古老的媒介传播疾病中,立克次体病主要是在病原体通过受感染的节肢动物媒介(包括蜱、跳蚤、虱子和螨虫)叮咬传播病原体后获得的3,4。尽管有效抗生素的发现改善了治疗结果,但新出现和重新出现的流行立克次体病继续挑战传统的预防和控制策略。因此,全面了解立克次体/宿主/媒介相互作用最终将为开发预防和治疗这些古老疾病的新方法奠定坚实的基础。
在自然界中,细菌中的水平基因转移(HGT)通过偶联,转导和转化发生5。体外细菌转化利用这些HGT概念,尽管立克次体的细胞内性质提出了一些挑战。不同种类立克次体中受限的生长条件和对共轭和转导系统知之甚少,阻碍了立克次体6,7,8中结合和转导方法的应用。与其他专性细胞内细菌属(例如衣原体、柯克斯体、无形体和埃立克体)相比,立克次体属在细胞质内的生长和复制策略方面有所不同,由于其独特的生活方式特征,这对立克次体的遗传修饰提出了特定的挑战9。
在尝试对立克次体进行基因改造时,要克服的最初障碍是实现成功的转化。因此,设计一种具有高转化效率的可行方法对于开发立克次体遗传工具具有极其有价值的价值。在这里,我们专注于电穿孔,这是一种被广泛认可的转化方法,已被用于将外源性DNA成功引入几种立克次体,包括普罗瓦泽氏立克次体,伤寒立克次氏体,圆锥立克次氏体,帕氏立克次氏体,蒙坦立克次氏体,贝氏立克次体,孔雀立克次体和布氏立克次体10,11,12,13,14,15,16.
本文描述了一种电穿孔帕 克利 菌株泰特地狱(加入:GCA_000965145.1)的程序,其穿梭载体pRAM18dSFA源自弱 细胞立克次氏立克次氏 菌株AaR/SC质粒pRAM18,该梭载体被工程化以编码mKATE(一种远红荧光蛋白)和 aadA,赋予壮观霉素和链霉素抗性13,15,20。转化的 R. parkeri 在蜱细胞系的抗生素选择下是可行的,并且稳定地维持。此外,我们表明,通过共聚焦显微镜在活蜱细胞中转化的 R. parkeri 的定位可用于评估载体细胞系中转化率的质量。
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Protocol
1. 从蜱细胞培养物中繁殖和纯化帕氏螨
注意:所有细胞培养程序均应在II类生物安全柜中进行。
- 准备 R. parkeri-受感染的蜱细胞
- 在 34 °C 的 5 mL L15C300 培养基17 中的 25 cm2 细胞培养瓶中培养 ISE6 细胞,并补充有 5% 胎牛血清 (FBS)、5% 色糖磷酸盐肉汤 (TPB) 和 0.1% 脂蛋白浓缩物 (LPC)。
注意:ISE6(肩突硬蜱胚胎来源细胞系)是许多实验室广泛使用的蜱细胞系,因此是研究蜱 - 病原体相互作用的基本模型17,18,19。ISE6细胞的生长速度比哺乳动物细胞慢,群体倍增时间为≥72小时。例如,以1:5的比例从100%融合培养物中传代的ISE6细胞将需要3-4周才能恢复100%汇合。健康的ISE6细胞通常与许多粘附的细丝呈圆形17。 - 在光学显微镜下用血细胞计数器计数ISE6细胞。以~106 个细胞/mL(100%汇合)的浓度使用。
- 用培养基轻轻冲洗烧瓶中的细胞,并通过移液分散细胞以产生均匀的细胞悬液。在血细胞计数器和盖玻片之间加入 20 μL 细胞悬液,以使用血细胞计数器对细胞进行计数。
- 将宿主无细胞野生型R. parkeri 20(平均数:5 × 10 7-10 ×10 7)添加到25cm 2细胞培养瓶中的ISE6细胞培养物中。将受感染的帕克利链球菌细胞培养物在 34 °C 下在由 L15C300 培养基、10% FBS、5% TPB、0.1% LPC、0.25% 碳酸氢钠 (NaHCO3) 和 25 mM HEPES 组成的完全培养基中孵育,直到 90%-100% 的细胞被感染。
注意: R. parkeri 在ISE6细胞中的感染率由Giemsa染色确定,达到90%-100%感染的孵育时间平均为5天至7天。 - 通过吉姆萨染色确定感染率。
- 在生物安全柜中,重悬感染的细胞培养物并将 50 μL 悬浮液转移到 1.5 mL 微量离心管中。
- 用完全培养基(1:5稀释)稀释悬浮液,并使用113 × g 离心机将100μL离心到玻璃显微镜载玻片上5分钟。为了保持活的 R. parkeri ,请使用带有密封转子的离心机,该转子设计为从离心机中取出。这样就可以将密封转子移入和运出罩。
注意:由于 R. parkeri 在离心前仍然活着,因此需要容纳样品直到立克次体被杀死。因此,用于将 帕克利R. parkeri 培养物旋转到载玻片上的离心机必须具有设计为从离心机中取出的密封转子。将转子置于层流罩中,将样品装入漏斗显微镜载玻片组件中,重新密封转子,然后将密封的转子放回离心机中。然后,打开离心机,将样品沉积到显微镜载玻片上。运行完成后,从离心机中取出密封转子并将其放入层流罩中。在那里,打开转子盖,并在引擎盖内卸载漏斗显微镜载玻片组件。干燥后,将玻璃显微镜载玻片浸入无水甲醇中,从而杀死所有病原体。漏斗和金属载体浸没在稀释的DMQ中,杀死 R. parkeri。 - 风干载玻片并在室温(RT)下在无水甲醇中固定5分钟。
- 用吉姆萨染色剂(Sørenson缓冲液中的4%,pH 6.6)在37°C下染色载玻片30分钟,并用水冲洗5秒。
- 通过光学显微镜确定感染百分比(感染立克次体/100 个细胞的细胞数)。
注: 图1 显示了典型的吉姆萨染色结果。
- 在 34 °C 的 5 mL L15C300 培养基17 中的 25 cm2 细胞培养瓶中培养 ISE6 细胞,并补充有 5% 胎牛血清 (FBS)、5% 色糖磷酸盐肉汤 (TPB) 和 0.1% 脂蛋白浓缩物 (LPC)。
- 制备无细胞帕 氏菌
注意:当培养物中90%-100%的细胞被感染时,应从ISE6细胞中分离立克次体并进行电穿孔。- 将无菌 60-90 碳化硅砂砾添加到无菌 2 mL 微量离心管中,体积约为 0.2 mL。
- 从 100% R. parkeri 感染的培养物中取出 2 mL 培养基(步骤 1.1.3),并将细胞重悬于剩余的 3 mL 培养基中。
- 将该悬浮液的相等部分转移到步骤1.2.1中制备的管中。
- 高速涡旋每个管子30秒,然后将管子放在冰上。让砂砾在重力作用下在几秒钟内沉降。
- 在 II 类生物安全柜中,准备好无菌 5 mL 鲁尔锁注射器,柱塞伸展,柱塞末端固定在聚苯乙烯基座中,用于 15 mL 锥形管。
- 使用安装在合适移液器上的无菌 1 mL 阻隔移液器吸头,从管中取出涡旋细胞裂解物的上清液,注意不要吸入任何砂砾。将移液器吸头插入注射器集线器开口,并以轻柔的压力将内容物弹出注射器。或者,使用无菌的屏障 2 mL 巴斯德移液器,该移液器由橡胶灯泡操作。
- 将灭菌的 2 μm 孔径过滤器连接到注射器集线器上,并将步骤 1.2.6 中的 R. parkeri 培养物过滤到无菌 1.5 mL 管中。
- 通过在4°C下以13,600×g离心5分钟来收集R. parkeri,并弃去上清液。
- 将沉淀重悬于1.2mL冰冷的300mM蔗糖中,并在4°C下以13,600× g 再次离心5分钟。重复重悬和离心,总共两次蔗糖洗涤。
- 将 R. parkeri 沉淀合并到一个冷冻的无菌 1.5 mL 微量离心管中,每次转化一次,放入 50 μL 冰冷的 300 mM 蔗糖中。当一个 25 cm 2 烧瓶的 R. parkeri 提供足够的立克次体进行2 到 3 次转化时,加入 100-150 μL 的 300 mM 冷蔗糖。
注意:如果需要,可以使用彼得罗夫-豪斯计数室计算立克次体的数量。当使用初始接种5 × 107 -10 × 107 无细胞帕克利 R. 时,平均需要 5-7 天才能达到 90%-100% 感染,产生大约 5 × 107-10 × 1010 无细胞帕克利。 - 通过移液轻轻重悬沉淀,直到其完全分散。将样品在冷藏、无菌的 1.5 mL 微量离心管中分成 50 μL 份。
注意:如果需要,可以在用荧光染料 21染色后通过流式细胞术评估立克次体活力。
2. 帕氏鼠 与pRAM18dSFA质粒的转化
- 在冰上,向含有 50 μL R. parkeri 悬浮液的每个试管中加入 3 μg 无内毒素的 pRAM18dSFA 质粒 DNA13、15、20,并用移液管尖端轻轻但彻底地搅拌混合物。
注意:制备质粒DNA时,请使用包含内毒素去除步骤的纯化试剂盒,以产生无内毒素质粒DNA23。我们发现,每50μL 帕克瑞鼠 悬液中质粒浓度在1μg至3μg之间会导致成功的转化,而将质粒的量增加到10μg会抑制转化。 - 将上述DNA和R. parkeri混合物转移到冷却的无菌 0.1cm 间隙电穿孔比色皿中(轻轻敲击比色皿,直到混合物均匀分布),并将其放在冰上10-30分钟。
- 从 ISE6 细胞的 100% 汇合培养物中取出培养基,并将细胞层重悬于 1.5 mL 的新鲜培养基中,并用 NaHCO 3 和 HEPES 缓冲液(如上文步骤 1.1.3 所述)。每次转化使用一瓶融合细胞。
- 将重悬的细胞转移到无菌的2 mL微量离心管中(每25cm2 瓶ISE6细胞一个管)。
- 使用电穿孔器在 1.8 KV、200 欧姆、25 μF 下电穿孔 R. parkeri/pRAM18dSFA 混合物。
- 使用无菌的加长细尖移液管,将少量ISE6细胞悬液(步骤2.4)转移到比色皿中,轻轻上下拉动液体以冲洗出比色皿。将混合物转移到含有剩余ISE6细胞悬液的2 mL微量离心管中,并将转化混合物与细胞轻轻混合。
- 在室温下以 700 × g 离心转化后的样品 2 分钟,然后在室温下将离心速度增加到 13,600 × g ,再旋转 1 分钟。
注意:两种离心速度促进立克次体结合和进入细胞:700 × g 用于拉下ISE6细胞,而13,600 × g 用于拉下立克次体。 - 让样品在室温或34°C下静置15分钟至1小时。
- 使用安装在移液器上的无菌 2 mL 阻隔移液器吸头将转化体(两个或三个)重悬于 ISE6 细胞中,并转移到含有 3.5 mL 新鲜培养基的两个或三个 25 cm2 细胞培养瓶中,其中包含 NaHCO3 和 HEPES 缓冲液。或者,使用无菌的屏障 2 mL 巴斯德移液器,该移液器由橡胶灯泡操作。
- 摇动烧瓶以使混合物均匀分布,然后在34°C下孵育。
- 16-24小时后,在步骤2.10中向每个烧瓶中加入10μL大观霉素(50mg / mL)和10μL链霉素(50mg / mL)。
3. 对转化后的R. parkeri的观察
注意:使用带有罗丹明/ TRITC滤光片的落射荧光显微镜在3-7天后观察步骤2.11中制备的烧瓶。一旦斑块在培养物中明显(5-14天),就可以看到转化的 R. parkeri 表达编码在pRAM18dSFA质粒上的红色荧光蛋白mKATE。
- 共聚焦显微镜
- 重悬步骤2.11烧瓶中的细胞培养物,并将100μL这些细胞培养物与5μLHoechst 33342溶液在室温下在黑暗中混合10-30分钟。
注意:Hoechst 33342 是一种细胞渗透性核复染剂,可与活蜱细胞 DNA 结合并发出蓝色荧光。 - 使用5 × g 离心机将 50 μL 混合物离心到玻璃显微镜载玻片上 3 分钟。
- 将 3 μL 1x PBS 添加到沉积在载玻片上的细胞点上,用盖玻片覆盖,并用共聚焦显微镜(60 倍物镜)观察。使用以下激发和发射参数进行荧光成像:对于4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),激发波长为350 nm,发射波长为470 nm;对于四甲基罗丹明(TRITC),激发波长为557 nm,发射波长为576 nm。
- 重悬步骤2.11烧瓶中的细胞培养物,并将100μL这些细胞培养物与5μLHoechst 33342溶液在室温下在黑暗中混合10-30分钟。
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Representative Results
吉姆萨染色后在光学显微镜下ISE6细胞中帕克里R. parkeri的形态如图1所示。在图2中,使用共聚焦显微镜显示了在ISE6细胞中表达红色荧光蛋白的转化R. parkeri。从孵育的第7天到(B)第10天,ISE6细胞(蓝色,对应于细胞核)中转化的R. parkeri(红色)的感染率显着增加。
图 1:显示 ISE6 细胞中吉姆萨染色的帕克次氏立克次体的载玻片。 ISE6细胞以(A)低感染率和(B)90%-100%感染率感染野生型帕氏R. parkeri。ISE6细胞的细胞核用Giemsa染色为深紫色;R. parkeri显示为深紫色棒。红色框表示细胞内立克次体,红色星号表示细胞外立克次体。所有图像均在具有100倍物镜的光学显微镜上拍摄。比例尺 = 50 μm。 缩写:N = 细胞核。请点击此处查看此图的大图。
图 2:在 ISE6 细胞中表达红色荧光蛋白的 转化帕氏立克次氏体 。 在ISE6细胞(蓝色)中pRAM18dSFA转化的 R. parkeri (红色),用Hoechst 33342染色,并在转化后7天和(B)通过共聚焦显微镜(A)和(B)检测。Hoechst 33342对原子核进行染色,其激发和发射波长与DAPI相似。合并的信号是DAPI和TRITC滤波器图像的组合。所有图像均在具有60倍物镜的共聚焦显微镜上拍摄。比例尺 = 20 μm。缩写:DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚;TRITC = 四甲基罗丹明。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在这里,我们展示了一种使用电穿孔将穿梭质粒pRAM18dSFA上编码的外源性DNA引入立克次体的方法。在此过程中,从宿主细胞中纯化游离立克次体,用立克次体穿梭载体转化,并释放到蜱细胞上进行感染。还描述了一种共聚焦免疫荧光程序,用于检测蜱细胞中表达红色荧光蛋白的 R. parkeri 。类似的方法适用于其他 立克次体 物种,并且通过进一步的修改可能适用于能够维持质粒的其他专性细胞内细菌。
该协议的成功转化需要三个组成部分:外源DNA,立克次体属细菌和合适类型的宿主细胞22。根据具体的研究目标,可以更改这些组件。首先,通过pRAM18dSFA质粒引入外源DNA,该质粒含有壮观霉素和链霉素可选择的标记物,并表达mKATE(一种远红色荧光蛋白)。该质粒还赋予氨苄青霉素抗性,以促进大肠杆菌的生长。如先前的研究所示,可以替换抗生素耐药性标记物和荧光蛋白的基因13。其次,选择ISE6细胞来代表转化的细胞系,因为该细胞系在许多实验室中被广泛使用,并且是研究载体 - 病原体相互作用的基本模型17,18,19。其他种类的蜱16或哺乳动物细胞23,24也可用于生长立克次体以进行转化。最后,在该协议中,使用了R. parkeri,可以在生物安全2级(BSL-2)实验室中使用具有适当安全预防措施的II类生物安全柜对其进行操作。其他致病性更强的立克次体属(例如立克次体;R. prowazekii)需要 BSL-3 设置才能进行操作;因此,在使用此类制剂时,必须使用更严格的生物安全标准规程。
虽然该协议可以用作立克次体转化的标准程序,但几个关键的技术步骤需要特别注意。首先,成功的纯化步骤必须确保无细胞立克次体存活和感染性9;因此,转化过程最关键的方面是分离具有传染性的无细胞立克次体。纯化立克次体中的任何残留盐都会导致电弧和转化失败。因此,需要用蔗糖洗涤分离的无细胞立克次体以去除所有盐。冷蔗糖溶液还可以保护细胞外条件下立克次体膜的完整性。
当培养物中90%-100%的细胞被感染时,应从ISE6细胞中分离立克次体,并且应立即且不间断地进行电穿孔,因为立克次体是细胞内生物,不能在细胞外存活良好。虽然立克次体培养物可以在4°C下储存,但这种类型的材料不应用于电穿孔。储存在4°C的培养物可用于接种新鲜的ISE6细胞层,一旦感染达到90%-100%,即可将其用于电穿孔。
其次,电穿孔设置,包括电压、电阻、电容和时间常数,特定于不同的立克次体。例如,电穿孔过程中所需的场强取决于立克次体和外源DNA的大小7。最后,重要的是在抗生素选择下维持转化的立克次体,以防止在宿主细胞中多次传代时外源质粒的丢失9。如前所述,所用抗生素的浓度和类型取决于正在转化的立克次体属,并且重要的是选择的抗生素标记物不应应用于临床治疗。
为了遵循此方案,应使用大观霉素和链霉素进行选择,直到所有残留的未转化立克次体都被消除。这两种抗生素联合使用可杀死细胞内和细胞外立克次体,并降低耐药野生型立克次体出现的可能性。此外,使用这两种抗生素不会影响下游实验,例如单独使用它们来选择两种不同质粒的能力, 因为 aadA 基因赋予对大观霉素和链霉素的抗性。该方案中使用的两种抗生素不会对立克次体病临床治疗中使用的抗生素产生耐药性。
本研究中使用的ISE6蜱细胞系具有独特的优势。首先,从黑腿蜱肩突硬蜱Say(Acari:Ixodidae)中分离ISE6细胞,这是美国七种人类病原体的主要载体。其次,ISE6是许多实验室广泛使用的蜱细胞系,并已成功用于电穿孔后回收许多蜱相关细菌(立克次体,无形体和埃立克体)。第三,一些致病性立克次体只能在蜱细胞中繁殖,而不能在哺乳动物细胞中繁殖17,18,19,24。然而,与哺乳动物细胞相比,蜱细胞系相对脆弱,并且具有更密集的培养需求25,26,27,28。此外,即使以相同的初始密度接种,ISE6细胞的生长速率也明显慢于哺乳动物细胞系,尽管当立克次体转化体表现出生长减少时,缓慢复制可能是有利的。
该协议还提供了一种在关键实验步骤中评估活细胞中立克次体转化效率的方法,这有助于优化电穿孔设置或测试各种细胞系回收转化体的效率。然而,该方案具有局限性,特别是对于获得的转化体的定量。转型效率作为成功转型的指标可以在未来的研究中得到证明。可以使用合适的染色试剂盒和流式细胞术21 来评估立克次体活力,以量化获得的转化体。将使用两个参数来确定转化效率 - 用于转化的活立克次体数量和表达mKATE的转化立克次体数量。
此外,荧光信号的图像分析可用于比较不同质粒的转化率。由于立克次体质粒维持的潜在机制知之甚少,用于引入外源质粒的表征良好的转化系统可以成为进一步研究的宝贵工具。此外,细胞或组织中表达荧光蛋白的立克次体的直接可视化将提高我们对立克次体/宿主/载体相互作用的理解。这将为设计控制和预防立克次体病的策略提供信息。
数据可用性:
本研究结果的所有数据都是公开的。
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Disclosures
不声明任何利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Timothy J. Kurtti和Benjamin Cull富有洞察力的讨论和建议。这项研究得到了美国国立卫生研究院(2R01AI049424)对U.G.M.的资助和明尼苏达州农业实验站(MIN-17-078)对U.G.M.的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652083 | |
2 μm pore size filter | GE Healthcare Life Sciences Whatman | 6783-2520 | |
5 mL Luer-lock syringe | BD | 309646 | |
60-90 silicon carbide grit | LORTONE, inc | 591-056 | |
absolute methanol | Fisher Scientific | A457-4 | |
Bacto tryptose phosphate broth | BD | 260300 | |
Cytospin centrifuge Cytospin4 | Thermo Fisher Scientific | A78300003 | The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples |
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | QIAGEN | 12362 | used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid |
extended fine tip transfer pipet | Perfector Scientific | TP03-5301 | |
fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it. |
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS | Bio-Rad | 165-2105 & 165-2110 | |
hemocytometer | Thermo Fisher Scientific | 267110 | |
HEPES | Millipore-Sigma | H4034 | |
ImageJ Fiji | National Institute of Health | raw image editing | |
KaryoMAX Giemsa stain | Gibco | 2021-10-30 | |
Leibovitz's L-15 medium | Gibco | 41300039 | |
lipoprotein concentrate | MP Biomedicals | 191476 | |
Nikon Diaphot | Nikon | epifluorescence microscope | |
NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope | Olympus | ||
Petroff-Hausser Counting Chamber | Hausser Scientific | Chamber 3900 | |
sodium bicarbonate | Millipore-Sigma | S5761 | |
Vortex | Fisher Vortex Genie 2 | 12-812 |
References
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