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Biology

टिक सेल लाइनों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त शटल वेक्टर के साथ रिकेट्सिया एसपीपी को बदलने के लिए एक इलेक्ट्रोपोरेशन विधि

Published: October 11, 2022 doi: 10.3791/64562
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Entomology, University of Minnesota

Summary

इलेक्ट्रोपोरेशन जीनस रिकेट्सिया में बहिर्जात डीएनए को पेश करने के लिए एक तेजी से, व्यापक रूप से अपनाया गया तरीका है। यह प्रोटोकॉल जीनस रिकेट्सिया में इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के परिवर्तन के लिए एक उपयोगी इलेक्ट्रोपोरेशन विधि प्रदान करता है।

Abstract

रिकेट्सियोस जीनस रिकेट्सिया से संबंधित इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला के कारण होते हैं जिन्हें संक्रमित आर्थ्रोपोड वैक्टर के काटने के माध्यम से कशेरुक मेजबानों को प्रेषित किया जा सकता है। आज तक, निदान में कठिनाई के कारण उभरते या फिर से उभरने वाले महामारी रिकेट्सियोस एक सार्वजनिक स्वास्थ्य जोखिम बने हुए हैं, क्योंकि नैदानिक विधियां सीमित हैं और मानकीकृत या सार्वभौमिक रूप से सुलभ नहीं हैं। संकेतों और लक्षणों की पहचान की कमी के परिणामस्वरूप गलत निदान एंटीबायोटिक उपचार में देरी और खराब स्वास्थ्य परिणामों का परिणाम हो सकता है। रिकेट्सिया विशेषताओं की एक व्यापक समझ अंततः बीमारी के बेहतर नियंत्रण और रोकथाम के साथ नैदानिक निदान, मूल्यांकन और उपचार में सुधार करेगी।

रिकेट्सियल जीन के कार्यात्मक अध्ययन रोगजनन में उनकी भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह पेपर शटल वेक्टर pRAM18dSFA के साथ रिकेट्सिया पार्करी स्ट्रेन टेट के हेल के इलेक्ट्रोपोरेशन और एंटीबायोटिक दवाओं (स्पेक्टिनोमाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ टिक सेल कल्चर में रूपांतरित आर पार्करी के चयन के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है। कोंफोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके टिक कोशिकाओं में रूपांतरित आर पार्केरी के स्थानीयकरण के लिए एक विधि भी वर्णित है, जो वेक्टर सेल लाइनों में परिवर्तन की जांच के लिए एक उपयोगी तकनीक है। इसी तरह के दृष्टिकोण अन्य रिकेट्सिया के परिवर्तन के लिए भी उपयुक्त हैं।

Introduction

रिकेट्सियोस इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला के कारण होते हैं जो जीनस रिकेट्सिया (परिवार रिकेट्सियासी, ऑर्डर रिकेट्सियल्स) से संबंधित हैं। जीनस रिकेट्सिया को फाइटोजेनेटिक विशेषताओं 1,2 के आधार पर चार प्रमुख समूहों में वर्गीकृत किया गया है: धब्बेदार बुखार समूह (एसएफजी), जिसमें वे रिकेट्सिया शामिल हैं जो सबसे गंभीर और घातक टिक-जनित रिकेट्सियोसिस का कारण बनते हैं (उदाहरण के लिए, रिकेट्सिया रिकेट्सी, रॉकी माउंटेन स्पॉटेड फीवर का प्रेरक एजेंट), टाइफस समूह (टीजी, उदाहरण के लिए, रिकेट्सिया प्रोवाज़ेकी, महामारी टाइफस का एजेंट), संक्रमणकालीन समूह (टीआरजी, उदाहरण के लिए, रिकेट्सिया फेलिस, पिस्सू जनित धब्बेदार बुखार का प्रेरक एजेंट), और पैतृक समूह (एजी, जैसे, रिकेट्सिया बेली)।

सबसे पुराने ज्ञात वेक्टर जनित रोगों में से, रिकेट्सियोस मुख्य रूप से संक्रमित आर्थ्रोपोड वैक्टर के काटने के माध्यम से रोगजनकों के संचरण के बाद प्राप्त किए जाते हैं, जिसमें टिक्स, पिस्सू, जूँ और घुन 3,4 शामिल हैं। यद्यपि प्रभावी एंटीबायोटिक दवाओं की खोज ने उपचार के परिणामों में सुधार किया, उभरते और फिर से उभरने वाले महामारी रिकेट्सियोसिस पारंपरिक रोकथाम और नियंत्रण रणनीतियों को चुनौती देना जारी रखते हैं। वेक्टर इंटरैक्शन की व्यापक समझ अंततः इन प्राचीन बीमारियों को रोकने और ठीक करने के लिए नए दृष्टिकोण विकसित करने के लिए एक मजबूत आधार स्थापित करेगी।

प्रकृति में, बैक्टीरिया में क्षैतिज जीन स्थानांतरण (एचजीटी) संयुग्मन, पारगमन और परिवर्तनके माध्यम से होता है। इन विट्रो बैक्टीरियल परिवर्तन इन एचजीटी अवधारणाओं का उपयोग करता है, हालांकि रिकेट्सिया की इंट्रासेल्युलर प्रकृति कुछ चुनौतियां प्रस्तुत करती है। रिकेट्सिया की विभिन्न प्रजातियों में प्रतिबंधित विकास की स्थिति और खराब समझे गए संयुग्मन और पारगमन प्रणालियों ने रिकेट्सिया 6,7,8 में संयुग्मन और पारगमन विधियों के आवेदन को रोक दिया है। अन्य बाध्यकारी इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल जेनेरा (जैसे, क्लैमाइडिया, कॉक्सिएला, एनाप्लाज्मा और एर्लिचिया) की तुलना में, जीनस रिकेट्सिया सेल साइटोप्लाज्म के भीतर विकास और प्रतिकृति रणनीतियों के संबंध में भिन्न होता है, जो उनकी अनूठी जीवनशैली विशेषताओं के कारण रिकेट्सिया के आनुवंशिक संशोधन के लिए विशिष्ट चुनौतियां लागू करता है।

रिकेट्सिया के आनुवंशिक संशोधन का प्रयास करते समय प्रारंभिक बाधा सफल परिवर्तन प्राप्त करना है। इस प्रकार, उच्च परिवर्तन दक्षता के साथ एक व्यवहार्य दृष्टिकोण डिजाइन करना रिकेट्सिया के लिए आनुवंशिक उपकरण विकसित करने के लिए बेहद मूल्यवान होगा। यहां, हम इलेक्ट्रोपोरेशन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, एक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त परिवर्तन विधि जिसका उपयोग रिकेट्सिया की कई प्रजातियों में बहिर्जात डीएनए को सफलतापूर्वक पेश करने के लिए किया गया है, जिसमें रिकेट्सिया प्रोवाज़ेकी, रिकेट्सिया टाइफी, रिकेट्सिया कोनोरी, रिकेट्सिया पार्केरी, रिकेट्सिया मोंटनेंसिस, रिकेट्सिया बेली, रिकेट्सिया मोरी और रिकेट्सिया बुचनेरी10,11,12 शामिल हैं। , 13,14,15,16.

यह पेपर आर पार्करी स्ट्रेन टेट के हेल (परिग्रहण: GCA_000965145.1) के इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है, जिसमें रिकेट्सिया एंबलियोमैटिस स्ट्रेन एएआर / एससी प्लास्मिड पीआरएएम 18 से प्राप्त शटल वेक्टर पीआरएएम 18 डीएसएफए को एमकेएटी, एक दूर-लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एडीए को एन्कोड करने के लिए इंजीनियर किया गया है, जो स्पेक्टिनोमाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोध 13,15,20 प्रदान करता है। पार्केरी टिक सेल लाइनों में एंटीबायोटिक चयन के तहत व्यवहार्य और स्थिर रूप से बनाए रखा जाता है। इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से लाइव टिक कोशिकाओं में रूपांतरित आर पार्केरी के स्थानीयकरण का उपयोग वेक्टर सेल लाइनों में परिवर्तन दरों की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. टिक सेल संस्कृति से आर पार्केरी का प्रसार और शुद्धिकरण

नोट: सभी सेल संस्कृति प्रक्रियाओं को द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना है।

  1. तैयारी R. parkeriसंक्रमित टिक कोशिकाएं
    1. 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 5% ट्रिप्टोज फॉस्फेट शोरबा (टीपीबी), और0.1% लिपोप्रोटीन कंसंट्रेट (एलपीसी) के साथ पूरक 34 डिग्री सेल्सियस पर25 सेमी 2 सेल कल्चर फ्लास्क में आईएसई 6 कोशिकाओं को उगाएं।
      नोट: आईएसई 6 (इक्सोड्स स्कैपुलारिस भ्रूण-व्युत्पन्न सेल लाइन) एक टिक सेल लाइन है जिसका उपयोग कई प्रयोगशालाओं में बड़े पैमाने पर किया जाता है और इस प्रकार, टिक-रोगज़नक़ इंटरैक्शन 17,18,19 का अध्ययन करने के लिए एक आवश्यक मॉडल है। आईएसई 6 कोशिकाओं की वृद्धि दर स्तनधारी कोशिकाओं की तुलना में धीमी है, जिसमें जनसंख्या दोगुनी समय ≥72 घंटे है। उदाहरण के लिए, 1: 5 के अनुपात में 100% कॉन्फ्लुएंट कल्चर से उप-निर्मित आईएसई 6 कोशिकाओं को 100% कॉन्फ्लुएंसी हासिल करने में 3-4 सप्ताह लगेंगे। स्वस्थ आईएसई 6 कोशिकाओं को आम तौर पर कई पालन फिलामेंट्स17 के साथ गोल किया जाएगा।
    2. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत हेमोसाइटोमीटर के साथ आईएसई 6 कोशिकाओं की गणना करें। ~ 106 कोशिकाओं / एमएल (100% कंफ्लुएंट) की एकाग्रता पर उपयोग करें।
      1. धीरे से फ्लास्क से कोशिकाओं को माध्यम से कुल्ला करें और एक समरूप सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को फैलाएं। हेमोसाइटोमीटर के बीच 20 μL सेल निलंबन जोड़ें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करने के लिए ग्लास को कवर करें।
    3. पार्केरी20 (औसत संख्या: 5 × 10 7-10 × 107) को 25 सेमी2 सेल कल्चर फ्लास्क में आईएसई 6 सेल संस्कृतियों में जोड़ें। पार्करी सेल संस्कृतियों को 5 एमएल पूर्ण माध्यम में 34 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जिसमें एल 15 सी 300 माध्यम, 10% एफबीएस, 5% टीपीबी, 0.1% एलपीसी, 0.25% सोडियम बाइकार्बोनेट (एनएएचसीओ3), और 25 एमएम एचईपीईएस शामिल हैं जब तक कि 90% -100% कोशिकाएं संक्रमित न हों।
      नोट: आईएसई 6 कोशिकाओं में आर पार्केरी की संक्रमण दर गिम्सा स्टेनिंग द्वारा निर्धारित की जाती है, और 90% -100% संक्रमण तक पहुंचने का इनक्यूबेशन समय औसतन 5 दिनों से 7 दिनों तक होता है।
    4. गिम्सा स्टेनिंग के माध्यम से संक्रमण दर निर्धारित करें।
      1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में, संक्रमित सेल संस्कृतियों को फिर से निलंबित करें और निलंबन के 50 μL को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      2. 5 मिनट के लिए 113 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पूर्ण माध्यम (1: 5 तनुकरण) और सेंट्रीफ्यूज 100 μL के साथ निलंबन को पतला करें। पार्केरी को जीवित रखने के लिए, एक सीलबंद रोटर के साथ एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें जिसे सेंट्रीफ्यूज से हटाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह सीलबंद रोटर को हुड के अंदर और बाहर ले जाने में सक्षम बनाता है।
        नोट: चूंकि आर पार्केरी सेंट्रीफ्यूजेशन से पहले अभी भी जीवित हैं, इसलिए रिकेट्सिया को मारे जाने तक नमूने को शामिल करने की आवश्यकता है। इस प्रकार, स्लाइड पर आर पार्केरी संस्कृति को घुमाने के लिए उपयोग किए जाने वाले सेंट्रीफ्यूज में एक सीलबंद रोटर होना चाहिए जिसे सेंट्रीफ्यूज से बाहर निकालने के लिए डिज़ाइन किया गया है। लैमिनार प्रवाह हुड में रोटर के साथ, नमूनों को फ़नल-माइक्रोस्कोप स्लाइड असेंबली में लोड करें, रोटर को फिर से सील करें, और सील किए गए रोटर को सेंट्रीफ्यूज में वापस रखें। फिर, सेंट्रीफ्यूज चालू करें, और नमूने माइक्रोस्कोप स्लाइड पर जमा किए जाते हैं। रन समाप्त होने के बाद, सेंट्रीफ्यूज से सील किए गए रोटर को हटा दें और इसे लैमिनार प्रवाह हुड में रखें। वहां, रोटर ढक्कन खोलें, और फनल-माइक्रोस्कोप स्लाइड असेंबली को हुड के अंदर अनलोड करें। एक बार सूखने के बाद, ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड को पूर्ण मेथनॉल में डुबोएं, जो सभी रोगजनकों को मारता है। फ़नल और धातु वाहक पतला डीएमक्यू में डूबे हुए हैं, जो आर पार्केरी को मारता है।
      3. स्लाइड्स को एयर-ड्राई करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए पूर्ण मेथनॉल में ठीक करें।
      4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए गिम्सा स्टेन (सोरेनसन के बफर में 4%, पीएच 6.6) के साथ स्लाइड को दागें और 5 सेकंड के लिए पानी से धो लें।
      5. प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा संक्रमण प्रतिशत (रिकेट्सिया / 100 कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाओं की संख्या) निर्धारित करें।
        नोट: चित्रा 1 विशिष्ट गिम्सा स्टेन परिणाम दिखाता है।
  2. सेल-मुक्त आर पार्करी तैयार करना
    नोट: जब संस्कृति में 90% -100% कोशिकाएं संक्रमित होती हैं, तो रिकेट्सिया को आईएसई 6 कोशिकाओं से अलग किया जाना चाहिए और इलेक्ट्रोपोरेशन किया जाना चाहिए।
    1. लगभग 0.2 एमएल की मात्रा में बाँझ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में बाँझ 60-90 सिलिकॉन कार्बाइड ग्रिट जोड़ें।
    2. पार्करी-संक्रमित संस्कृतियों (चरण 1.1.3) से 2 एमएल माध्यम निकालें और शेष 3 एमएल माध्यम में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    3. चरण 1.2.1 में तैयार ट्यूबों में इस निलंबन के बराबर भाग स्थानांतरित करें।
    4. भंवर प्रत्येक ट्यूब को 30 सेकंड के लिए उच्च गति से और फिर ट्यूबों को बर्फ पर रखें। गुरुत्वाकर्षण द्वारा कुछ सेकंड के भीतर धैर्य को व्यवस्थित होने दें।
    5. द्वितीय श्रेणी के जैव सुरक्षा कैबिनेट में, प्लंजर के विस्तार के साथ एक बाँझ 5 एमएल लुअर-लॉक सिरिंज तैयार है और प्लंजर के अंत को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों के लिए पॉलीस्टाइनिन बेस में सुरक्षित किया गया है।
    6. एक बाँझ, 1 एमएल बैरियर पिपेट टिप का उपयोग करके, एक उपयुक्त पिपेटर में फिट किया जाता है, ट्यूब से भंवर सेल लाइसेट के सुपरनैटेंट को हटा दें, इस बात का ध्यान रखें कि किसी भी धैर्य को न रोका जाए। पिपेट टिप को सिरिंज हब खोलने में डालें और सामग्री को सौम्य दबाव के साथ सिरिंज में बाहर निकाल दें। वैकल्पिक रूप से, रबर बल्ब के साथ संचालित एक बाँझ, बैरियर 2 एमएल पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
    7. सिरिंज हब पर एक निष्फल 2 μm छिद्र आकार फ़िल्टर संलग्न करें और चरण 1.2.6 से बाँझ 1.5 एमएल ट्यूबों में R. Parkeri संस्कृति को फ़िल्टर करें।
    8. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,600 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा आर पार्करी एकत्र करें, और सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    9. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.2 एमएल बर्फ-ठंडा 300 एमएम सुक्रोज और सेंट्रीफ्यूज में फिर से 13,600 × ग्राम पर गोली को फिर से निलंबित करें। कुल दो सुक्रोज वॉश के लिए रिसस्पेंशन और सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं।
    10. पार्केरी छर्रों को एक ठंडा, बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 50 μL बर्फ-ठंडा 300 mM सुक्रोज प्रति परिवर्तन में मिलाएं। पार्केरी का एक25 सेमी 2 फ्लास्क दो से तीन परिवर्तनों के लिए पर्याप्त रिकेट्सिया प्रदान करता है, इसलिए 300 एमएम ठंडे सुक्रोज का 100-150 μL जोड़ें।
      नोट: यदि वांछित है, तो रिकेट्सिया की संख्या की गणना एक पेट्रोफ-हौसर गिनती कक्ष का उपयोग करके की जा सकती है। 5 × 107 -10 × 107 सेल-फ्री आर पार्केरी के प्रारंभिक टीकाकरण का उपयोग करते समय, 90% -100% संक्रमण तक पहुंचने में औसतन 5-7 दिन लगेंगे, जिससे लगभग 5 × 107-10 ×10 सेल-मुक्त आर पार्केरी प्राप्त होंगे।
    11. धीरे से गोली को पाइप द्वारा फिर से निलंबित करें जब तक कि यह पूरी तरह से फैल न जाए। नमूने को ठंडा, बाँझ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 50 μL भागों में विभाजित करें।
      नोट: यदि वांछित हो, तो फ्लोरोसेंट डाई 21 के साथ धुंधला होने के बाद प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा रिकेट्सियल व्यवहार्यता का आकलन किया जा सकता है।

2. PRAM18dSFA प्लास्मिड के साथ आर पार्केरी का परिवर्तन

  1. बर्फ पर, प्रत्येक ट्यूब में 3 μg एंडोटॉक्सिन-मुक्त pRAM18dSFA प्लास्मिड डीएनए 13,15,20 जोड़ें जिसमें 50 μL R. Parkeri Suspension होता है और मिश्रण को पिपेट टिप के साथ धीरे-धीरे लेकिन अच्छी तरह से हिलाएं।
    नोट: प्लास्मिड डीएनए तैयार करते समय, एक शुद्धिकरण किट का उपयोग करें जिसमें एंडोटॉक्सिन-मुक्त प्लास्मिड डीएनए23 प्राप्त करने के लिए एंडोटॉक्सिन-हटाने का कदम शामिल है। हमने पाया कि आर पार्केरी निलंबन के प्रति 50 μL में 1 μg और 3 μg के बीच प्लास्मिड सांद्रता की एक श्रृंखला के परिणामस्वरूप सफल परिवर्तन हुए, जबकि प्लास्मिड की मात्रा को 10 μg तक बढ़ाने से परिवर्तन रुक गया।
  2. डीएनए और आर पार्केरी के उपरोक्त मिश्रण को एक ठंडा, बाँझ 0.1 सेमी गैप इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट में स्थानांतरित करें (मिश्रण को समान रूप से वितरित होने तक धीरे से क्यूवेट टैप करें) और इसे 10-30 मिनट के लिए बर्फ पर बैठने दें।
  3. आईएसई 6 कोशिकाओं के 100% कंफ्लुएंट कल्चर से माध्यम को हटा दें और एनएएचसीओ3 और एचईपीईएस बफर (चरण 1.1.3 में ऊपर वर्णित) के साथ 1.5 एमएल ताजा माध्यम में सेल परतों को फिर से निलंबित करें। प्रति परिवर्तन कंफ्लुएंट कोशिकाओं के एक फ्लास्क का उपयोग करें।
  4. पुन: निलंबित कोशिकाओं को एक बाँझ 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (आईएसई 6 कोशिकाओं के प्रति 25 सेमी2 फ्लास्क में एक ट्यूब) में स्थानांतरित करें।
  5. एक इलेक्ट्रोपोरेटर का उपयोग करके 1.8 केवी, 200 ओम, 25 μF पर R. Parkeri / pRAM18dSFA मिश्रण को इलेक्ट्रोपोरेट करें।
  6. बाँझ, विस्तारित फाइन-टिप ट्रांसफर पाइप का उपयोग करके, क्यूवेट में आईएसई 6 सेल सस्पेंशन (चरण 2.4) की एक छोटी मात्रा को स्थानांतरित करें और धीरे से क्यूवेट को धोने के लिए तरल को ऊपर और नीचे खींचें। मिश्रण को 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें आईएसई 6 सेल निलंबन का शेष हिस्सा होता है और धीरे से कोशिकाओं के साथ परिवर्तन मिश्रण मिलाएं।
  7. आरटी पर 2 मिनट के लिए 700 × ग्राम पर रूपांतरित नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर आरटी पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन गति को 13,600 × ग्राम तक बढ़ाएं।
    नोट: दो सेंट्रीफ्यूजेशन गति रिकेट्सियल बाइंडिंग और कोशिकाओं में प्रवेश को बढ़ावा देती है: आईएसई 6 कोशिकाओं को नीचे खींचने के लिए 700 × ग्राम का उपयोग किया जाता है, जबकि रिकेट्सिया को नीचे खींचने के लिए 13,600 × जी का उपयोग किया जाता है।
  8. नमूने को 15 मिनट से 1 घंटे के लिए आरटी या 34 डिग्री सेल्सियस पर बैठने दें।
  9. आईएसई 6 कोशिकाओं में ट्रांसफॉर्मेंट्स (दो या तीन) को एक बाँझ 2 एमएल बैरियर पाइपेट टिप के साथ पुन: निलंबित करें और दो या तीन 25 सेमी2 सेल कल्चर फ्लास्क में स्थानांतरित करें जिसमें एनएएचसीओ 3 और एचईपीईएस बफर के साथ3.5 एमएल ताजा माध्यम होता है। वैकल्पिक रूप से, रबर बल्ब के साथ संचालित एक बाँझ, बैरियर 2 एमएल पाश्चर पिपेट का उपयोग करें।
  10. मिश्रण को समान रूप से फैलाने के लिए फ्लास्क को हिलाएं और फिर 34 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  11. 16-24 घंटे के बाद, चरण 2.10 में प्रत्येक फ्लास्क में 10 μL स्पेक्टिनोमाइसिन (50 mg / mL) और 10 μL स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 mg / mL) जोड़ें।

3. रूपांतरित आर पार्केरी का अवलोकन

नोट: 3-7 दिनों के बाद चरण 2.11 में तैयार फ्लास्क का निरीक्षण करने के लिए रोडामाइन / टीआरआईटीसी फिल्टर के साथ एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। एक बार संस्कृतियों (5-14 दिनों) में सजीले टुकड़े स्पष्ट हो जाने के बाद, रूपांतरित आर पार्केरी को देखा जा सकता है जो पीआरएएम 18 डीएसएफए प्लास्मिड पर एन्कोडेड लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन एमकेएटीई को व्यक्त करते हैं।

  1. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी
    1. चरण 2.11 फ्लास्क से सेल संस्कृतियों को पुन: निलंबित करें और अंधेरे में आरटी में 10-30 मिनट के लिए 5 μL Hoechst 33342 घोल के साथ इन सेल संस्कृतियों के 100 μL को मिलाएं।
      नोट: होचस्ट 33342 एक सेल-पारगम्य परमाणु काउंटरस्टेन है जो लाइव टिक सेल डीएनए को बांधता है और नीले प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है।
    2. 3 मिनट के लिए 5 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर मिश्रण का 50 μL सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. स्लाइड पर जमा कोशिकाओं के स्थान पर 1x PBS का 3 μL जोड़ें, कवर स्लिप के साथ ओवरले करें, और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (60x उद्देश्य) के साथ देखें। फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए निम्नलिखित उत्तेजना और उत्सर्जन मापदंडों का उपयोग करें: 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (डीएपीआई), 350 एनएम पर उत्तेजना, 470 एनएम पर उत्सर्जन; टेट्रामिथाइलरोडामाइन (टीआरआईटीसी) के लिए, 557 एनएम पर उत्तेजना, 576 एनएम पर उत्सर्जन।

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Representative Results

गिम्सा धुंधला होने के बाद एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत आईएसई 6 कोशिकाओं में आर पार्केरी की आकृति विज्ञान चित्र 1 में दिखाया गया है। चित्रा 2 में, आईएसई 6 कोशिकाओं में लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन व्यक्त करने वाले रूपांतरित आर पार्केरी को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दिखाया गया है। आईएसई 6 कोशिकाओं (नीला, नाभिक से मेल खाता है) में रूपांतरित आर पार्केरी (लाल) की संक्रमण दर में (ए) दिन 7 से (बी) दिन 10 इनक्यूबेशन तक पर्याप्त वृद्धि हुई है।

Figure 1
चित्र 1: आईएसई 6 कोशिकाओं में गिम्सा-सना रिकेट्सिया पार्केरी दिखाने वाली स्लाइड्स। आईएसई 6 कोशिकाएं जंगली प्रकार के आर पार्केरी से संक्रमित हैं (ए) कम संक्रमण और (बी) 90% -100% संक्रमण दर। आईएसई 6 कोशिकाओं के नाभिक गिम्सा के साथ गहरे बैंगनी रंग में दाग देते हैं; पार्केरी गहरे बैंगनी रंग की छड़ के रूप में दिखाई देते हैं। लाल बक्से इंट्रासेल्युलर रिकेट्सिया दिखाते हैं, और लाल तारांकन बाह्य रिकेट्सिया का संकेत देते हैं। सभी छवियों को 100x उद्देश्य के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर लिया गया था। स्केल सलाखों = 50 μm. संक्षिप्त नाम: N = नाभिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: आईएसई 6 कोशिकाओं में लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन व्यक्त करने वाले रिकेट्सिया पार्करी को रूपांतरित किया। आईएसई 6 कोशिकाओं (नीले) में pRAM18dSFA-रूपांतरित R. Parkeri (लाल), Hoechst 33342 से सना हुआ और परिवर्तन के 7 दिन बाद और (B) कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी (A) द्वारा पता लगाया गया। Hoechst 33342 नाभिक पर दाग लगाता है, और इसकी उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य DAPI के समान हैं। विलय किए गए सिग्नल DAPI और TRITC फ़िल्टर छवियों का एक संयोजन हैं। सभी छवियों को 60x उद्देश्य के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर लिया गया था। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षेप: DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल; TRITC = टेट्रामिथाइलरोडामाइन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां, हम शटल प्लास्मिड pRAM18dSFA पर एन्कोड किए गए बहिर्जात डीएनए को इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग करके रिकेट्सिया में पेश करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन करते हैं। इस प्रक्रिया में, सेल-फ्री रिकेट्सिया को मेजबान कोशिकाओं से शुद्ध किया गया, रिकेट्सियल शटल वेक्टर के साथ बदल दिया गया, और संक्रमण के लिए टिक कोशिकाओं पर जारी किया गया। टिक कोशिकाओं में लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन-व्यक्त आर पार्केरी का पता लगाने के लिए एक कॉन्फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रक्रिया भी वर्णित है। इसी तरह के तरीके अन्य रिकेट्सिया प्रजातियों पर लागू होते हैं और आगे के संशोधनों के साथ अन्य बाध्यकारी इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के लिए अनुकूलनीय हो सकते हैं जो प्लास्मिड को बनाए रखने में सक्षम हैं।

इस प्रोटोकॉल में एक सफल परिवर्तन के लिए तीन घटकों की आवश्यकता होती है: बहिर्जात डीएनए, रिकेट्सिया एसपीपी बैक्टीरिया, और एक उपयुक्त प्रकार का मेजबान सेल22। विशिष्ट अनुसंधान लक्ष्य के आधार पर, इन घटकों को बदला जा सकता है। सबसे पहले, बहिर्जात डीएनए को pRAM18dSFA प्लास्मिड के माध्यम से पेश किया गया था, जिसमें स्पेक्टिनोमाइसिन- और स्ट्रेप्टोमाइसिन-चयन योग्य मार्कर होते हैं और एमकेएटीई (एक दूर-लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन) व्यक्त करते हैं। यह प्लास्मिड एस्चेरिचिया कोलाई में विकास के लिए एम्पीसिलीन प्रतिरोध भी प्रदान करता है। जैसा कि पिछले अध्ययनों में दिखाया गया है, एंटीबायोटिक-प्रतिरोध मार्करों और फ्लोरोसेंट प्रोटीन13 के लिए जीन को बदलना संभव है। दूसरा, आईएसई 6 कोशिकाओं को रूपांतरित सेल लाइनों का प्रतिनिधित्व करने के लिए चुना गया था क्योंकि इस सेल लाइन का कई प्रयोगशालाओं में बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है और वेक्टर-रोगज़नक़ इंटरैक्शन 17,18,19 के अध्ययन के लिए एक आवश्यक मॉडल है। टिक16 या स्तनधारी कोशिकाओं23,24 की अन्य प्रजातियों का उपयोग परिवर्तन के लिए रिकेट्सिया विकसित करने के लिए भी किया जा सकता है। अंत में, इस प्रोटोकॉल में, आर पार्केरी का उपयोग किया गया था, जिसे उचित सुरक्षा सावधानियों के साथ द्वितीय श्रेणी के जैव सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग करके जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) प्रयोगशाला में हेरफेर किया जा सकता है। अन्य अधिक रोगजनक रिकेट्सिया एसपीपी (उदाहरण के लिए, आर रिकेट्सी; आर. प्रोवाज़ेकी) हेरफेर के लिए बीएसएल -3 सेटिंग की आवश्यकता है; इसलिए, ऐसे एजेंटों के साथ काम करते समय एक अधिक कठोर जैव सुरक्षा मानक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना चाहिए।

यद्यपि इस प्रोटोकॉल का उपयोग रिकेट्सिया परिवर्तन के लिए एक मानक प्रक्रिया के रूप में किया जा सकता है, कई प्रमुख तकनीकी चरणों को विशेष ध्यान देने की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, एक सफल शुद्धिकरण कदम को सेल-मुक्त रिकेट्सिया अस्तित्व और संक्रामकता सुनिश्चित करनी चाहिए; इसलिए, परिवर्तन प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण पहलू संक्रामक, सेल-मुक्त रिकेट्सिया को अलग करना है। शुद्ध रिकेट्सिया में किसी भी अवशिष्ट नमक के परिणामस्वरूप आर्किंग और परिवर्तन विफलता होगी। इसलिए, सभी लवणों को हटाने के लिए सुक्रोज के साथ पृथक सेल-मुक्त रिकेट्सिया को धोना आवश्यक है। ठंडा सुक्रोज समाधान बाह्य स्थिति में रिकेट्सियल झिल्ली अखंडता की भी रक्षा करता है।

जब एक संस्कृति में 90% -100% कोशिकाएं संक्रमित होती हैं, तो रिकेट्सिया को आईएसई 6 कोशिकाओं से अलग किया जाना चाहिए, और इलेक्ट्रोपोरेशन को बिना देरी और बिना किसी रुकावट के किया जाना चाहिए, क्योंकि रिकेट्सिया इंट्रासेल्युलर जीव हैं और कोशिकाओं के बाहर अच्छी तरह से जीवित नहीं रहते हैं। यद्यपि रिकेट्सियल संस्कृतियों को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, इस प्रकार की सामग्री का उपयोग इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए नहीं किया जाना चाहिए। एक संस्कृति जिसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया है, का उपयोग आईएसई 6 कोशिकाओं की एक ताजा परत को टीका लगाने के लिए किया जा सकता है, जिसे संक्रमण 90% -100% तक पहुंचने के बाद इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

दूसरा, वोल्टेज, प्रतिरोध, धारिता और समय स्थिरांक सहित इलेक्ट्रोपोरेशन सेटिंग्स, विभिन्न रिकेट्सियल प्रजातियों के लिए विशिष्ट हैं। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान आवश्यक क्षेत्र की ताकत रिकेट्सिया और बहिर्जात डीएनए7 के आकार पर निर्भर है। अंत में,मेजबान कोशिकाओं में कई मार्गों के दौरान बहिर्जात प्लास्मिड के नुकसान को रोकने के लिए एंटीबायोटिक चयन के तहत रूपांतरित रिकेट्सिया को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। नियोजित एंटीबायोटिक की एकाग्रता और प्रकार रिकेट्सिया प्रजातियों के रूपांतरित होने पर निर्भर हैं, जैसा कि पहलेवर्णित 13,15,16,23 है, और यह महत्वपूर्ण है कि चयनित एंटीबायोटिक मार्कर वह नहीं होना चाहिए जो नैदानिक उपचार में लागू होता है।

इस प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए, स्पेक्टिनोमाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन दोनों का उपयोग चयन के लिए किया जाना चाहिए जब तक कि सभी अवशिष्ट अपरिवर्तित रिकेट्सिया को समाप्त नहीं किया जाता है। संयुक्त रूप से, दो एंटीबायोटिक्स इंट्रासेल्युलर और एक्स्ट्रासेल्युलर रिकेट्सिया दोनों को मारते हैं और प्रतिरोधी जंगली-प्रकार के रिकेट्सिया के उभरने की संभावना को कम करते हैं। इसके अलावा, इन दोनों एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग डाउनस्ट्रीम प्रयोगों को प्रभावित नहीं करता है, जैसे कि दो अलग-अलग प्लास्मिड के लिए चयन करने के लिए उन्हें अलग-अलग उपयोग करने की क्षमता, क्योंकि एडीए जीन स्पेक्टिनोमाइसिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन दोनों के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले दो एंटीबायोटिक्स रिकेट्सियल रोग के नैदानिक उपचार में उपयोग किए जाने वाले एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध प्रदान नहीं करते हैं।

इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली आईएसई 6 टिक सेल लाइन के अद्वितीय फायदे हैं। सबसे पहले, आईएसई 6 कोशिकाओं को संयुक्त राज्य अमेरिका में सात मानव रोगजनकों के लिए प्रमुख वेक्टर काले पैर वाले टिक इक्सोड्स स्कैपुलारिस से (अकारी: इक्सोडिडे) से अलग किया गया था। दूसरा, आईएसई 6 कई प्रयोगशालाओं में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल की जाने वाली टिक सेल लाइन है और इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद कई टिक-जुड़े बैक्टीरिया (रिकेट्सिया, एनाप्लाज्मा और एर्लिचिया) को पुनर्प्राप्त करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। तीसरा, कुछ रोगजनक रिकेट्सिया केवल टिक कोशिकाओं में प्रचारित किया जा सकता है लेकिन स्तनधारी कोशिकाओं 17,18,19,24 में नहीं। हालांकि, स्तनधारी कोशिकाओं की तुलना में टिक सेल लाइनें अपेक्षाकृत नाजुक होती हैं और इसमें अधिक गहन संस्कृति आवश्यकताएं होती हैं 25,26,27,28। इसके अलावा, आईएसई 6 कोशिकाओं की वृद्धि दर स्तनधारी सेल लाइनों की तुलना में काफी धीमी है, भले ही एक ही प्रारंभिक घनत्व पर बीज दिया गया हो, हालांकि धीमी प्रतिकृति फायदेमंद हो सकती है जब रिकेट्सियल ट्रांसफॉर्मेंट्स कम विकास प्रदर्शित करते हैं।

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक चरणों में लाइव कोशिकाओं में रिकेट्सिया की परिवर्तन दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि भी प्रदान करता है, जो इलेक्ट्रोपोरेशन सेटिंग्स को अनुकूलित करने या ट्रांसफॉर्मेंट्स को पुनर्प्राप्त करने के लिए विभिन्न सेल लाइनों की दक्षता का परीक्षण करने में मदद करता है। फिर भी, इस प्रोटोकॉल की सीमाएं हैं, विशेष रूप से प्राप्त ट्रांसफॉर्मेंट्स की मात्रा का ठहराव के लिए। एक सफल परिवर्तन के संकेतक के रूप में परिवर्तन दक्षता भविष्य के अध्ययन में प्रदर्शित की जा सकती है। रिकेट्सियल व्यवहार्यता का मूल्यांकन एक उपयुक्त धुंधला किट और फ्लो साइटोमेट्री21 का उपयोग करके किया जा सकता है ताकि प्राप्त किए जाने वाले ट्रांसफॉर्मेंट्स की मात्रा निर्धारित की जा सके। परिवर्तन दक्षता निर्धारित करने के लिए दो मापदंडों का उपयोग किया जाएगा- परिवर्तन के लिए उपयोग किए जाने वाले लाइव रिकेट्सिया की संख्या और एमकेएटीई को व्यक्त करने वाले रूपांतरित रिकेट्सिया की संख्या।

इसके अलावा, प्रतिदीप्ति संकेतों के साथ छवि विश्लेषण का उपयोग विभिन्न प्लास्मिड की परिवर्तन दरों की तुलना करने के लिए किया जा सकता है। चूंकि रिकेट्सियल प्लास्मिड रखरखाव के अंतर्निहित तंत्र को खराब तरीके से समझा जाता है, बहिर्जात प्लास्मिड पेश करने के लिए अच्छी तरह से विशेषता वाले परिवर्तन प्रणाली आगे की जांच के लिए मूल्यवान उपकरण हो सकते हैं। इसके अलावा, कोशिकाओं या ऊतकों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त रिकेट्सिया का प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन रिकेट्सिया / होस्ट / वेक्टर इंटरैक्शन की हमारी समझ में सुधार करेगा। यह रिकेट्सियोस को नियंत्रित करने और रोकने के लिए रणनीतियों को डिजाइन करने के लिए जानकारी प्रदान करेगा।

डेटा उपलब्धता:
इस अध्ययन के परिणामों के अंतर्निहित सभी डेटा सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं।

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Disclosures

हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की जाती है।

Acknowledgments

हम टिमोथी जे कर्टी और बेंजामिन कुल को उनकी व्यावहारिक चर्चाओं और सुझावों के लिए धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को एनआईएच (2R01AI049424) से U.G.M. को अनुदान और मिनेसोटा कृषि प्रयोग स्टेशन (MIN-17-078) से U.G.M. को अनुदान द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 cm gap gene pulser electroporation cuvette Bio-Rad 1652083
2 μm pore size filter  GE Healthcare Life Sciences Whatman 6783-2520
5 mL Luer-lock syringe  BD 309646
60-90 silicon carbide grit  LORTONE, inc  591-056
absolute methanol  Fisher Scientific A457-4
Bacto tryptose phosphate broth  BD 260300
Cytospin centrifuge Cytospin4 Thermo Fisher Scientific A78300003 The rotor is detachable so the whole rotor can be put into the hood to load infectious samples
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) QIAGEN 12362 used to obtain endotoxin-free pRAM18dSFA plasmid
extended fine tip transfer pipet  Perfector Scientific TP03-5301
fetal bovine serum  Gemini Bio 900-108 The FBS batch has to be tested to make sure ISE6 cells will grow well in it.
Gene Pulser II electroporator with Pulse Controller PLUS Bio-Rad 165-2105 & 165-2110
hemocytometer Thermo Fisher Scientific 267110
HEPES Millipore-Sigma H4034
ImageJ Fiji National Institute of Health raw image editing
KaryoMAX Giemsa stain  Gibco  2021-10-30
Leibovitz's L-15 medium Gibco 41300039
lipoprotein concentrate  MP Biomedicals 191476
Nikon Diaphot Nikon epifluorescence microscope
NucBlue Live ReadyProbes Reagent  Thermo Fisher Scientific R37605
Olympus Disc Scanning Unit (DSU) confocal microscope  Olympus
Petroff-Hausser Counting Chamber Hausser Scientific  Chamber 3900
sodium bicarbonate Millipore-Sigma S5761
Vortex Fisher Vortex Genie 2 12-812

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References

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जीव विज्ञान अंक 188 इलेक्ट्रोपोरेशन रिकेट्सिया इम्यूनोफ्लोरेसेंस
टिक सेल लाइनों में फ्लोरोसेंट प्रोटीन-व्यक्त शटल वेक्टर के साथ <em>रिकेट्सिया</em> एसपीपी को बदलने के लिए एक इलेक्ट्रोपोरेशन विधि
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Wang, X. R., Burkhardt, N. Y., Price, L. D., Munderloh, U. G. An Electroporation Method to Transform Rickettsia spp. with a Fluorescent Protein-Expressing Shuttle Vector in Tick Cell Lines. J. Vis. Exp. (188), e64562, doi:10.3791/64562 (2022).

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