Summary
Syftet med denna studie är att demonstrera genomförbarheten av flotationsbaserad separation för att isolera, aktivera och expandera primära humana T-celler.
Abstract
Processen att isolera T-celler från mononukleära celler i perifert blod (PBMC) för att etablera ex vivo-kulturer är avgörande för forskning, klinisk testning och cellbaserade terapier. I denna studie presenteras ett enkelt, nytt protokoll för att isolera, aktivera och expandera T-celler från PBMC ex vivo . Denna studie använder funktionaliserad flytkraftsaktiverad cellsorteringsteknik (BACS) för att isolera och aktivera T-celler. Kortfattat involverar protokollet det positiva urvalet av CD3 + -celler från leukopak-härledda PBMC, följt av en 48 timmars samstimulering med förkonjugerade anti-CD28-bundna streptavidinmikrobubblor (SAMB) före transduktion i 24-brunnsplattor. Funktionaliserade mikrobubblor erbjuder en unik möjlighet att flytande aktivera celler, vilket leder till proliferativa fenotyper som möjliggör expansion med minimal utmattning. Denna teknik erbjuder minskad utmattning eftersom de samstimulerande mikrobubblorna förblir flytande och återgår till toppen av odlingsmediet, vilket minskar den tid som de expanderande cellerna är i kontakt med de samstimulerande faktorerna. Resultaten indikerar att de isolerade och odlade T-cellerna får tillräckligt med stimulering för att aktivera och sprida sig men inte i en utsträckning som leder till överaktivering, vilket sedan leder till utmattning, vilket framgår av närvaron av överdriven PD-1.
Introduction
Mer än 500 kliniska prövningar av chimär antigenreceptor (CAR)-T-cellterapi genomförs för närvarande över hela världen, och fyra CAR-T-cellterapiprodukter finns tillgängliga på marknaden1. Det finns dock fortfarande många CAR-T-cellforsknings- och tillverkningsbehov som måste åtgärdas för att förbättra effekten, skalbarheten och den långsiktiga framgången för dessa potentiellt botande terapier 2,3,4,5. Adoptiv CAR-T-cell klinisk forskning och tillverkning börjar med T-cellisolering från ett perifert blodprov och efterföljande stimulering, transduktion och expansion av de isolerade cellerna. Parametrar som T-cellåtervinning, renhet och aktiverings- / utmattningssignaler kräver noggrant övervägande när man väljer cellisolerings- och stimuleringstekniker för CAR-T-cellforskning och tillverkning 3,4,6. Viktigt är att förbättring av den terapeutiska persistensen av CAR-T-cellterapier genom att minimera de biologiska hinder som härrör från de nuvarande tillverkningsprocesserna, såsom T-cellutmattning, behövs för att förbättra den terapeutiska effekten 6,7.
Som ett alternativ till traditionella cellisoleringsmetoder som fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och magnetaktiverad cellsortering (MACS) demonstreras här flytkraftsaktiverad cellsortering (BACS) med mikrobubblor för T-cellisolering. Mikrobubbelseparation använder flytande, ihåliga mikrosfärer (mikrobubblor) för att binda målen och flyta dem till ytan av vätskeprover 8,9. Genom att funktionalisera mikrobubblor med antikroppar (dvs anti-CD3) kan de önskade T-cellpopulationerna väljas positivt från perifera blodprover. Därefter demonstreras användningen av en annan population av antikroppsfunktionaliserade mikrobubblor (dvs. anti-CD28) för att samstimulera och aktivera positivt utvalda T-celler i suspension i detta arbete. Mikrobubblor erbjuder ett enkelt och mycket avstämbart isolerings- och aktiveringsarbetsflöde som genererar T-celler redo för suspenderad cellodling och nedströmsapplikationer som genetisk modifiering och expansion. Kritiskt främjar flytande cellaktivering med mikrobubblor återhållsam cellstimulering för att förhindra överdriven T-cellutmattning7.
För denna studie var flödescytometri det primära verktyget som användes för att analysera isolering, aktivering och transduktionsframgång för de funktionaliserade mikrobubblorna, samt för att ge detaljerad information om de specifika delpopulationer som finns under tillväxt- och expansionsfaserna efter transduktion. Förutom flödescytometri användes ljusfälts- och fluorescensmikroskopi för att bekräfta cellhälsan, morfologin och transduktionsframgången. Baserat på dessa resultat ger mikrobubbeltekniken och protokollet ett mer avstämbart och skonsammare alternativ till de traditionella isolerings- och aktiveringsmetoderna som för närvarande används idag; i synnerhet visar mikrobubbelaktiverade celler särskilt lägre uttryck av T-cellutmattningsmarkörer än vad som vanligtvis observeras med industristandardverktyg och kit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av T-celler med mikrobubblor med positivt urval
Det här protokollet beskriver en småskalig CD3+ -metod för positivt urval med SAMB:er.
- Inkubera 3 x 108 kommersiellt erhållna PBMC i 2,5 ml separationsbuffert med biotinylerad anti-CD3 (OKT3) antikropp i en koncentration av 25 ng antikropp per 1 miljon celler (25 ng/M). Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner och inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
- Tillsätt streptavidinmikrobubblor (SAMB) i förhållandet 0,5 (SAMB-kvantitet):1 (cellmängd) enligt tillverkarens rapporterade SAMB-koncentration.
- Blanda med en kommersiell EOE-rotator (end-over-end) vid 20 rpm i 10-15 min vid rumstemperatur. Centrifugera i 5 min vid 400 x g vid rumstemperatur.
- Efter centrifugering kommer de positivt valda cellerna att vara högst upp på suspensionen med SAMB: erna. De återstående icke-valda cellerna kommer att finnas i cellpelleten längst ner på röret. Använd en 9-tums glaspipett och sätt in spetsen under bubbelcellsskiktet i botten av röret, aspirera cellpelleten och subnatanten med en elektronisk pipett och överför dem till ett nytt rör.
2. Samstimulering (aktivering) av de positivt utvalda T-cellerna
- Återsuspendera bubbelcellskiktet som finns kvar i originalröret i 1 ml komplett T-cellmedium (eller annat önskat medium).
- Räkna cellerna i undernadanten med ljusfältsmikroskopi med hjälp av en automatiserad cellräknare och subtrahera detta värde från startcellnumret för att bestämma antalet celler som fångats i bubbelcellskiktet.
- Före detta steg, blanda den biotinylerade anti-CD28-antikroppen med kommersiella SAMBs i minst 2 timmar för att skapa de konjugerade anti-CD28 SAMBs. Kontakta SAMBs-tillverkaren för att avgöra hur mycket anti-CD28-antikropp som behövs för konjugering. Tillsätt de anti-CD28-konjugerade SAMB:erna till bubbelcellssuspensionen som är resultatet av steg 2.1 med ett förhållande på 1,5 (anti-CD28 SAMBs):1 (celler).
- Blanda med EOE-rotation i 15 minuter och justera sedan den totala volymen till 2 miljoner celler per ml med komplett T-cellmedium eller annat önskat medium enligt cellnumret som erhållits i steg 2.2.
3. Expansion av de samstimulerade cellerna i cellodlingsmediet
- Fördela 1 ml aktiverade celler från steg 2.4 i en koncentration av 2 M/ml per brunn i en 24-brunnsplatta. Inkubera i en fuktad 5%CO2-inkubator vid 37 °C.
- Efter 24 timmar, tillsätt 50 U/ml IL-2 och 25 ng/M löslig anti-CD3 (OKT3) för att ytterligare uppmuntra expansion, beräknat med hjälp av det ursprungliga antalet celler som pläterats dag 0. Placera tillbaka cellplattan i den fuktade CO 2-inkubatorn och låt den inkubera över natten vid 37 °C.
4. Valfritt: Transduktion av aktiverade T-celler med lentivirus
OBS: Tillvägagångssättet som används här är anpassat från Prommersberger et al. 10.
- Tina lentiviruset vid rumstemperatur och blanda kort genom pipettering.
- Ta försiktigt bort mitten av natanten, 600 μL från varje brunn, utan att röra vid dottercellerna som nu finns längst ner i brunnen eller bubbelskiktet som har kvar på ytan av lösningen.
- Tillsätt 5 μg/ml hexadimetrinbromid per brunn för att förbättra viral transduktion. Tillsätt de lentivirala partiklarna vid en mångfald av infektion (MOI) på 3 (lentivirala partiklar per cell).
- Centrifugera plattan i 45 minuter vid 800 x g och 32 °C med långsam acceleration och utan paus för retardation. Inkubera cellerna i 4 timmar i en fuktadCO2-inkubator vid 37 °C.
- Efter 4 timmar, tillsätt 600 μl kommersiellt tillgängligt, färskt komplett T-cellmedium och 50 U / ml IL-2 till varje brunn och placera cellplattan tillbaka i den fuktade CO 2-inkubatorn vid 37 ° C för T-cellutvidgning.
5. Expansion av T-cellerna (med eller utan föregående transduktion)
- Var 2: e dag, ta bort hälften av mediet från mitten av natanten, ersätt det med färskt, komplett T-cellmedium och tillsätt IL-2 i en koncentration av 50 U / ml.
- Räkna T-cellerna två gånger per vecka för att bedöma celltätheten. När celldensiteten överstiger 2 x 10 6-2,5 x 106 celler / ml, överför cellerna till ett större kärl och späd dem till 5 x 105 celler / ml.
6. Skörda T-cellerna och flödescytometri
- Blanda försiktigt innehållet i varje brunn genom att pipettera upp och ner. Ta bort hela innehållet i brunnen, inklusive mikrobubblorna, och överför dem till ett 1,5 ml rör.
- Tvätta varje brunn med 400 μL kalciumfri och magnesiumfri DPBS (−/−) och överför lösningen till ett 1,5 ml rör. Centrifugera vid 400 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 50 μL separationsbuffert.
- Fläcka med en aktiverings- och utmattningsantikropps-/färgningscocktail och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker. Förbered färgningscocktailsna enligt följande- aktiveringscocktail: AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; utmattningscocktail: AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, PE-PD-1.
- Tillsätt 1 ml separationsbuffert och blanda försiktigt. Centrifugera vid 400 x g i 5 min vid rumstemperatur för att tvätta bort överflödiga antikroppar. Aspirera supernatanten helt.
- Återsuspendera cellpelleten i 1 ml separationsbuffert och överför till ett lämpligt kärl (t.ex. ett FACS-rör, en 96-brunnsplatta etc.) för flödescytometrianalysen. Det rekommenderade flödescytometrianalysschemat beskrivs i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
T-celler isolerades från köpta PBMC och pläterades för aktivering enligt beskrivningen i protokollet. De negativa kontrollproverna (inköpta PBMC) aktiverades inte. Dessa kontrollprover inkluderades för att visa effekten som mikrobubbelaktiveringsprocessen hade på de experimentella proverna jämfört med de orörda och ostimulerade T-cellkontrollerna, vilket säkerställde att de observerade aktiveringsmarkörerna var resultatet av de tillsatta aktiveringsfaktorerna och inte var inneboende för själva T-cellerna. Enligt den experimentella konturen i figur 2 såddes cellerna vid 2 x 106 celler / ml i T-cellmedium och var antingen orörda / ostimulerade eller samstimulerade med anti-CD3 (klon OKT3) och anti-CD28 (klon 28.2) SAMBs. Efter 48 timmars stimulering i odling transducerades cellerna med den lentivirala partikeln som kodar för zsGreen. Vid 4 dagar och 6 dagar efter transduktion avbildades, skördades och ytfärgades cellerna med AF700-CD3, PE / Dazzle-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-PD-1 (eller PE-CD69 beroende på om utmattnings- eller aktiveringspanelerna användes) respektive 7-AAD. ZsGreen-transgenen var detekterbar i FITC-kanalen. Flödescytometrins gatingmetod beskrivs i figur 1. Ökningar av antalet livskraftiga T-celler och transgenpositiva T-celler observerades mellan kontrollprovet och cellerna som fick mikrobubbel-samstimulering (figur 3). Ökade effektorcellpopulationer observerades också i mikrobubbelproverna (figur 4). T-celler som uttryckte ökad aktivering och utmattningsmarkörer observerades bland cellproverna som fick mikrobubbelstimulering (figur 5 och figur 6). Cellexpansion observerades mellan dag 4 och dag 6 tidpunkter för de samstimulerade proverna, vilket indikerar att cellerna var aktiva, proliferativa och passerade transgenen när de expanderade.
Figur 1: Exempel på grindschema-orört/negativt kontrollprov. Från och med singlets gated populationscellerna nästa med SSC-A / FSC-A. De totala CD3 + -cellerna gated ut, följt av livskraftiga CD3 + gating med 7-AAD för att bestämma befolkningens livskraft. Alla efterföljande populationer och beräkningar bestämdes från den livskraftiga 7-AAD(−)/CD3+(+)-populationen, vilket visas med hjälp av pilarna som indikerar delpopulationsportarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Översikt över experimentell tidslinje. Protokollets dagar noteras ovan, och motsvarande dagar efter transduktion (D0-D6) används i figurerna nedan. Cellerna pläterades omedelbart efter urval och aktivering. Kontrollbrunnarna genererades med hjälp av ett mikrobubbla negativt urvalsprotokoll. Kontroll-T-cellerna fick inte samstimuleringsmedel och genomgick inte transduktion, även om de fick IL-2 för att säkerställa att cellerna hölls tillräckligt friska för att upprätthålla rimlig livskraft under hela experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Bedömning av livskraftiga och framgångsrikt transducerade celler efter transduktion. (A) Livskraftiga CD3 + -celler 4 dagar och 6 dagar efter transduktion. Viabiliteten bestämdes genom flödescytometrianalys, där populationen kvantifierades genom gating på 7-AAD(−)/CD3+(+)-celler. (B) Antalet celler som framgångsrikt transducerats med rLV.EF1.zsGreen bestämdes genom flödescytometri, där den livskraftiga 7-AAD(−)/CD3+(+)-populationen ytterligare gated till zsGreen(+)-celler. Alla villkor utfördes i tre exemplar (n = 3). Uppgifterna representerar medelvärdet ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Livskraftiga CD4+- och CD8+T-celler. Delpopulationerna CD4+ och CD8+ T kvantifierades genom att gating på den livskraftiga CD3+-populationen (CD3+ [+]/7-AAD[−]) och mäta uttrycket av (A) CD4+ och (B) CD8+. Alla villkor utfördes i tre exemplar (n = 3). Uppgifterna representerar medelvärdet ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Livskraftiga aktiverade T-celler. Den livskraftiga CD3 + -populationen analyserades också för specifika aktiveringsmarkörer som anges i figurerna ovan. (A) CD69 är en tidig markör för aktivering; (B) CD25 är en aktiveringsmarkör mellan och sent i mitten. Procentsatserna ovanför felstaplarna representerar procentandelen livskraftiga CD3 + -celler som uttrycker respektive markör. Alla villkor utfördes i tre exemplar (n = 3). Uppgifterna representerar medelvärdet ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Uttömda T-celler. Den livskraftiga CD3 + -populationen analyserades också för utmattningsmarkörer (PD-1). (A) Det totala antalet 7-AAD(−)/CD3+(+)/PD-1+(+)-celler vid dag 4 och dag 6 efter transduktionen. (B) Procentandelen PD-1+ celler. På dag 4 och dag 6 hade den aktiverade / transducerade provpopulationen ~ 25% livskraftiga CD3 + / PD-1 + -celler, medan kontrollprovpopulationen hade ~ 2% livskraftiga CD3 + / PD-1 + -celler. Observera att det startande / isolerade materialet hade < ~ 15% livskraftiga CD3 + / PD-1 + -celler (postisolering / förodlingsdata visas inte). Alla villkor utfördes i tre exemplar (n = 3). Uppgifterna representerar medelvärdet ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det beskrivna protokollet möjliggör isolering av T-celler från PBMC-prover och aktivering av suspenderade T-celler i odlingsmedier med mikrobubblor. Denna metod bygger på funktionaliserade mikrobubblor vars inneboende flytkraft erbjuder en unik möjlighet att införa samstimulerande signaler till celler och aktivera dem medan de är suspenderade i ett odlingsmedium, vilket minskar exponeringen av de expanderande cellerna för långvarig stimulering; sådan överstimulering kan resultera i ökat uttryck av T-cellutmattningsmarkörer och minskad terapeutisk effekt11. Stimulerade T-celler som är flytande fästa vid funktionaliserade mikrobubblor producerar orörda dotterceller som faller till botten av cellodlingsplattan för expansion, vilket möjliggör en period av tillväxt bort från de flytande stimuleringsfaktorerna. Det har beskrivits i litteraturen hur långvarig exponering av isolerade T-celler för stimuleringsfaktorer - såsom magnetiska pärlbaserade protokoll 12 - kan påverka expansionen och terapeutisk effekt 6,7,11 negativt.
Eftersom detta rapporterade protokoll förlitar sig på det positiva urvalet av CD3 + -celler är det viktigt att ta bort subnatanten under bubbelcellskiktet noggrant men noggrant under isoleringsfasen av detta protokoll. Detta säkerställer att endast den positivt utvalda T-cellpopulationen stimuleras och pläteras ytterligare. Detta är också ett viktigt steg för att bestämma antalet celler som valts från det startande PBMC-provet, vilket är nödvändigt för exakta samstimulerings- och pläteringsberäkningar.
Dessa mikrobubbelprotokollutvecklingsaktiviteter för T-cellaktivering och expansion utnyttjade ett brett spektrum av markörer under flödescytometrianalys, vilket möjliggjorde grundlig karakterisering av den isolerade och stimulerade T-cellpopulationen för att bedöma kritiska T-cellparametrar, inklusive aktivering, utmattning och klonal expansion. Jämfört med vanliga T-cellisolerings- och stimuleringstekniker, såsom magnetiska pärlbaserade protokoll, syftar detta mikrobubbelprotokoll till att minimera överstimuleringen av celler utan att offra expansionen och motsvarande effektorfunktionsförmåga hos de isolerade T-cellerna. Framtida tillämpningar av denna mikrobubbelteknik kommer att inkludera olika protokoll för T-cellpositivt urval, samstimulering och efterföljande mikrobubbelcellkulturer för att möta en mängd olika arbetsflödesbehov för cellterapiforskning och tillverkningssamhällen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare är vid tidpunkten för inlämningen anställda hos Akadeum Life Sciences, som tillverkar och säljer mikrobubbelseparationsprodukter.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
- Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
- Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
- Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
- Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
- McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
- Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
- Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
- Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).
