Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dyrkning, frysning, behandling og billeddannelse af hele organoider og sfæroider, mens de stadig er i en hydrogel

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64563
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1, 3,5, 6, 2,3,4
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

Summary

Denne undersøgelse beskriver metoder til dyrkning, frysning, optøning, forarbejdning, farvning, mærkning og undersøgelse af hele sfæroider og organoider under forskellige mikroskoper, mens de forbliver intakte i en hydrogel i en multifunktionel enhed.

Abstract

Organoider og sfæroider, tredimensionelle voksende strukturer i cellekulturlaboratorier, bliver i stigende grad anerkendt som overlegne modeller sammenlignet med todimensionelle kulturmodeller, da de efterligner menneskekroppen bedre og har fordele i forhold til dyreforsøg. Imidlertid står disse undersøgelser ofte over for problemer med reproducerbarhed og konsistens. Under de lange eksperimentelle processer - med overførsler af organoider og sfæroider mellem forskellige cellekulturbeholdere, pipettering og centrifugering - bliver disse modtagelige og skrøbelige 3D-voksende strukturer ofte beskadiget eller tabt. I sidste ende påvirkes resultaterne væsentligt, da 3D-strukturerne ikke kan opretholde de samme egenskaber og kvalitet. De metoder, der er beskrevet her, minimerer disse stressende trin og sikrer et sikkert og ensartet miljø for organoider og sfæroider gennem hele behandlingssekvensen, mens de stadig er i en hydrogel i en multifunktionel enhed. Forskerne kan vokse, fryse, tø op, behandle, plette, mærke og derefter undersøge strukturen af organoider eller sfæroider under forskellige højteknologiske instrumenter, fra konfokale til elektronmikroskoper, ved hjælp af en enkelt multifunktionsenhed. Denne teknologi forbedrer undersøgelsernes reproducerbarhed, pålidelighed og validitet, samtidig med at der opretholdes et stabilt og beskyttende miljø for 3D-dyrkningsstrukturerne under behandlingen. Derudover minimerer eliminering af stressende trin håndteringsfejl, reducerer den tid, det tager, og mindsker risikoen for forurening.

Introduction

Fremtiden for celleforskning og terapi ligger inden for 3D-cellekulturer 1,2,3. Organoid- og sfæroidmodeller lukker kløften mellem in vitro-eksperimenter og dyremodeller ved at skabe bedre modeller, der efterligner menneskelig kropsudvikling, fysiologi og sygdomme 4,5,6,7,8,9. Disse modellers reproducerbarhed og repeterbarhed er dog fortsat udfordrende. Desuden resulterer håndtering, høst, overførsel og centrifugering af disse strukturer med nuværende teknologier i tab eller beskadigelse af organoider og sfæroider under mange forhold, hvilket påvirker resultaterne betydeligt.

På trods af mange protokoller for histologisk farvning, immunohistokemisk farvning, immunofluorescensmærkning og kryopræservering er der ingen universel tilgang relateret til standardisering af eksperimentelle forhold, håndtering og behandling af disse sarte strukturer uden at miste eller beskadige dem. Nuværende protokoller er også utroligt lange, skiftevis fra et par dage til flere uger og inkluderer komplekse procedurer med forskellige reagenser 10,11,12,13,14. Derudover forårsager høst, pipettering, centrifugering og overførsel af 3D-voksende strukturer mellem cellekulturbeholdere og kryoviale ændringer i placeringen af strukturerne og mekaniske kræfter og påvirker i sidste ende differentieringen og modningen af organoiderne og sfæroiderne. Det er blevet rapporteret, at vævstopologi, positionering af cellerne og mekaniske kræfter påvirker celledifferentiering og modning signifikant 6,15,16,17.

Derfor er det ønskeligt at forbedre de nuværende konventionelle teknologier til at generere organoider og sfæroider med stabil kvalitet. En metode/anordning, der springer centrifugeringen og andre trin som beskrevet ovenfor over og leverer materialet i et enkelt sikkert miljø fra begyndelsen til slutningen af de mange processer, vil være gavnligt for at nå frem til de mest konsistente og pålidelige data. Derudover vil dette reducere tids-, arbejds- og omkostningsbegrænsninger.

Den multifunktionelle enhed (MD), der er beskrevet her, giver et enkelt sikkert miljø for flere processer af organoider og sfæroider (supplerende figur 1). Denne enhed og komplementeringsprotokoller eliminerer høst-, pipetterings-, overførsels- og centrifugeringstrinnene. Organoiderne og sfæroiderne forbliver i deres in vitro-miljø under de sekventielle processer. Dette miljø omfatter hovedsageligt naturlige eller syntetiske ekstracellulære matrixkomponenter, som kommercielt tilgængelige hydrogeler. Med andre ord tillader de metoder, der er beskrevet her, at en helmonteret prøve af organoider / sfæroider behandles, undersøges og fryses, mens de stadig er i en hydrogeldråbe.

Den biokompatible enhed er modstandsdygtig over for temperaturer mellem 60 °C og -160 °C, hvilket gør det muligt at genoprette organoiderne/steroiderne i en flydende nitrogentank ved -160 °C eller at forberede harpiksblokke til elektronmikroskopi ved 60 °C. Nichen i enheden er designet til at definere et begrænset rum for 3D-voksende strukturer og stimulere dannelsen af sfæroider eller organoider baseret på de tidligere undersøgelser 18,19,20,21,22,23. Den del af enheden er gennemsigtig og indeholder en specifik plast, der giver høj optisk kvalitet (brydningsindeks: 1,43; abbe-værdi: 58; tykkelse: 7,8 mil [0,0078 in eller 198 μm]). Både nichen og den omgivende 'side' del forårsager autofluorescens. Den gennemsigtige niche i midten har et 80 mm 2 område, mens sidedelen er 600 mm2. Beholderens dybde er 15 mm, og tykkelsen er 1,5 mm. Disse funktioner gør det ud over enhedens størrelse og design muligt at foretage observationer under forskellige typer højteknologisk mikroskop og forberede prøverne til elektronmikroskopiske undersøgelser (figur 2). Enhedens lukkesystem giver to positioner, den ene forseglet i fryseren og den anden tillader gasstrøm i inkubatoren. CCK8-proliferations- og cytotoksicitetsassays viser lignende virkninger på celler sammenlignet med de traditionelle cellekulturretter (supplerende figur 2). Trypan blå udelukkelsestest viser høj cellelevedygtighed (94%) under cellekulturen i MD (figur 3).

De processer, der kan udføres for en prøve i den enkelte enhed, omfatter (1) dyrkning, (2) histologisk farvning, (3) immunostaining, herunder immunohistokemisk og immunfluorescensmærkning, (4) frysning, (5) optøning, (6) undersøgelse under optiske mikroskoper, såsom brightfield, darkfield, fluorescens, konfokale og superopløsningsmikroskoper, (7) belægning og undersøgelse direkte under et scanningselektronmikroskop eller (8) forberedelse til transmissionselektronmikroskopi ( Figur 2).

Der findes forskellige metoder til histologisk farvning, immunohistokemisk mærkning eller fluorescerende mærkning af organoider og sfæroider 10,11,12,13,14,24,25. Høstning af dem fra hydrogelen er det første og vigtigste trin i den nuværende teknologi. Efter dette trin tillader nogle metoder helmonteret immunmærkning. De høstede organoider er indlejret i paraffin, sektioneret og mærket til farvning og immunostaining i andre. Afsnittene viser dog muligvis ikke hele prøven og giver kun begrænsede data relateret til strukturens 3D-arkitektur. Desuden er skader på disse 3D-strukturer og tab af antigenicitet velkendte bivirkninger af disse teknologier.

De supplerende nye protokoller for mikroskopiske undersøgelser i denne artikel tillader en analyse af helmonterede prøver, der stadig er i en hydrogel. De her beskrevne protokoller omfatter to nyudviklede formuleringer: opløsning til immunhistokemi (S-IHC) og opløsning til immunfluorescensmærkning (S-IF). Metoderne med disse løsninger giver forskere mulighed for at få mere nøjagtige data, da der ikke er nogen skadelige virkninger af traditionelle arbejdsgange, såsom centrifugering, pipettering og overførsel af de sarte strukturer. Protokollen beskrevet her eliminerer også behovet for høst, blokering, rydning og antigenhentning trin og forkorter hele proceduren til 6-8 timer. Desuden tillader metoden samtidig at tilføje et til tre antistoffer til den samme S-IF. Derfor er det muligt at få resultaterne samme dag, selv efter de mange mærkningseksperimenter, hvilket er en anden fordel ved protokollen beskrevet her; Traditionelle helmonterede immunfluorescensmærkningsprotokoller tager typisk mellem 3 dage og flere uger 10,11,12,13,14.

Paraffinindlejring, et andet skadeligt trin, der reducerer antigenicitet, udelades også. 3D-strukturen forbliver i sit in vitro-miljø fra begyndelsen til slutningen af den mikroskopiske undersøgelse. Da 3D-strukturen forbliver i sine vækstbetingelser, efterligner proteinekspressions- og lokaliseringsdataene in vivo-forholdene bedre. Der forventes mere nøjagtige resultater, da metoden eliminerer de trin, der påvirker prøvens antigenekspression. Tabel 1 og tabel 2 viser, hvordan disse nye protokoller eliminerer trin, sparer tid og arbejdskraft i laboratoriet og reducerer omkostninger og affaldsprodukter sammenlignet med traditionelle arbejdsgange.

Ud over de afgørende trin, der er beskrevet ovenfor, er et andet problem at tilvejebringe et kryopræserveringsmedium og en metode til at bevare prøvens 3D-struktur med højere cellelevedygtighedshastigheder 26,27,28,29,30,31. Kryopræservering er afgørende for at skabe et stabilt modelsystem og muliggøre biobanking af organoider og sfæroider32,33. Biobanking hele den oprindelige 3D-struktur giver mulighed for en mere trofast rekapitulering af den naturlige sundhedstilstand eller sygdom. De vigtigste overvejelser er bekvemmeligheden og pålideligheden af kryopræservering og optøning af organoider / sfæroider. Post-optøning organoid opsving er meget lav i de fleste nuværende teknologier, ofte mindre end 50%. Nylige undersøgelser har imidlertid vist lovende resultater med forbedrede overlevelsesrater26,27,28,29. Lee et al. viste, at 78% af sfæroidcellerne overlevede efter kryopræservering, da de brugte University of Wisconsin-opløsningen indeholdende 15% DMSO28. Celleoverlevelsesforholdet steg til 83% i undersøgelsen af Arai et al.29. Resultaterne efter kryopræservering påvirkes dog væsentligt, da 3D-strukturerne ikke kan opretholde de samme egenskaber og kvalitet. Derudover kræves serumfrie reagenser til god fremstillingspraksis i farmaceutiske og diagnostiske omgivelser. Traditionelle arbejdsgange bruger et medium indeholdende føtalt bovint serum (FBS) og dimethylsulfoxid (DMSO) til langsomfrysningsmetoden, som begge er forbundet med handicap. FBS er et animalsk afledt produkt og kan have batchvariationer. DMSO er et meget vellykket kryoprotektant, men langvarig eksponering, især under optøning, kan forårsage cytotoksiske virkninger30,31.

Denne artikel beskriver også fryse- / optøningsmetoden for hele organoider eller sfæroider, mens de stadig er i en hydrogel. To formler til frysning af organoider og sfæroider anvendes i undersøgelsen: (1) 10% DMSO indeholdende traditionel fryseopløsning (FS) og (2) et serum- og DMSO-frit kryopræserveringsmedium. Dette kryopræserveringsmedium indeholder ekstracellulære matrixkomponenter, som adskiller sig fra nuværende formler. Den ekstracellulære matrix består af to hovedklasser af makromolekyler, proteoglycaner og fibrøse proteiner, som er afgørende for fysiske stilladser for de cellulære bestanddele, men også initierer processer, der kræves til vævsmorfogenese, differentiering og homeostase 34,35,36,37,38,39,40 . Kollagener giver trækstyrke, regulerer celleadhæsion, understøtter kemotaxis og migration og direkte vævsudvikling37. Derudover giver elastinfibre rekyl til væv, der gennemgår gentagen strækning38. Et tredje fibrøst protein, fibronectin, styrer organisationen af den interstitielle ekstracellulære matrix og har en afgørende rolle i formidling af cellebinding og fungerer som en ekstracellulær mekano-regulator39. Du et al. har demonstreret den kryobeskyttende virkning af kyllingekollagenhydrolysat på det naturlige actomyosin-modelsystem41. Deres resultater tyder på, at kollagenhydrolysat kan hæmme iskrystalvækst, reducere proteinfrysningsdenaturering og oxidation på samme måde som kommercielle kryoprotektanter og give en bedre gelstruktur efter fryse-optøningscyklusser. Derfor giver tilføjelse af ekstracellulære matrixkomponenter til kryopræserveringsmediet et mere sikkert og beskyttende miljø for prøven og understøtter de levende strukturer til at helbrede efter frysning-optøning.

Derudover beskriver denne undersøgelse en ligetil protokol til mærkning af cytoplasmatiske membraner og kerner af levende organoider og sfæroider, mens de stadig er i hydrogelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dyrkning af organoider og sfæroider

  1. Placer hydrogelen på is natten over (i køleskab eller et koldt rum) for at tø op.
  2. Anbring den kommercielt tilgængelige multifunktionsenhed (MD; se Materialetabel) i inkubatoren 1 dag før eksperimentet (37 °C, 5% CO2) for at varme.
  3. Anbring sterile brede pipettespidser i køleskabet ved 4 °C.
    BEMÆRK: Trin 1.1-1.3 skal udføres på dag 0, og trin 1.4-1.11 skal udføres på dag 1.
  4. Placer hydrogelen på is i en laminær strømningshætte i 15 min.
    1. Valgfrit: Fortynd hydrogelen i koldcellekulturmedium i henhold til producentens anbefaling.
  5. Placer røret indeholdende en pellet af HepG2-celler (kommercielt opnået hepatocellulært karcinomcellelinje; se Materialetabel) på is.
  6. Plade 30-35 μL 100% hydrogel inden for nichen af den forvarmede enhed for at skabe et gelfald.
  7. Placer 10.000 HepG2-celler i midten af toppen af hver hydrogeldråbe (figur 2), og inkuber i 15 minutter ved 37 °C.
  8. Dæk hydrogeldråben med 200 μL Dulbeccos Modificerede Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt kvægserum.
  9. Dæk låget på MD i den rigtige position for at tillade gasstrøm, og læg enheden i inkubatoren.
  10. Foder cellerne med 200 μL DMEM med 10% FBS hver anden dag.
  11. Kontroller væksten af sfæroiderne under et omvendt mikroskop (figur 3). Sfæroiddannelse starter efter den 3. dag. Video 1 viser placeringen af sfæroider på forskellige niveauer i en hydrogelkuppel.
    BEMÆRKNINGER: Det anbefales kraftigt at forsigtigt opsuge væsken omkring hydrogelen og langsomt tilføje den nye væske til miljøet for at forhindre beskadigelse af hydrogeldråberne.

2. Hematoxylin- og Eosinfarvning af helmonterede organoider/sfæroider i en hydrogel

  1. Varm fikseringsmidlet (4% paraformaldehyd; PFA), PBS og hæmatoxylin (se materialetabel) til 37 °C.
  2. Aspirer mediet omkring hydrogeldråben med en pipette, tilsæt 100-200 μL 4% PFA for at fastgøre, og inkuber i 15-20 minutter ved 37 °C.
  3. Aspirer 4% PFA og tilsæt 200 μL PBS for at vaske 3x i 5 minutter hver ved 37 °C. Derefter aspireres PBS'en og inkuberes med 200 μL Hematoxylinopløsning i 15-20 minutter ved 37 °C.
  4. Hematoxylin aspireres, og der tilsættes 200 μL dH2O, som skal vaskes 3x i 10 minutter hver ved 37 °C. DH2O-værdienaspireres, og der inkuberes med 200 μL ethanol i 5-10 minutter ved 37 °C.
  5. Ethanolen aspireres og inkuberes med 200 μL Eosin (se materialetabel) i 10 minutter ved 37 °C. Aspirer Eosin og tilsæt 200 μL dH2O for at vaske i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
  6. DH2Oaspireres, og der tilsættes 100 μL glycerol for at dække hydrogeldråben som monteringsmedium.
  7. Valgfrit: Monter nichen med en dækslip. Dette trin kan udelades for at undgå at klemme organoider / sfæroider af betydelig størrelse.
  8. Luk låget på MD ordentligt for at undgå tørring indtil undersøgelse. Prøven er stabil til undersøgelse i mindst 6 måneder.

3. Immunohistokemi af helmonterede organoider/sfæroider i en hydrogel

  1. Den kommercielt opnåede opløsning til immunhistokemi (S-IHC; se materialetabel) opvarmes til 37 °C.
  2. Organoiderne eller sfæroiderne inkuberes i hydrogelen med 3% hydrogenperoxid (H2O2) i 200 μL dH 2Oi 5 minutter ved 37 °C.
  3. Hydrogenperoxidopløsningen aspireres og vaskes idH 2O i 5 minutter ved 37 °C. DH 2 O aspireres, og der inkuberes to gange med 100 μL S-IHC ved 37 °C i 10 minutter hver.
  4. Aspirér S-IHC og inkuberes med 100 μL primært antistof (se Materialetabel) fortyndet i S-IHC i 1-2 timer ved 37 °C (efter producentens anbefalinger vedrørende arbejdsfortynding).
  5. Aspirer den primære antistofopløsning og inkuberes med 100 μL S-IHC 3x i 5 minutter hver ved 37 °C.
  6. Aspirer 100 μL S-IHC og inkuberes med et biotinyleret sekundært antistof (se Materialetabel) i 10 minutter ved 37 °C.
  7. Den sekundære antistofopløsning aspireres og inkuberes med 100 μL S-IHC 3x i 5 minutter hver ved 37 °C. Aspirer S-IHC og inkuberes med 100 μL peberrodsperoxidase (HRP) mærket streptavidin (se materialetabel) i 10 minutter ved 37 °C.
  8. Aspirer HRP-mærket streptavidin og inkuberes med 100 μL S-IHC 3x i 5 minutter hver ved 37 °C.
  9. S-IHC aspireres og inkuberes med 100 μL DAB/AEC-kromogenopløsningsblanding (se materialetabel) i 5-10 minutter ved 37 °C.
  10. Overvåg intensiteten af farvningen under et lysmikroskop.
  11. Vask med dH 2 O 3x i2minutter hver.
  12. Valgfrit: Inkuberes med 100 μL hæmatoxylin (se materialetabel) til nuklear modfarvning i 5 minutter ved 37 °C.
  13. Aspiraner hæmatoxylinen og vask i dH2O i 5 min.
  14. DH2O, aspireres, og hydrogeldråben dækkes med 100 μL glycerol som monteringsmedie.
  15. Luk låget på MD fast indtil mikroskopisk undersøgelse.
    BEMÆRKNINGER: Antigenhentning og proteinblokeringstrin udelades i denne protokol, da S-IHC eliminerer disse trin.

4. Immunofluorescensmærkning af helmonterede organoider/sfæroider i en hydrogel

  1. Følgende materialer opvarmes til 37 °C: 4 % PFA, PBS, S-IF, primær antistofopløsning i S-IF, sekundær antistofopløsning i S-IF, nuklear plet og glycerol (se materialetabel).
  2. Cellekulturmediet aspireres og fikseres med 200 μL 4% PFA i 15-30 minutter ved 37 °C. Sspire fikseringsmidlet og vask i S-IF 3x i 10 minutter hver ved 37 °C.
  3. Tilføj dH2O til siden omkring nichen for at give fugtighed under de følgende trin.
  4. Aspirer S-IF'en omkring hydrogeldråben, og hydrogeldråben inkuberes med 100 μL primær antistofopløsning (se Materialetabel) i S-IF i 30-60 minutter ved 37 °C.
  5. Aspirer den primære antistofopløsning og vask i S-IF 3x i 10 minutter hver ved 37 °C.
  6. S-IF aspireres og inkuberes med 100 μL sekundær antistofopløsning (se materialetabel) i S-IF i 30-60 minutter ved 37 °C i mørke.
  7. Den sekundære antistofopløsning aspireres, og der vaskes med PBS 3x i 10 minutter hver ved 37 °C i mørke.
  8. PBS aspireres og inkuberes med 100 μL nuklear DNA-plet indeholdende monteringsmedium eller glycerol ved 37 °C i mørke.
  9. Fyld nichen med glycerol for at undgå tørring.
  10. Valgfrit: Dæk nichen med en coverslip. Dette trin kan udelades for at undgå at klemme organoiderne / sfæroiderne.
  11. Luk MD tæt. Prøver i MD'er kan opbevares ved 4 °C i mørke i mindst 6 måneder med minimalt fluorescenstab.
  12. Brug følgende indstillinger til konfokal mikroskopisk undersøgelse: Indstil pinholeværdien for alle kanaler til 20,1, hold gain masterkonstanten ved 550 for 488 nm, 485 for 550 nm og 450 for 594 nm, hold lasereffekten konstant for alle eksperimenter og den laveste procentdel på 2,0.
    BEMÆRKNINGER: Primære antistoffer: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumin (1:50), Anti-Beta-galactosidase (1:25), Antimitokondrieantistof (1:100), Anti-Golgi-antistof (1:50), Anti-Cytokeratin 5 (1:100), Ov6-antistof (1:100). Sekundære antistoffer: Gedeanti-kanin IgG (H+L)- 488, Gedeanti-Kanin IgG (H+L)-550, Gedeanti-Mus IgG (H+L)-488, Gedeanti-Mus IgG (H+L)-550, Gede-anti-Kylling IgY(H+L)-647. Fortyndingen for alle sekundære antistoffer er 1:100. Derudover anvendes FITC-Phalloidin (1:100), et konjugeret antistof, også (se Materialetabel).

5. Plasmamembran og kernemærkning af levende organoider og sfæroider i en hydrogel

  1. Der fremstilles mærkningsopløsning indeholdende Alexa fluorhvedekim agglutinin (5,0 μg/ml) og Hoechst (2 μM) i Hanks afbalancerede saltopløsning (HBSS) i henhold til producentens anbefalinger (se Materialetabel), og opvarm op til 37 °C.
  2. Aspirer cellekulturmediet og tilsæt 100 μL mærkningsopløsning for at dække hydrogeldråben. Inkuberes i 15-30 min ved 37 °C.
  3. Mærkningsopløsningen fjernes, og der vaskes to gange i PBS 2x i 10 minutter hver ved 37 °C. Valgfrit: Fastgøres med 200 μL 4% formaldehyd i 15 minutter ved 37 °C.
  4. Dæk hydrogeldråben med glycerol som monteringsmedium. Valgfrit: Monter nichen med et dækglas.
  5. Luk låget på MD tæt, og hold det nedkølet i mørke indtil fluorescens / konfokal mikroskopisk undersøgelse. Det er stabilt i mindst 6 måneder.

6. Frysning og optøning af helmonterede organoider/sfæroider i en hydrogel

  1. Frys organoiderne ved at følge nedenstående trin.
    1. Den kommercielt opnåede fryseopløsning (FS; se materialetabellen) opvarmes til 37 °C.
    2. Aspirer cellekulturmediet omkring hydrogelkuplen forsigtigt.
    3. Tilsæt forsigtigt 200 μL FS. Prøven inkuberes med FS ved 37 °C i 1 time.
    4. Luk enhedens låg tæt, og læg det i en skumkasse. Denne skumkasse anbringes i en anden skumkasse, som vist i supplerende figur 3. Luk begge skumkasser tæt. To skumkasser inde i hinanden giver et temperaturkølegradientområde på 1 til 2 ° C / min af prøven i en -20 ° C fryser.
    5. Anbring kassen ved -20 °C i 2 timer. Overfør kassen til en -80 °C fryser og lad den stå natten over.
    6. Tag prøven ud af kasserne. Prøven i MD kan opbevares i -80 °C fryseren i 6 måneder.
    7. Overfør MD, der indeholder prøven, til væskenitrogentanken til langtidsopbevaring.
  2. Optø organoiderne ved at følge nedenstående trin.
    1. Udtagning af maskindirektivet, der indeholder prøven, fra fryseren/nitrogenbeholderen og anbringes direkte i en inkubator ved 37 °C. Inkuberes i 1 time ved 37 °C.
    2. Tilsæt 200 μL varmt kulturmedium til nichen (forholdet mellem FS og cellekulturmedium er 1: 1) og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
    3. Tilsæt mere varmt kulturmedium til nichen (forholdet mellem FS og cellekulturmedium er 1: 2) og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
    4. Aspirer mediet og FS-blandingen forsigtigt. Fortsæt med at scanne elektronmikroskopi (trin 7) og transmissionselektronmikroskopi (trin 8) billeddannelse af de helmonterede organoider / sfæroider i hydrogelen.

7. Scanning elektronmikroskopi af helmonterede organoider / sfæroider

  1. Varm Karnovskys fikserende og postfikserende opløsning (se Materialetabel) op til stuetemperatur (RT).
  2. Aspirer cellekulturmediet omkring hydrogelen i MD. Prøven anbringes i MD på is i den laminære strømningshætte i 15 minutter.
  3. Aspirer den flydende hydrogel, der omgiver organoiderne / sfæroiderne meget forsigtigt. En begrænset mængde matrigel kan forblive i nichen for at undgå at beskadige og miste prøven.
  4. Fix med Karnovskys fikseringsmiddel (2% PFA, 2,5% glutaraldehyd i 0,15 M Cacodylatbuffer og 2 mM CaCl2; se Materialetabel) ved RT i 1 time.
  5. Surgér fikseringsmidlet forsigtigt og vask med destilleret vand (dH2O) 3x i 15 minutter hver.
  6. DH2O aspireres forsigtigt og fastgøres med postfikserende opløsning (1% vandig osmiumtetroxid [OsO4]; se materialetabel) ved RT i 1 time.
  7. Aspirer det efterfikserende middel forsigtigt og vask med destilleret vand (dH2O) 3x i 15 minutter hver.
  8. Dehydrere i en gradueret serie af ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), blanding af ethanol/acetone (1:1; 1:2) og absolut acetone ved RT i 15 minutter hver.
  9. Tør med en kritisk punkttørrer.
  10. Belæg prøven i enheden med 6 nm guld/palladium ved hjælp af en sputter coater (se Materialetabel) i 90 s.
  11. Observer under et scanningselektronmikroskop med en sekundær elektrondetektor i linsen ved 2-3 kV i vakuumtilstand (5 x 10-6 mA). Tag billeder med en arbejdsafstand på 8,1-8,2 mm og ved 675x, 1050x og 1570x forstørrelser.
    BEMÆRKNINGER: Alle trin udføres i MD. Brug 200-250 μL opløsning til hvert trin.

8. Transmissionselektronmikroskopi af helmonterede organoider/sfæroider i en hydrogel

  1. Varm Karnovskys fikseringsmiddel op til 37 °C. Aspirer cellekulturmediet omkring hydrogelen i MD.
  2. Fix prøven med Karnovskys fikseringsmiddel ved RT i 1 time. Vask med dH2O 3x i 15 minutter hver.
  3. Efterfiksering med 2% vandig OsO4 og 2,5% kaliumferrocyanid ved RT i 45 min. Vask med dH2O 3x i 10 minutter hver.
  4. Inkuberes i 0,5% thiocarbohydrazid (TCH; se materialetabel) ved RT i 30 min. Vask med dH2O 3x i 10 minutter hver.
  5. Inkuberes i 2% vandig OsO4 ved RT i 30 min. Vask med dH2O 3x i 10 minutter hver.
  6. Inkuberes i 2% uranylacetatopløsning (se materialetabel) ved RT i 1 time.
    BEMÆRK: I dette trin kan sfæroider opbevares ved 4 °C natten over.
  7. Inkuberes i blyaspartatopløsning (se materialetabel) ved 60 °C i 45 min. Vask med dH2O 3x i 10 minutter hver.
  8. Dehydrere i en gradueret serie af ethanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) og absolut acetone ved RT i 15 minutter hver.
  9. Behandl med en blanding af (1:1; 1:2) acetone/Eponharpiks og ren Eponharpiks (se Materialetabel) ved RT i 2 timer hver.
  10. Polymeriser harpiksen ved 60 °C natten over (mindst 16 timer). Efter polymerisationen fjernes harpiksblokken fra MD, som vist i supplerende figur 4.
  11. Fastgør harpiksblokken til en større med en harpikslim. Trim blokken og nå placeringen af organoider eller sfæroider.
  12. Få halvtynde (1.000 nm) og ultratynde sektioner (60 nm) ved hjælp af et ultramikrotom (se Materialetabel).
  13. Placer de ultratynde sektioner på 100 mesh kobbergitter og observer under et scanningselektronmikroskop med en STEM-detektor ved en accelererende spænding på 30 kV. Tag billeder med en arbejdsafstand på 44 mm og ved 2580x, 5020x og 6060x forstørrelser.
    BEMÆRKNINGER: Brug 200-250 μL opløsning til hvert trin. Trin 8.1-8.10 udføres i MD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne artikel repræsenterer en multifunktionel enhed (MD) og supplerende metoder til dyrkning, frysning, optøning, histologisk farvning, immunohistokemisk farvning, immunofluorescensmærkning, belægning og behandling af hele organoider eller sfæroider, mens de stadig er i en hydrogel i et enkelt unikt designet miljø. Den nuværende undersøgelse var designet til at forberede HepG2 leverkræft sfæroider i 35 hydrogel dråber i 35 MD'er. Derudover blev lungeorganoider i MD'er immunfluorescerende mærket som et eksempel for at demonstrere resultaterne af de nuværende metoder til organoidundersøgelser.

Figur 1 viser et nærmere kig på enheden, der indeholder en hydrogelkuppel. Nichens størrelse og form er designet til at give et beskyttende miljø for hydrogelen, der indeholder organoiderne / sfæroiderne og gemme de reagenser, der anvendes under forskellige processer. Derudover kan sidedelen af enheden, der omgiver nichen, bruges som fugtighedskammer under immunostaining eksperimenter. Mediet til fodring af prøven kan variere mellem 100-200 μL afhængigt af hydrogeldråbens højde. Den nuværende undersøgelse fokuserer på den kuppelbaserede metode, da mange hydrogeler, kommercielle ekstracellulære matrixkomponenter og kældermembranekstrakter giver brugeren mulighed for at forberede dråber. Det er dog også muligt at fylde MD's niche med hydrogelen og derefter frø cellerne inde i den for at generere organoider / sfæroider. Denne metode kan foretrækkes, hvis matrixens viskositet ikke tillader fremstilling af kupler, eller hvis eksperimentet omfatter store mængder organoider. Hydrogeltypen og hydrogel/medium-forholdet til fremstilling af dråber kan variere afhængigt af celletypen, det eksperimentelle design og mediet. Figur 1  repræsenterer også enhedens design, der gør det muligt at undersøge organoider / sfæroider under brightfield, konfokale og scanningselektronmikroskoper, mens organoider / sfæroider stadig er i deres oprindelige in vitro-miljø .

Figur 2 viser, hvordan man frøer celler i en hydrogel og undersøger udviklingen af sfæroider eller organoider. Designet og dimensionerne af multifunktionsenheden er også blevet præsenteret i denne figur. Video 1 viser placeringen af 3D-voksende sfæroider i en hydrogel. Figur 3 repræsenterer levende billeder af voksende sfæroider fra dag 3 til dag 21. Tiden for dannelsen af sfæroider og organoider kan variere alt efter prøvens art. For eksempel dannede sfæroider fra HepG2-celler og HEK-celler inden for 3 dage, mens dannelsen af lever- og galdeorganoider varede 2 uger under forsøgene.

Hæmatoxylin og Eosin-farvede sfæroider ses i figur 4. Billedet repræsenterer velbevarede og homogent farvede sfæroider i forskellige størrelser og fusioner af sfæroider. Levende celler i midten af sfæroiderne er bemærkelsesværdige. Billedet viser også de delikate forbindelser mellem cellerne fra forskellige sfæroider. Disse skrøbelige forbindelser kunne ikke visualiseres efter traditionelle arbejdsgange, da overførsel, pipettering eller centrifugering ville beskadige dem. Figur 5  demonstrerer immunostaining af sfæroider med antistoffet, der er specifikt for Arginase, en af de mest almindelige markører for diagnose og prognose for hepatocellulært karcinom42,43. Mikrograferne afslører differentierede og udifferentierede leverkræftceller i de samme sfæroider. Denne figur indeholder billeder med og uden modfarvning med hæmatoxylin. Forskere kan vælge at udelade modfarvning med hæmatoxylin i tilfælde, hvor det ville være svært at differentiere mærkede områder i en 3D-struktur.

Figur 6 repræsenterer en anden ligetil protokol for helmonteret visualisering af levende organoider / sfæroider i en hydrogel: levende cellemembran og kernefarvning. Metoden tillader den samme mærkningstæthed i periferien og midten, hvilket viser fuldstændig reagenspenetration. Figur 7, figur 8 og figur 9 viser repræsentative billeder af sfæroider mærket med henholdsvis et, to eller tre antistoffer. Et til tre primære antistoffer fortyndes i S-IF samtidigt. Tilsvarende fortyndes et til tre matchende sekundære antistoffer, der er egnede til eksperimentet, samtidigt i S-IF. Immunolabeling-protokollen giver forskere mulighed for at markere 3D-strukturerne inden for 4-6 timer uden at miste eller beskadige dem. Baggrunden er gennemsigtig, og den teknologi, der anvendes her, kræver ikke yderligere clearing, antigenhentning eller blokeringsmetoder / opløsninger. Metoden giver også forskere mulighed for at mærke prøven med flere antistoffer i et enkelt trin. Med andre ord forbereder brugeren en opløsning indeholdende et til tre primære antistoffer og en anden opløsning, der matcher med et til tre sekundære antistoffer. Protokollen beskrevet her eliminerer sekventielle mærkningstrin med forskellige antistoffer i konventionelle metoder.

Figur 10 repræsenterer scannings- og transmissionselektronmikroskopiske billeder af sfæroiderne. Den første række viser billeder af hele sfæroider i MD under et scanningselektronmikroskop. Den anden række indeholder transmissionselektronmikroskopiske billeder af sfæroider efter fremstilling af harpiksblokkene, der indeholder helmonterede sfæroider i MD, samt billeder af sektionerede og farvede sfæroider. Velbevarede cytoplasmatiske organeller og andre ultrastrukturelle træk ved cellerne viser effektiviteten af denne enkle protokol, som beskytter 3D-strukturen af hele prøven. MD giver også forskerne mulighed for at fryse og optø de hele monteringsprøverne i en hydrogel. Figur 11  demonstrerer hydrogelkupler og sfæroiderne ved en højere forstørrelse før og efter frysning. Uregelmæssigheden ved grænserne for hydrogelkuplen er bemærkelsesværdig. Imidlertid er rundheden af de kryopræserverede sfæroider næsten stabil efter optøning sammenlignet med sfæroiderne før frysning. Levende cellemembran- og kernemærkningsmetoder anvendes også 48 timer efter optøning for at demonstrere, hvordan frysnings- / optøningsproceduren påvirkede 3D-arkitekturen, cellemembranen og cellens levedygtighed. Den traditionelle fryseopløsning indeholdende dimethylsulfoxid og den nuværende nyformulerede opløsning, SF, viser lignende resultater. Mere end 75% af 3D-strukturerne kunne overleve i denne protokol. Imidlertid er der behov for yderligere eksperimenter for at afsløre de langsigtede bivirkninger af hver formulering på organoider og sfæroider.

Tabel 1 og tabel 2 sammenligner de traditionelle arbejdsgange med dem, der er beskrevet her, baseret på trinnummer, varighed og affaldsproduktion (dvs. det samlede antal plasthandsker, pipettespidser, serologiske pipetter, centrifugerør, mikrocentrifugerør, cellekulturbeholdere, kryovialer osv. for hver arbejdsgang).

Supplerende figur 1 repræsenterer sekventielle trin, der kan udføres skematisk i en enkelt MD. Supplerende figur 2 viser resultaterne af forsøgene designet til at sammenligne cellelevedygtighed, toksicitet og spredningshastigheder for HepG2-celler i en MD eller en traditionel glasbundet skål. Supplerende figur 3 viser de skumkasser, der er blevet brugt til frysning af prøverne i MD'er . Supplerende figur 5 indeholder billeder af luftvejsorganoider, der blev immunfluorescerende mærket og derefter visualiseret, mens de stadig var i MD'er. På samme måde viser video 2 to immunfluorescerende mærkede luftvejsorganoider i en MD. Endelig er supplerende figur 6 en graf, der sammenligner den gennemsnitlige intensitet af cellemembranmærkningsintensiteten i levende sfæroider før og efter frysning ved hjælp af traditionel arbejdsgang og arbejdsgangen beskrevet her. Image J-software er blevet brugt til analyse.

Figure 1
Figur 1: Multifunktionscellekulturenheden (MD). (A) Nichen (N), den centrale del af enheden, er designet til at skabe et beskyttende miljø for organoider / sfæroider, der dyrkes i en hydrogeldråbe (D) under sekventielle processer. Siden (S), den omgivende del af nichen, kan bruges som luftfugterkammer under immunostaining eksperimenter. (B) Det gennemsigtige center i låget giver brugeren mulighed for at observere organoiderne/sfæroiderne, når enheden er lukket. (C) Hydrogelkuplen indeholdende organoider i MD kan farves eller indlejres i en harpiksblok til transmissionselektronmikroskopi. Låget indeholder også nichen (N) til hængende dråbemetode. Enhedens størrelse og design giver brugeren mulighed for at undersøge organoiderne / sfæroiderne under (D) brightfield, (E) konfokale og (F) scanningselektronmikroskoper. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Såning af celler inde i en hydrogel. (A) Cellepelleten i pipetten indsættes i toppen af kuplen. Efter 3-5 dage bliver sfæroider synlige i kuplen, især i periferien af dråben. (B) Fire levende billeder af voksende sfæroider fra hvert kvartal i en kuppel blev taget og fusioneret. Skala bar = 200 μm. (C) Multifunktionsenhedens design og dimensioner (i centimeter). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Udvikling af sfæroider i et hydrogelfald fra dag 3 til dag 21. Skala bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Hematoxylin og Eosin-farvede helmonterede sfæroider inden for MD. Visualisering af forbindelserne mellem cellerne placeret i de tilstødende eller fusionerende sfæroider. De delikate processer mellem cellerne (pilene) er synlige, da hele monteringsprøven i hydrogelen fastgøres, farves og undersøges uden at beskadige 3D-vækststrukturerne. Skala bar: dag 3, dag 9 = 50 μm; dag 7, dag 17 = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Immunohistokemisk farvning af helmonterede sfæroider i hydrogelen inden for MD. Prøverne blev immunfarvet med et antistof, der var specifikt for Arginase. Arginase positive (røde pile) og negative (sorte pile) celler ses i sfæroiderne. Billeder er fra to eksperimenter: (A-C) uden og (D-F) med modfarvning med hæmatoxylin. Skala bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Konfokalbillede af en levende organoid i hydrogelen. De levende organoider blev mærket med levende cellemembran (WGA) og kernepletter (Hoechst). Skala bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Immunofluorescensmærkning af helmonterede sfæroider i en hydrogel med et antistof og en nuklear plet (Hoechst). (A-C) Det øverste panel viser en sfæroid mærket med et antistof, der er specifikt for Na-K ATPase i cellemembranen. (D-F) Det nederste panel viser placeringen af et andet antistof, der er specifikt for Arginase, et cytosolisk protein, der er specifikt for hepatocellulært karcinom, i leverkræftsfæroider. Farvningsprotokollens varighed: 6 timer. Skala bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Immunofluorescensmærkning af helmonterede sfæroider i en hydrogel med to antistoffer og en nuklear plet (Hoechst). (A-C) Det øverste panel viser en sfæroid mærket med to antistoffer, der er specifikke for albumin og Ov6. Skalabar = 5 μm. (D-F) Bundpanelet viser placeringen af alfa feto protein og Ov6 i leverkræft sfæroider. Skala bar = 20 μm. Varighed af farvningsprotokol: 6 timer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Immunofluorescensmærkning af helmonterede sfæroider i en hydrogel med tre antistoffer og en nuklear plet (Hoechst). (A-E) Sfæroidet i det øverste panel er mærket med antistoffer, der er specifikke for Arginase, Na-K ATPase og beta-galactosidase. Skala bar = 10 μm. (F-J) Det midterste panel demonstrerer en sfæroid mærket med Ov6, beta-galactosidase og alfa-feto protein. Skalastang = 20 μm. (K-O) Sfæroidet i det nederste panel er mærket med FITC-phalloidin, anti-mitokondrieantistof og anti-Golgi-antistof. Skala bar = 20 μm. Bemærk den høje mærkningsspecificitet og reducerede baggrund. Varighed af farvningsprotokol: 6 timer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Elektronmikroskopibilleder. (A-C) Scanning elektronmikroskopiske billeder af hele sfæroider i hydrogelen i MD. Skalabar = 10 μm. (D-F) Ultrastrukturelle træk ved cellerne i en sfæroid er også blevet visualiseret under et transmissionselektronmikroskop. Skala søjler: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 11
Figur 11: Levende billeder af sfæroider før og efter frysning. (A-F) Uregelmæssigheden af grænserne for hydrogelkuplerne er tydelig efter frysning. Imidlertid forbliver størrelsen og rundheden af sfæroider ens. (F) Cellemigration på dyrkningsoverfladen kan ses efter optøning. (G-L) Den levende cellemembran (WGA) og kernefarvning (Hoechst) viser lignende cellelevedygtighed og intakte cellemembraner før og efter frysning af hele sfæroider i en hydrogel i MD. Skala basr: (A, B, D, E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Traditionel arbejdsgang Arbejdsgang med multifunktionsenhed (MD)
Trin 22 6
Tidspunkt 9 dage 4 dage
Affaldsprodukter 26 9

Tabel 1: Sammenligning af trinantal, tid og spildproduktion mellem de traditionelle og nye arbejdsgange under et kortvarigt eksperiment.

Traditionel arbejdsgang Arbejdsgang med løsning til immunfluorescens (S-IF)
Trin 25 7
Tidspunkt 120 timer 6-8 timer
Affaldsprodukter 28 10

Tabel 2: Sammenligning af den konventionelle immunmærkning og den nye immunolabeling-protokol.

Video 1: Tidsserie af billeder på forskellige niveauer af en hydrogel indeholdende sfæroider under et omvendt fasekontrastmikroskop. Klik her for at downloade denne video.

Video 2: 3D-struktur af to luftvejsorganoider mærket med antistoffer mod Cytokeratin 5 og DAPI. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende figur 1: Oversigt over forsøget. Dette skema viser de sekventielle eksperimentelle trin til dyrkning og undersøgelse af helmonterede organoider i en hydrogel. Den teknologi, der er beskrevet her, gør det muligt at dyrke, fryse, tø op, mærke og undersøge organoiderne under forskellige mikroskoper. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Sammenligning af cellelevedygtighed, toksicitet og proliferationshastigheder for HepG2-celler i en traditionel glasbundet skål eller en MD. HepG2-celler blev dyrket på (A) en traditionel glasbundet cellekulturskål eller (B) i en MD for at sammenligne cellelevedygtighed og toksicitet. (C) Trypan blå udelukkelsestest blev brugt til at demonstrere levedygtigheden. Skala bar = 20 μm. Resultaterne blev sammenlignet ved hjælp af (D-E) CCK8 cytotoksicitet og (F) celleproliferationsassays. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: Opstilling af de to skumkasser. Den ene skumkasse placeres inde i den anden under den langsomme fryseproces af hele organoiderne eller sfæroiderne i MD. *betegner de to felter. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: Trin, der viser, hvordan harpiksblokken fjernes fra MD efter polymerisation af harpiksen. (A) Harpiksblokken, der omgiver sfæroiderne eller organoiderne, fremstilles inde i MD-nichen og polymeriseres derefter. (B-D) Derefter skubbes harpiksblokken med en passende tynd stang for at fjerne den fra nichen. (E) Derefter fjernes harpiksblokken med plasten nedenunder. (F-G) Endelig bruges en pincet til at adskille dem, hvis blokken stadig er fastgjort til plasten. (H) Blokken er klar til tynd sektionering. De helmonterede organoider eller sfæroider i harpiksblokken (*) er klar til sektionering til transmissionselektronmikroskopi. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 5: Luftvejsorganoider, der var immunfluorescerende mærket og derefter visualiseret, mens de stadig var i MD'er. (A-C) Det øverste panel viser cirkulære luftvejsorganoider med et centralt lumen. Grøn repræsenterer luftvejsprogenitorceller, der udtrykker Cytokeratin 5 i organoidens yderste ring, og blå repræsenterer kernerne. Skalabjælke = 50 μm. (D-F) Det nederste panel viser det tredimensionelle billede af de to side om side organoider i (D) DAPI- og (E) Alexa 488-filtrene samt det (F) flettede billede. Skala bar = 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 6: Sammenligning af mærkningstætheden på cellernes levende cellemembraner. Grafen sammenligner sfæroiderne før og efter frysning ved hjælp af den traditionelle og i øjeblikket vedtagne arbejdsgang. Analysen blev udført ved hjælp af Image J-billedanalysesoftwaren. Forkortelser: IntDen = Integreret densitet (fluorescensintensitet i de valgte sfæroider). CTCF = Korrigeret total cellefluorescens. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MD, der supplerer formuleringer og protokoller beskrevet her, letter hurtig og spontan 3D-vækst af organoider og sfæroider i et mere kontrolleret miljø og fortsætter eksperimentet under de samme forhold. Prøven forbliver i det samme miljø under hele processen, og næsten 100% af de 3D-voksende arkitekturer forbliver intakte i beholderen. Dette forbedrer homogeniteten under de sekventielle eksperimenter og giver mulighed for en længere kulturperiode. Derudover reduceres antallet af trin under organoider og sfæroidbehandling drastisk sammenlignet med traditionelle arbejdsgange (figur 4), hvilket igen minimerer håndteringstid og menneskelige fejl og reducerer forureningsrisikoen. Desuden forbedrer dette pålideligheden og gyldigheden, da eksperimentelle forhold forbliver stabile, samtidig med at de 3D-voksende strukturer beskyttes i et enkelt miljø. Det hjælper med at spare tid og arbejde i laboratoriet, samtidig med at nøjagtigheden, pålideligheden og validiteten forbedres. Derudover tillader det sporing af individuelle 3D-voksende strukturer under hele den sekventielle proces. Undersøgelse af størrelse og positionsændringer under kulturen og deres reaktion på forskellige forbindelser er mulig i enheden. Dette giver en fremragende in vitro eksperimentel model til rekapitulering af udviklingen af menneskekroppen og sygdomme. Forskere kan undersøge stadierne under fusionen af sfæroider og organoider, en væsentlig mekanisme for migration i sygdomme og normal udvikling44,45,46,47. Nylige undersøgelser, der sigter mod modellering af fusion i laboratoriet, foretrækker at bruge organoid- og sfæroidmodeller44,45,46,47.

Denne enhed giver også forskere mulighed for at stoppe undersøgelsen i en presserende situation ved at fryse dem i deres nuværende tilstand og derefter fortsætte uden tab, når forholdene tillader nye eksperimenter. For eksempel på grund af COVID-pandemien var forskere nødt til at stoppe eksperimenter med det samme og miste deres dyrebare materialer og data. Der er ingen nuværende løsning til at sikre et eksperiment, hvis der er en pludselig afbrydelse af undersøgelserne på grund af en ændring af omstændighederne.

Begrænsninger af teknikken
De teknikker, der er beskrevet her, er udviklet til at undersøge den spontane udvikling af organoider og sfæroider, en model til at forstå udviklingen af den normale menneskelige krop og sygdomme. Derfor kan den nuværende enhed og metoder ikke bruges til at udvikle sfæroider eller organoider af ensartet størrelse, der er blevet foretrukket til lægemiddelscreeningstest. En anden begrænsning er relateret til størrelsen af sfæroiderne og organoiderne. Fulde organoider og sfæroider kan være meget tætte, med flere cellelag, der kræver reagenser, der bevarer eller mærker prøverne for at trænge ind i deres kerne. Inkubationsperioder for alle protokoller, herunder farvning, mærkning og frysning, varierer imidlertid afhængigt af prøvens størrelse og mikromiljøgelen omkring prøven. For eksempel kræver større organoider og stivere geler mere længere inkubationsperioder for at muliggøre indtrængning i midten af prøven.

Fremtidige applikationer
Enheden og disse metoder tillader langsigtet undersøgelse af 3D-voksende organoider og sfæroider for at forstå organogenese, vævsmorfogenese og sygdomme, samtidig med at reproducerbarheden, pålideligheden og nøjagtigheden forbedres. De organoider eller sfæroider, der er mærket i MD'er, kan undersøges ved hjælp af højteknologiske mikroskopiteknologier, herunder multifotonlaserscanning og lysarkfluorescensmikroskopi. Derudover kan forskere undersøge den samme prøve i en enkelt enhed under både et konfokal og scanningselektronmikroskop for at lave en korrelativ undersøgelse, CLEM (Correlative light electron microscopy). Enheden og metoderne kan også bruges til biobankorganoider og sfæroider, samtidig med at 3D-arkitekturer beskyttes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ranan Gulhan Aktas ejer MD, S-IHC, S-IF og FS patentansøgninger. Olgu Enis Tok var involveret i udviklingen af disse produkter. Olgu Enis Tok og Gamze Demirel er F &U-teammedlemmer i virksomheden ved navn Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut og Ozgecan Kayalar har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Dale Mertes fra University of Chicago for udarbejdelsen af diagrammer, til Dr. Mehmet Serif Aydin for hans tekniske support ved Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies og til Dr. Rana Kazemi fra Maltepe University for redigering af manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol (EtOH) Merck 8187602500 Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
Acetone Merck 8222512500 Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)   Invitrogen I34406 Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody Biocare Medical CP 028 A Store at +4 °C
Anti-albumin antibody Abcam EPR20195 Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal Abcam 134435 Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5 Abcam 53121 Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody Biocare Medical ACI 3058 A, B Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C1016-500G Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) Abcam ab228554
Centrifuge tubes, 15 mL  Nest 601051
Centrifuge tubes, 50 mL  Nest 602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus Telstar EN12469
CO2 Incubator Panasonic KM-CC17RU2
Copper Grids Electron Microscopy Sciences G100-Cu Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture   Sigma Aldrich AEC101 Store at +4 °C
Diamond knife Diatome Ultra 45°, 40-US Use for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biology Biofroxx 67-68-5
Disposable Plastic Pasteur Pippettes Nest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 41966-029 Store at +4 °C
Eosin Y Solution Alcoholic Bright Slide 2.BS01-105-1000
Epon resin  Sigma 45359-1EA-F Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier Pan Biotech P30-3304 Store at +4 °C
Freezing Solution (FS) Cellorama CellO-F Store at +4 °C
Glass knife maker Leica EM KMR3 For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) Leica 7890-08 Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%  Electron Microscopy Sciences 16210 Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solution Sigma Aldrich 56-81-5 Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 Invitrogen A32933 Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35502 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84540 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35552 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84541 Store at +4 °C
Hematoxylin Harris  Bright Slide 2.BS01-104-1000
HepG2 cells ATCC HB-8065 Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 R&D Systems MAB2020 Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354248 Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354234 Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel ThermoFischer Scientific A1413201 Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
Hydrogel Biotechne, R&D Systems BME001-01 Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acid Sigma 11189-100G Store at RT
Lead aspartate solution Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrate Electron Microscopy Sciences 17900 Store at RT
Leica Confocal Microscope Leica DMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss
Microplate reader Biotek Synergy
Multipurpose Device (MD) Cellorama CellO-M
Nuclear-DNA stain Invitrogen H3569 Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stain ThermoFischer Scientific 62248 DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% Electron Microscopy Sciences 19190 Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibody R&D systems MAB2020 Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%  Sigma 1.04005.1000 Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets MP Biomedicals, LLC 2810305
Post-fixative solution %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%  Electron Microscopy Sciences 26603-01 Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS Zeiss Item no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL Nest 620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachment Zeiss GeminiSEM 500 We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack ScyTek Laboratories SHP125 Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 Electron Microscopy Sciences 11655 Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] GeneTex GTX22871 Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) Cellorama CellO-IF Store at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) Cellorama CellO-P Store at +4 °C
Specimen trimming device Leica EM TRIM2 For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coater Leica EM ACE200 Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH) Sigma 223220-5G Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Ultra gel super glue Pattex PSG2C For glue polymerized epon block with sample to holder epon block
Ultramicrotome Leica EM UC7 For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µL Nest 171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µL Isolab L-002
Universal Pipette Tips, 200 µL  Nest 110919HA01
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208 (2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578 (2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907 (2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), Elsevier. 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159 (2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149 (2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133 (2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614 (2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248 (2020).

Tags

Biologi udgave 190
Dyrkning, frysning, behandling og billeddannelse af hele organoider og sfæroider, mens de stadig er i en hydrogel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., … More

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., Akbulut, Z., Kayalar, O., Aktas, R. G. Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel. J. Vis. Exp. (190), e64563, doi:10.3791/64563 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter