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Biology

Kultivierung, Einfrieren, Verarbeitung und Bildgebung ganzer Organoide und Sphäroide noch in einem Hydrogel

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64563
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1, 3,5, 6, 2,3,4
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

Summary

Die vorliegende Studie beschreibt Methoden zum Kultivieren, Einfrieren, Auftauen, Verarbeiten, Färben, Markieren und Untersuchen ganzer Sphäroide und Organoide unter verschiedenen Mikroskopen, während sie in einem Hydrogel in einem Mehrzweckgerät intakt bleiben.

Abstract

Organoide und Sphäroide, dreidimensionale Wachstumsstrukturen in Zellkulturlaboren, werden zunehmend als überlegene Modelle im Vergleich zu zweidimensionalen Kulturmodellen anerkannt, da sie den menschlichen Körper besser nachahmen und Vorteile gegenüber Tierversuchen haben. Diese Studien haben jedoch häufig Probleme mit der Reproduzierbarkeit und Konsistenz. Während der langen experimentellen Prozesse - mit Transfers von Organoiden und Sphäroiden zwischen verschiedenen Zellkulturgefäßen, Pipettieren und Zentrifugieren - werden diese anfälligen und fragilen 3D-Wachstumsstrukturen oft beschädigt oder gehen verloren. Letztendlich werden die Ergebnisse erheblich beeinflusst, da die 3D-Strukturen nicht die gleichen Eigenschaften und Qualitäten beibehalten können. Die hier beschriebenen Methoden minimieren diese stressigen Schritte und gewährleisten eine sichere und konsistente Umgebung für Organoide und Sphäroide während des gesamten Verarbeitungsablaufs, während sie sich noch in einem Hydrogel in einem Mehrzweckgerät befinden. Die Forscher können die Struktur von Organoiden oder Sphäroiden unter verschiedenen High-Tech-Instrumenten, vom Konfokal- bis zum Elektronenmikroskop, mit einem einzigen Mehrzweckgerät züchten, einfrieren, auftauen, verarbeiten, färben, markieren und dann untersuchen. Diese Technologie verbessert die Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Gültigkeit der Studien und sorgt gleichzeitig für eine stabile und schützende Umgebung für die 3D-Wachstumsstrukturen während der Verarbeitung. Darüber hinaus minimiert die Eliminierung stressiger Schritte Handhabungsfehler, reduziert den Zeitaufwand und verringert das Kontaminationsrisiko.

Introduction

Die Zukunft der Zellforschung und -therapie liegt in 3D-Zellkulturen 1,2,3. Organoid- und Sphäroidmodelle schließen die Lücke zwischen In-vitro-Experimenten und Tiermodellen, indem sie bessere Modelle schaffen, die die Entwicklung, Physiologie und Krankheiten des menschlichen Körpers nachahmen 4,5,6,7,8,9. Die Reproduzierbarkeit und Wiederholbarkeit dieser Modelle bleibt jedoch eine Herausforderung. Darüber hinaus führt die Handhabung, Ernte, Übertragung und Zentrifugierung dieser Strukturen mit aktuellen Technologien unter vielen Bedingungen zu Verlust oder Beschädigung der Organoide und Sphäroide, was die Ergebnisse erheblich beeinflusst.

Trotz vieler Protokolle für histologische Färbung, immunhistochemische Färbung, Immunfluoreszenzmarkierung und Kryokonservierung gibt es keinen universellen Ansatz zur Standardisierung experimenteller Bedingungen, zur Handhabung und Verarbeitung dieser empfindlichen Strukturen, ohne sie zu verlieren oder zu beschädigen. Aktuelle Protokolle sind auch unglaublich lang, wechseln sich von wenigen Tagen bis zu mehreren Wochen ab und beinhalten komplexe Verfahren mit verschiedenen Reagenzien 10,11,12,13,14. Darüber hinaus verursachen das Ernten, Pipettieren, Zentrifugieren und Übertragen von 3D-Wachstumsstrukturen zwischen Zellkulturgefäßen und Kryozellen Veränderungen in der Positionierung der Strukturen und mechanischen Kräfte und beeinflussen letztendlich die Differenzierung und Reifung der Organoide und Sphäroide. Es wurde berichtet, dass die Gewebetopologie, die Positionierung der Zellen und mechanische Kräfte die Zelldifferenzierung und -reifung signifikant beeinflussen 6,15,16,17.

Daher ist es wünschenswert, die derzeitigen konventionellen Technologien zur Erzeugung von Organoiden und Sphäroiden mit stabiler Qualität zu verbessern. Eine Methode/Vorrichtung, die die Zentrifugation und andere oben beschriebene Schritte überspringt und das Material von Anfang bis Ende der verschiedenen Prozesse in einer einzigen sicheren Umgebung bereitstellt, wäre von Vorteil, um die konsistentesten und zuverlässigsten Daten zu erhalten. Darüber hinaus reduziert dies Zeit-, Arbeits- und Kostenbeschränkungen.

Das hier beschriebene Mehrzweckgerät (MD) bietet eine einzige sichere Umgebung für mehrere Prozesse von Organoiden und Sphäroiden (ergänzende Abbildung 1). Dieses Gerät und ergänzende Protokolle eliminieren die Schritte Ernten, Pipettieren, Übertragen und Zentrifugieren. Die Organoide und Sphäroide bleiben während der sequentiellen Prozesse in ihrer in vitro Umgebung. Diese Umgebung besteht hauptsächlich aus natürlichen oder synthetischen extrazellulären Matrixkomponenten, wie handelsübliche Hydrogele. Mit anderen Worten, die hier beschriebenen Methoden ermöglichen es, eine ganze Probe von Organoiden / Sphäroiden zu verarbeiten, zu untersuchen und einzufrieren, während sie sich noch in einem Hydrogeltropfen befindet.

Das biokompatible Gerät ist beständig gegen Temperaturen zwischen 60 °C und -160 °C, wodurch es möglich ist, die Organoide/Steroide in einem Flüssigstickstofftank bei -160 °C wiederherzustellen oder Harzblöcke für die Elektronenmikroskopie bei 60 °C vorzubereiten. Die Nische im Gerät wurde entwickelt, um einen begrenzten Raum für 3D-Wachstumsstrukturen zu definieren und die Bildung von Sphäroiden oder Organoiden basierend auf den vorherigen Studien 18,19,20,21,22,23 zu stimulieren. Dieser Teil des Geräts ist transparent und enthält einen spezifischen Kunststoff, der eine hohe optische Qualität bietet (Brechungsindex: 1,43; Abbe-Wert: 58; Dicke: 7,8 mil [0,0078 Zoll oder 198 μm]). Sowohl die Nische als auch der umgebende "Seitenteil" verursachen Autofluoreszenz. Die transparente Nische in der Mitte hat eine Fläche von 80 mm 2, während der Seitenteil 600 mm2 beträgt. Die Tiefe des Behälters beträgt 15 mm und die Dicke 1,5 mm. Diese Merkmale sowie die Größe und das Design des Geräts ermöglichen es, Beobachtungen unter verschiedenen Arten von High-Tech-Mikroskopen durchzuführen und die Proben für elektronenmikroskopische Untersuchungen vorzubereiten (Abbildung 2). Das Schließsystem des Geräts bietet zwei Positionen, eine im Gefrierschrank und die andere für den Gasfluss im Inkubator. CCK8-Proliferations- und Zytotoxizitätstests zeigen ähnliche Wirkungen auf Zellen im Vergleich zu den traditionellen Zellkulturschalen (ergänzende Abbildung 2). Der Trypanblau-Exschlusstest zeigt eine hohe Zelllebensfähigkeit (94%) während der Zellkultur in der MD (Abbildung 3).

Die Prozesse, die für eine Probe in der einzelnen Vorrichtung durchgeführt werden können, umfassen (1) Kultivierung, (2) histologische Färbung, (3) Immunfärbung, einschließlich immunhistochemischer und Immunfluoreszenzmarkierung, (4) Einfrieren, (5) Auftauen, (6) Untersuchung unter optischen Mikroskopen wie Hellfeld-, Dunkelfeld-, Fluoreszenz-, Konfokal- und hochauflösenden Mikroskopen, (7) Beschichtung und Untersuchung direkt unter einem Rasterelektronenmikroskop oder (8) Vorbereitung auf die Transmissionselektronenmikroskopie ( Abbildung 2).

Es gibt verschiedene Methoden für histologische Färbung, immunhistochemische Markierung oder fluoreszierende Markierung von Organoiden und Sphäroiden 10,11,12,13,14,24,25. Die Ernte aus dem Hydrogel ist der erste und wichtigste Schritt der aktuellen Technologie. Nach diesem Schritt ermöglichen einige Methoden eine Whole-Mount-Immunmarkierung. Die geernteten Organoide werden in Paraffin eingebettet, geschnitten und für die Färbung und Immunfärbung in anderen markiert. Die Abschnitte stellen jedoch möglicherweise nicht die gesamte Stichprobe dar und liefern nur begrenzte Daten zur 3D-Architektur der Struktur. Darüber hinaus sind Schäden an diesen 3D-Strukturen und der Verlust der Antigenität bekannte Nebenwirkungen dieser Technologien.

Die ergänzenden neuen Protokolle für mikroskopische Untersuchungen in diesem Artikel ermöglichen eine Analyse ganzer Proben, die sich noch in einem Hydrogel befinden. Die hier beschriebenen Protokolle umfassen zwei neu entwickelte Formulierungen: Lösung für Immunhistochemie (S-IHC) und Lösung für Immunfluoreszenzmarkierung (S-IF). Die Methoden mit diesen Lösungen ermöglichen es den Forschern, genauere Daten zu gewinnen, da traditionelle Arbeitsabläufe wie Zentrifugieren, Pipettieren und Übertragen der empfindlichen Strukturen keine schädlichen Auswirkungen haben. Das hier beschriebene Protokoll eliminiert auch die Notwendigkeit von Ernte-, Blockierungs-, Clearing- und Antigen-Retrieval-Schritten und verkürzt den gesamten Vorgang auf 6-8 h. Darüber hinaus ermöglicht die Methodik die gleichzeitige Zugabe von ein bis drei Antikörpern zu demselben S-IF. Daher ist es möglich, die Ergebnisse auch nach den mehrfachen Markierungsexperimenten noch am selben Tag zu erhalten, was ein weiterer Vorteil des hier beschriebenen Protokolls ist; Herkömmliche Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Markierungsprotokolle dauern typischerweise zwischen 3 Tagen und mehreren Wochen 10,11,12,13,14.

Paraffineinbettung, ein weiterer schädlicher Schritt, der die Antigenität reduziert, wird ebenfalls weggelassen. Die 3D-Struktur bleibt von Anfang bis Ende der mikroskopischen Untersuchung in ihrer In-vitro-Umgebung . Da die 3D-Struktur in ihren Wachstumsbedingungen bleibt, ahmen die Proteinexpressions- und Lokalisierungsdaten die In-vivo-Bedingungen besser nach. Es werden genauere Ergebnisse erwartet, da die Methodik die Schritte eliminiert, die die Antigenexpression der Probe beeinflussen. Tabelle 1 und Tabelle 2 zeigen, wie diese neuen Protokolle Schritte eliminieren, Zeit und Arbeit im Labor sparen und Kosten und Abfallprodukte im Vergleich zu herkömmlichen Arbeitsabläufen reduzieren.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen entscheidenden Schritten besteht ein weiteres Problem darin, ein Kryokonservierungsmedium und eine Methode zur Erhaltung der 3D-Struktur der Probe mit höheren Zelllebensfähigkeitsratenbereitzustellen 26,27,28,29,30,31. Kryokonservierung ist unerlässlich, um ein stabiles Modellsystem zu schaffen und das Biobanking von Organoiden und Sphäroiden zu ermöglichen32,33. Biobanking der gesamten ursprünglichen 3D-Struktur ermöglicht eine getreuere Rekapitulation des natürlichen Gesundheits- oder Krankheitszustands. Die wichtigsten Überlegungen sind die Bequemlichkeit und Zuverlässigkeit der Kryokonservierung und das Auftauen von Organoiden / Sphäroide. Die Organoidrückgewinnung nach dem Auftauen ist in den meisten aktuellen Technologien sehr gering, oft weniger als 50%. Neuere Studien haben jedoch vielversprechende Ergebnisse mit verbesserten Überlebensratengezeigt 26,27,28,29. Lee et al. zeigten, dass 78% der Sphäroidzellen nach der Kryokonservierung überlebten, wenn sie die Lösung der University of Wisconsin verwendeten, die 15% DMSO28 enthielt. Die Zellüberlebensrate stieg in der Studie von Arai et al.29 auf 83%. Die Ergebnisse nach der Kryokonservierung werden jedoch erheblich beeinflusst, da die 3D-Strukturen nicht die gleichen Eigenschaften und Qualitäten beibehalten können. Darüber hinaus sind serumfreie Reagenzien für die gute Herstellungspraxis in pharmazeutischen und diagnostischen Umgebungen erforderlich. Traditionelle Arbeitsabläufe verwenden ein Medium, das fetales Rinderserum (FBS) und Dimethylsulfoxid (DMSO) für die langsame Gefriermethode enthält, die beide mit Behinderungen verbunden sind. FBS ist ein tierisches Produkt und kann Chargenvariationen aufweisen. DMSO ist ein sehr erfolgreiches Kryoprotektivum, aber eine langfristige Exposition, insbesondere während des Auftauens, kann zytotoxische Wirkungen verursachen30,31.

Dieser Artikel beschreibt auch die Gefrier-/Auftaumethode ganzer Organoide oder Sphäroide noch in einem Hydrogel. In der Studie werden zwei Formeln zum Einfrieren von Organoiden und Sphäroiden verwendet: (1) 10% DMSO mit herkömmlicher Gefrierlösung (FS) und (2) ein serum- und DMSO-freies Kryokonservierungsmedium. Dieses Kryokonservierungsmedium enthält extrazelluläre Matrixkomponenten, die sich von aktuellen Formeln unterscheiden. Die extrazelluläre Matrix umfasst zwei Hauptklassen von Makromolekülen, Proteoglykanen und faserigen Proteinen, die für das physikalische Gerüst der zellulären Bestandteile unerlässlich sind, aber auch Prozesse initiieren, die für die Morphogenese, Differenzierung und Homöostase des Gewebes erforderlich sind 34,35,36,37,38,39,40 . Kollagene sorgen für Zugfestigkeit, regulieren die Zelladhäsion, unterstützen Chemotaxis und Migration und steuern die Gewebeentwicklung37. Darüber hinaus bieten Elastinfasern Rückstoß für Gewebe, die wiederholt gedehnt werden38. Ein drittes faseriges Protein, Fibronektin, steuert die Organisation der interstitiellen extrazellulären Matrix und spielt eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der Zellbindung und fungiert als extrazellulärer Mechanoregulator39. Du et al. haben die kryoprotektive Wirkung von Hühnerkollagenhydrolysat auf das natürliche Actomyosin-Modellsystem41 nachgewiesen. Ihre Ergebnisse deuten darauf hin, dass Kollagenhydrolysat das Wachstum von Eiskristallen hemmen, die Proteingefrierdenaturierung und -oxidation ähnlich wie kommerzielle Kryoprotektiva reduzieren und nach Gefrier-Tau-Zyklen eine bessere Gelstruktur bieten kann. Daher bietet die Zugabe extrazellulärer Matrixkomponenten zu den Kryokonservierungsmedien eine sicherere und schützendere Umgebung für die Probe und unterstützt die Heilung der lebenden Strukturen nach dem Einfrieren und Auftauen.

Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Studie ein einfaches Protokoll zur Markierung von zytoplasmatischen Membranen und Kernen lebender Organoide und Sphäroide, während sie sich noch im Hydrogel befinden.

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Protocol

1. Kultivierung von Organoiden und Sphäroiden

  1. Legen Sie das Hydrogel über Nacht auf Eis (in einem Kühlschrank oder einem Kühlraum), um aufzutauen.
  2. Das handelsübliche Mehrzweckgerät (MD; siehe Materialtabelle) 1 Tag vor dem Versuch (37 °C, 5% CO2) zum Erwärmen in den Inkubator stellen.
  3. Sterile Pipettenspitzen mit breitem Ende bei 4 °C in den Kühlschrank stellen.
    HINWEIS: Die Schritte 1.1-1.3 sind an Tag 0 und die Schritte 1.4-1.11 an Tag 1 durchzuführen.
  4. Legen Sie das Hydrogel für 15 min in eine Laminar-Flow-Haube.
    1. Optional: Verdünnen Sie das Hydrogel in kaltem Zellkulturmedium gemäß der Empfehlung des Herstellers.
  5. Legen Sie das Röhrchen mit einem Pellet von HepG2-Zellen (kommerziell gewonnene hepatozelluläre Karzinom-Zelllinie; siehe Materialtabelle) auf Eis.
  6. Platte 30-35 μL 100% Hydrogel in der Nische des vorgewärmten Geräts, um einen Geltropfen zu erzeugen.
  7. Platzieren Sie 10.000 HepG2-Zellen in der Mitte der Oberseite jedes Hydrogeltropfens (Abbildung 2) und inkubieren Sie 15 Minuten bei 37 °C.
  8. Bedecken Sie den Hydrogeltropfen mit 200 μL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% Fetal Bovine Serum.
  9. Decken Sie den Deckel des MD in der richtigen Position ab, um den Gasfluss zu ermöglichen, und legen Sie das Gerät in den Inkubator.
  10. Füttern Sie die Zellen jeden zweiten Tag mit 200 μL DMEM mit 10% FBS.
  11. Überprüfen Sie das Wachstum der Sphäroide unter einem inversen Mikroskop (Abbildung 3). Die Sphäroidbildung beginnt nach dem 3. Tag. Video 1 zeigt die Position von Sphäroiden auf verschiedenen Ebenen in einer Hydrogelkuppel.
    ANMERKUNGEN: Es wird dringend empfohlen, die Flüssigkeit, die das Hydrogel umgibt, vorsichtig abzusaugen und die neue Flüssigkeit langsam in die Umgebung einzubringen, um eine Beschädigung der Hydrogeltropfen zu vermeiden.

2. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung ganzer Organoide/Sphäroide in einem Hydrogel

  1. Erwärmen Sie das Fixiermittel (4% Paraformaldehyd; PFA), PBS und Hämatoxylin (siehe Materialtabelle) bis 37 °C.
  2. Das Medium, das den Hydrogeltropfen umgibt, mit einer Pipette absaugen, 100-200 μL 4% PFA zur Fixierung hinzufügen und 15-20 min bei 37 °C inkubieren.
  3. Die 4% PFA einsaugen und 200 μL PBS hinzufügen, um sie 3x für je 5 min bei 37 °C zu waschen. Dann saugen Sie das PBS ab und inkubieren Sie mit 200 μL Hämatoxylinlösung für 15-20 min bei 37 °C.
  4. Das Hämatoxylin wird abgesaugt und 200 μLdH2Ozugegeben, um 3x jeweils 10 min bei 37 °C zu waschen. DasdH2Oeinsaugen und mit 200 μL Ethanol 5-10 min bei 37 °C inkubieren.
  5. Das Ethanol einsaugen und mit 200 μL Eosin (siehe Materialtabelle) 10 min bei 37 °C inkubieren. Das Eosin absaugen und 200 μLdH2Ohinzufügen, um es 5 min bei Raumtemperatur (RT) zu waschen.
  6. DasdH2Oeinsaugen und 100 μL Glycerin zugeben, um den Hydrogeltropfen als Trägermedium abzudecken.
  7. Optional: Montieren Sie die Nische mit einem Deckglas. Dieser Schritt kann entfallen, um ein Zusammendrücken von Organoiden/Sphäroiden beträchtlicher Größe zu vermeiden.
  8. Schließen Sie den Deckel von MD fest, um ein Austrocknen bis zur Untersuchung zu vermeiden. Die Probe ist für die Untersuchung für mindestens 6 Monate stabil.

3. Immunhistochemie von Organoiden/Sphäroiden in einem Hydrogel

  1. Die kommerziell gewonnene Lösung für die Immunhistochemie (S-IHC; siehe Materialtabelle) wird auf 37 °C erwärmt.
  2. Die Organoide oder Sphäroide im Hydrogel mit 3%igem Wasserstoffperoxid (H2O2) in 200 μLdH2O für 5 min bei 37 °C inkubieren.
  3. Die Wasserstoffperoxidlösung wird abgesaugt und 5 min bei 37 °C indH2Ogewaschen. DasdH2Oeinsaugen und zweimal mit 100 μL S-IHC bei 37 °C für jeweils 10 min inkubieren.
  4. S-IHC einsaugen und mit 100 μL primärem Antikörper (siehe Materialtabelle) verdünnt in S-IHC für 1-2 h bei 37 °C inkubieren (gemäß den Empfehlungen des Herstellers zur Arbeitsverdünnung).
  5. Die primäre Antikörperlösung wird abgesaugt und mit 100 μL S-IHC 3x für je 5 min bei 37 °C inkubiert.
  6. 100 μL S-IHC aspirieren und mit einem biotinylierten sekundären Antikörper (siehe Materialtabelle) 10 min bei 37 °C inkubieren.
  7. Die sekundäre Antikörperlösung wird abgesaugt und mit 100 μL S-IHC 3x für je 5 min bei 37 °C inkubiert. Das S-IHC absaugen und mit 100 μL Meerrettichperoxidase (HRP) markiertem Streptavidin (siehe Materialtabelle) 10 min bei 37 °C inkubieren.
  8. Das HRP-markierte Streptavidin einsaugen und mit 100 μL S-IHC 3x für jeweils 5 min bei 37 °C inkubieren.
  9. Das S-IHC absaugen und mit 100 μL DAB/AEC-Chromogenlösungsgemisch (siehe Materialtabelle) 5-10 min bei 37 °C inkubieren.
  10. Überwachen Sie die Intensität der Färbung unter einem Lichtmikroskop.
  11. Mit dH 2 O 3x jeweils2min waschen.
  12. Optional: Inkubieren mit 100 μL Hämatoxylin (siehe Materialtabelle) für die nukleare Gegenfärbung für 5 min bei 37 °C.
  13. Das Hämatoxylin absaugen und indH2O 5 min waschen.
  14. DasdH2Oeinsaugen und den Hydrogeltropfen mit 100 μL Glycerin als Befestigungsmedium abdecken.
  15. Schließen Sie den Deckel des MD fest bis zur mikroskopischen Untersuchung.
    ANMERKUNGEN: Antigen-Retrieval- und Proteinblockierungsschritte werden in diesem Protokoll weggelassen, da S-IHC diese Schritte eliminiert.

4. Immunfluoreszenzmarkierung von Organoiden/Sphäroiden in einem Hydrogel

  1. Folgende Materialien werden auf 37 °C aufgewärmt: 4% PFA, PBS, S-IF, primäre Antikörperlösung in S-IF, sekundäre Antikörperlösung in S-IF, Kernfärbung und Glycerin (siehe Materialtabelle).
  2. Das Zellkulturmedium einsaugen und mit 200 μL 4% PFA für 15-30 min bei 37 °C fixieren. Das Fixiermittel einsaugen und in S-IF 3x für je 10 min bei 37 °C waschen.
  3. Fügen Sie dH2O an der Seite hinzu, die die Nische umgibt, um während der folgenden Schritte Feuchtigkeit zu erzeugen.
  4. Das S-IF, das den Hydrogeltropfen umgibt, wird abgesaugt und der Hydrogeltropfen mit 100 μL primärer Antikörperlösung (siehe Materialtabelle) in S-IF für 30-60 min bei 37 °C inkubiert.
  5. Die primäre Antikörperlösung einsaugen und in S-IF 3x jeweils 10 min bei 37 °C waschen.
  6. Das S-IF einsaugen und mit 100 μL sekundärer Antikörperlösung (siehe Materialtabelle) in S-IF für 30-60 min bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
  7. Die sekundäre Antikörperlösung einsaugen und mit PBS 3x jeweils 10 min bei 37 °C im Dunkeln waschen.
  8. Das PBS einsaugen und mit 100 μL nuklearer DNA-Färbung mit Montagemedium oder Glycerin bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
  9. Füllen Sie die Nische mit Glycerin, um ein Austrocknen zu vermeiden.
  10. Optional: Decken Sie die Nische mit einem Deckglas ab. Dieser Schritt kann weggelassen werden, um ein Zusammendrücken der Organoide/Sphäroide zu vermeiden.
  11. Schließen Sie den MD fest. Proben in MDs können bei 4 °C im Dunkeln für mindestens 6 Monate mit minimalem Fluoreszenzverlust gelagert werden.
  12. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für die konfokalmikroskopische Untersuchung: Stellen Sie den Lochwert aller Kanäle auf 20,1 ein, halten Sie die Verstärkungsmasterkonstante bei 550 für 488 nm, 485 für 550 nm und 450 für 594 nm, halten Sie die Laserleistung für alle Experimente konstant und den niedrigsten Prozentsatz bei 2,0.
    ANMERKUNGEN: Primäre Antikörper: Anti-Na-K ATPase (1:100), Anti-Arginase (1:50), Anti-Albumin (1:50), Anti-Beta-Galactosidase (1:25), Antimitochondrialer Antikörper (1:100), Anti-Golgi-Antikörper (1:50), Anti-Cytokeratin 5 (1:100), Ov6-Antikörper (1:100). Sekundäre Antikörper: Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)- 488, Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L)-550, Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)-488, Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)-550, Ziegen-Anti-Hühner-IgY(H+L)-647. Die Verdünnung für alle sekundären Antikörper beträgt 1:100. Zusätzlich wird FITC-Phalloidin (1:100), ein konjugierter Antikörper, verwendet (siehe Materialtabelle).

5. Plasmamembran- und Kernmarkierung lebender Organoide und Sphäroide in einem Hydrogel

  1. Etikettierlösung mit Alexa Fluorweizenkeimagglutinin (5,0 μg/ml) und Hoechst (2 μM) in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) gemäß den Empfehlungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) herstellen und auf 37 °C erwärmen.
  2. Das Zellkulturmedium absaugen und 100 μL Markierungslösung hinzufügen, um den Hydrogeltropfen abzudecken. 15-30 min bei 37 °C inkubieren.
  3. Entfernen Sie die Etikettierlösung und waschen Sie sie zweimal in PBS 2x für je 10 min bei 37 °C. Optional: Mit 200 μL 4% Formaldehyd für 15 min bei 37 °C fixieren.
  4. Decken Sie den Hydrogeltropfen mit Glycerin als Montagemedium ab. Optional: Montieren Sie die Nische mit einem Deckglas.
  5. Schließen Sie den Deckel des MD fest und bewahren Sie ihn im Dunkeln bis zur fluoreszenz- / konfokalmikroskopischen Untersuchung im Kühlschrank auf. Es ist für mindestens 6 Monate stabil.

6. Einfrieren und Auftauen ganzer Organoide/Sphäroide in einem Hydrogel

  1. Frieren Sie die Organoide ein, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Die handelsüblich gewonnene Gefrierlösung (FS; siehe Materialtabelle) wird auf 37 °C erwärmt.
    2. Saugen Sie die Zellkulturmedien, die die Hydrogelkuppel umgeben, vorsichtig ab.
    3. Fügen Sie 200 μL FS vorsichtig hinzu. Die Probe mit FS bei 37 °C für 1 h inkubieren.
    4. Schließen Sie den Deckel des Geräts fest und legen Sie ihn in eine Schaumstoffbox. Legen Sie diese Schaumstoffbox in eine andere Schaumstoffverpackung, wie in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt. Schließen Sie beide Schaumstoffkästen fest. Zwei ineinander liegende Schaumstoffkästen bieten einen Temperaturkühlgradientenbereich von 1 bis 2°C/min der Probe in einem -20 °C Gefrierschrank.
    5. Stellen Sie die Box bei -20 °C für 2 h. Die Box in einen -80 °C Gefrierschrank geben und über Nacht stehen lassen.
    6. Nehmen Sie die Probe aus den Kartons. Die Probe im MD kann 6 Monate im -80 °C Gefrierschrank aufbewahrt werden.
    7. Die MD, die die Probe enthält, wird zur längerfristigen Lagerung in den Flüssigstickstofftank überführt.
  2. Tauen Sie die Organoide auf, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Nehmen Sie den MD mit der Probe aus dem Gefrier-/Stickstofftank und legen Sie ihn direkt in einen Inkubator bei 37 °C. 1 h bei 37 °C inkubieren.
    2. 200 μL warmes Kulturmedium in die Nische geben (das Verhältnis von FS zu Zellkulturmedium beträgt 1:1) und 30 min bei 37 °C inkubieren.
    3. Mehr warmes Kulturmedium in die Nische geben (das Verhältnis von FS zu Zellkulturmedium ist 1:2) und 30 min bei 37 °C inkubieren.
    4. Das Medium und die FS-Mischung vorsichtig absaugen. Fahren Sie mit der Rasterelektronenmikroskopie (Schritt 7) und der Transmissionselektronenmikroskopie (Schritt 8) fort, um die gesamten Organoide / Sphäroide im Hydrogel abzubilden.

7. Rasterelektronenmikroskopie von ganzmontierten Organoiden/Sphäroiden

  1. Erwärmen Sie Karnovskys fixierende und postfixative Lösung (siehe Materialtabelle) auf Raumtemperatur (RT).
  2. Asspirieren Sie das Zellkulturmedium, das das Hydrogel in der MD umgibt. Legen Sie die Probe für 15 min in den MD auf Eis in der Laminar-Flow-Haube.
  3. Das verflüssigte Hydrogel, das die Organoide/Sphäroide umgibt, sehr vorsichtig absaugen. Eine begrenzte Menge Matrigel kann in der Nische bleiben, um eine Beschädigung und den Verlust der Probe zu vermeiden.
  4. Fixieren Sie mit Karnovskys Fixiermittel (2% PFA, 2,5% Glutaraldehyd in 0,15 M Cacodylatpuffer und 2 mM CaCl2; siehe Materialtabelle) bei RT für 1 h.
  5. Das Fixiermittel vorsichtig absaugen und mit destilliertem Wasser (dH2O) 3x für jeweils 15 min waschen.
  6. DasdH2Owird vorsichtig abgesaugt und mit einer postfixativen Lösung (1% wässriges Osmiumtetroxid [OsO4]; siehe Materialtabelle) bei RT für 1 h fixiert.
  7. Das Nachfixiermittel vorsichtig absaugen und mit destilliertem Wasser (dH2O) 3x jeweils 15 min waschen.
  8. Dehydrieren Sie in einer abgestuften Reihe von Ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), Mischung aus Ethanol / Aceton (1: 1; 1: 2) und absolutem Aceton bei RT für jeweils 15 min.
  9. Mit einem kritischen Punkttrockner trocknen.
  10. Beschichten Sie die Probe im Gerät mit 6 nm Gold/Palladium mit einem Sputtercoater (siehe Materialtabelle) für 90 s.
  11. Beobachten Sie unter einem Rasterelektronenmikroskop mit einem Sekundärelektronendetektor in der Linse bei 2-3 kV im Vakuummodus (5 x 10-6 mA). Nehmen Sie Bilder mit einem Arbeitsabstand von 8,1-8,2 mm und mit 675-facher, 1050-facher und 1570-facher Vergrößerung auf.
    HINWEISE: Alle Schritte werden in der MD ausgeführt. Verwenden Sie 200-250 μL Lösung für jeden Schritt.

8. Transmissionselektronenmikroskopie von ganzmontierten Organoiden/Sphäroiden in einem Hydrogel

  1. Karnovskys Fixiermittel auf 37 °C aufwärmen. Asspirieren Sie das Zellkulturmedium, das das Hydrogel in der MD umgibt.
  2. Fixieren Sie die Probe mit Karnovskys Fixiermittel bei RT für 1 h. Mit dH2O 3x jeweils 15 min waschen.
  3. Post-fix mit 2% wässrigemOsO4 und 2,5% Kaliumferrocyanid bei RT für 45 min. Mit dH2O 3x jeweils 10 min waschen.
  4. Inkubieren in 0,5% Thiocarbohydrazid (TCH; siehe Materialtabelle) bei RT für 30 min. Mit dH2O 3x jeweils 10 min waschen.
  5. Inkubation in 2% wässrigemOsO4 bei RT für 30 min. Mit dH2O 3x jeweils 10 min waschen.
  6. In 2%iger Uranylacetatlösung (siehe Materialtabelle) bei RT für 1 h inkubieren.
    HINWEIS: In diesem Schritt können Sphäroide über Nacht bei 4 °C gehalten werden.
  7. In Bleiaspartatlösung (siehe Materialtabelle) bei 60 °C für 45 min inkubieren. Mit dH2O 3x jeweils 10 min waschen.
  8. Dehydrieren Sie in einer abgestuften Reihe von Ethanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) und absolutem Aceton bei RT für jeweils 15 min.
  9. Mit einer Mischung aus (1:1; 1:2) Aceton/Eponharz und reinem Eponharz (siehe Materialtabelle) bei RT jeweils 2 h behandeln.
  10. Polymerisieren Sie das Harz bei 60 °C über Nacht (mindestens 16 h). Entfernen Sie nach der Polymerisation den Harzblock aus dem MD, wie in ergänzender Abbildung 4 dargestellt.
  11. Befestigen Sie den Harzblock mit einem Harzkleber an einem größeren. Schneiden Sie den Block und erreichen Sie die Position von Organoiden oder Sphäroide.
  12. Erhalten Sie halbdünne (1.000 nm) und ultradünne Schnitte (60 nm) mit einem Ultramikrotom (siehe Materialtabelle).
  13. Legen Sie die ultradünnen Schnitte auf 100 Mesh-Kupfergitter und beobachten Sie unter einem Rasterelektronenmikroskop mit einem STEM-Detektor bei einer Beschleunigungsspannung von 30 kV. Nehmen Sie Bilder mit einem Arbeitsabstand von 44 mm und einer Vergrößerung von 2580x, 5020x und 6060x auf.
    ANMERKUNGEN: Verwenden Sie 200-250 μL Lösung für jeden Schritt. Die Schritte 8.1-8.10 werden in der MD ausgeführt.

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Representative Results

Der vorliegende Artikel stellt ein Mehrzweckgerät (MD) dar und ergänzt Methoden zum Kultivieren, Einfrieren, Auftauen, histologischen Färben, immunhistochemischen Färben, Immunfluoreszenzmarkierung, Beschichten und Verarbeiten ganzer Organoide oder Sphäroide, während sie sich noch in einem Hydrogel in einer einzigen, einzigartig gestalteten Umgebung befinden. Die aktuelle Studie wurde entwickelt, um HepG2-Leberkrebs-Sphäroide in 35 Hydrogel-Tropfen in 35 MDs herzustellen. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, um die Genauigkeit zu gewährleisten. Zusätzlich wurden Lungenorganoide in MDs als Beispiel immunfluoreszierend markiert, um die Ergebnisse der aktuellen Methoden für Organoidstudien zu demonstrieren.

Abbildung 1 zeigt einen genauen Blick auf das Gerät, das eine Hydrogelkuppel enthält. Die Größe und Form der Nische ist so konzipiert, dass sie eine schützende Umgebung für das Hydrogel mit den Organoiden / Sphäroiden bietet und die Reagenzien speichert, die bei verschiedenen Prozessen verwendet werden. Darüber hinaus kann der seitliche Teil des Geräts, der die Nische umgibt, während Immunfärbungsexperimenten als Feuchtigkeitskammer verwendet werden. Das Medium zur Zuführung der Probe kann je nach Höhe des Hydrogeltropfens zwischen 100-200 μL variieren. Die aktuelle Studie konzentriert sich auf die kuppelbasierte Methode, da viele Hydrogele, kommerzielle extrazelluläre Matrixkomponenten und Basalmembranextrakte es dem Benutzer ermöglichen, Tropfen herzustellen. Es ist jedoch auch möglich, die Nische des MD mit dem Hydrogel zu füllen und dann die Zellen darin zu säen, um Organoide / Sphäroide zu erzeugen. Dieses Verfahren könnte bevorzugt werden, wenn die Viskosität der Matrix die Herstellung von Kuppeln nicht zulässt oder wenn das Experiment große Mengen von Organoiden enthält. Der Hydrogeltyp und das Hydrogel/Medium-Verhältnis für die Herstellung von Tropfen können je nach Zelltyp, Versuchsdesign und Medium variieren. Abbildung 1  stellt auch das Design des Geräts dar, das es ermöglicht, die Organoide / Sphäroide unter Hellfeld-, Konfokal- und Rasterelektronenmikroskopen zu untersuchen, während sich Organoide / Sphäroide noch in ihrer nativen In-vitro-Umgebung befinden.

Abbildung 2 zeigt, wie man Zellen in einem Hydrogel sät und die Entwicklung von Sphäroiden oder Organoiden untersucht. Das Design und die Abmessungen des Mehrzweckgeräts wurden ebenfalls in dieser Abbildung dargestellt. Video 1 zeigt die Position von 3D-wachsenden Sphäroiden in einem Hydrogel. Abbildung 3 zeigt Live-Bilder wachsender Sphäroide von Tag 3 bis Tag 21. Die Zeit für die Bildung von Sphäroiden und Organoiden kann je nach Art der Probe variieren. Zum Beispiel bildeten sich Sphäroide aus HepG2-Zellen und HEK-Zellen innerhalb von 3 Tagen, während die Bildung von Leber- und Gallenorganoiden während der Experimente 2 Wochen dauerte.

Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Sphäroide sind in Abbildung 4 zu sehen. Das Bild zeigt gut erhaltene und homogen gefärbte Sphäroide in verschiedenen Größen und Fusionen von Sphäroide. Lebende Zellen im Zentrum der Sphäroide sind bemerkenswert. Das Bild zeigt auch die empfindlichen Verbindungen zwischen den Zellen verschiedener Sphäroide. Diese zerbrechlichen Verbindungen konnten nach herkömmlichen Arbeitsabläufen nicht visualisiert werden, da das Übertragen, Pipettieren oder Zentrifugieren sie beschädigen würde. Abbildung 5  zeigt die Immunfärbung von Sphäroiden mit dem für Arginase spezifischen Antikörper, einem der häufigsten Marker für die Diagnose und Prognose des hepatozellulären Karzinoms42,43. Die Mikroskopaufnahmen zeigen differenzierte und undifferenzierte Leberkrebszellen in denselben Sphäroide. Diese Abbildung enthält Bilder mit und ohne Gegenfärbung mit Hämatoxylin. Forscher könnten sich dafür entscheiden, die Gegenfärbung mit Hämatoxylin in Fällen zu vermeiden, in denen es schwierig wäre, markierte Bereiche in einer 3D-Struktur zu unterscheiden.

Abbildung 6 stellt ein weiteres einfaches Protokoll für die Visualisierung lebender Organoide/Sphäroide in einem Hydrogel dar: lebende Zellmembran- und Kernfärbung. Die Methodik ermöglicht die gleiche Markierungsdichte in der Peripherie und im Zentrum und zeigt eine vollständige Reagenzpenetration. Abbildung 7, Abbildung 8 und Abbildung 9 zeigen repräsentative Bilder von Sphäroide, die mit einem, zwei bzw. drei Antikörpern markiert sind. Ein bis drei primäre Antikörper werden gleichzeitig in S-IF verdünnt. Ebenso werden ein bis drei passende sekundäre Antikörper, die für das Experiment geeignet sind, gleichzeitig in S-IF verdünnt. Das Immunmarkierungsprotokoll ermöglicht es den Forschern, die 3D-Strukturen innerhalb von 4-6 h zu markieren, ohne sie zu verlieren oder zu beschädigen. Der Hintergrund ist transparent und die hier verwendete Technologie erfordert keine zusätzlichen Clearing-, Antigen-Retrieval- oder Blockierungsmethoden/-lösungen. Die Methode ermöglicht es den Forschern auch, die Probe in einem einzigen Schritt mit mehreren Antikörpern zu markieren. Mit anderen Worten, der Benutzer bereitet eine Lösung mit einem bis drei primären Antikörpern und eine andere Lösung mit einem bis drei sekundären Antikörpern vor. Das hier beschriebene Protokoll eliminiert sequenzielle Markierungsschritte mit unterschiedlichen Antikörpern in herkömmlichen Methoden.

Abbildung 10 zeigt raster- und transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen der Sphäroide. Die erste Reihe zeigt Bilder ganzer Sphäroide im MD unter einem Rasterelektronenmikroskop. Die zweite Reihe enthält transmissionselektronenmikroskopische Bilder von Sphäroiden nach Herstellung der Harzblöcke, die ganze Sphäroide im MD enthalten, sowie Bilder von geschnittenen und gefärbten Sphäroide. Gut erhaltene zytoplasmatische Organellen und andere ultrastrukturelle Merkmale der Zellen zeigen die Wirksamkeit dieses einfachen Protokolls, das die 3D-Struktur der gesamten Probe schützt. Der MD ermöglicht es den Forschern auch, die gesamten Proben in einem Hydrogel einzufrieren und aufzutauen. Abbildung 11  zeigt Hydrogelkuppeln und die Sphäroide bei einer höheren Vergrößerung vor und nach dem Einfrieren. Die Unregelmäßigkeit an den Grenzen der Hydrogelkuppel ist bemerkenswert. Die Rundheit der kryokonservierten Sphäroide ist jedoch nach dem Auftauen im Vergleich zu den Sphäroiden vor dem Einfrieren nahezu stabil. Lebende Zellmembran- und Zellkernmarkierungsmethoden werden ebenfalls 48 Stunden nach dem Auftauen angewendet, um zu zeigen, wie sich das Gefrier-/Auftauverfahren auf die 3D-Architektur, die Zellmembran und die Zelllebensfähigkeit auswirkt. Die traditionelle Gefrierlösung, die Dimethylsulfoxid enthält, und die aktuelle neu formulierte Lösung, SF, zeigen ähnliche Ergebnisse. Mehr als 75% der 3D-Strukturen könnten in diesem Protokoll überleben. Es sind jedoch weitere Experimente erforderlich, um die langfristigen Nebenwirkungen jeder Formulierung auf Organoide und Sphäroide aufzudecken.

Tabelle 1 und Tabelle 2 vergleichen die traditionellen Arbeitsabläufe mit den hier beschriebenen basierend auf Schrittnummer, Dauer und Abfallproduktion (d. h. die Gesamtzahl der Kunststoffhandschuhe, Pipettenspitzen, serologischen Pipetten, Zentrifugenröhrchen, Mikrozentrifugenröhrchen, Zellkulturgefäße, Kryogeräte usw. für jeden Workflow).

Ergänzende Abbildung 1 stellt sequenzielle Schritte dar, die schematisch in einem einzelnen MD ausgeführt werden können. Die ergänzende Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der Experimente zum Vergleich der Zelllebensfähigkeit, Toxizität und Proliferationsraten von HepG2-Zellen in einer MD- oder einer herkömmlichen Glasbodenschale. Ergänzende Abbildung 3 zeigt die Schaumstoffkästen, die zum Einfrieren der Proben in MDs verwendet wurden. Ergänzende Abbildung 4 fasst die Schritte zum Herausnehmen eines Harzblocks aus einem MD zusammen. Ergänzende Abbildung 5 enthält Bilder von Atemwegsorganoiden, die immunfluoreszierend markiert und dann visualisiert wurden, während sie noch in MDs waren. In ähnlicher Weise zeigt Video 2 zwei immunfluoreszierend markierte Atemwegsorganoide in einem MD. Schließlich ist die ergänzende Abbildung 6 eine Grafik, die die mittlere Intensität der Zellmembranmarkierungsintensität in lebenden Sphäroiden vor und nach dem Einfrieren unter Verwendung des traditionellen Workflows und des hier beschriebenen Workflows vergleicht. Für die Analyse wurde die Software Image J verwendet.

Figure 1
Abbildung 1: Das Mehrzweck-Zellkulturgerät (MD). (A) Die Nische (N), der zentrale Teil der Vorrichtung, soll eine Schutzumgebung für die Organoide / Sphäroide schaffen, die während sequenzieller Prozesse in einem Hydrogeltropfen (D) gezüchtet werden. Die Seite (S), der umgebende Teil der Nische, kann während Immunfärbungsexperimenten als Luftbefeuchterkammer verwendet werden. (B) Die transparente Mitte im Deckel ermöglicht es dem Benutzer, die Organoide/Sphäroide zu beobachten, wenn das Gerät geschlossen ist. (C) Die Hydrogelkuppel, die Organoide im MD enthält, kann für die Transmissionselektronenmikroskopie gefärbt oder in einen Harzblock eingebettet sein. Der Deckel enthält auch die Nische (N) für die Hanging-Drop-Methodik. Die Größe und das Design des Geräts ermöglichen es dem Benutzer, die Organoide / Sphäroide unter (D) Hellfeld-, (E) Konfokal- und (F) Rasterelektronenmikroskopen zu untersuchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Aussaatzellen in einem Hydrogel. (A) Das Zellpellet in der Pipette wird in die Oberseite der Kuppel eingeführt. Nach 3-5 Tagen werden Sphäroide in der Kuppel sichtbar, insbesondere an der Peripherie des Tropfens. (B) Vier Live-Bilder von wachsenden Sphäroiden aus jedem Viertel in einer Kuppel wurden aufgenommen und zusammengeführt. Maßstabsbalken = 200 μm. (C)Das Design und die Abmessungen (in Zentimetern) des Mehrzweckgeräts (MD). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Entwicklung von Sphäroiden in einem Hydrogeltropfen von Tag 3 bis Tag 21. Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Whole-Mount-Sphäroide innerhalb der MD. Visualisierung der Verbindungen zwischen den Zellen, die sich in den benachbarten oder fusionierenden Sphäroiden befinden. Die empfindlichen Prozesse zwischen den Zellen (Pfeile) sind sichtbar, da die gesamte Probe im Hydrogel fixiert, gefärbt und untersucht wird, ohne die 3D-Wachstumsstrukturen zu beschädigen. Maßstabsbalken: Tag 3, Tag 9 = 50 μm; Tag 7, Tag 17 = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Immunhistochemische Färbung von Whole-mount-Sphäroiden im Hydrogel innerhalb des MD. Die Proben wurden mit einem arginasespezifischen Antikörper immungefärbt. Arginase-positive (rote Pfeile) und negative (schwarze Pfeile) Zellen sind in den Sphäroiden zu sehen. Die Bilder stammen aus zwei Experimenten: (A-C) ohne und (D-F) mit Gegenfärbung mit Hämatoxylin. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Konfokale Aufnahme eines lebenden Organoids im Hydrogel. Die lebenden Organoide wurden mit der Lebendzellmembran (WGA) und Zellkernfärbung (Hoechst) markiert. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Immunfluoreszenzmarkierung von Whole-Mount-Sphäroiden in einem Hydrogel mit einem Antikörper und einer Kernfärbung (Hoechst). (A-C) Das obere Bild zeigt ein Sphäroid, das mit einem für Na-K-ATPase spezifischen Antikörper in der Zellmembran markiert ist. (D-F) Das untere Bild zeigt die Position eines weiteren Antikörpers, der spezifisch für Arginase, ein zytosolisches Protein spezifisch für hepatozelluläres Karzinom, in Leberkrebssphäroiden ist. Dauer des Färbeprotokolls: 6 h. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Immunfluoreszenzmarkierung ganzer Sphäroide in einem Hydrogel mit zwei Antikörpern und einer Kernfärbung (Hoechst). (A-C) Das obere Bild zeigt ein Sphäroid, das mit zwei für Albumin und Ov6 spezifischen Antikörpern gekennzeichnet ist. Maßstabsbalken = 5 μm. (D-F) Das untere Bild zeigt die Position von Alpha-Feto-Protein und Ov6 in Leberkrebs-Sphäroide. Maßstabsbalken = 20 μm. Dauer des Färbeprotokolls: 6 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 9
Abbildung 9: Immunfluoreszenzmarkierung von Whole-Mount-Sphäroiden in einem Hydrogel mit drei Antikörpern und einer Kernfärbung (Hoechst). (A-E) Das Sphäroid im oberen Bild ist mit Antikörpern markiert, die spezifisch für Arginase, Na-K-ATPase und Beta-Galaktosidase sind. Maßstabsbalken = 10 μm. (F-J) Das mittlere Bild zeigt ein Sphäroid, das mit Ov6, Beta-Galactosidase und Alpha-Feto-Protein markiert ist. Maßstabsbalken = 20 μm. (K-O) Das Sphäroid im unteren Feld wurde mit FITC-Phalloidin, anti-mitochondrialem Antikörper und Anti-Golgi-Antikörper markiert. Maßstabsbalken = 20 μm. Beachten Sie die hohe Kennzeichnungsspezifität und den reduzierten Hintergrund. Dauer des Färbeprotokolls: 6 h. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 10
Abbildung 10: Elektronenmikroskopische Bilder. (A-C) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen ganzer Sphäroide im Hydrogel im MD. Maßstabsbalken = 10 μm. (D-F) Ultrastrukturelle Merkmale der Zellen in einem Sphäroid wurden auch unter einem Transmissionselektronenmikroskop sichtbar gemacht. Maßstabsbalken: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 11
Abbildung 11: Live-Bilder von Sphäroiden vor und nach dem Einfrieren. (A-F) Die Unregelmäßigkeit der Ränder der Hydrogelkuppeln ist nach dem Einfrieren offensichtlich. Die Größe und Rundheit der Sphäroide bleibt jedoch ähnlich. (F) Die Zellmigration auf der Kulturoberfläche ist nach dem Auftauen zu sehen. (G-L) Die Lebendzellmembran (WGA) und die Zellkernfärbung (Hoechst) zeigen eine ähnliche Zelllebensfähigkeit und intakte Zellmembranen vor und nach dem Einfrieren der gesamten Sphäroide in einem Hydrogel im MD. Skala basr: (A,B,D,E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Traditioneller Workflow Workflow mit Mehrzweckgerät (MD)
Schritte 22 6
Zeit 9 Tage 4 Tage
Abfallprodukte 26 9

Tabelle 1: Vergleich von Schrittzahl, Zeit und Abfallproduktion zwischen den traditionellen und neuen Arbeitsabläufen während eines Kurzzeitexperiments.

Herkömmlicher Workflow Workflow mit Lösung für Immunfluoreszenz (S-IF)
Schritte 25 7
Zeit 120 Std. 6-8 Uhr
Abfallprodukte 28 10

Tabelle 2: Vergleich der konventionellen Immunmarkierung und des neuen Immunmarkierungsprotokolls.

Video 1: Zeitreihe von Bildern auf verschiedenen Ebenen eines Hydrogels, das Sphäroide enthält, unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Video 2: 3D-Struktur von zwei Atemwegsorganoiden, markiert mit Antikörpern für Cytokeratin 5 und DAPI. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 1: Überblick über das Experiment. Dieses Schema zeigt die sequenziellen experimentellen Schritte zum Züchten und Untersuchen ganzer Organoide in einem Hydrogel. Die hier beschriebene Technologie ermöglicht es, die Organoide unter verschiedenen Mikroskopen zu züchten, einzufrieren, aufzutauen, zu markieren und zu untersuchen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Vergleich der Zelllebensfähigkeit, Toxizität und Proliferationsraten von HepG2-Zellen in einer traditionellen Glasbodenschale oder einem MD. HepG2-Zellen wurden auf (A) einer traditionellen Zellkulturschale mit Glasboden oder (B) in einem MD gezüchtet, um Zelllebensfähigkeit und Toxizität zu vergleichen. (C) Der Ausschlusstest von Trypanblau wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit nachzuweisen. Maßstabsbalken = 20 μm. Die Ergebnisse wurden mit (D-E) CCK8 Zytotoxizitäts- und (F) Zellproliferationstests verglichen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Anordnung der beiden Schaumstoffboxen. Eine Schaumstoffbox wird während des langsamen Gefrierprozesses der gesamten Organoide oder Sphäroide im MD in die andere gelegt. *bezeichnet die beiden Boxen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Schritte, die zeigen, wie der Harzblock nach der Polymerisation des Harzes aus dem MD entfernt wird. (A) Der Harzblock, der die Sphäroide oder Organoide umgibt, wird in der MD-Nische hergestellt und dann polymerisiert. (B-D) Dann wird der Harzblock mit einem geeigneten dünnen Stab gedrückt, um ihn aus der Nische zu entfernen. (E) Als nächstes wird der Harzblock mit dem Kunststoff darunter entfernt. (F-G) Schließlich wird eine Pinzette verwendet, um sie zu trennen, wenn der Block noch am Kunststoff befestigt ist. (H) Der Block ist bereit für den Dünnschnitt. Die ganzmontierten Organoide oder Sphäroide im Harzblock (*) sind bereit für die Sektion für die Transmissionselektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Atemwegsorganoide, die immunfluoreszierend markiert und dann visualisiert wurden, während sie noch in MDs waren. (A-C) Das obere Bild zeigt kreisförmige Atemwegsorganoide mit einem zentralen Lumen. Grün repräsentiert Vorläuferzellen der Atemwege, die Cytokeratin 5 im äußersten Ring des Organoids exprimieren, und Blau repräsentiert die Kerne. Maßstabsbalken = 50 μm. (D-F) Das untere Feld zeigt das dreidimensionale Bild der beiden nebeneinander liegenden Organoide in den Filtern (D) DAPI und (E) Alexa 488 sowie das zusammengeführte Bild (F). Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Vergleich der Markierungsdichte auf den lebenden Zellmembranen der Zellen. Die Grafik vergleicht die Sphäroide vor und nach dem Einfrieren unter Verwendung des traditionellen und derzeit verwendeten Workflows. Die Analyse wurde mit der Bildanalysesoftware Image J durchgeführt. Abkürzungen: IntDen = Integrated Density (Fluoreszenzintensität in den ausgewählten Sphäroide). CTCF = Korrigierte Gesamtzellfluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Der MD, der die hier beschriebenen Formulierungen und Protokolle ergänzt, ermöglicht ein schnelles und spontanes 3D-Wachstum von Organoiden und Sphäroiden in einer kontrollierteren Umgebung und setzt das Experiment unter den gleichen Bedingungen fort. Die Probe bleibt während des gesamten Prozesses in der gleichen Umgebung, und fast 100% der 3D-Wachstumsarchitekturen bleiben im Container intakt. Dies verbessert die Homogenität während der sequentiellen Experimente und ermöglicht eine verlängerte Kulturperiode. Darüber hinaus ist die Anzahl der Schritte während der Organoid- und Sphäroidverarbeitung im Vergleich zu herkömmlichen Arbeitsabläufen drastisch reduziert (Abbildung 4), was wiederum die Handhabungszeit und menschliche Fehler minimiert und das Kontaminationsrisiko verringert. Darüber hinaus verbessert dies die Zuverlässigkeit und Validität, da die experimentellen Bedingungen stabil bleiben und gleichzeitig die 3D-Wachstumsstrukturen in einer einzigen Umgebung geschützt werden. Es hilft, Zeit und Arbeit im Labor zu sparen und gleichzeitig die Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Gültigkeit zu verbessern. Darüber hinaus ermöglicht es die Verfolgung einzelner 3D-Wachstumsstrukturen während des gesamten sequentiellen Prozesses. Die Untersuchung der Größen- und Positionsänderungen während der Kultur und deren Reaktion auf verschiedene Verbindungen ist im Gerät möglich. Dies bietet ein hervorragendes in vitro experimentelles Modell für die Rekapitulation der Entwicklung des menschlichen Körpers und von Krankheiten. Forscher können die Stadien während der Fusion von Sphäroiden und Organoiden untersuchen, ein wesentlicher Mechanismus für die Migration bei Krankheiten und die normale Entwicklung44,45,46,47. Neuere Studien, die auf die Modellierung der Fusion im Labor abzielen, bevorzugen Organoid- und Sphäroidmodelle44,45,46,47.

Dieses Gerät ermöglicht es den Forschern auch, die Untersuchung in einer dringenden Situation zu stoppen, indem sie sie in ihrem aktuellen Zustand einfrieren und dann ohne Verlust fortsetzen, wenn die Bedingungen neue Experimente zulassen. Zum Beispiel mussten Forscher aufgrund der COVID-Pandemie die Experimente sofort stoppen und verloren ihre wertvollen Materialien und Daten. Es gibt keine aktuelle Lösung, um ein Experiment zu sichern, wenn es zu einer plötzlichen Unterbrechung der Studien aufgrund einer Änderung der Umstände kommt.

Einschränkungen der Technik
Die hier beschriebenen Techniken wurden entwickelt, um die spontane Entwicklung von Organoiden und Sphäroiden zu untersuchen, ein Modell, um die Evolution des normalen menschlichen Körpers und Krankheiten zu verstehen. Daher können die derzeitigen Geräte und Methoden nicht für die Entwicklung einheitlich großer Sphäroide oder Organoide verwendet werden, die für Drogenscreening-Tests bevorzugt wurden. Eine weitere Einschränkung hängt mit der Größe der Sphäroide und Organoide zusammen. Vollständige Organoide und Sphäroide können sehr dicht sein, wobei mehrere Zellschichten Reagenzien erfordern, die die Proben konservieren oder markieren, um ihren Kern zu durchdringen. Die Inkubationszeiten für alle Protokolle, einschließlich Färbung, Markierung und Einfrieren, variieren jedoch je nach Größe der Probe und dem Mikroumgebungsgel, das die Probe umgibt. Zum Beispiel benötigen größere Organoide und steifere Gele längere Inkubationszeiten, um ein Eindringen in die Mitte der Probe zu ermöglichen.

Zukünftige Anwendungen
Das Gerät und diese Methoden ermöglichen eine Langzeituntersuchung von 3D-wachsenden Organoiden und Sphäroide, um Organogenese, Gewebemorphogenese und Krankheiten zu verstehen und gleichzeitig die Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und Genauigkeit zu verbessern. Die in MDs markierten Organoide oder Sphäroide können mit High-Tech-Mikroskopietechnologien untersucht werden, einschließlich Multiphotonen-Laserscanning und Lichtblattfluoreszenzmikroskopie. Darüber hinaus können Forscher die gleiche Probe in einem einzigen Gerät sowohl unter einem konfokalen als auch unter einem Rasterelektronenmikroskop untersuchen, um eine korrelative Studie, CLEM (Correlative Light Electron Microscopy), durchzuführen. Das Gerät und die Methoden können auch für Biobanking-Organoide und Sphäroide verwendet werden, während 3D-Architekturen geschützt werden.

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Disclosures

Ranan Gulhan Aktas besitzt MD-, S-IHC-, S-IF- und FS-Patentanmeldungen. Olgu Enis Tok war an der Entwicklung dieser Produkte beteiligt. Olgu Enis Tok und Gamze Demirel sind Mitglieder des F&E-Teams des Unternehmens Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut und Ozgecan Kayalar haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Wir danken Dale Mertes von der University of Chicago für die Erstellung der Diagramme, Dr. Mehmet Serif Aydin für seine technische Unterstützung am Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies und Dr. Rana Kazemi von der Maltepe University für die Bearbeitung des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol (EtOH) Merck 8187602500 Dilute in dH2O to make 30%, 50%, 70%, 80%, 90% and 96% solution and store at RT
Acetone Merck 8222512500 Store at RT
Alexa fluor wheat germ agglutinin and Hoechst  in Hank's balanced salt solution (HBSS)   Invitrogen I34406 Image-IT LIVE Plasma Membrane and Nuclear Labeling Kit, Store at -20 °C
Alpha-1-Fetoprotein (AFP) Concentrated and Prediluted Polyclonal Antibody Biocare Medical CP 028 A Store at +4 °C
Anti-albumin antibody Abcam EPR20195 Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Anti-beta galactosidase antibody, Chicken polyclonal Abcam 134435 Store at +4 °C, Dilution: 1:25
Anti-cytokeratin 5 Abcam 53121 Store at +4 °C, Dilution: 1:100
Arginase-1 Concentrated and Prediluted Rabbit Monoclonal Antibody Biocare Medical ACI 3058 A, B Store at +4 °C, Dilution: 1:50
Calcium chloride (CaCl2) Sigma C1016-500G Dissolve in Karnovsky's fixative to make 2 mM CaCl2; store at RT
Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) Abcam ab228554
Centrifuge tubes, 15 mL  Nest 601051
Centrifuge tubes, 50 mL  Nest 602052
Class II Microbiological Safety Cabinet Bio II Advance Plus Telstar EN12469
CO2 Incubator Panasonic KM-CC17RU2
Copper Grids Electron Microscopy Sciences G100-Cu Ultra-thin sections put on the grids; 100 lines/inch square mesh
Critical Point Dryer Leica EM CPD300 For drying biological samples for SEM applications in absolute acetone
DAB/AEC chromogen solution mixture   Sigma Aldrich AEC101 Store at +4 °C
Diamond knife Diatome Ultra 45°, 40-US Use for ultra-thin sections for TEM
Dimethyl sulfoxide for molecular biology Biofroxx 67-68-5
Disposable Plastic Pasteur Pippettes Nest
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 41966-029 Store at +4 °C
Eosin Y Solution Alcoholic Bright Slide 2.BS01-105-1000
Epon resin  Sigma 45359-1EA-F Epoxy Embedding Medium kit, Store at +4 °C
Fetal Bovine Serum with Additive Fortifier Pan Biotech P30-3304 Store at +4 °C
Freezing Solution (FS) Cellorama CellO-F Store at +4 °C
Glass knife maker Leica EM KMR3 For make glass knives in 8 mm thickness
Glass knife strips (Size 8 mm x 25.4 mm x 400 mm) Leica 7890-08 Use for ultra- or semi-thin sections for TEM
Glutaraldehyde Aqueous Solution, EM grade, 25%  Electron Microscopy Sciences 16210 Dilute in dH2O to make 2.5% solution and store at +4 °C
Glycerol solution Sigma Aldrich 56-81-5 Store at -20 C, Dilution :1:100
Goat anti-chicken IgY (H+L) Secondary Antibody,Alexa, 647 Invitrogen A32933 Store at RT
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35502 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84540 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 488 Invitrogen 35552 Store at +4 °C,  Dilution :1:50
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight, 550 Invitrogen 84541 Store at +4 °C
Hematoxylin Harris  Bright Slide 2.BS01-104-1000
HepG2 cells ATCC HB-8065 Store in nitrogen tank
Human/Rat OV-6 Antibody Monoclonal Mouse IgG1 Clone # OV-6 R&D Systems MAB2020 Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354248 Matrigel, Basement Membrane Matrix High Concentration (HC), LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel Corning 354234 Matrigel, Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL, Store at -20 °C
Hydrogel ThermoFischer Scientific A1413201 Geltrex, LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix
Hydrogel Biotechne, R&D Systems BME001-01 Cultrex Ultramatrix RGF BME, Store at -20 °C
Karnovsky's fixative %2 PFA, %2.5 Glutaraldehyde in 0.15 M Cacodylate Buffer, 2 mM CaCl2; prepare fresh; use for TEM & SEM samples
L-Aspartic acid Sigma 11189-100G Store at RT
Lead aspartate solution Dissolve 40 mg aspartic acid in 10 mL ddH2O and add 66 mg lead nitrate. Solution stabilize at 60 °C and adjust pH to 5; prepare fresh
Lead nitrate Electron Microscopy Sciences 17900 Store at RT
Leica Confocal Microscope Leica DMi8
LSM 700 Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss
Microplate reader Biotek Synergy
Multipurpose Device (MD) Cellorama CellO-M
Nuclear-DNA stain Invitrogen H3569 Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg/mL Solution in Water, Store at +4 °C
Nuclear-DNA stain ThermoFischer Scientific 62248 DAPI solution, Store at +4 °C
Osmium Tetroxide (OsO4) ,4% Electron Microscopy Sciences 19190 Dilute in dH2O to make 2% solution; store at +4 °C and in airtight container; protect light
Ov6 antibody R&D systems MAB2020 Store at +4 °C
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4%  Sigma 1.04005.1000 Dissolve 4% PFA in dH2O and boil, cool and aliquot; store at -20 °C
Paraformaldehyde solution 4% in PBS, 1 L Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Store at +4 °C
Phosphate Buffered Saline (PBS), tablets MP Biomedicals, LLC 2810305
Post-fixative solution %2 OsO4, %2.5 Potassium Ferrocyanide in dH2O; prepare fresh
Potassium Ferrocyanide aqueous solution, 5%  Electron Microscopy Sciences 26603-01 Store at RT
Primovert - Inverted Bright Field Microscope - ZEISS Zeiss Item no.: 491206-0001-000
Round bottom microcentrifuge tubes, 2 mL Nest 620611
Scanning Electron Microscopy with STEM attachment Zeiss GeminiSEM 500 We use Inlens Secondary Electron (SE) detector at 2-3 kV for scanning electron micrographs and aSTEM detector at 30 kV for transmission electron micrographs.
SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack ScyTek Laboratories SHP125 Store at +4 °C
Sodium Cacodylate Buffer, 0.4 M, pH 7.2 Electron Microscopy Sciences 11655 Dilute in dH2O to make 0.2 M and store at +4 °C
Sodium/Potassium ATPase alpha 1 antibody [M7-PB-E9] GeneTex GTX22871 Store at -20 °C
Solution for Immunofluorescence Labeling (S-IF) Cellorama CellO-IF Store at +4 °C
Solution for Immunohistochemistry (S-IHC) Cellorama CellO-P Store at +4 °C
Specimen trimming device Leica EM TRIM2 For prepare epon sample block to ultramicrotome
Sputter coater Leica EM ACE200 Coat the SEM samples with 6 nm gold/palladium for 90 s
Thiocarbohydrazide (TCH) Sigma 223220-5G Dilute in dH2O to make 0.5% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; store at RT; prepare fresh
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Ultra gel super glue Pattex PSG2C For glue polymerized epon block with sample to holder epon block
Ultramicrotome Leica EM UC7 For prepare high-quality ultra- or semi-thin sections for transmission electron microscopy (TEM)
Universal Pipette Tips, 10 µL Nest 171215-1101
Universal Pipette Tips, 1000 µL Isolab L-002
Universal Pipette Tips, 200 µL  Nest 110919HA01
Uranyl Acetate Electron Microscopy Sciences 22400 Dilute in dH2O to make 2% solution and filter with 0.22 µm membrane filter; keep tightly closed container store at RT

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References

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Biologie Ausgabe 190
Kultivierung, Einfrieren, Verarbeitung und Bildgebung ganzer Organoide und Sphäroide noch in einem Hydrogel
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Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., … More

Tok, O. E., Demirel, G., Saatci, Y., Akbulut, Z., Kayalar, O., Aktas, R. G. Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel. J. Vis. Exp. (190), e64563, doi:10.3791/64563 (2022).

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