Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

माइक्रोबबल का उपयोग करके मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल नमूनों से प्लवनशीलता-आधारित टी सेल अलगाव, सक्रियण और विस्तार

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64573
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

Summary

इस अध्ययन का उद्देश्य प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं को अलग करने, सक्रिय करने और विस्तार करने के लिए प्लवनशीलता-आधारित पृथक्करण की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करना है।

Abstract

पूर्व विवो संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से टी कोशिकाओं को अलग करने की प्रक्रिया अनुसंधान, नैदानिक परीक्षण और सेल-आधारित उपचारों के लिए महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन में, पीबीएमसी एक्स विवो से टी कोशिकाओं को अलग करने, सक्रिय करने और विस्तारित करने के लिए एक सरल, नया प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। यह अध्ययन टी कोशिकाओं को अलग करने और सक्रिय करने के लिए कार्यात्मक उछाल-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (बीएसीएस) तकनीक का उपयोग करता है। संक्षेप में, प्रोटोकॉल में ल्यूकोपाक-व्युत्पन्न पीबीएमसी से सीडी 3 + कोशिकाओं का सकारात्मक चयन शामिल है, इसके बाद 24-वेल प्लेटों में पारगमन से पहले पूर्व-संयुग्मित एंटी-सीडी 28-बाउंड स्ट्रेप्टाविडिन माइक्रोबबल्स (एसएएमबी) के साथ 48 घंटे की सह-उत्तेजना होती है। कार्यात्मक माइक्रोबबल कोशिकाओं को सक्रिय करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं, जिससे प्रोलिफेरेटिव फेनोटाइप होते हैं जो न्यूनतम थकावट के साथ विस्तार की अनुमति देते हैं। यह तकनीक कम थकावट प्रदान करती है क्योंकि सह-उत्तेजक माइक्रोबबलउत्तेजित रहते हैं और संस्कृति माध्यम के शीर्ष पर वापस आ जाते हैं, इस प्रकार विस्तारित कोशिकाओं को सह-उत्तेजक कारकों के संपर्क में आने वाले समय की मात्रा कम हो जाती है। परिणाम बताते हैं कि पृथक और सुसंस्कृत टी कोशिकाओं को सक्रिय और प्रसार के लिए पर्याप्त उत्तेजना प्राप्त होती है, लेकिन उस हद तक नहीं जो अतिसक्रियण की ओर जाता है, जो तब थकावट की ओर जाता है, जैसा कि अत्यधिक पीडी -1 की उपस्थिति से प्रदर्शित होता है।

Introduction

500 से अधिक चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर)-टी सेल थेरेपी नैदानिक परीक्षण वर्तमान में दुनिया भर में आयोजित किए जा रहे हैं, और चार सीएआर-टी सेल थेरेपी उत्पाद बाजारपर उपलब्ध हैं। हालांकि, कई सीएआर-टी सेल अनुसंधान और विनिर्माण आवश्यकताएं अभी भी मौजूद हैं जिन्हें इन संभावित उपचारात्मक उपचारों 2,3,4,5 की प्रभावकारिता, मापनीयता और दीर्घकालिक सफलता में सुधार के लिए संबोधित किया जाना चाहिए। दत्तक सीएआर-टी सेल नैदानिक अनुसंधान और विनिर्माण परिधीय रक्त नमूने से टी सेल अलगाव और बाद में उत्तेजना, पारगमन और पृथक कोशिकाओं के विस्तार के साथ शुरू होता है। टी सेल रिकवरी, शुद्धता और सक्रियण / थकावट संकेतों जैसे मापदंडों को सीएआर-टी सेल अनुसंधान और विनिर्माण 3,4,6 के लिए सेल अलगाव और उत्तेजनातकनीकों का चयन करते समय सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता होती है। महत्वपूर्ण रूप से, चिकित्सीय प्रभावकारिता 6,7 को बढ़ाने के लिए वर्तमान विनिर्माण प्रक्रियाओं, जैसे टी सेल थकावट के परिणामस्वरूप जैविक बाधाओं को कम करके सीएआर-टी सेल थेरेपी की चिकित्सीय दृढ़ता में सुधार की आवश्यकता है।

पारंपरिक सेल अलगाव विधियों जैसे फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) और चुंबकीय-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एमएसीएस) के विकल्प के रूप में, यहां, टी सेल अलगाव के लिए माइक्रोबबल के साथ उछाल-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (बीएसीएस) का प्रदर्शन किया जाता है। माइक्रोबबल पृथक्करण लक्ष्यों को बांधने और उन्हें द्रव नमूने 8,9 की सतह पर तैरने के लिए उत्प्लावन, खोखले माइक्रोसेफर्स (माइक्रोबबल) का उपयोग करता है। एंटीबॉडी (यानी, एंटी-सीडी 3) के साथ माइक्रोबबल को कार्यात्मक बनाकर, वांछित टी सेल आबादी को परिधीय रक्त नमूनों से सकारात्मक रूप से चुना जा सकता है। इसके बाद, निलंबन में सकारात्मक रूप से चयनित टी कोशिकाओं को सह-उत्तेजित और सक्रिय करने के लिए एंटीबॉडी-कार्यात्मक माइक्रोबबल (यानी, एंटी-सीडी 28) की एक अलग आबादी का उपयोग इस काम में प्रदर्शित किया गया है। माइक्रोबबलएक सरल और अत्यधिक अक्षम अलगाव और सक्रियण वर्कफ़्लो प्रदान करते हैं जो निलंबित सेल संस्कृति और अनुवांशिक संशोधन और विस्तार जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार टी कोशिकाओं को उत्पन्न करता है। गंभीर रूप से, माइक्रोबबल्स के साथ उत्प्लावन सेल सक्रियण अत्यधिक टी सेल थकावट को रोकने के लिए संयमित सेल उत्तेजना को बढ़ावादेता है।

इस अध्ययन के लिए, फ्लो साइटोमेट्री प्राथमिक उपकरण था जिसका उपयोग कार्यात्मक माइक्रोबबल्स के अलगाव, सक्रियण और पारगमन की सफलता का विश्लेषण करने के साथ-साथ ट्रांसडक्शन के बाद विकास और विस्तार चरणों के दौरान मौजूद विशिष्ट उप-आबादी के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करने के लिए किया जाता था। फ्लो साइटोमेट्री के अलावा, सेल स्वास्थ्य, आकृति विज्ञान और पारगमन सफलता की पुष्टि करने के लिए ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया गया था। इन परिणामों के आधार पर, माइक्रोबबल तकनीक और प्रोटोकॉल वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक अलगाव और सक्रियण विधियों के लिए एक अधिक असमर्थ और सौम्य विकल्प प्रदान करते हैं; विशेष रूप से, माइक्रोबबल-सक्रिय कोशिकाएं टी सेल थकावट मार्करों की विशेष रूप से कम अभिव्यक्ति दिखाती हैं जो आमतौर पर उद्योग-मानक उपकरणों और किट के साथ देखी जाती हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सकारात्मक चयन का उपयोग करके माइक्रोबबल के साथ टी कोशिकाओं का अलगाव

नोट: यह प्रोटोकॉल एसएएमबी का उपयोग करके एक छोटे पैमाने पर सीडी 3 + सकारात्मक चयन दृष्टिकोण का विवरण देता है।

  1. इनक्यूबेट 3 x 108 व्यावसायिक रूप से बायोटिनिलेटेड एंटी-सीडी 3 (ओकेटी 3) एंटीबॉडी के साथ 2.5 एमएल पृथक्करण बफर में प्रति 1 मिलियन कोशिकाओं (25 एनजी / एम) एंटीबॉडी के 25 एनजी की एकाग्रता पर पीबीएमसी प्राप्त करते हैं। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  2. निर्माता की रिपोर्ट की गई एसएएमबी एकाग्रता के अनुसार 0.5 (एसएएमबी मात्रा): 1 (सेल मात्रा) के अनुपात में स्ट्रेप्टाविडिन माइक्रोबबल्स (एसएएमबी) जोड़ें।
  3. कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए 20 आरपीएम पर वाणिज्यिक एंड-ओवर-एंड (ईओई) रोटेटर का उपयोग करके मिलाएं। कमरे के तापमान पर 400 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  4. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सकारात्मक रूप से चयनित कोशिकाएं एसएएमबी के साथ निलंबन के शीर्ष पर होंगी। शेष गैर-चयनित कोशिकाएं ट्यूब के तल पर सेल पेलेट में होंगी। ग्लास पिपेट में 9 का उपयोग करके, बुलबुला-सेल परत के नीचे की नोक को ट्यूब के तल पर डालें, सेल पेलेट और सबनैटेंट को इलेक्ट्रॉनिक पिपेट के साथ एस्पिरेट करें और उन्हें एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।

2. सकारात्मक रूप से चयनित टी कोशिकाओं की सह-उत्तेजना (सक्रियण)

  1. पूर्ण टी सेल माध्यम (या किसी अन्य वांछित माध्यम) के 1 एमएल में मूल ट्यूब में शेष बबल-सेल परत को पुन: निलंबित करें।
  2. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ सबनैटेंट में कोशिकाओं की गणना करें, और बबल-सेल परत में कैप्चर की गई कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए शुरुआती सेल नंबर से इस मान को घटाएं।
  3. इस चरण से पहले, संयुग्मित एंटी-सीडी 28 एसएएमबी बनाने के लिए कम से कम 2 घंटे के लिए वाणिज्यिक एसएएमबी के साथ बायोटिनिलेटेड एंटी-सीडी 28 एंटीबॉडी मिलाएं। संयुग्मन के लिए आवश्यक एंटी-सीडी 28 एंटीबॉडी की मात्रा निर्धारित करने के लिए एसएएमबी निर्माता से संपर्क करें। 1.5 (एंटी-सीडी 28 एसएएमबी): 1 (कोशिकाओं) के अनुपात का उपयोग करके चरण 2.1 से उत्पन्न बबल-सेल निलंबन में एंटी-सीडी 28 संयुग्मित एसएएमबी जोड़ें।
  4. 15 मिनट के लिए ईओई रोटेशन का उपयोग करके मिलाएं, और फिर चरण 2.2 में प्राप्त सेल संख्या के अनुसार पूर्ण टी सेल माध्यम या किसी अन्य वांछित माध्यम के साथ कुल मात्रा को 2 मिलियन कोशिकाओं प्रति एमएल में समायोजित करें।

3. सेल कल्चर माध्यम में सह-उत्तेजित कोशिकाओं का विस्तार

  1. चरण 2.4 से 2 एम / एमएल प्रति कुएं की एकाग्रता पर 1 एमएल सक्रिय कोशिकाओं को 24-वेल प्लेट में वितरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  2. 24 घंटे के बाद, विस्तार को प्रोत्साहित करने के लिए आईएल -2 के 50 यू / एमएल और घुलनशील एंटी-सीडी 3 (ओकेटी 3) के 25 एनजी / एम जोड़ें, जैसा कि दिन 0 पर चढ़ाए गए कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या का उपयोग करके गणना की जाती है। सेल प्लेट को ह्यूमिडिफाइड सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस रखें, और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करने दें।

4. वैकल्पिक: लेंटीवायरस के साथ सक्रिय टी कोशिकाओं का पारगमन

नोट: यहां उपयोग किया जाने वाला दृष्टिकोण प्रॉमर्सबर्गर एट अल से अनुकूलित है। 10.

  1. कमरे के तापमान पर लेंटीवायरस को पिघलाएं, और संक्षेप में पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
  2. धीरे से प्रत्येक कुएं से मध्य-नटेंट, 600 μL को हटा दें, बेटी कोशिकाओं को स्पर्श किए बिना जो अब कुएं के तल पर हैं या बुलबुला परत जो घोल की सतह पर बनी हुई है।
  3. वायरल ट्रांसडक्शन को बढ़ाने के लिए प्रति अच्छी तरह से 5 μg / mL हेक्साडिमेथ्रिन ब्रोमाइड जोड़ें। 3 (लेंटिवायरल कण प्रति सेल लेंटिवायरल कण) की बहुलता (एमओआई) पर लेंटिवायरल कण जोड़ें।
  4. धीमी गति से त्वरण का उपयोग करके प्लेट को 45 मिनट के लिए 800 x g और 32 °C पर सेंट्रीफ्यूज करें और मंदी के लिए कोई ब्रेक न दें। 37 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफायर सीओ2 इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. 4 घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, ताजा पूर्ण टी सेल माध्यम और आईएल -2 के 50 यू / एमएल जोड़ें, और टी सेल विस्तार के लिए सेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफाइड सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस रखें।

5. टी कोशिकाओं का विस्तार (पूर्व पारगमन के साथ या बिना)

  1. हर 2 दिनों में, माध्यम के आधे हिस्से को मध्य-नटेंट से हटा दें, इसे ताजा, पूर्ण टी सेल माध्यम से बदलें, और 50 यू / एमएल की एकाग्रता पर आईएल -2 जोड़ें।
  2. सेल घनत्व का आकलन करने के लिए प्रति सप्ताह दो बार टी कोशिकाओं की गणना करें। जब सेल घनत्व 2 x 10 6-2.5 x 106 कोशिकाओं / एमएल से अधिक हो जाता है, तो कोशिकाओं को एक बड़े पोत में स्थानांतरित करें, उन्हें 5 x 105 कोशिकाओं / एमएल तक पतला करें।

6. टी कोशिकाओं और प्रवाह साइटोमेट्री की कटाई

  1. धीरे-धीरे प्रत्येक कुएं की सामग्री को ऊपर और नीचे करके मिलाएं। माइक्रोबबल सहित कुएं की पूरी सामग्री को हटा दें, और उन्हें 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. कैल्शियम मुक्त और मैग्नीशियम मुक्त डीपीबीएस (−/−) के 400 μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से धोएं, और घोल को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  3. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और सेल पेलेट को 50 μL पृथक्करण बफर में पुन: निलंबित करें।
  4. एक सक्रियण और थकावट एंटीबॉडी / धुंधला कॉकटेल के साथ दाग, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। स्टेनिंग कॉकटेल निम्नानुसार तैयार करें- सक्रियण कॉकटेल: एएफ 700-सीडी 3, पीई / डैज़ल-सीडी 4, पीई / साइ 7-सीडी 8, बीवी 510-सीडी 25, पीई-सीडी 6 9; थकावट कॉकटेल: एएफ 700-सीडी 3, पीई / डैज़ल-सीडी 4, पीई / Cy7-CD8, PE-PD-1।
  5. 1 एमएल पृथक्करण बफर जोड़ें, और धीरे से मिलाएं। अतिरिक्त एंटीबॉडी को धोने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सुपरनैटेंट को पूरी तरह से एस्पिरेट करें।
  6. सेल पेलेट को 1 एमएल पृथक्करण बफर में पुन: निलंबित करें, और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त पोत (जैसे, एक एफएसीएस ट्यूब, एक 96-वेल प्लेट, आदि) में स्थानांतरित करें। अनुशंसित प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण गेटिंग योजना चित्रा 1 में विस्तृत है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

टी कोशिकाओं को खरीदे गए पीबीएमसी से अलग किया गया था और प्रोटोकॉल में वर्णित सक्रियण के लिए चढ़ाया गया था। नकारात्मक नियंत्रण नमूने (खरीदे गए पीबीएमसी) सक्रिय नहीं थे। इन नियंत्रण नमूनों को अनछुए और अनियंत्रित टी सेल नियंत्रणों की तुलना में प्रयोगात्मक नमूनों पर माइक्रोबबल सक्रियण प्रक्रिया के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए शामिल किया गया था, यह सुनिश्चित करते हुए कि देखे गए सक्रियण मार्कर अतिरिक्त सक्रियण कारकों का परिणाम थे और स्वयं टी कोशिकाओं में अंतर्निहित नहीं थे। चित्रा 2 में प्रयोगात्मक रूपरेखा के अनुसार, कोशिकाओं को टी सेल माध्यम में 2 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर बीज दिया गया था और एंटी-सीडी 3 (क्लोन ओकेटी 3) और एंटी-सीडी 28 (क्लोन 28.2) एसएएमबी के साथ या तो अछूता / उत्तेजित या सह-उत्तेजित किया गया था। संस्कृति में उत्तेजना के 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को zsGreen के लिए लेंटिवायरल कण एन्कोडिंग के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था। ट्रांसडक्शन के बाद 4 दिनों और 6 दिनों में, कोशिकाओं को एएफ 700-सीडी 3, पीई / डैज़ल-सीडी 4, पीई / साइ 7-सीडी 8, बीवी 510-सीडी 25, पीई-पीडी -1 (या पीई-सीडी 69) का उपयोग करके चित्रित, कटाई और सतह-दाग दिया गया था। zsGreen ट्रांसजेन FITC चैनल में पता लगाने योग्य था। फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग दृष्टिकोण चित्रा 1 में विस्तृत है। नियंत्रण नमूने और माइक्रोबबल सह-उत्तेजना प्राप्त करने वाली कोशिकाओं के बीच व्यवहार्य टी सेल संख्या और ट्रांसजीन-पॉजिटिव टी कोशिकाओं में वृद्धि देखी गई (चित्रा 3)। माइक्रोबबल नमूनों (चित्रा 4) में प्रभावक कोशिका आबादी में वृद्धि भी देखी गई। बढ़ी हुई सक्रियण और थकावट मार्करों को व्यक्त करने वाली टी कोशिकाओं को माइक्रोबबल सह-उत्तेजना प्राप्त करने वाले सेल नमूनों के बीच देखा गया (चित्रा 5 और चित्रा 6)। सह-उत्तेजित नमूनों के दिन 4 और दिन 6 के समय बिंदुओं के बीच सेल विस्तार देखा गया था, यह दर्शाता है कि कोशिकाएं सक्रिय, प्रोलिफेरेटिव और ट्रांसजीन को पारित कर रही थीं क्योंकि वे विस्तारित हुए थे।

Figure 1
चित्रा 1: उदाहरण गेटिंग स्कीम-अनछुआ / नकारात्मक नियंत्रण नमूना। सिंगल्स से शुरू होकर, जनसंख्या कोशिकाओं को एसएससी-ए / एफएससी-ए का उपयोग करके गेट किया गया था। कुल सीडी 3 + कोशिकाओं को गेट आउट किया गया था, इसके बाद आबादी की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए 7-एएडी का उपयोग करके व्यवहार्य सीडी 3 + गेटिंग की गई थी। बाद की सभी आबादी और गणना व्यवहार्य 7-एएडी (−)/सीडी 3 + (+) आबादी से निर्धारित की गई थी, जैसा कि उप-जनसंख्या द्वारों को इंगित करने वाले तीरों का उपयोग करके दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: प्रायोगिक समयरेखा अवलोकन। प्रोटोकॉल के दिनों को ऊपर नोट किया गया है, और ट्रांसडक्शन के बाद के संबंधित दिनों (डी 0-डी 6) का उपयोग नीचे दिए गए आंकड़ों में किया जाता है। चयन और सक्रियण के तुरंत बाद कोशिकाओं को चढ़ाया गया था। नियंत्रण कुओं को माइक्रोबबल नकारात्मक चयन प्रोटोकॉल का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। नियंत्रण टी कोशिकाओं को सह-उत्तेजना एजेंट प्राप्त नहीं हुए और पारगमन से नहीं गुजरना पड़ा, हालांकि उन्हें आईएल -2 प्राप्त हुआ ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोशिकाओं को प्रयोग के दौरान उचित व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए पर्याप्त स्वस्थ रखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ट्रांसडक्शन के बाद व्यवहार्य और सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूस कोशिकाओं का आकलन। (ए) व्यवहार्य सीडी 3 + कोशिकाएं ट्रांसडक्शन के 4 दिन और 6 दिन बाद। व्यवहार्यता प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से निर्धारित की गई थी, जिसमें 7-एएडी (−)/सीडी 3 + (+) कोशिकाओं पर सिंचाई करके जनसंख्या की मात्रा निर्धारित की गई थी। (ख) आरएलवी.ईएफ1.जेडएसग्रीन के साथ सफलतापूर्वक ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं की संख्या फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से निर्धारित की गई थी, जिसमें व्यवहार्य 7-एएडी (−)/सीडी3+(+) आबादी को आगे जेडएसग्रीन (+) कोशिकाओं में प्रवेश किया गया था। सभी शर्तों को तीन प्रतियों (एन = 3) में किया गया था। डेटा SD ± का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: व्यवहार्य सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाएं। सीडी 4 + और सीडी 8 + टी सेल उप-आबादी को व्यवहार्य सीडी 3 + आबादी (सीडी 3 + [+]/7-एएडी [−]) पर सिंचाई करके और (ए) सीडी 4 + और (बी) सीडी 8 + की अभिव्यक्ति को मापकर निर्धारित किया गया था। सभी शर्तों को तीन प्रतियों (एन = 3) में किया गया था। डेटा SD ± का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: व्यवहार्य सक्रिय टी कोशिकाएं। व्यवहार्य सीडी 3 + आबादी का विश्लेषण विशिष्ट सक्रियण मार्करों के लिए भी किया गया था जैसा कि ऊपर दिए गए आंकड़ों में दर्शाया गया है। (ए) सीडी 69 सक्रियण का एक प्रारंभिक मार्कर है; (बी) सीडी 25 एक मध्य-से-देर से सक्रियण मार्कर है। त्रुटि पट्टियों के ऊपर प्रतिशत संबंधित मार्कर को व्यक्त करने वाले व्यवहार्य सीडी 3 + कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। सभी शर्तों को तीन प्रतियों (एन = 3) में किया गया था। डेटा SD ± का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: थके हुए टी कोशिकाएं। थकावट (पीडी -1) मार्करों के लिए व्यवहार्य सीडी 3 + आबादी का भी विश्लेषण किया गया था। (ए) ट्रांसडक्शन के बाद दिन 4 और दिन 6 में 7-एएडी (−)/सीडी3+(+)/पीडी-1+(+) कोशिकाओं की कुल संख्या। (बी) पीडी -1 + कोशिकाओं का प्रतिशत। दिन 4 और दिन 6 पर, सक्रिय / ट्रांसड्यूस्ड नमूना आबादी में ~ 25% व्यवहार्य सीडी 3 + / पीडी -1 + कोशिकाएं थीं, जबकि नियंत्रण नमूना आबादी में ~ 2% व्यवहार्य सीडी 3 + / पीडी -1 + कोशिकाएं थीं। ध्यान दें, प्रारंभिक / पृथक सामग्री में < ~ 15% व्यवहार्य सीडी 3 + / पीडी -1 + कोशिकाएं थीं (पोस्ट-आइसोलेशन / प्री-कल्चर डेटा नहीं दिखाया गया)। सभी शर्तों को तीन प्रतियों (एन = 3) में किया गया था। डेटा SD ± का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

वर्णित प्रोटोकॉल पीबीएमसी नमूनों से टी कोशिकाओं के अलगाव और माइक्रोबबल के साथ संस्कृति मीडिया में निलंबित टी कोशिकाओं के सक्रियण की अनुमति देता है। यह विधि कार्यात्मक माइक्रोबबल्स पर निर्भर करती है जिनकी अंतर्निहित उछाल कोशिकाओं को सह-उत्तेजक संकेतों को पेश करने और उन्हें सक्रिय करने का एक अनूठा अवसर प्रदान करती है, जबकि वे एक संस्कृति माध्यम में निलंबित होते हैं, जिससे विस्तारित कोशिकाओं के जोखिम को लंबे समय तक उत्तेजना के लिए कम किया जाता है; इस तरह के अतिउत्तेजना के परिणामस्वरूप टी सेल थकावट मार्करों की अभिव्यक्ति में वृद्धि हो सकती है और चिकित्सीय प्रभावकारिता कम हो सकतीहै। उत्तेजित टी कोशिकाएं जो कार्यात्मक माइक्रोबबल से जुड़ी होती हैं, अनछुई बेटी कोशिकाओं का उत्पादन करती हैं जो विस्तार के लिए सेल कल्चर प्लेट के तल तक गिरती हैं, जिससे उत्प्लावन उत्तेजना कारकों से दूर विकास की अवधि की अनुमति मिलती है। साहित्य में यह विस्तृत किया गया है कि कैसे उत्तेजना कारकों के लिए पृथक टी कोशिकाओं के लंबे समय तक संपर्क - जैसे चुंबकीय मोती-आधारित प्रोटोकॉल12 - विस्तार और चिकित्सीय प्रभावकारिता 6,7,11 पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है।

जैसा कि यह रिपोर्ट किया गया प्रोटोकॉल सीडी 3 + कोशिकाओं के सकारात्मक चयन पर निर्भर करता है, इस प्रोटोकॉल के अलगाव चरण के दौरान बबल-सेल परत के नीचे सबनैटेंट को सावधानीपूर्वक लेकिन अच्छी तरह से निकालना महत्वपूर्ण है। यह सुनिश्चित करता है कि केवल सकारात्मक रूप से चयनित टी सेल आबादी को आगे उत्तेजित और चढ़ाया जाता है। यह शुरुआती पीबीएमसी नमूने से चयनित कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए भी एक महत्वपूर्ण कदम है, जो सटीक सह-उत्तेजना और चढ़ाना गणना के लिए आवश्यक है।

टी सेल सक्रियण और विस्तार के लिए इन माइक्रोबबल प्रोटोकॉल विकास गतिविधियों ने फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के दौरान मार्करों की एक विस्तृत श्रृंखला का लाभ उठाया, जिससे सक्रियण, थकावट और क्लोनल विस्तार सहित महत्वपूर्ण टी सेल मापदंडों का आकलन करने के लिए पृथक और उत्तेजित टी सेल आबादी के गहन लक्षण वर्णन की अनुमति मिली। जब आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले टी सेल अलगाव और उत्तेजना प्रौद्योगिकियों, जैसे चुंबकीय मोती-आधारित प्रोटोकॉल की तुलना में, इस माइक्रोबबल प्रोटोकॉल का उद्देश्य पृथक टी कोशिकाओं के विस्तार और संबंधित प्रभावकारक कार्य क्षमताओं का त्याग किए बिना कोशिकाओं के अतिउत्तेजना को कम करना है। इस माइक्रोबबल तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों में सेल थेरेपी अनुसंधान और विनिर्माण समुदायों के लिए विभिन्न प्रकार की वर्कफ़्लो आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए टी सेल पॉजिटिव चयन, सह-उत्तेजना और बाद में माइक्रोबबल सेल संस्कृतियों के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल शामिल होंगे।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

सभी लेखक, प्रस्तुत करने के समय, अकादेम लाइफ साइंसेज के कर्मचारी हैं, जो माइक्रोबबल पृथक्करण उत्पादों का निर्माण और बिक्री करता है।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023 CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates VWR  76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody Biolegend 302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody Biolegend 317320
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IL2  BioVision (vwr) 10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 Takara Bio 0038VCT
Leukopak BioIVT HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs BioIVT HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture VWR 97063-708 CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated Innovative Research ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES Gibco 72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) Akadeum 11110-000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 190
माइक्रोबबल का उपयोग करके मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल नमूनों से प्लवनशीलता-आधारित टी सेल अलगाव, सक्रियण और विस्तार
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Snow, T., Roussey, J., Wegner, C.,… More

Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles. J. Vis. Exp. (190), e64573, doi:10.3791/64573 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter