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Neuroscience

Soziales Isolationsmodell: Ein nichtinvasives Nagetiermodell für Stress und Angst

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64567
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Titus Family Department of Clinical Pharmacy, School of Pharmacy, University of Southern California, 2Homer Stryker M.D. School of Medicine, Western Michigan University

Summary

Hier wird ein durch soziale Isolation (SI) induziertes Angstmausmodell vorgestellt, das Wildtyp-C56BL / 6J-Mäuse verwendet, um Stress und angstähnliches Verhalten mit minimaler Handhabung und ohne invasive Verfahren zu induzieren. Dieses Modell spiegelt moderne Lebensmuster sozialer Isolation wider und ist ideal für die Untersuchung von Angstzuständen und verwandten Störungen.

Abstract

Angststörungen sind eine der Hauptursachen für Behinderungen in den Vereinigten Staaten (USA). Aktuelle Behandlungen sind nicht immer wirksam und weniger als 50% der Patienten erreichen eine vollständige Remission. Ein entscheidender Schritt bei der Entwicklung eines neuartigen Anxiolytikums ist die Entwicklung und Verwendung eines Tiermodells, wie z. B. Mäuse, um pathologische Veränderungen zu untersuchen und Arzneimittelziele, Wirksamkeit und Sicherheit zu testen. Aktuelle Ansätze umfassen genetische Manipulation, chronische Verabreichung von angstauslösenden Molekülen oder die Verabreichung von Umweltstress. Diese Methoden spiegeln jedoch möglicherweise nicht realistisch die Angst wider, die während des täglichen Lebens induziert wird. Dieses Protokoll beschreibt ein neuartiges Angstmodell, das die absichtlichen oder unbeabsichtigten Muster sozialer Isolation im modernen Leben nachahmt. Das durch soziale Isolation induzierte Angstmodell minimiert wahrgenommene Ablenkungen und Invasivität und verwendet Wildtyp-C57BL/6-Mäuse. In diesem Protokoll werden 6 bis 8 Wochen alte Mäuse (männlich und weiblich) einzeln in undurchsichtigen Käfigen untergebracht, um die äußere Umgebung, wie benachbarte Mäuse, für 4 Wochen visuell zu blockieren. Es werden keine Umweltanreicherungen (wie Spielzeug) bereitgestellt, das Einstreumaterial wird um 50% reduziert, jede Behandlung des Arzneimittels wird als Agarform verabreicht und die Exposition / Handhabung der Mäuse wird minimiert. Sozial isolierte Mäuse, die mit diesem Protokoll erzeugt wurden, zeigen ein größeres angstähnliches Verhalten, Aggression sowie eine verminderte Kognition.

Introduction

Angststörungen stellen die größte Klasse und Belastung von psychischen Erkrankungen in den Vereinigten Staaten (USA) dar, mit damit verbundenen jährlichen Kosten von mehr als 42 Milliarden US-Dollar 1,2,3. In den letzten Jahren haben Angst und Stress die Prävalenz von Selbstmord und Suizidgedanken um über 16% erhöht4. Patienten mit chronischen Erkrankungen sind besonders anfällig für unbeabsichtigte Nebenwirkungen von psychischer Belastung oder verminderter kognitiver Funktion5. Aktuelle Behandlungen für Angstzustände umfassen Psychotherapie, Medikamente oder eine Kombination aus beidem6. Trotz dieser Krise erreichen jedoch weniger als 50% der Patienten eine vollständige Remission 6,7. Anxiolytika wie Benzodiazepine (BZs) und selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRIs) haben erhebliche Nachteile oder erzeugen wenig bis keine unmittelbaren Wirkungen8. Darüber hinaus gibt es einen relativen Mangel an neuartigen Anxiolytika in der Entwicklung, der durch den kostspieligen und zeitaufwändigen Prozess der Arzneimittelentwicklung herausgefordert wird 9,10.

Ein kritischer Schritt im Arzneimittelentwicklungsprozess ist die Einrichtung und Verwendung eines Tiermodells, wie z. B. Mäuse, um pathologische Veränderungen zu untersuchen und die Sicherheit und Wirksamkeit von Arzneimitteln zu testen11. Aktuelle Ansätze zur Etablierung von Angsttiermodellen umfassen 1) genetische Manipulation, wie das Ausschalten von Serotoninrezeptoren (5-HT1A) oder γ-Aminobuttersäure-A-Rezeptor (GABAAR) α Untereinheiten12; 2) chronisch verabreichende Angstinduzierer wie Corticosteron oder Lipopolysaccharide (LPS)13,14; oder 3) Verabreichung von Umweltstress einschließlich sozialer Niederlage und mütterlicher Trennung15. Diese Methoden spiegeln jedoch möglicherweise nicht realistisch Angstzustände wider, die während des täglichen Lebens induziert werden, und sind daher möglicherweise nicht geeignet, den zugrunde liegenden Mechanismus zu untersuchen oder neuartige Medikamente zu testen.

Mäuse und Ratten sind wie Menschen sehr soziale Wesen16,17,18. Soziale Kontakte und soziale Interaktionen sind für eine optimale Gesundheit des Gehirns unerlässlich und entscheidend für die richtige Neuroentwicklung während der Aufzuchtzeit19. So führt die Trennung der Mutter oder soziale Isolation während der Aufzuchtzeit zu Mäusen, die mehr Angstzustände, Depressionen und Veränderungen der Neurotransmission zeigen20. Darüber hinaus ist Social Grooming oder Allogrooming eine häufige Form der Bindung oder des beruhigenden Verhaltens bei Mäusen und Ratten, die zusammen leben21. Daher ist die Sozialisation ein integraler Bestandteil des Nagetierlebens, und die Isolation wirkt sich negativ auf ihre Gesundheit aus.

In diesem Zusammenhang beschreibt das vorliegende Protokoll ein neuartiges Angstmodell, um die absichtlichen oder unbeabsichtigten Muster sozialer Isolation im modernen Leben nachzuahmen. Dieses Modell der sozialen Isolation (SI) minimiert wahrgenommene Ablenkungen und Invasivität und verwendet erwachsene Wildtyp-C57BL/6-Mäuse und Sprague-Dawley-Ratten (SD). Das hier vorgestellte Protokoll konzentriert sich auf das Angstmäusemodell, das auf unseren veröffentlichten Beweisen basiert, die ein erhöhtes angstähnliches Verhalten, Aggression, verminderte Kognition und erhöhte Neuroinflammation als Folge der sozialen Isolation zeigten22,23,24. Angstähnliches Verhalten wird durch die Tests Elevated Plus Maze (EPM) und Open Field (OF) bestätigt, während die kognitive Funktion durch neuartige Objekterkennungs- (NOR) und neuartige Kontexterkennungstests (NCR) gemessen wird. Dieses Modell ist nützlich für die Untersuchung von Angstzuständen und verwandten Störungen, kann aber auch angepasst oder modifiziert werden, um die natürliche Progression und Entwicklung leichter kognitiver Beeinträchtigungen sowie metabolischer Veränderungen aufgrund von Stress zu untersuchen.

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Protocol

Alle Tierversuche werden nach den vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Southern California (USC) genehmigten Protokollen durchgeführt, und alle Methoden werden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien, Vorschriften und Empfehlungen durchgeführt.

1. Tiere

  1. Holen Sie die Genehmigung der zuständigen Tierpflegeausschüsse für die Studie ein.
  2. Stellen Sie das Vivarium auf einen Dunkel-Hell-12-Stunden-Zyklus mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit zwischen 24 ± 2 °C bzw. 50%-60% ein.
  3. Erhalten Sie männliche und/oder weibliche Wildtyp-C57BL/6-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen. Nachdem Sie die Tiere nach Geschlecht geschichtet haben, ordnen Sie sie nach dem Zufallsprinzip einer der folgenden Gruppen zu: 1) Gruppenhaus mit Fahrzeugbehandlung; 2) Gruppenhaus mit medikamentöser Behandlung; 3) soziale Isolation mit Fahrzeugbehandlung; oder 4) soziale Isolation mit Drogenbehandlung. Ziel sind mindestens vier Mäuse pro Gruppe und Geschlecht (idealerweise sechs Mäuse pro Gruppe).
  4. Nach der Ankunft der Mäuse gewöhnen Sie sie für mindestens 24 Stunden an das Vivarium. Die Mäuse sollten einzeln untergebracht ankommen.

2. Käfigaufbau

  1. Für Tiere mit sozialer Isolation nehmen Sie einen Standard-Mauskäfig (75 in 2 Bodenfläche) und fügen Sie die Hälfte der Menge an Einstreu und ein 1 in2 Stück Baumwolle (oder gleichwertig) zum Nisten hinzu.
  2. Wickeln Sie die Außenwände der Käfige in undurchsichtige, schwarze Plastiktüten (oder gleichwertig) und sichern Sie sie mit Klebeband. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse die Außenumgebung oder die umliegenden Tiere nicht sehen können.
    1. Lassen Sie die Ober- und Unterseite des Käfigs unverpackt, es sei denn, die Mäuse können benachbarte Tiere durch sie hindurch sehen.
    2. Achten Sie beim Einwickeln darauf, dass kein Segment des Beutels von der Innenseite des Käfigs aus zugänglich ist. Dies soll verhindern, dass das Tier den Beutel auseinanderreißt.
    3. Fügen Sie keine Form der Umweltanreicherung wie Spielzeug oder Laufräder hinzu.
  3. Legen Sie die Mäuse vorsichtig und vorsichtig in die vorbereiteten Käfige. Stellen Sie Nahrung und Wasser ad libitum zur Verfügung.
  4. Hauskontrollmäuse in Gruppen von zwei oder drei unter normalen Käfigbedingungen (dh in einem Standard-Mauskäfig [75 in 2 Bodenfläche], eine volle Menge an Bettwäsche, ein 2 in2 Stück Baumwolle oder gleichwertig zum Nisten und keine Verpackung von undurchsichtigen Taschen).
    1. Stellen Sie sicher, dass die in der Gruppe untergebrachten Mäuse miteinander kompatibel sind (d. H. Es gibt keine Kämpfe / Konflikte zwischen ihnen). Wenn ein Konflikt auftritt, entfernen Sie den Angreifer und schließen Sie ihn von der Analyse aus.
    2. Trennen Sie die Unterbringung männlicher und weiblicher Mäuse und halten Sie Abstand zwischen den Männchen und Weibchen, um die Möglichkeit zu vermeiden, die endokrinen Spiegeländerungen weiblicher Mäuse aufgrund ihrer Geruchsfähigkeit zu beeinflussen.

3. Pflege und Behandlung während der sozialen Isolation

  1. Stören Sie die Mäuse während der sozialen Isolation so minimal wie möglich. Führen Sie alle Verfahren und Aktivitäten, wie z. B. Käfigwechsel und Behandlungsverabreichung, während ihrer aktiven Zeit (d. H. Während des Dunkelzyklus) und unter minimalen Lärmbelästigungen durch.
  2. Wechseln Sie die Käfige nur einmal pro Woche während des Dunkelzyklus. Derselbe Plastikbeutel kann entfernt und in neue Käfige umgewickelt werden, es sei denn, es liegt ein erheblicher Schaden vor.
    1. Für Kontrollmäuse (Gruppenmäuse) wechseln Sie die Käfige zweimal pro Woche oder bei Bedarf während des Dunkelzyklus.
  3. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse viel Wasser und Nahrung haben, um mindestens 1 Woche zu halten.
  4. Isolieren Sie die Mäuse für mindestens 4 Wochen (oder gruppieren Sie sie), um optimale Ergebnisse zu erzielen.

4. Agar-Medikament / Behandlungsvorbereitung - eine nichtinvasive medikamentöse Behandlung

  1. Wenn Behandlungen (z. B. untersuchte Medikamente) in die Studie einbezogen werden, verabreichen Sie die Behandlung idealerweise mit so wenig Handhabung wie möglich unter Verwendung von Agarformen. Wege wie Injektion und Mundsonde verursachen zusätzlichen Stress für die Mäuse, der zu einem Störfaktor der Angst werden kann.
  2. Passen Sie den Zeitpunkt und die Häufigkeit der Behandlung basierend auf der Art des verwendeten Arzneimittels an.
    HINWEIS: In dieser Studie wurden 2 mg/kg Dihydromyricetin (DHM, [(2R,3R)-3,5,7-trihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphenyl)-2,3-dihydrochromen-4-on]) als Behandlung verwendet. DHM wurde täglich in einer Einzeldosis während der Dunkelphase der letzten 2 Wochen der Isolationsphase (oder Gruppenhaus) verabreicht.
  3. Um die Behandlung vorzubereiten, fügen Sie 3% (w / v) Agar in entionisiertem (DI) Wasser hinzu und erhitzen Sie es auf ~ 90 ° C, um sich aufzulösen. Die Lösung wird sprudeln. Verschütten oder Überkochen verhindern.
    HINWEIS: Erhitzen Sie die Lösung in einem Glaskolben in kurzen Abständen von 10 s Mikrowelle.
    ACHTUNG: Die Glaswaren werden heiß sein. Tragen Sie beim Umgang mit der Lösung eine geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA).
  4. Schwenken Sie die Lösung und sorgen Sie optisch für eine homogene Lösung.
    HINWEIS: Die Lösung sollte durchscheinend und hellgelb bis hellbraun gefärbt sein.
  5. Während die Lösung noch warm ist, fügen Sie 5% (w / v) Saccharose und die gewünschte Dosis der Behandlung hinzu. Fügen Sie nur Saccharose hinzu und fügen Sie der Fahrzeugsteuerung nicht die Behandlung von Interesse hinzu.
  6. Schwenken Sie die Lösung und sorgen Sie optisch für eine homogene Lösung. Dann gießen Sie die Lösung in eine Form und lassen Sie sie bei Raumtemperatur abkühlen, um zu erstarren. Wenn die Behandlung lichtempfindlich ist, achten Sie darauf, sie vor Licht zu schützen.
    HINWEIS: Die Lösung sollte leicht viskos sein.
  7. Nach dem Erstarren den Agar in Würfel von 0,5 cm x 0,5 cm x 0,5 cm schneiden und bis zur Verabreichung bei 4 °C lagern.
  8. Um die Behandlung zu verabreichen, legen Sie einen einzelnen Würfel auf ein kleines Wiegeboot. Während der Dunkelphase des Hell-Dunkel-Zyklus das Agarwaagenboot ruhig und vorsichtig in einzelne Käfige legen, ohne die Maus zu berühren. Lassen Sie die Maus das Agar verzehren.
    HINWEIS: Mäuse benötigen normalerweise 15-45 Minuten, um das Agar vollständig zu verzehren.
  9. Bestätigen Sie den vollständigen Verbrauch des Agars und entfernen Sie dann vorsichtig das Wiegeboot aus dem Käfig. Wiederholen Sie diesen Vorgang nach Bedarf.
  10. Bereiten Sie Agarwürfel wöchentlich zu, um frisch zu bleiben und Verunreinigungen zu vermeiden.

5. Verhaltensanalyse

  1. Führen Sie Verhaltenstests 24 Stunden nach dem letzten Tag der 4-wöchigen (oder mehr) Isolationszeit durch. Führen Sie Tests während der Dunkelphase unter indirekter roter Beleuchtung durch und zeichnen Sie sie mit einer Videokamera auf.
  2. Ordnen Sie mindestens drei Personen an, die eine manuelle Offline-Bewertung auf doppelblinde Weise durchführen, um Verzerrungen und Fehler zu minimieren.
  3. Erhöhtes Plus-Labyrinth (EPM)
    1. Bereiten Sie das EPM-Gerät vor. Die in diesem Protokoll verwendete Vorrichtung wurde kommerziell erworben (siehe Materialtabelle) und aus undurchsichtigem Kunststoff mit zwei offenen Armen und zwei geschlossenen Armen (je 33 cm x 5 cm, offene Arme senkrecht zu den geschlossenen Armen) mit einer Mittelplattform von 5 cm x 5 cm hergestellt. Heben Sie das Gerät 50 cm über den Boden.
    2. Legen Sie das Tier auf die Mitte des Apparates, mit Blick auf einen offenen Arm. Lassen Sie das Tier 5 Minuten lang erkunden und zeichnen Sie seine Aktivität mit einer Videokamera auf.
      1. Reinigen Sie das Gerät nach jedem Tier, indem Sie alle Oberflächen gründlich mit Desinfektionsmittel (70% Ethylalkohol) abwischen. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Nagetierkot abgewischt wird.
    3. Bewerten Sie das Verhalten der Mäuse offline basierend auf der Zeit, die Sie in offenen Armen, geschlossenen Armen und der mittleren Plattform mit einer Stoppuhr verbringen. Starten Sie die Stoppuhr, wenn die Maus mindestens drei Pfoten in den jeweiligen Arm oder die Plattform legt.
  4. Test im offenen Feld (OF)
    1. Bereiten Sie das OF-Gerät vor. Die in diesem Protokoll verwendete Vorrichtung (siehe Materialtabelle) bestand aus opakem Kunststoff mit den Maßen 50 cm x 50 cm x 38 cm (Länge x Breite x Höhe).
    2. Zeichne quadratische Raster (je 10 cm x 10 cm) auf dem Feld für insgesamt 25 Raster.
    3. Stellen Sie das Tier in die Mitte des Feldes und lassen Sie es für 10 Minuten erkunden. Zeichnen Sie ihre Aktivitäten auf einer Videokamera auf.
      1. Reinigen Sie das Gerät nach jedem Tier, indem Sie die gesamte Oberfläche gründlich mit Desinfektionsmittel (70% Ethylalkohol) abwischen. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Nagetierkot abgewischt wird.
    4. Bewerten Sie das Verhalten der Mäuse offline basierend auf der Zeit, die in der zentralen Zone verbracht wurde, der Zeit, die in den Ecken verbracht wurde, der insgesamt zurückgelegten Strecke und der Häufigkeit, mit der die Maus aufgezogen wurde.
      1. Verwenden Sie eine Stoppuhr, um die in der Mitte oder Ecke verbrachte Zeit aufzuzeichnen. Starten Sie die Stoppuhr, wenn die Maus mindestens drei Pfoten in den jeweiligen Bereich legt.
      2. Verwenden Sie einen Zähler, um die zurückgelegte Strecke und die Häufigkeit der Aufzucht aufzuzeichnen. Zählen Sie die Anzahl der Quadrate, die die Maus betritt (wenn die Maus mindestens drei Pfoten in das Quadrat legt). Zählen Sie die Aufzucht, wenn die Maus deutlich auf den Hinterpfoten steht. Zählen Sie nicht, wenn die Maus aufsteht und sich an die Wände lehnt oder wenn sie aufsteht, um sich zu pflegen.
  5. NOR-Test (Novel Object Recognition)
    1. Führen Sie diesen Test über 3 Tage durch. Bereiten Sie an Tag 1 ein Freilandgerät von 50 cm x 50 cm x 38 cm (Länge x Breite x Höhe) vor. Stellen Sie das Tier in die Mitte des offenen Feldes und lassen Sie es für 5 min gewöhnen. Setzen Sie das Tier dann wieder in seinen Heimatkäfig.
      1. Reinigen Sie das Gerät nach jedem Tier, indem Sie alle Oberflächen gründlich mit Desinfektionsmittel (70% Ethylalkohol) abwischen. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Nagetierkot abgewischt wird.
    2. Bereiten Sie an Tag 2 den gleichen Freilandapparat vor und platzieren Sie zwei identische Objekte, z. B. einen kleinen Würfel. Platzieren Sie sie symmetrisch etwa 20 cm auseinander. Stellen Sie das Tier in die Mitte des Geräts und lassen Sie es 5 Minuten lang erkunden. Setzen Sie das Tier dann wieder in seinen Heimatkäfig.
      1. Reinigen Sie das Gerät nach jedem Tier, indem Sie alle Oberflächen gründlich mit Desinfektionsmittel (70% Ethylalkohol) abwischen. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Nagetierkot abgewischt wird.
    3. Bereiten Sie an Tag 3 den gleichen Freilandapparat und eines der Objekte aus Tag 2 (d.h. einen kleinen Würfel) vor, der als vertrautes Objekt fungiert. Platzieren Sie ein anderes, unähnliches neuartiges Objekt, wie z.B. eine Holzpyramide, symmetrisch zu dem bekannten Objekt in einem Abstand von etwa 20 cm. Lassen Sie das Tier 3 Minuten lang erkunden und zeichnen Sie seine Aktivität mit einer Videokamera auf.
      1. Reinigen Sie das Gerät nach jedem Tier, indem Sie alle Oberflächen gründlich mit Desinfektionsmittel (70% Ethylalkohol) abwischen. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Nagetierkot abgewischt wird.
    4. Bewerten Sie das Verhalten der Mäuse offline basierend auf der Zeit, die Sie mit der Erforschung des vertrauten Objekts und des neuartigen Objekts verbracht haben. Berechnen Sie den Objekterkennungsindex (ORI%), wobei Equation 1tf und tn die Zeiten der Erforschung der bekannten bzw. neuartigen Objekte darstellen.
  6. Neuartiger Kontexterkennungstest (NCR)
    1. Führen Sie diesen Test über 2 Tage durch. Bereiten Sie zwei deutlich geformte offene Felder und zwei Paare von deutlich geformten Objekten vor. Die OF-Apparatur kann als einer der Kontexte (offenes Feld) verwendet werden. Der andere Kontext sollte von ähnlicher Größe, aber unterschiedlicher Form sein, z. B. ein rundes offenes Feld.
    2. Platzieren Sie an Tag 1 ein Paar identischer Objekte (d. H. Zwei Würfel) im quadratischen Kontext und das andere Paar identischer Objekte (d. H. Zwei Pyramiden) im runden Kontext. Objekte sollten symmetrisch 15-20 cm voneinander entfernt platziert werden.
    3. Stellen Sie das Tier in die Mitte und lassen Sie es für 5 Minuten in einem Kontext erkunden. Wiederholen Sie dies im anderen Kontext. Dann setzen Sie das Tier zurück in seinen Heimatkäfig.
      1. Reinigen Sie das Gerät nach jedem Tier, indem Sie alle Oberflächen gründlich mit Desinfektionsmittel (70% Ethylalkohol) abwischen. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Nagetierkot abgewischt wird.
    4. Tauschen Sie an Tag 2 eines der Objekte aus einem Kontext mit dem anderen aus (d. H. Platzieren Sie einen Würfel und eine Pyramide im quadratischen Kontext und einen Würfel und eine Pyramide im runden Kontext).
    5. Stellen Sie das Tier in die Mitte und lassen Sie es für 3 Minuten erkunden. Zeichnen Sie ihre Aktivitäten auf einer Videokamera auf. Die Tiere müssen nicht in beiden Kontexten erfasst werden.
      1. Reinigen Sie das Gerät nach jedem Tier, indem Sie alle Oberflächen gründlich mit Desinfektionsmittel (70% Ethylalkohol) abwischen. Stellen Sie sicher, dass der gesamte Nagetierkot abgewischt wird.
    6. Bewerten Sie das Verhalten der Mäuse offline basierend auf der Zeit, die Sie für die Untersuchung der verschiedenen Objekte aufgewendet haben. Berechnen Sie den Erkennungsindex (RI%) als den Anteil der Zeit, die für die Untersuchung des neuartigen "aus dem Kontext gerissenen" Objekts (d. h. der Pyramide im quadratischen Kontext) im Vergleich zum bekannten "kontextbezogenen" Objekt (d. h. dem Würfel im quadratischen Kontext) aufgewendet wird. Equation 2.

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Representative Results

Alle repräsentativen Ergebnisse und Zahlen wurden aus unseren aktuellen Veröffentlichungen22,23 modifiziert. Um die Auswirkungen sozialer Isolation auf Angst und exploratives Verhalten zu bewerten, wurden EPM- und OF-Tests 24 Stunden nach dem Enddatum der 4-wöchigen sozialen Isolationsphase durchgeführt. Sozial isolierte Mäuse verbrachten signifikant weniger Zeit im offenen Arm (1,28 ± 0,17 min) als die Kontrolle (2,31 ± 0,27 min) und eine signifikant längere Zeit im geschlossenen Arm (3,31 ± 0,27 min) im Vergleich zur Kontrolle (2,24 ± 0,31 min) (Abbildung 1). Ebenso reisten im OF-Test sozial isolierte Mäuse weniger (2.176 ± 146 cm vs. Kontrolle [2.765 ± 161 cm]), weniger aufgezogen (28,25 ± 2,07 vs. Kontrolle [46,63 ± 1,52]), verbrachten mehr Zeit in den Kurven (73,00 ± 4,31 s vs. Kontrolle [28,25 ± 2,07 s]) und verbrachten weniger Zeit im zentralen Bereich (7,63 ± 0,86 s vs. Kontrolle [19,63 ± 0,71 s]), deutet auf ein verstärktes angstähnliches Verhalten hin (Abbildung 2).

Darüber hinaus wurden die Auswirkungen sozialer Isolation auf die Kognition untersucht, da Angststörungen typischerweise auch Symptome kognitiver Beeinträchtigungen wie Gedächtnisverlust und Konzentrationsschwierigkeiten aufweisen25,26. Zwei Tests wurden verwendet: Novel Object Recognition (NOR) und Novel Context Recognition (NCR), wie zuvor beschrieben23, um die Fähigkeit der Mäuse zu bewerten, neuartige Objekte unter ähnlichem Kontext (NOR) und neuartigem Kontext mit ähnlichen Objekten (NCR) zu erkennen. Sozial isolierte Mäuse zeigten sowohl eine reduzierte Erkennung neuartiger Objekte (55,3 ± 4,1% vs. Kontrolle [66,3 ± 4,7%]) (Abbildung 3A) als auch eine reduzierte Erkennung des neuartigen Kontexts (51,5 ± 6,5% vs. Kontrolle [68,6 ± 2,8%]), was auf eine kognitive Beeinträchtigung hindeutet (Abbildung 3B).

Figure 1
Abbildung 1: Veränderungen des angstähnlichen Verhaltens, gemessen durch das erhöhte Plus-Labyrinth (EPM). Zeit, die im (A) offenen Arm und (B) geschlossenen Arm des EPM-Geräts verbracht wird. Daten, die als Mittelwert ± REM dargestellt werden. Einweg-ANOVA gefolgt von mehreren Vergleichen, Holm-Sidak-Methode. N = 11 pro Gruppe. * p ≤ 0,05. Diese Abbildung wurde modifiziert von Al Omran et al.22 (Open Access unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Veränderungen des angstähnlichen Verhaltens und der Bewegungsaktivität, gemessen durch den Open Field (OF)-Test. Die Daten werden als (A) zurückgelegte Gesamtstrecke, (B) Anzahl der Aufzucht der Mäuse, (C) Gesamtzeit in der Ecke und (D) Gesamtzeit in der Mitte des OF-Geräts angezeigt. Daten, die als Mittelwert ± REM dargestellt werden. Einweg-ANOVA gefolgt von mehreren Vergleichen, Holm-Sidak-Methode. N = 11 pro Gruppe. * S≤ 0,05. Diese Abbildung wurde modifiziert von Al Omran et al.22 (Open Access unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Veränderungen der Kognition, gemessen durch Novel Object Recognition (NOR) und Novel Context Recognition (NCR) Tests. (A) ORI = Objekterkennungsindex. (B) RI = (neuartiger Kontext) Erkennungsindex. Daten, die als Mittelwert ± REM dargestellt werden. Einweg-ANOVA gefolgt von mehreren Vergleichen, Holm-Sidak-Methode. N = 9 pro Gruppe. * p ≤ 0,05. Diese Abbildung wurde modifiziert von Watanabe et al.23 (Open Access unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehören die ordnungsgemäße Einrichtung der sozialen Isolationskäfige (d. H. Umwickeln von undurchsichtigen Beuteln und Reduzierung der Menge an Einstreu), die Minimierung der Handhabung und Störung von Mäusen während der gesamten Isolationszeit und die Sicherstellung, dass die Mäuse das Agar vollständig mit Drogen erhalten und konsumieren. Es ist wichtig, dass der Vivarium- oder Gehäusezustand auf einer konstanten Temperatur und Luftfeuchtigkeit gehalten wird und externe Störungen minimiert werden. Es sollten erhebliche Anstrengungen unternommen werden, um so viele dieser Störfaktoren wie möglich zu reduzieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Lärmbelästigungen (z. B. Gespräche, Gerätegeräusche usw.), Überbehandlung und Störung der Tiere während der Lichtphase des Dunkellichtzyklus. Die Zeit, die benötigt wird, um die Käfige zu wechseln, Nahrung und / oder Wasser nachzufüllen, die Behandlung durchzuführen und alle anderen Funktionen während der Isolationszeit sollte ebenfalls minimiert werden. Obwohl selten, haben wir in der Vergangenheit Kämpfe zwischen männlichen Mäusen beobachtet, die in Gruppen untergebracht sind. Daher ist für die in der Gruppe untergebrachten Mäuse (Kontrolle oder ähnliches) eine sorgfältige Beobachtung erforderlich, um sicherzustellen, dass es keine Konflikte zwischen den Mäusen gibt, da dies als ein weiterer Störfaktor von Angst oder Stress eine Rolle spielen würde. Für den Fall, dass es zu Kämpfen kommt, sollte der mutmaßliche Angreifer mit einem anderen Gruppengegner ausgetauscht und weiterhin beobachtet werden. Wenn der Angreifer weiterhin Konflikte verursacht, wird vorgeschlagen, den Angreifer sowie Mäuse, die Verletzungen durch den Angreifer erlitten haben, von der Studie auszuschließen.

Das beschriebene Protokoll empfiehlt 4 Wochen Isolation, aber dieser Zeitrahmen kann verlängert werden. Die längste Zeit der sozialen Isolation, die wir durchgeführt haben, beträgt 8 Wochen, und wir haben auch wiederholte soziale Isolation (Isolation, Gruppenhaus, Re-Isolation) als Modell für angesammelte Angst / Stress durchgeführt. Der Zeitpunkt und die Länge dieser Isolationszeiträume können an die experimentellen Bedürfnisse oder Zwecke angepasst werden. Es wird jedoch nicht empfohlen, die Isolationszeit auf weniger als 4 Wochen zu verkürzen, da es möglicherweise nicht genug Zeit für die Mäuse ist, angstähnliches Verhalten oder pathologische Veränderungen des Gehirns zu zeigen. Der Zeitpunkt und die Häufigkeit der Behandlung(en) können ebenfalls geändert werden.

Im Vergleich zu bestehenden Methoden zur Etablierung von Angsttiermodellen hat dieses Modell mehrere Vorteile. Erstens erfordert es keine umfangreiche Phänotypauswahl (selektive Züchtung) oder genetische Manipulation, wie das Ausschalten oder Stummschalten von Rezeptoren im Gehirn. Während genetisch veränderte Mäuse für die Untersuchung anfälliger Gene nützlich sind, erfassen sie möglicherweise nicht vollständig die Angstpathogenese12. Darüber hinaus könnten Gen-Knockouts tödlich sein oder die beim Menschen beobachtete Angst nicht genau nachahmen27. Die genetische Manipulation erfordert Zeit und Mühe und erfordert die Extraktion embryonaler Stammzellen, DNA-Injektion, Kultivierung, Implantation in die Gebärmutter und Aufzucht27. Darüber hinaus spiegeln diese genetischen Tiere möglicherweise nicht wirklich Arzneimittelwirkungen für die Entwicklung von Medikamenten wider. Dieses Modell der sozialen Isolation erfordert zwar mindestens 4 Wochen Isolation, ist aber in Bezug auf Zeit, Aufwand und Zuverlässigkeit von Vorteil. Zweitens müssen die Mäuse nicht chronisch mit Angstinduzierern wie Corticosteron oder Lipopolysacchariden (LPS) verabreicht werden13,14. Es besteht keine Notwendigkeit für Ermittler, tägliche Injektionsverfahren durchzuführen, und das Modell der sozialen Isolation spiegelt die Angst beim Menschen genauer wider, da die meisten Menschen keine täglichen Injektionen erhalten, um Angst zu erleben. Schließlich müssen Mäuse nicht konditioniert werden (wie in sozialen Niederlagenparadigmen), was Zeit braucht und möglicherweise kein reproduzierbares Maß an Angst erzeugt (dh signifikante Unterschiede zwischen Mäusen)15.

Viele der derzeit verfügbaren Modelle der sozialen Isolation beginnen die Isolationsphase in der frühen Entwicklung, zwischen neonatalen bis zu juvenilen und jugendlichen Perioden. Solche Isolationsmodelle im frühen Leben induzieren depressive und angstähnliche Verhaltensweisen, soziales Vermeidungsverhalten und andere neuropsychiatrische Symptome, die Angststörungen, Depressionen, Autismus und verwandte psychische Störungen widerspiegeln28. Während die Methode der sozialen Isolation im frühen Leben gut etabliert und häufig verwendet ist, spiegelt sie nicht vollständig die Entwicklung psychischer Störungen wider, da nicht alle Personen während ihrer Jugendjahre eine mütterliche Trennung (soziale Isolation) erfahren29. Darüber hinaus variieren ihre Auswirkungen je nach Art, Stamm, Geschlecht und Häufigkeit/Dauer der Isolation28. Zum Beispiel haben einige Studien herausgefunden, dass die soziale Isolation nach dem Absetzen aggressives Verhalten bei C57BL / 6J-Mäusen erhöht, während andere nur eine geringe oder keine Wirkung gezeigt haben28. Diese Abweichung ist wahrscheinlich auf geringfügige Unterschiede in der Häufigkeit, Dauer oder Gehäusekonfiguration der Isolationszeit zurückzuführen. Eine weitere Studie mit Mäusen im Erwachsenen- oder Spätstadium ergab, dass soziale Isolation die Hyperaktivität erhöht, ohne offensichtliche depressive oder angstähnliche Verhaltensweisen30. Diese Mäuse konnten benachbarte Mäuse nicht sehen, ähnlich wie in unserem Modell, verwendeten aber weibliche F1-Hybridmäuse C57BL / 6J x 129S6 / SvEvTac-Mäuse30, was auf die Variabilität zwischen Stämmen und Geschlecht hindeutet. Diese Studie hofft, diese Variationen zu minimieren, indem sie eine konsistente Methode vorschlägt.

Ein Nachteil dieser Technik ist, dass der Klangfaktor nicht eliminiert wird. Da die Käfige nicht schalldicht sind, können sich die Tiere immer noch gegenseitig hören und befinden sich daher möglicherweise nicht in absoluter Isolation. Es kann von Interesse sein, einen schalldichten Käfig in das Protokoll aufzunehmen und die Auswirkungen der auditiven Isolation auf Angst und Kognition zu untersuchen. Für die Zwecke dieses Modells werden jedoch nur visuelle Sinne und Interaktionen blockiert, da dieses Modell kein sensorisches Deprivationsmodell ist, sondern ein Modell, um soziale Interaktion von Angesicht zu Angesicht zu verbieten. Das Modell beabsichtigt, die persönlichen sozialen Interaktionen nachzuahmen, da auditive Reize typischerweise im menschlichen Leben vorhanden sind. Ein weiterer Nachteil ist, dass dieses Protokoll nur an C57BL/6-Mäusen und Sprague-Dawley-Ratten getestet wurde. Wie bereits erwähnt, können die Auswirkungen sozialer Isolation je nach Art und Belastung variieren. Obwohl die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls bei anderen Nagetierarten/-stämmen nicht garantiert werden kann, kann bestätigt werden, dass dieses Modell bei diesen beiden Tieren konsistent nachgebildet werden kann.

Da die Tiere eine reduzierte Kognition und ein reduziertes Gedächtnis aufwiesen, kann dieses Modell als Modell mit leichter kognitiver Beeinträchtigung entwickelt werden. Obwohl eine weitere Optimierung erforderlich ist, kann das Modell nützlich sein, um den Mechanismus der durch soziale Isolation induzierten kognitiven Beeinträchtigung zu untersuchen, möglicherweise durch akkumulierte Episoden von Stress und Angstzuständen. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Auswirkungen sozialer Isolation im späteren Leben auf soziales Verhalten, Aggression oder Gewalt zu untersuchen.

Insgesamt kann das durch soziale Isolation induzierte Angstmausmodell auf die Untersuchung von Angstzuständen und verwandten Störungen in einer nichtinvasiven, minimal behandelten Weise angewendet werden und zielt darauf ab, Angstzustände, die durch soziale Isolation und Einsamkeit verursacht werden, genau nachzuahmen.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde finanziert durch das National Institute of Health Stipendium AA17991 (an J.L.), Carefree Biotechnology Foundation (an J.L.), University of Southern California (USC), USC Graduate School Travel/Research Award (an S.W.) Saudi Arabia Cultural Mission Scholarship (an A.A.O.) und Army Health Professions Scholarship Program (an A.S.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Black Plastic Bags Office Depot 791932 24" x 32"
Elevated Plus Maze SD Instruments NA Black color
Open Field enclosure SD Instruments NA White color
Select Agar Invitrogen 30391-023
Square cotton for nesting (nestlet) Ancare Corporation NC9365966 Divide a 2" square piece into 4 pieces to create a 1" square piece for isolation group
Sucrose Sigma S1888-1KG
Weigh boat SIgma HS1420A Small, square white polystyrene

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References

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Neurowissenschaften Ausgabe 189
Soziales Isolationsmodell: Ein nichtinvasives Nagetiermodell für Stress und Angst
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Watanabe, S., Al Omran, A., Shao, A. … More

Watanabe, S., Al Omran, A., Shao, A. S., Liang, J. Social Isolation Model: A Noninvasive Rodent Model of Stress and Anxiety. J. Vis. Exp. (189), e64567, doi:10.3791/64567 (2022).

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