Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Flotationsbaseret T-celleisolering, aktivering og ekspansion fra mononukleære celleprøver fra humant perifert blod ved hjælp af mikrobobler

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64573

Summary

Formålet med denne undersøgelse er at demonstrere muligheden for flotationsbaseret adskillelse for at isolere, aktivere og udvide primære humane T-celler.

Abstract

Processen med at isolere T-celler fra mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) for at etablere ex vivo-kulturer er afgørende for forskning, klinisk testning og cellebaserede terapier. I denne undersøgelse præsenteres en enkel, ny protokol til at isolere, aktivere og udvide T-celler fra PBMC'er ex vivo . Denne undersøgelse anvender funktionaliseret opdriftsaktiveret cellesorteringsteknologi (BACS) til at isolere og aktivere T-celler. Kort fortalt involverer protokollen den positive udvælgelse af CD3+ celler fra leukopak-afledte PBMC'er efterfulgt af en 48 timers co-stimulering med prækonjugerede anti-CD28-bundne streptavidinmikrobobler (SAMB'er) før transduktion i 24-brøndsplader. Funktionaliserede mikrobobler giver en unik mulighed for at aktivere celler flydende, hvilket fører til proliferative fænotyper, der giver mulighed for ekspansion med minimal udmattelse. Denne teknik giver reduceret udmattelse, fordi de co-stimulerende mikrobobler forbliver flydende og vender tilbage til toppen af dyrkningsmediet, hvilket reducerer den tid, de ekspanderende celler er i kontakt med de co-stimulerende faktorer. Resultaterne indikerer, at de isolerede og dyrkede T-celler modtager tilstrækkelig stimulering til at aktivere og proliferere, men ikke i et omfang, der fører til overaktivering, hvilket derefter fører til udmattelse, som det fremgår af tilstedeværelsen af overdreven PD-1.

Introduction

Mere end 500 kliniske forsøg med kimær antigenreceptor (CAR)-T-celleterapi udføres i øjeblikket over hele verden, og fire CAR-T-celleterapiprodukter er tilgængelige på markedet1. Imidlertid eksisterer der stadig adskillige CAR-T-celleforsknings- og fremstillingsbehov, der skal løses for at forbedre effektiviteten, skalerbarheden og den langsigtede succes for disse potentielt helbredende terapier 2,3,4,5. Adoptiv CAR-T-celle klinisk forskning og fremstilling begynder med T-celleisolering fra en perifer blodprøve og den efterfølgende stimulering, transduktion og udvidelse af de isolerede celler. Parametre som T-cellegendannelse, renhed og aktiverings-/udmattelsessignaler kræver nøje overvejelse, når man vælger celleisolations- og stimuleringsteknikker til CAR-T-celleforskning og fremstilling 3,4,6. Det er vigtigt, at forbedring af den terapeutiske persistens af CAR-T-celleterapier ved at minimere de biologiske hindringer, der skyldes de nuværende fremstillingsprocesser, såsom T-celleudmattelse, er nødvendig for at forbedre den terapeutiske effekt 6,7.

Som et alternativ til traditionelle celleisoleringsmetoder såsom fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og magnetisk aktiveret cellesortering (MACS) demonstreres her opdriftsaktiveret cellesortering (BACS) med mikrobobler til T-celleisolering. Mikrobobleseparation bruger flydende, hule mikrosfærer (mikrobobler) til at binde målene og flyde dem til overfladen af væskeprøver 8,9. Ved at funktionalisere mikrobobler med antistoffer (dvs. anti-CD3) kan de ønskede T-cellepopulationer vælges positivt fra perifere blodprøver. Efterfølgende demonstreres brugen af en anden population af antistoffunktionaliserede mikrobobler (dvs. anti-CD28) til at co-stimulere og aktivere positivt udvalgte T-celler i suspension i dette arbejde. Mikrobobler tilbyder en enkel og meget justerbar isolations- og aktiveringsarbejdsgang, der genererer T-celler klar til suspenderet cellekultur og downstream-applikationer såsom genetisk modifikation og ekspansion. Kritisk fremmer flydende celleaktivering med mikrobobler tilbageholdt cellestimulering for at forhindre overdreven T-celleudmattelse7.

Til denne undersøgelse var flowcytometri det primære værktøj, der blev brugt til at analysere isolation, aktivering og transduktionssucces for de funktionaliserede mikrobobler samt til at give detaljerede oplysninger om de specifikke subpopulationer, der var til stede under vækst- og ekspansionsfaserne efter transduktion. Ud over flowcytometri blev brightfield- og fluorescensmikroskopi brugt til at bekræfte cellesundhed, morfologi og transduktionssucces. Baseret på disse resultater giver mikrobobleteknologien og protokollen et mere justerbart og blidere alternativ til de traditionelle isolations- og aktiveringsmetoder, der i øjeblikket anvendes i dag; især mikrobobleaktiverede celler viser især lavere ekspression af T-celleudmattelsesmarkører end den, der typisk observeres med industristandardværktøjer og -sæt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering af T-celler med mikrobobler ved hjælp af positiv selektion

BEMÆRK: Denne protokol beskriver en lille CD3+ positiv udvælgelsesmetode ved hjælp af SAMB'er.

  1. Inkuber 3 x 108 kommercielt opnåede PBMC'er i 2,5 ml separationsbuffer med biotinyleret anti-CD3 (OKT3) antistof i en koncentration på 25 ng antistof pr. 1 million celler (25 ng/M). Bland forsigtigt ved pipettering op og ned, og inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
  2. Tilsæt streptavidinmikrobobler (SAMB'er) i et forhold på 0,5 (SAMB-mængde):1 (cellemængde) i henhold til producentens rapporterede SAMB-koncentration.
  3. Bland ved hjælp af en kommerciel end-over-end (EOE) rotator ved 20 o / min i 10-15 minutter ved stuetemperatur. Centrifuger i 5 min ved 400 x g ved stuetemperatur.
  4. Efter centrifugering vil de positivt udvalgte celler være øverst på suspensionen med SAMB'erne. De resterende ikke-udvalgte celler vil være i cellepillen i bunden af røret. Brug en 9 i glaspipette til at indsætte spidsen under boblecellelaget i bunden af røret, opsuge cellepillen og subnatanten med en elektronisk pipette og overføre dem til et nyt rør.

2. Co-stimulering (aktivering) af de positivt udvalgte T-celler

  1. Resuspender boblecellelaget, der er tilbage i det oprindelige rør, i 1 ml komplet T-cellemedium (eller et andet ønsket medium).
  2. Tæl cellerne i subnatanten med brightfieldmikroskopi ved hjælp af en automatiseret celletæller, og træk denne værdi fra startcellenummeret for at bestemme antallet af celler, der er fanget i boblecellelaget.
  3. Før dette trin blandes det biotinylerede anti-CD28-antistof med kommercielle SAMB'er i mindst 2 timer for at skabe de konjugerede anti-CD28-SAMB'er. Kontakt SAMB-producenten for at bestemme mængden af anti-CD28-antistof, der er nødvendigt til konjugering. De konjugerede SAMB'er mod CD28 tilsættes boblecellesuspensionen som følge af trin 2.1 ved hjælp af et forhold på 1,5 (anti-CD28 SAMB'er):1 (celler).
  4. Bland ved hjælp af EOE-rotation i 15 minutter, og juster derefter det samlede volumen til 2 millioner celler pr. ml med komplet T-cellemedium eller et andet ønsket medium i henhold til cellenummeret opnået i trin 2.2.

3. Udvidelse af de co-stimulerede celler i cellekulturmedium

  1. Der fordeles 1 ml aktiverede celler fra trin 2.4 i en koncentration på 2 M/ml pr. hul i en plade med 24 huller. Der inkuberes i en befugtet 5 % CO2 -inkubator ved 37 °C.
  2. Efter 24 timer tilsættes 50 E/ml IL-2 og 25 ng/M opløseligt anti-CD3 (OKT3) for yderligere at fremme ekspansionen, beregnet ved hjælp af det oprindelige antal celler, der er belagt på dag 0. Cellepladen anbringes igen i den befugtede CO2 -inkubator, og lad den inkubere natten over ved 37 °C.

4. Valgfrit: Transduktion af aktiverede T-celler med lentivirus

BEMÆRK: Den fremgangsmåde, der anvendes her, er tilpasset fra Prommersberger et al. 10.

  1. Optø lentivirus ved stuetemperatur, og bland kort ved pipettering.
  2. Fjern forsigtigt mid-natanten, 600 μL fra hver brønd uden at røre ved dattercellerne, der nu er i bunden af brønden eller boblelaget, der er forblevet ved overfladen af opløsningen.
  3. Der tilsættes 5 μg/ml hexadimetherbromid pr. hul for at forbedre viral transduktion. Tilsæt lentivirale partikler ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 3 (lentivirale partikler pr. Celle).
  4. Pladen centrifugeres i 45 minutter ved 800 x g og 32 °C ved langsom acceleration og uden brud ved deceleration. Cellerne inkuberes i 4 timer i en befugtet CO2 -inkubator ved 37 °C.
  5. Efter 4 timer tilsættes 600 μL kommercielt tilgængeligt, friskt komplet T-cellemedium og 50 E / ml IL-2 til hvert hul, og cellepladen anbringes tilbage i den befugtede CO2 -inkubator ved 37 ° C til T-celleudvidelse.

5. Udvidelse af T-cellerne (med eller uden forudgående transduktion)

  1. Hver 2. dag fjernes halvdelen af substratet fra midten af natanten, erstattes med frisk, komplet T-cellemedium, og der tilsættes IL-2 i en koncentration på 50 E/ml.
  2. Tæl T-cellerne to gange om ugen for at vurdere celletætheden. Når celletætheden overstiger 2 x 10 6-2,5 x 106 celler / ml, overføres cellerne til en større beholder og fortyndes til 5 x 105 celler / ml.

6. Høstning af T-celler og flowcytometri

  1. Bland forsigtigt indholdet af hvert hul ved pipettering op og ned. Fjern hele indholdet af brønden, inklusive mikroboblerne, og overfør dem til et 1,5 ml rør.
  2. Hvert hul vaskes med 400 μL calciumfri og magnesiumfri DPBS (−/−), og opløsningen overføres til et 1,5 ml rør. Der centrifugeres ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  3. Supernatanten suges op, og cellepellet resuspenderes i 50 μl separationsbuffer.
  4. Plet med en aktiverings- og udmattelsesantistof/farvningscocktail, og inkuber i 10 min ved stuetemperatur i mørke. Forbered farvningscocktails som følger- aktiveringscocktail: AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; udmattelsescocktail: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
  5. Tilsæt 1 ml separationsbuffer, og bland forsigtigt. Centrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at vaske overskydende antistoffer ud. Supernatanten suges helt op.
  6. Cellepelleten gensuspenderes i 1 ml separationsbuffer, og overføres til en passende beholder (f.eks. et FACS-rør, en 96-brøndsplade osv.) til flowcytometrianalysen. Det anbefalede flowcytometrianalyseskema er beskrevet i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

T-celler blev isoleret fra købte PBMC'er og belagt til aktivering som beskrevet i protokollen. De negative kontrolprøver (købte PBMC'er) blev ikke aktiveret. Disse kontrolprøver blev inkluderet for at demonstrere den effekt, som mikrobobleaktiveringsprocessen havde på de eksperimentelle prøver sammenlignet med de uberørte og ustimulerede T-cellekontroller, hvilket sikrede, at de observerede aktiveringsmarkører var resultatet af de tilføjede aktiveringsfaktorer og ikke var iboende for T-cellerne selv. I henhold til den eksperimentelle oversigt i figur 2 blev cellerne podet ved 2 x 106 celler / ml i T-cellemedium og blev enten uberørt / ustimuleret eller co-stimuleret med anti-CD3 (klon OKT3) og anti-CD28 (klon 28.2) SAMB'er. Efter 48 timers stimulering i kultur blev cellerne transduceret med den lentivirale partikel, der koder for zsGreen. 4 dage og 6 dage efter transduktion blev cellerne afbildet, høstet og overfladefarvet ved hjælp af AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-PD-1 (eller PE-CD69 afhængigt af om henholdsvis udmattelses- eller aktiveringspanelerne blev brugt) og 7-AAD. zsGreen-transgenet kunne påvises i FITC-kanalen. Flowcytometrigatingmetoden er beskrevet i figur 1. Stigninger i levedygtige T-celletal og transgen-positive T-celler blev observeret mellem kontrolprøven og cellerne, der modtog mikroboble-co-stimulering (figur 3). Forhøjede effektorcellepopulationer blev også observeret i mikrobobleprøverne (figur 4). T-celler, der udtrykte øget aktivering og udmattelsesmarkører, blev observeret blandt de celleprøver, der modtog mikroboble-co-stimulering (figur 5 og figur 6). Celleudvidelse blev observeret mellem dag 4 og dag 6 tidspunkter for de co-stimulerede prøver, hvilket indikerer, at cellerne var aktive, proliferative og passerede transgenet, da de ekspanderede.

Figure 1
Figur 1: Eksempel på gating scheme-uberørt/negativ kontrolprøve. Fra singlets blev populationscellerne lukket ved hjælp af SSC-A / FSC-A. De samlede CD3 + celler blev lukket ud, efterfulgt af levedygtig CD3 + gating ved hjælp af 7-AAD for at bestemme befolkningens levedygtighed. Alle de efterfølgende populationer og beregninger blev bestemt ud fra den levedygtige 7-AAD(−)/CD3+(+) population, som vist ved hjælp af pilene, der angiver subpopulationsportene. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Oversigt over eksperimentel tidslinje. Protokollens dage er nævnt ovenfor, og de tilsvarende dage efter transduktion (D0-D6) anvendes i nedenstående figurer. Cellerne blev belagt umiddelbart efter selektion og aktivering. Kontrolbrøndene blev genereret ved hjælp af en mikroboble negativ udvælgelsesprotokol. Kontrol-T-cellerne modtog ikke co-stimuleringsmidler og gennemgik ikke transduktion, selvom de modtog IL-2 for at sikre, at cellerne blev holdt sunde nok til at opretholde rimelig levedygtighed under hele eksperimentet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Vurdering af levedygtige og vellykkede transducerede celler efter transduktion. (A) Levedygtige CD3+ celler 4 dage og 6 dage efter transduktion. Levedygtighed blev bestemt gennem flowcytometrianalyse, hvor populationen blev kvantificeret ved gating på 7-AAD (-) / CD3 + (+) celler. (B) Antallet af celler, der med succes blev transduceret med rLV.EF1.zsGreen, blev bestemt gennem flowcytometri, hvor den levedygtige 7-AAD (-) / CD3 + (+) population blev yderligere gated i zsGreen (+) celler. Alle betingelserne blev udført i tre eksemplarer (n = 3). Dataene repræsenterer middelværdien ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Levedygtige CD4+- og CD8+ T-celler. CD4+ og CD8+ T-celleunderpopulationerne blev kvantificeret ved at gating på den levedygtige CD3+ population (CD3+ [+]/7-AAD[−]) og måle ekspressionen af (A) CD4+ og (B) CD8+. Alle betingelser blev udført i tre eksemplarer (n = 3). Dataene repræsenterer middel ± SD. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Levedygtige aktiverede T-celler. Den levedygtige CD3+ population blev også analyseret for specifikke aktiveringsmarkører som angivet i figurerne ovenfor. (A) CD69 er en tidlig markør for aktivering; (B) CD25 er en midt-til-sen aktiveringsmarkør. Procenterne over fejlbjælkerne repræsenterer procentdelen af levedygtige CD3+ celler, der udtrykker den respektive markør. Alle betingelserne blev udført i tre eksemplarer (n = 3). Dataene repræsenterer middel ± SD. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Udmattede T-celler. Den levedygtige CD3+ population blev også analyseret for udmattelse (PD-1) markører. (A) Det samlede antal 7-AAD(−)/CD3+(+)/PD-1+(+)-celler på dag 4 og dag 6 efter transduktion. (B) Procentdelen af PD-1+ celler. På dag 4 og dag 6 havde den aktiverede/transducerede prøvepopulation ~25% levedygtige CD3+/PD-1+ celler, mens kontrolprøvepopulationen havde ~2% levedygtige CD3+/PD-1+ celler. Det skal bemærkes, at det startende / isolerede materiale havde < ~ 15% levedygtige CD3 + / PD-1 + celler (data efter isolering / prækultur ikke vist). Alle betingelser blev udført i tre eksemplarer (n = 3). Dataene repræsenterer middelværdien ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne protokol giver mulighed for isolering af T-celler fra PBMC-prøver og aktivering af suspenderede T-celler i kulturmedier med mikrobobler. Denne metode er afhængig af funktionaliserede mikrobobler, hvis iboende opdrift giver en unik mulighed for at introducere co-stimulerende signaler til celler og aktivere dem, mens de suspenderes i et dyrkningsmedium, hvorved de ekspanderende cellers eksponering for langvarig stimulering reduceres; sådan overstimulering kan resultere i øget ekspression af T-celleudmattelsesmarkører og reduceret terapeutisk effekt11. Stimulerede T-celler, der er flydende fastgjort til funktionaliserede mikrobobler, producerer uberørte datterceller, der falder til bunden af cellekulturpladen for ekspansion, hvilket tillader en vækstperiode væk fra de flydende stimuleringsfaktorer. Det er blevet beskrevet i litteraturen, hvordan langvarig eksponering af isolerede T-celler for stimuleringsfaktorer - såsom magnetiske perlebaserede protokoller12 - kan påvirke ekspansionen og den terapeutiske effekt negativt 6,7,11.

Da denne rapporterede protokol er afhængig af den positive selektion af CD3+ -celler, er det afgørende at fjerne subnatanten under boblecellelaget omhyggeligt, men grundigt i isolationsfasen af denne protokol. Dette sikrer, at kun den positivt udvalgte T-cellepopulation stimuleres og belægges yderligere. Dette er også et vigtigt skridt til bestemmelse af antallet af celler valgt fra start-PBMC-prøven, hvilket er nødvendigt for nøjagtige co-stimulerings- og pletteringsberegninger.

Disse mikrobobleprotokoludviklingsaktiviteter til T-celleaktivering og ekspansion udnyttede en bred vifte af markører under flowcytometrianalyse, hvilket muliggjorde en grundig karakterisering af den isolerede og stimulerede T-cellepopulation for at vurdere kritiske T-celleparametre, herunder aktivering, udmattelse og klonal ekspansion. Sammenlignet med almindeligt anvendte T-celleisolerings- og stimuleringsteknologier, såsom magnetiske perlebaserede protokoller, sigter denne mikrobobleprotokol mod at minimere overstimulering af celler uden at ofre ekspansionen og de tilsvarende effektorfunktionsevner hos de isolerede T-celler. Fremtidige anvendelser af denne mikrobobleteknik vil omfatte forskellige protokoller til T-cellepositiv selektion, co-stimulering og efterfølgende mikroboblecellekulturer for at imødekomme en række arbejdsgangsbehov for celleterapiforsknings- og produktionssamfund.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere er på indsendelsestidspunktet ansatte i Akadeum Life Sciences, der fremstiller og sælger mikrobobleseparationsprodukter.

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023 CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates VWR  76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody Biolegend 302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody Biolegend 317320
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IL2  BioVision (vwr) 10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 Takara Bio 0038VCT
Leukopak BioIVT HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs BioIVT HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture VWR 97063-708 CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated Innovative Research ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES Gibco 72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) Akadeum 11110-000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).

Tags

Immunologi og infektion udgave 190
Flotationsbaseret T-celleisolering, aktivering og ekspansion fra mononukleære celleprøver fra humant perifert blod ved hjælp af mikrobobler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Snow, T., Roussey, J., Wegner, C.,More

Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles. J. Vis. Exp. (190), e64573, doi:10.3791/64573 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter