Summary
El objetivo de este estudio es demostrar la viabilidad de la separación basada en flotación para aislar, activar y expandir las células T humanas primarias.
Abstract
El proceso de aislamiento de células T de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para establecer cultivos ex vivo es crucial para la investigación, las pruebas clínicas y las terapias basadas en células. En este estudio, se presenta un protocolo simple y novedoso para aislar, activar y expandir las células T de PBMC ex vivo . Este estudio utiliza la tecnología de clasificación celular activada por flotabilidad funcionalizada (BACS) para aislar y activar las células T. Brevemente, el protocolo implica la selección positiva de células CD3 + de PBMC derivadas de leukopak, seguida de una coestimulación de 48 h con microburbujas de estreptavidina (SAMB) anti-CD28 unidas a CD28 antes de la transducción en placas de 24 pocillos. Las microburbujas funcionalizadas ofrecen una oportunidad única para activar las células de forma boyante, lo que lleva a fenotipos proliferativos que permiten la expansión con un agotamiento mínimo. Esta técnica ofrece un agotamiento reducido porque las microburbujas coestimuladoras permanecen flotantes y regresan a la parte superior del medio de cultivo, reduciendo así la cantidad de tiempo que las células en expansión están en contacto con los factores coestimuladores. Los resultados indican que las células T aisladas y cultivadas reciben suficiente estimulación para activarse y proliferar, pero no en una medida que conduzca a la sobreactivación, que luego conduce al agotamiento, como lo demuestra la presencia de PD-1 excesiva.
Introduction
Actualmente se están llevando a cabo más de 500 ensayos clínicos de terapia de células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR) en todo el mundo, y cuatro productos de terapia de células CAR-T están disponibles en el mercado1. Sin embargo, todavía existen numerosas necesidades de investigación y fabricación de células CAR-T que deben abordarse para mejorar la eficacia, la escalabilidad y el éxito a largo plazo de estas terapias potencialmente curativas 2,3,4,5. La investigación clínica y la fabricación adoptiva de células CAR-T comienza con el aislamiento de células T de una muestra de sangre periférica y la posterior estimulación, transducción y expansión de las células aisladas. Parámetros como la recuperación de células T, la pureza y las señales de activación/agotamiento requieren una cuidadosa consideración al elegir las técnicas de aislamiento y estimulación celular para la investigación y fabricación de células CAR-T 3,4,6. Es importante destacar que la mejora en la persistencia terapéutica de las terapias de células CAR-T minimizando los impedimentos biológicos que resultan de los procesos de fabricación actuales, como el agotamiento de las células T, es necesaria para mejorar la eficacia terapéutica 6,7.
Como alternativa a los métodos tradicionales de aislamiento celular, como la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la clasificación celular activada magnéticamente (MACS), aquí se demuestra la clasificación celular activada por flotabilidad (BACS) con microburbujas para el aislamiento de células T. La separación de microburbujas utiliza microesferas huecas flotantes (microburbujas) para unir los objetivos y hacerlos flotar a la superficie de las muestras de fluidos 8,9. Al funcionalizar microburbujas con anticuerpos (es decir, anti-CD3), las poblaciones de células T deseadas pueden seleccionarse positivamente a partir de muestras de sangre periférica. Posteriormente, se demuestra en este trabajo el uso de una población diferente de microburbujas funcionalizadas con anticuerpos (es decir, anti-CD28) para coestimular y activar células T seleccionadas positivamente en suspensión. Las microburbujas ofrecen un flujo de trabajo de aislamiento y activación simple y altamente ajustable que genera células T listas para el cultivo de células suspendidas y aplicaciones posteriores como la modificación genética y la expansión. Críticamente, la activación celular flotante con microburbujas promueve la estimulación celular restringida para prevenir el agotamiento excesivo de las células T7.
Para este estudio, la citometría de flujo fue la principal herramienta utilizada para analizar el éxito del aislamiento, activación y transducción de las microburbujas funcionalizadas, así como para proporcionar información detallada sobre las subpoblaciones específicas presentes durante las fases de crecimiento y expansión después de la transducción. Además de la citometría de flujo, se utilizaron microscopía de campo claro y fluorescencia para confirmar la salud celular, la morfología y el éxito de la transducción. Sobre la base de estos resultados, la tecnología y el protocolo de microburbujas proporcionan una alternativa más sintonizable y suave a los métodos tradicionales de aislamiento y activación actualmente en uso; en particular, las células activadas por microburbujas muestran una expresión notablemente menor de marcadores de agotamiento de células T que la observada típicamente con herramientas y kits estándar de la industria.
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Protocol
1. Aislamiento de células T con microburbujas mediante selección positiva
NOTA: Este protocolo detalla un enfoque de selección positiva CD3+ a pequeña escala utilizando SAMB.
- Incubar 3 x 108 PBMC obtenidos comercialmente en 2,5 ml de tampón de separación con anticuerpo anti-CD3 biotinilado (OKT3) a una concentración de 25 ng de anticuerpo por 1 millón de células (25 ng/M). Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo, e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
- Agregue microburbujas de estreptavidina (SAMB) en una proporción de 0.5 (cantidad de SAMB): 1 (cantidad de células) de acuerdo con la concentración de SAMB informada por el fabricante.
- Mezclar utilizando un rotador comercial de extremo a extremo (EOE) a 20 rpm durante 10-15 min a temperatura ambiente. Centrifugar durante 5 min a 400 x g a temperatura ambiente.
- Después de la centrifugación, las células seleccionadas positivamente estarán en la parte superior de la suspensión con los SAMB. Las células restantes no seleccionadas estarán en el pellet de células en la parte inferior del tubo. Con una pipeta de vidrio de 9 pulgadas, inserte la punta debajo de la capa de celda de burbuja en el fondo del tubo, aspire el pellet de celda y el subnadante con una pipeta electrónica y transfiéralos a un nuevo tubo.
2. Coestimulación (activación) de las células T seleccionadas positivamente
- Resuspenda la capa de células burbuja que queda en el tubo original en 1 ml de medio de células T completo (u otro medio deseado).
- Cuente las células en el subnadante con microscopía de campo claro utilizando un contador de células automatizado y reste este valor del número de células iniciales para determinar el número de células capturadas en la capa de células burbuja.
- Antes de este paso, mezcle el anticuerpo anti-CD28 biotinilado con SAMB comerciales durante un mínimo de 2 h para crear los SAMB anti-CD28 conjugados. Póngase en contacto con el fabricante de los SAMB para determinar la cantidad de anticuerpo anti-CD28 necesaria para la conjugación. Agregue los SAMB conjugados anti-CD28 a la suspensión de células burbuja resultante del paso 2.1 utilizando una proporción de 1.5 (SAMB anti-CD28):1 (células).
- Mezclar usando rotación EOE durante 15 min, y luego ajustar el volumen total a 2 millones de células por ml con medio de células T completo u otro medio deseado de acuerdo con el número de células obtenido en el paso 2.2.
3. Expansión de las células coestimuladas en medio de cultivo celular
- Distribuir 1 ml de células activadas a partir del paso 2.4 a una concentración de 2 m/ml por pocillo en una placa de 24 pocillos. Incubar en una incubadora humidificada deCO2 al 5% a 37 °C.
- Después de 24 h, agregue 50 U/mL de IL-2 y 25 ng/M de anti-CD3 soluble (OKT3) para estimular aún más la expansión, calculado utilizando el número inicial de células plateadas en el día 0. Vuelva a colocar la placa celular en la incubadora humidificada deCO2 y déjela incubar durante la noche a 37 °C.
4. Opcional: Transducción de células T activadas con lentivirus
NOTA: El enfoque utilizado aquí está adaptado de Prommersberger et al. 10.
- Descongele el lentivirus a temperatura ambiente y mezcle brevemente con pipeteo.
- Retire suavemente el nadante medio, 600 μL de cada pocillo, sin tocar las células hijas que ahora están en el fondo del pocillo o la capa de burbujas que ha quedado en la superficie de la solución.
- Agregue 5 μg / ml de bromuro de hexadimetrina por pocillo para mejorar la transducción viral. Agregue las partículas lentivirales a una multiplicidad de infección (MOI) de 3 (partículas lentivirales por célula).
- Centrifugar la placa durante 45 min a 800 x g y 32 °C con una aceleración lenta y sin interrupciones para la desaceleración. Incubar las células durante 4 h en una incubadora humidificada deCO2 a 37 °C.
- Después de 4 h, agregue 600 μL de medio de células T completo fresco disponible comercialmente y 50 U/ml de IL-2 a cada pocillo, y vuelva a colocar la placa celular en la incubadora humidificada deCO2 a 37 °C para la expansión de células T.
5. Expansión de las células T (con o sin transducción previa)
- Cada 2 días, retire la mitad del medio del mosquito medio, reemplácelo con un medio de células T fresco y completo, y agregue IL-2 a una concentración de 50 U / ml.
- Cuente las células T dos veces por semana para evaluar la densidad celular. Cuando la densidad celular exceda 2 x 10 6-2.5 x 106 células/ml, transfiera las células a un recipiente más grande, diluyéndolas a 5 x 105 células/ml.
6. Recolección de las células T y citometría de flujo
- Mezclar suavemente el contenido de cada pocillo pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Retire todo el contenido del pozo, incluidas las microburbujas, y transfiéralas a un tubo de 1,5 ml.
- Lave cada pocillo con 400 μL de DPBS sin calcio y sin magnesio (-/-), y transfiera la solución a un tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 50 μL de tampón de separación.
- Manchar con un anticuerpo de activación y agotamiento/cóctel de tinción, e incubar durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Prepare los cócteles de tinción de la siguiente manera: cóctel de activación: AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; cóctel de agotamiento: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
- Agregue 1 ml de tampón de separación y mezcle suavemente. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente para eliminar el exceso de anticuerpos. Aspirar el sobrenadante completamente.
- Resuspender el pellet celular en 1 ml de tampón de separación y transferirlo a un recipiente apropiado (por ejemplo, un tubo FACS, una placa de 96 pocillos, etc.) para el análisis de citometría de flujo. El esquema de compuerta de análisis de citometría de flujo recomendado se detalla en la Figura 1.
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Representative Results
Las células T se aislaron de PBMC compradas y se colocaron en placas para su activación como se describe en el protocolo. Las muestras de control negativo (PBMC compradas) no se activaron. Estas muestras de control se incluyeron para demostrar el efecto que el proceso de activación de microburbujas tuvo en las muestras experimentales en comparación con los controles de células T intactas y no estimuladas, asegurando que los marcadores de activación observados fueran el resultado de los factores de activación agregados y no fueran inherentes a las propias células T. Según el esquema experimental de la Figura 2, las células se sembraron a 2 x 106 células/ml en medio de células T y no fueron tocadas/no estimuladas o coestimuladas con SAMB anti-CD3 (clon OKT3) y anti-CD28 (clon 28.2). Después de 48 h de estimulación en cultivo, las células fueron transducidas con la partícula lentiviral que codifica para zsGreen. A los 4 días y 6 días después de la transducción, las células fueron fotografiadas, recolectadas y teñidas superficialmente usando AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-PD-1 (o PE-CD69 dependiendo de si se usaron los paneles de agotamiento o activación, respectivamente) y 7-AAD. El transgén zsGreen fue detectable en el canal FIFC. El enfoque de activación por citometría de flujo se detalla en la Figura 1. Se observaron aumentos en el número de células T viables y células T transgénicas positivas entre la muestra de control y las células que recibieron coestimulación de microburbujas (Figura 3). También se observó un aumento de las poblaciones de células efectoras en las muestras de microburbujas (Figura 4). Se observaron células T que expresaban un aumento de los marcadores de activación y agotamiento entre las muestras celulares que recibieron coestimulación de microburbujas (Figura 5 y Figura 6). La expansión celular se observó entre los puntos de tiempo del día 4 y el día 6 de las muestras coestimuladas, lo que indica que las células estaban activas, proliferativas y transmitían el transgén a medida que se expandían.
Figura 1: Ejemplo de esquema de compuerta: muestra de control intacto/negativo. A partir de los singletes, las células de población se cerraron a continuación utilizando SSC-A / FSC-A. El total de células CD3+ fue eliminado, seguido de un cierre viable CD3+ usando 7-AAD para determinar la viabilidad de la población. Todas las poblaciones y cálculos posteriores se determinaron a partir de la población viable 7-AAD(-)/CD3+(+), como se muestra utilizando las flechas que indican las puertas de la subpoblación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Descripción general de la línea de tiempo experimental. Los días del protocolo se indican anteriormente, y los días correspondientes posteriores a la transducción (D0-D6) se utilizan en las figuras a continuación. Las células fueron plateadas inmediatamente después de la selección y activación. Los pocillos de control se generaron mediante un protocolo de selección negativa de microburbujas. Las células T de control no recibieron agentes de coestimulación y no se sometieron a transducción, aunque sí recibieron IL-2 para garantizar que las células se mantuvieran lo suficientemente sanas como para mantener una viabilidad razonable durante todo el experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Evaluación de células viables y transducidas con éxito después de la transducción. (A) Células CD3+ viables 4 días y 6 días después de la transducción. La viabilidad se determinó mediante análisis de citometría de flujo, en el que se cuantificó la población mediante gating en células 7-AAD(-)/CD3+(+). (B) El número de células transducidas con éxito con rLV.EF1.zsGreen se determinó mediante citometría de flujo, en la que la población viable 7-AAD(-)/CD3+(+) se encerró aún más en células zsGreen(+). Todas las condiciones se realizaron por triplicado (n = 3). Los datos representan la media ± DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Células T CD4+ y CD8+ viables. Las subpoblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8+ se cuantificaron mediante la activación de la población viable CD3+ (CD3+ [+]/7-AAD[−]) y midiendo la expresión de (A) CD4+ y (B) CD8+. Todas las condiciones se realizaron por triplicado (n = 3). Los datos representan la media ± DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Células T activadas viables. La población viable de CD3+ también se analizó en busca de marcadores de activación específicos como se indica en las figuras anteriores. (A) CD69 es un marcador temprano de activación; (B) CD25 es un marcador de activación de mediados a tardíos. Los porcentajes por encima de las barras de error representan el porcentaje de células CD3+ viables que expresan el marcador respectivo. Todas las condiciones se realizaron por triplicado (n = 3). Los datos representan la media ± DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Células T agotadas. La población viable CD3+ también se analizó para detectar marcadores de agotamiento (PD-1). (A) El número total de células 7-AAD(-)/CD3+(+)/PD-1+(+) en el día 4 y el día 6 después de la transducción. (B) El porcentaje de células PD-1+. En el día 4 y el día 6, la población de muestra activada/transducida tenía ~25% de células CD3+/PD-1+ viables, mientras que la población de la muestra de control tenía ~2% de células CD3+/PD-1+ viables. Cabe destacar que el material inicial / aislado tenía < ~ 15% de células CD3 + / PD-1 + viables (no se muestran datos posteriores al aislamiento / precultivo). Todas las condiciones se realizaron por triplicado (n = 3). Los datos representan la media ± DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito permite el aislamiento de células T de muestras de PBMC y la activación de células T suspendidas en medios de cultivo con microburbujas. Este método se basa en microburbujas funcionalizadas cuya flotabilidad inherente ofrece una oportunidad única para introducir señales coestimuladoras a las células y activarlas mientras están suspendidas en un medio de cultivo, reduciendo así la exposición de las células en expansión a la estimulación prolongada; tal sobreestimulación puede resultar en el aumento de la expresión de marcadores de agotamiento de células T y reducción de la eficacia terapéutica11. Las células T estimuladas que se unen flotantemente a microburbujas funcionalizadas producen células hijas intactas que caen al fondo de la placa de cultivo celular para su expansión, lo que permite un período de crecimiento lejos de los factores de estimulación flotantes. Se ha detallado en la literatura cómo la exposición prolongada de células T aisladas a factores de estimulación, como los protocolos basados en perlas magnéticas12, puede afectar negativamente la expansión y la eficacia terapéutica 6,7,11.
Como este protocolo reportado se basa en la selección positiva de células CD3 + , es fundamental eliminar el subnadante debajo de la capa de células burbuja con cuidado pero a fondo durante la fase de aislamiento de este protocolo. Esto asegura que solo la población de células T seleccionada positivamente sea estimulada y plateada. Este es también un paso importante para determinar el número de células seleccionadas de la muestra inicial de PBMC, que es necesario para los cálculos precisos de coestimulación y recubrimiento.
Estas actividades de desarrollo del protocolo de microburbujas para la activación y expansión de células T aprovecharon una amplia gama de marcadores durante el análisis de citometría de flujo, lo que permitió la caracterización exhaustiva de la población de células T aisladas y estimuladas para evaluar los parámetros críticos de las células T, incluida la activación, el agotamiento y la expansión clonal. En comparación con las tecnologías de aislamiento y estimulación de células T comúnmente utilizadas, como los protocolos basados en perlas magnéticas, este protocolo de microburbujas tiene como objetivo minimizar la sobreestimulación de las células sin sacrificar la expansión y las correspondientes capacidades de función efectora de las células T aisladas. Las aplicaciones futuras de esta técnica de microburbujas incluirán varios protocolos para la selección positiva de células T, la coestimulación y los cultivos posteriores de células microburbujas para satisfacer una variedad de necesidades de flujo de trabajo para la investigación de terapia celular y las comunidades de fabricación.
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Disclosures
Todos los autores, en el momento de la presentación, son empleados de Akadeum Life Sciences, que fabrica y vende productos de separación de microburbujas.
Acknowledgments
Ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
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